ELECTROFORESIS

La electroforesis es un método de laboratorio en el que se utiliza una corriente eléctrica controlada con la finalidad de separar biomoléculas según su tamaño y carga eléctrica a través de una matriz gelatinosa.

Es la movilidad o desplazamiento de las partículas coloidales en un campo eléctrico. Es una técnica de separación

Es el transporte de partículas cargadas en un campo eléctrico. Es una técnica de separación en la que estas partículas se separan mediante la diferencia de su velocidad de migración.

La electroforesis se utiliza para separar compuestos con carga neta, como aminoácidos, péptidos, proteínas, nucleótidos y ácidos nucleicos.

Factores: Intensidad del campo eléctrico, carga eléctrica, forma y tamaño de las partículas.

Las diferentes moléculas muestran en un campo eléctrico diversos grados de emigración en relación con su forma, tamaño y carga.

La velocidad es mayor cuanto más carga eléctrica tenga la molécula y menor sea su masa molecular.

Las partículas cargadas positivamente (cationes) se dirigen hacia el electrodo cargado negativamente (cátodo).

MEDIOS DE SOPORTE: Particulados: fibras de celulosa Continuos: poliacrilamida, almidón, geles de

agarosa, acetato de celulosa.

COLORACIÓN: Proteínas: Ponceau S Lipoproteínas: Sudan black B

Procedimiento: 1. Marcar el medio de soporte: placa 2. Colocarla en la cubeta que tiene solución

Tampon 3. Aplicar la muestra en la placa 4. Colocar la placa en la cámara electroforética 5. Fuente de poder: recorrido electroforético 6. Proceso de Tinción 7. Secado de la placa 8. Lectura: Densitometro-cuantificación. 9. Se expresa en gr/lt ó en %.

La electroforesis en acetato de celulosa separa las proteínas del suero en 5 fracciones:

Albúmina Globulinas: α1, α2, β y γ

APLICACIONES CLINICAS

1. Proteínas específicas: séricas, urinarias, LCR.

2. Análisis cuantitativo: albúminas, gammaglobulinas

3. Identificación y cuantificación de Hb

4. Análisis de isoenzimas (lactato deshidrogenasa (LDH), creatincinasa (CK), fosfatasa alcalina).

5. Inmunoglobulinas

Las condiciones particulares para cada electroforesis deben seleccionarse minuciosamente en cada caso particular y la elección tanto del medio de soporte como del pH y la fuerza iónica del tampón como la duración de la electroforesis y otros parámetros que intervienen en la separación deben ser objeto de un estudio empírico en cada caso particular.

FRACCIONAMIENTO DE LA HEMOGLOBINA

MEDIANTE ELECTROFORESIS SOBRE

ACETATO DE CELULOSA

METODO DE HELENA LABORATORIES

REACTIVOS:1. BUFFER: Tris-EDTA y Ac. Bórico pH 8,2-8,62. REACTIVO HEMOLIZANTE: 0.005M EDTA en Agua Destilada con 0.01% de Cianuro

dePotasio.3. COLORANTE PONCEAU S:

Ponceau S en sol. Acuosa 0.5%Ac. Tricloroacètico 3.5%Ac. Sulfosalìcilico 3.5%

4. TRANSPARENTADOR o SOL.CLARIFICANTEAc. Acético glacial 30ml.Metanol absoluto 70mlClear Aid 4ml

5.SUSTANCIA LAVADORA:Ac. Acètico al 5%Metanol absoluto

PLACAS:TITAN III – H(Acetato de Celulosa para Hemoglobina Electroforesis)

PATRONES DE HEMOGLOBINA

EQUIPOS:Camara Electroforètica Fuente PoderDensitòmetroSecador

MUESTRA PROBLEMA:

Sangre Total en EDTA o Heparina

PROCEDIMIENTO:

1. PREPARACION DE LA PLACA DE TITAN III-H. Marcar sobre la placa de acetato de celulosa el punto de aplicación.. Empapar la placa en el Buffer por 5´ utilizando unclavijero de placas en una cubeta especial.

2. PREPARACION DE LA CAMARA ZIP-ZONE. Colocar 100ml del Buffer en los compartimientos externos de la cámara.. Humedecer 2 papeles en el Buffer y cubrir encimade cada soporte haciendo contacto con el buffer.

3. PREPARACION Y APLICACIÓN DE LA MUESTRA. Preparar un hemolizado de la muestra del paciente

a. Usando sangre totalb. Usando paquetes de glóbulos rojos

. Colocar 5ul del hemolizado y 5ul del controlHemo Helena en los pozos o ranuras especialesutilizando Micro dispensadores.. Sobre ella se coloca el Aplicador presionando unas 3 ò 4 veces con el TIC. Transferir la muestra cargada a la placa de Titáncolocando en la base de alineación CATHODE APLICATION presionando por una sola vez duranteunos 5 segundos.

4. ELECTROFORESIS:. Colocar la placa invertida en la cámara electroforètica. El tiempo de corrida será de 25´ a 350 voltios.

5. COLORACION:. Sacar la placa de la camara y colorear con PONCEAUpor 5´. . Desteñir por 3 veces con sol de ac. Acético glacial 5%en cada uno por 2´. .Deshidratar la placa en 2 sucesivas

lavadas con metanol absoluto por 2´ en cada lavada.. Colocar la placa en sol clarificante por 5 a 10´.. Secar las placas al calor a 56 oC por 10´.

6. EVALUACION DE LAS BANDAS DE HEMOGLOBINA

. Se procede a efectuar las lecturas empleando elDensitómetro para su cuantificación usando filtrode 525 nm haciendo la comparación con los controles correspondientes.

Resultados de la ElectroforesisNº Paciente Sexo A1 A2 F S C INTERPR

ETACION

1 M.O.M. F 59.20 - - 40.80 - Portador

2 R.M.J. M 61.10 - - 38.90 - Portador

3 G.A.R F 8.60 - 3.10 88.30 - Anemia Sickle Cell

4 A.CH.G. F 7.90 - 2.90 89.20 - AnemiaSickle Cell

5 S.CH.V F 8.10 - 3.40 88.50 - Anemia Sickle Cell

6 O.A.M. F 8.40 - 2.90 88.70 - Anemia Sickle Cell

7 D.Q.A. M 7.60 - 4.40 88.00 - Anemia Sickle Cell

8 J.M.P. M 100 - - - - Normal

9 E.P.L. F 100 - - - - Normal

HOMBRES

P D

MUJERES

P D

TOTAL

P D

MESTIZOS 3

1.8%

-

-

4

2.3%

1

0.6%

7

4.1%

1 = 8

0.6% 4.7%

NEGROS 16

25.4%

1

1.6%

15

23.8%

5

7.9%

31

49.1%

6 = 37

9.5% 58.6%

TOTAL 19 1 19 6 38 7

20

0.8%

25

1.0%

45

1.8%

DISTRIBUCION DE CASOS PORTADORES Y DREPANOCITOSIS POR SEXO Y RAZA

CONCLUSIONESDe la investigación de Hb-S Realizada en 2454 niños en edad escolar de la provincia de Chincha se ha llegado a las siguientes conclusiones:

1. Se encontró 45 casos con Hb-S pertenecientes a “Sickle Cell anemia”, que representa el 1,8% de positividad en la población investigada con unahemoglobina media de 10,23 g/dl

2. De los 45 casos, 7 tienen Hb-S,Hb-A y Hb-F y 38 solamente con Hb-S y Hb-A.

3. En mestizos de la provincia de Chincha se encontró un caso de Hb-S, Hb-A y Hb-F y 7 casos con Hb-S y Hb-Alo que corrobora que este trastorno no es exclusivo de la raza negra.