5 de Octubre de 2011

TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA

DIA 1. 5 de Octubre

Microarrays (Ricardo Gonzalo)RTqPCR (Paqui Gallego)Diseño experimental y análisis de resultados (Alex Sánchez)

DIA 2. 30 de Noviembre

Ultrasecuenciación (Paqui Gallego y Alex Sánchez)

Pre-Experimento…

UEB

INVESTIGADOR

UCTS

TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA

TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA

MATERIAL DE PARTIDA: RNA

•Calidad (Bioanalyzer/RIN)

•Cantidad (Kits amplificación)

TIPOS DE ARRAYS

•Según su tecnología•Según objetivo del estudio (Affymetrix/UCTS)

EXPERIMENTO DE MICROARRAYS

•Procedimiento de amplificación / detección•GeneTitan•Controles de calidad

MIC

RO

AR

RA

YS

TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA

MATERIAL DE PARTIDA: RNA

•Calidad (Bioanalyzer/RIN)

•Cantidad (Kits amplificación)

TIPOS DE ARRAYS

•Según su tecnología•Según objetivo del estudio (Affymetrix/UCTS)

EXPERIMENTO DE MICROARRAYS

•Procedimiento de amplificación / detección•GeneTitan•Controles de calidad

MIC

RO

AR

RA

YS

TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA

Tipos de arrays de expresión según su tecnología (I)

Arrays de cDNA – 2 colores Arrays de oligos – 1 color

Impresión de la sonda síntesis de la sonda “in situ”

2 dyes fluorescentes (Cy3/5) 1 dye fluorescente (FE)

1 gen = pocos spots/replicados 1 gen = representado por muchas sondas diferentes

2 muestras / slide 1 muestra / slide

Longitud (nt) elevada oligos de 20-25 nt

Medidas relativas medidas absolutas

Tipos de arrays de expresión según su tecnología (II)

•Más económicos

•Alta flexibilidad en el diseño

•Chips de alta densidad

•Muy reproducibles

•Medidas absolutas

TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA

Arrays de cDNA (2 colores) Arrays de oligos (1 color)

pros

•Manejo de clones

•Posibles hibridaciones cruzadas

•Baja reproducibilidad

•Precio elevado

•Falta de flexibilidad en algunos formatos

•Equipamiento especializado

cons

•Genome-Wide SNP Analysis GW Human SNP array 6.0

? 1.8 M marcadores genéticos (900.000 SNP + 900.000 CNV)

•Resequencing Arrays Human Mitochondrial array

“Custom” resequencing arrays

•Citogenética GW Human SNP array 6.0

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Tipos de microarrays (Plataforma de Affymetrix) (I)

DNA ANALYSIS ARRAYS

TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA

GENE REGULATION ANALYSIS ARRAYS

Tipos de microarrays (Plataforma de Affymetrix) (II)

• ChiP-on-Chip: Estudio de interacciones entre DNA y proteínas

y modificaciones del DNA, ej.

Sitios de unión de factores de transcripción

Sitios de unión de histonas

Metilación del ADN

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Tipos de microarrays (Plataforma de Affymetrix) (III)

EXPRESSION ANALYSIS ARRAYS (I)

3’ Expression Human U133 Plus 2.0 array

Human U219 array plate

Rat, Mouse, Porcine, Zebrafish, …

3’5’

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Tipos de microarrays (Plataforma de Affymetrix) (IV)

EXPRESSION ANALYSIS ARRAYS (II)

Gene Arrays Human, Mouse, Rat Gene 1.0 ST Array

Exon Arrays Human, Mouse, Rat Gene 1.0 ST Array

3’5’

Gene Arrays

Exon Arrays

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Tipos de microarrays (Plataforma de Affymetrix) (V)

miRNA GeneChip miRNA 2.0 Array

•131 organisms in the array (human, mouse, rat, canine, ….)

•100% miRBase v115

•2.334 snoRNAs and scaRNAs (human small nuclear RNAs)

•Low inputs amounts (0.1 to 1 ug total RNA)

•2.202 probe sets unique to pre-miRNA hairpins

• Según el método de purificación se enriquece una fracción u otra.

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Tipos de microarrays (Plataforma de Affymetrix) (VI). Resumen

RNA - 3’IVT Expression Hg U133 Plus 2.0 Formato individual o formato placa (16, 24 ó 96)

Hg U219 Formato placa

- WT-Expression Human Gene Array Formato individual o formato placa

Human Exon Array Formato individual

- miRNA miRNA Array Formato individual

DNA - Resequencing Mitochip Formato individual

“Custom” Formato individual

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¿Cómo están hechos? (I). Fotolitografía

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¿Cómo están hechos? (II)

TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA

MATERIAL DE PARTIDA: RNA

•Calidad (Bioanalyzer/RIN)

•Cantidad (Kits amplificación)

TIPOS DE ARRAYS

•Según su tecnología•Según objetivo del estudio (Affymetrix/UCTS)

EXPERIMENTO DE MICROARRAYS

•Procedimiento de amplificación / detección•GeneTitan•Controles de calidad

MIC

RO

AR

RA

YS

TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA

MATERIAL DE PARTIDA RNA TOTAL

Poli A mRNA

EXTRACCIÓN

Células eucariótas QIAGEN

Tejido TRIZOL

CALIDAD CANTIDADBIOANALYZER

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CALIDAD RNA (I): BIOANALYZER

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CALIDAD RNA (II): BIOANALYZER

CALIDAD RNA (III): BIOANALYZER. Cálculo de la concentración

RNA Area: 192.0 RNA Concentration: 150 ng/µlResult Flagging Color: 255 Result Flagging Label: Bad RNA quality

RNA Area: 155.7 RNA Concentration: 122 ng/µlrRNA Ratio [28s / 18s]: 1.6 RNA Integrity Number (RIN): 8.5 (B.02.08) Result Flagging Color: 65280 Result Flagging Label

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Not all expected ladder peaks have been found. You should try to modify peak find settings or add peaks using manual integration.

Issue with ladder peak detection. Please check ladder.

RNA Area: 1,653.2 RNA Concentration: 50,101 pg/µlrRNA Ratio [28s / 18s]: 1.3 RNA Integrity Number (RIN): 7.7 (B.02.08) Result Flagging Color: 65280 Result Flagging Label: Good RNA quality

CALIDAD RNA (IV): BIOANALYZER. Cálculo de la concentración

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BIOANALYZER

Chips disponibles:

RNA

PROTEINAS

DNA

CÉLULAS

Agilent RNA 6000 Nano Kit Agilent RNA 6000 Pico Kit Agilent 2100 Small RNA Kit

Agilent DNA 1000 Kit Agilent DNA 7500 Kit Agilent DNA 12000 Kit Agilent High Sensitivity DNA Kit

Agilent Protein 80 Kit Agilent Protein 230 Kit High Sensitivity Protein 250 Kit

Agilent Cell Kit

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CALIDAD RNA (III): RNA INTEGRITY NUMBER

0 ≤ RIN ≤ 10

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CALIDAD RNA (IV): RNA INTEGRITY NUMBER

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CALIDAD RNA (V): RNA INTEGRITY NUMBER

? ¿qué RIN es el más adecuado?

RIN 5.0 RIN 8.0

¿hasta que RIN se puede utilizar?

¿se pueden mezclar diferentes RIN?

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CALIDAD RNA (VI): TIPO DE MUESTRA

• kits especiales extracción RNA

• extracción “genes globina”

• no trabajar con sangre total

• HABLAR CON NOSOTROS ANTES

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CANTIDAD RNA

• 3’ IVT ARRAYS 200 ng / 3 µL

• Exon/Gene ARRAYS 200 ng / 3 µL

• NUGEN 500 pg / 5 µL

• miRNA 1 µg / 8 µL

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MATERIAL DE PARTIDA: RNA

•Calidad (Bioanalyzer/RIN)

•Cantidad (Kits amplificación)

TIPOS DE ARRAYS

•Según su tecnología•Según objetivo del estudio (Affymetrix/UCTS)

•EXPERIMENTO DE MICROARRAYS

•Procedimiento de amplificación / detección•GeneTitan•Controles de calidad

MIC

RO

AR

RA

YS

RNA (150 ng)

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3’IVT EXPRESS

AAAAAAAAAAAATTTTTTT

TTTTT

RNA (150 ng) RNA-cDNA dscDNA cRNA (≈ 40 µg)

IVT

O/N

PROCEDIMIENTO (I)

EXON/GENE

NNNNN

RNA-cDNA dscDNA

IVT

O/NcRNA

NNNNN

ssDNA (7 µg)

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NUGEN

PROCEDIMIENTO (II)

NNNNN

RNA (500 pg) RNA-cDNA dscDNA

SPIA

ssDNA (8 µg)TTTTT

miRNA

ATPAAAAAA

RNA (1 µg) AAAAAA

Biotin-labeled 3DNA

Biotin-labeled RNA

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PROCEDIMIENTO (III)

Fragmentación

O/N

3’IVT EXPRESS EXON/GENE NUGEN miRNA Resequencing

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Y ESTO SOLO ACABA DE EMPEZAR…

.CEL

UEB

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DIFERENCIAS ENTRE LOS KITS

3’ IVT Exon/Gene NUGEN

Oligo dT NNN oligo dT + NNN

cRNA ssDNA ssDNA

15 µg 5.5 µg 5 µg

NO MEZCLAR DIFERENTES PROTOCOLOS DE AMPLIFICACIÓN

EN UN MISMO PROYECTO…

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GENETITAN (I)

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GENETITAN(II)

• Formato placa: 16, 24, 96 arrays

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GENETITAN(III)

• Formato placa: 16, 24, 96 arrays

mayor high throughtput

reducción del tiempo de procesado

disminución de costes

mayor reproducibilidad (disminución de efecto batch)

Formato cerrado (16, 24, 96)

No todos los tipos de especies, tipo de array representados

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CONTROL DE CALIDAD (I)

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CONTROL DE CALIDAD (II)

CONTROL DE CALIDAD (III). cRNA Puricado

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CONTROL DE CALIDAD (III). cRNA Fragmentado

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