MUTACIONES CLONACIÓN: ADN RECOMBINANTE Y PCR

MSc. Tatiana Quinteros

Facultad de Química y Farmacia Bioquímica General Unidad: Genética

25 Abril 2012

Mutaciones

• Variación en el número y arreglo de los cromosomas

Mutaciones Cromosómicas

• Alteración de la secuencia de bases del ADN

Mutaciones Génicas

1. Mutaciones cromosómicas

1. Variación en el número de cromosomas: aneuploidía (error durante la meiosis)

2. Pérdida, duplicación o reorganización de un segmento de cromosoma (ruptura espontánea)

(aberraciones cromosómicas)

Ejemplo 1

• Síndrome de Down o Trisomía 21 (47, 21+)

Klug y Cummings. Essentials of Genetics. 4ª edición

Ejemplo 2

Síndrome del maullido de gato (Cri du chat)

Deleción de una parte del cromosoma 5 (46,5p-)

2. Mutaciones génicas

Cambio en la secuencia normal de ADN

Pueden ser clasificadas en varias categorías

Espontáneas – Inducidas

Gaméticas – Somáticas

Dominantes – Recesivas

Mutaciones morfológicas

Mutaciones bioquímicas

Tipos de mutaciones génicas según el tipo de cambio en la secuencia de ADN

1. Puntuales o Sustituciones

2. Inserciones

3. Deleciones

4. Inversiones

5. Duplicaciones

6. Transposiciones

¿Cómo se originan las mutaciones?

1. Mutaciones espontáneas

1.1 Errores en la replicación

1.2 Lesiones espontáneas

despurinización, desaminación

oxidación por radicales libres

2. Mutaciones Inducidas: agentes mutágenos

Agentes químicos (agentes intercalentes), físicos (UV causa dímeros de timina), biológicos.

La mayoría de mutaciones son silenciosas pero algunas causan graves enfermedades

Belk. Biology Science for Life

ADN ADN

ARNm ARNm

Proteína Proteína

Proteína Funcional

Proteína No Funcional

(a) Secuencia normal de ADN (b) Secuencia mutada de ADN

Clonación Clonar = copiar

Clonación: creación de clones

Clones = copias genéticamente idénticas entre si

Hay varios tipos de clonación:

–Clonación de secuencias de ADN (genes)

–Clonación de células

–Clonación de organismos (animales, plantas)

Clonación

Clonación de secuencias de ADN (genes)

Producción de una gran cantidad de copias idénticas de un gen.

– In vivo: en células, por medio de técnicas de ADN recombinante

– In vitro: PCR. Reacción en cadena de la polimerasa

Tecnología del ADN recombinante

Conjunto de técnicas para la manipulación in vitro del material genético de los seres vivos, las cuales permiten la creación y análisis de nuevas moléculas de “ADN recombinante” que no se encuentran como tal en la naturaleza.

Molécula de ADN recombinante Contiene ADN de dos organismos diferentes

ADN del vector.

Sirve de vehículo para transportar el ADN de interés. Puede ser de una bacteria o un virus.

ADN del organismo de interés.

Puede ser un gen o parte de él.

1 2

ADN de interés

ADN del vector bacteriano (plásmido)

Molécula de ADN recombinante

bacteria

Elementos básicos de la clonación en células

• ADN de interés

• Vectores de clonación (vehículos moleculares)

• Enzimas de restricción (tijeras moleculares)

• ADN ligasa (pegamento para unión de ADN)

• Células huesped

PASOS BÁSICOS EN LA CLONACIÓN DE UN GEN

Enzimas de Restricción

Endonucleasas de restricción

Grupo de enzimas de origen bacteriano que cortan la doble cadena de ADN en secuencias determinadas.

Las enzimas de restricción reconocen y cortan una secuencia específica de ADN (4-8 pares de nucleótidos) que es palindrómica, es decir, tiene la misma secuencia en las dos cadenas al leer en dirección 5’ 3’

5’ G A A T T C 3’

3’ C T T A A G 5’

¿Cuál es una secuencia palindrómica?

a) G G A T C C

C C T A G G

b) G G T A C A

C C A T G T

c) C T G C A G

G A C G T C

d) A G T A G T

T C A T C A

Corte cohesivo /escalonado

Colas complementarias

Las enzimas de restricción realizan cortes cohesivos o escalonados: cortan la cadena de ADN en diferentes puntos de la secuencia de reconocimiento

Los enlaces cortados pueden volver a unirse por medio de la

enzima ligasa

Cooper’s. Pág. 108

http://highered.mcgraw-hill.com/olc/dl/120078/bio37.swf

Enzimas de restricción y las secuencias que reconocen

Darnell et al. Molecular Biology

Enzima Microorganismo del que procede Secuencia de reconocimiento

(sitio de restricción)

EcoRI

Escherichia coli

G A A T T C C T T A A G

BamHI

Bacillus amyloliquefaciens

G G A T C C C C T A G G

HindIII

Haemophilus influenzae

A A G C T T T T C G A A

Procedimiento básico de clonación de ADN in vivo

1. El segmento a ser clonado es extraído del ADN original usando endonucleasas de restricción (EcoRI)

Koolman, Color Atlas of Biochemistry, 2nd edition

2. El plásmido se corta con la misma enzima y se abre con un corte cohesivo, quedando colas complementarias

Koolman, Color Atlas of Biochemistry, 2nd edition

3. El fragmento de ADN se inserta en el vector. Ambos han sido cortados con la misma enzima EcoRI,

tienen colas complementarias y se unen por medio de apareamiento de bases. A continuación la enzima ADN ligasa une las cadenas de nucleótidos formando un plásmido “recombinante”

Koolman, Color Atlas of Biochemistry, 2nd edition

4. Transformación

Se introduce el plásmido creado en células huésped (bacterias)

5. La bacteria se cultiva y multiplica reproduciendo en su interior el plásmido recombinante, produciendo millones de copias.

Koolman, Color Atlas of Biochemistry, 2nd edition

Koolman, Color Atlas of Biochemistry, 2nd edition

1 2

3

4

5

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

Revolucionó el campo de la Ing. Genética (1986)

– Permite la replicación de segmentos de ADN in vitro (AMPLIFICACIÓN) sin utilizar enzimas de restricción, vectores o células huésped.

PCR

– La secuencia de nucleótidos del segmento debe conocerse.

– La reacción se realiza en un termociclador que calienta y enfría la reacción en periodos cortos de tiempo.

Elementos de la reacción

• Segmento de ADN de interés

• Dos “cebadores”: fragmentos de ADN sintético de cadena sencilla

• dNTP’s desoxirribonucleotidos trifosfatados (ATP, GTP, CTP y TTP)

• Enzima ADN polimerasa termorresistente

Paso 1:

Paso 2:

30-40 ciclos de 3 pasos:

45 seg 54°C

Paso 3:

2 min 72°C

PCR: Reacción en Cadena de la Polimerasa

1 min 94°C

Pasos de la Reacción

1. Desnaturalización: Consiste en separar la doble cadena de ADN y convertirla en cadenas sencillas. Temperatura de 94˚C/15 de 40 segundos a 1 min.

2. Hibridación (Apareamiento o “annealing”)

Los cebadores se unen a la cadena sencilla de ADN en lugares específicos por complementariedad de bases. Para esto, se baja la temperatura ~55˚C por 45 segundos.

3. Extensión

La polimerasa de ADN extiende los cebadores en el

espacio comprendido entre ambos, y coloca dNTP’s.

De esta forma sintetiza la secuencia complementaria

de las cadenas de ADN.

Se efectúa a ~72˚C por 2 minutos

Animación PCR http://www.maxanim.com/

genetics/PCR/pcr.swf