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IN G . L A UR A V Z QUE Z
CROMATOGRAFA
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CROMATOGRAFA
Fase estacionaria: slido o lquido fijado a un slido
Fase mvil: fludo (lquido o gas) que arrastra la muestra a travs de lafase estacionaria
Los distintos componentes de la mezcla interaccionan demanera diferente con las dos fases establecindose un reparto
entre ambas
Se establece un equilibrio entre partculas adsorbidas desorbidas
! " #molculas adsorbidas$
#mol% adsorbidas$ & #mol% desorbidas$coeficiente de reparto
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F'SS'*+,-'.+'
F'S /01+L
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*lasificaciones de cromatografa
2%Seg3n como se encuentre la fase estacionaria
a%columna
b%plana cromatografa en papel en capa fina
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4%Seg3n el tipo de fase estacionaria fase mvil
Fase estacionaria
Lquido adsorbido
Fase mvil
Slida Lquida o gaseosa
Lquida o gaseosa
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5%Seg3n el tipo de flujo empleado
a%6ravedad
b%*apilaridad (papel7 capa fina)
c%Fludo a presin (89L*)
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89L* (ig performance liquid cromatograp)
Se basa en los mismos principios que la cromatografa a baja presin
iene mejor resolucin7 tiempos menores7 mejor reproducibilidad
l material empacado en las columnas est; formado por peque
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FPLC (fast protein liquid cromato!rap"#
s una variante del 89L* con columnas equipamiento especialmente dise
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>%Seg3n la finalidad del e=perimento
Separacin purificacin 9reparativa
Separacin7 cuantificacin caracterizacin
'naltica
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>%Seg3n la interaccin entre la fase mvil el soluto
a%*romatografa de intercambio inico carga?carga
b% *romatografa de interaccin idrofbica efecto idrofbico
c% *romatografa de afinidad variada pero especfica
d%*romatografa de afinidad por metalesinmovilizados (+/'*)
e%*romatografa de fase normal reversa dipolos
enlaces covalentes
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*romatografa de intercambio inico
La separacin se basa en diferencias de carga a un p8 dado
Las interacciones son electrost;ticas
@os tipos
lucin: puede llevarse a cabo mediante cambios de p87 fuerza inica oambos
+ntercambio aninico: matriz cargadapositivamente (@'7 '7 A')
+ntercambio catinico: matriz cargadanegativamente (carbo=imetilos7sulfonatos7 fosfatos)
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*romatografa de afinidad
Se basa en una interaccin biolgica especfica:
nzima?sustrato
'nticuerpo?antgeno
nzima?coenzima9rotena?ligando especfico
La elucin se puede lograr agregando el ligando (el que est; unido a la
columna) en solucin o mediante cambios en el buffer que seancapaces de debilitar la interaccin
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+/'* (immobilized metal affinit cromatograp)
Se basa en la formacin de enlaces de coordinacin entre iones
met;licos inmovilizados grupos b;sicos en protenas (istidinas)9rincipalmente a los iones divalentes de metales de transicincomo Fe7 *o7 $i7 *u Bn
La elucin se lleva a cabo adicionando quelantes m;s fuertes como elimidazol a distintas concentraciones o cambios en el p8
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s mu utilizada para la purificacin de protenas recombinantes
6eneralmente se adicionan C istidinas en el e=tremo -to en el *t
*ola de (8istidina)C
-i4&
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*romatografa de interaccin idrofbica
l soporte est; sustitudo con cadenas alif;ticas de 4 a 2D carbonos u otros
grupos idrofbicos
La interaccin es de tipo idrofbica
La fase mvil debe tener una alta concentracin de sales((-8>)4S,54 E > /)
Salting out
9ara la elucin se disminue la concentracin de sales en la fase mvil
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*romatografa de fase reversa
st; mu relacionada con la cromatografa de interaccin idrofbica
pero son diferentes
l soporte est; sustitudo por alif;ticas pero m;s largas ( ?2 carbonos) la densidad de sustituentes es maor
La unin es m;s fuerte por eso requiere mezclas con solventes nopolares para la elucin
@esnaturaliza protenas
Se utiliza en 89L*
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6el filtracin (cromatografa de e=clusin molecular)
-o es una cromatografa
La separacin se da por tama
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l gel debe ser inerte7 de tama
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Resultado final% cromato!rama
1elucin(mL) 1elucin(mL)
" unidades de absorbancia7 unidades de fluorescencia relativa7 intensidad
del pico (espectrometra de masa)7 entre otras
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La pregunta m;s importanteG
Hn qu son distintas las sustancias que deseo separarI
*oncluendoG%
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