Mutaciones en proteínas de unión al telómero Mutaciones en la telomerasa Acortamiento del telómero

DESENCADENAN SIMILARES RESPUESTAS CELULARES:

Fusión cromosómicaArresto del ciclo celularApoptosis dependiente de p53

DISTINTOS MECANISMOS QUE PRODUCEN DISFUNCIÓN

TELOMÉRICA

TELOMERASA

Transcriptasa inversa que añade repeticiones teloméricas al final de los cromosomas para compensar la pérdida de secuencias que se produce durante la replicación del DNA.

Su ausencia provoca el acortamiento paulatino del telómero.

El progresivo acortamiento desencadena la pérdida de función telomérica.

CONSECUENCIAS DE LA

AUSENCIA DE TELOMERASAGenerar especies de ratones Knock out

telomerasa mTR -/-

ACORTAMIENTO DE LOS TELOMEROS

Blasco et al 1997

RATONES Knock out mTR -/-

Para generar ratones deficientes en la actividad de la telomerasa se delecionó la copia del gen ARN telomerasa (mTR) de la línea germinal.

Mediante Southern blot se determinó la presencia de una única copia del gen.

Para delecionar el gen mTR se construyó el plásmido pPNT-mTRΔ, el que reemplazó el gen mTR completo con un gen de resistencia a la neomicina.

Los ratones mTR-/- carecen de actividad detectable de la telomerasa aunque fueron viables por seis generaciones.

Gene Replacement and

Transgenic Animals

G1

G3

G6

•Telomeros normales

•Fenotipo WT

GENERACIONES DE RATONES mTR -/- (Gen de la telomerasa Knock out)

•Telomeros cortos

•Fenotipo WT

•Telomeros muy cortos

•Fusion de los extremos de los cromosomas

•Apoptosis de células germinales

•Alta tasa de infertilidad

AUSENCIA DE TELOMERASA

OBJETIVO GENERALOBJETIVO GENERAL Establecer si para la viabilidad celular y la

estabilidad cromosómica es determinante

el largo promedio de los telómeros

o el acortamiento crítico de los mismos

Apoptosis por una disminucion del

largo promedio de los telomeros

Apoptosis por un acortamiento crítico del

telomero de un cromosoma

PRIMER EXPERIMENTOPRIMER EXPERIMENTO

Los telómeros cortos inician la respuesta celular en mTR-/-

mTR -/- (G6)

TELOMEROS CORTOS

SIN TELOMERASA

mTR +/-

TELOMEROS LARGOS

CON TELOMERASA

mTR +/- (iF1)

CON TELOMERASA

mTR -/- (iF1)

SIN TELOMERASA

50 % TELOMEROS CORTOS

50% TELOMEROS LARGOS

2 NUEVAS GENERACIONES

Apoptosis testicularFusión de cromosomas en

metafase de leucocitos

Comparación de los fenotipos

Peso testicular.

WT mTR+/- : Con telomerasa. 100% telómeros largos “PARENTAL”

G3 mTR-/- : Sin telomerasa. 100% telómeros cortos

G6 mTR-/- : Sin telomerasa. 100% telómeros muy cortos “PARENTAL”

iF1 mTR-/- : Sin telomerasa. 50% telómeros cortos, 50% telómeros largos

iF1 mTR+/- : Con telomerasa. 50% telómeros cortos, 50% telómeros largos

G6 mTR-/- : Sin telomerasa. 100% telómeros muy cortos “PARENTAL”iF1 mTR-/- : Sin telomerasa. 50% telómeros cortos, 50% telómeros largos

WT mTR+/- : Con telomerasa. 100% telómeros largos “PARENTAL”G3 mTR-/- : Sin telomerasa. 100% telómeros cortos

iF1 mTR+/- : Con telomerasa. 50% telómeros cortos, 50% telómeros largos

CONCLUSIÓN CONCLUSIÓN

La presencia de telómeros cortos es suficiente para desencadenar una

respuesta celular

La adición de la telomerasarescata el fenotipo W-T

SEGUNDO EXPERIMENTOSEGUNDO EXPERIMENTO

¿EXISTE UNA ELONGACIÓN PREFERENCIAL DE LOS TELOMEROS

CORTOS POR LA TELOMERASA EN RATONES mTR +/- (iF1)?

Se realiza una comparación de la

distribución del largo de los telomeros

en cada genotipo.

WT mTR+/- , G3 mTR-/- , G6 mTR-/- , F1 mTR-/- , F1 mTR+/-

Se utiliza la técnica de Q-Fish

( Quantitative Fluorescence in situ hybridization)

para medir la cantidad de repeticiones teloméricas en cada cromosoma.

Q FISH

El largo de los telómeros en cada genotipo está

representado como una distribución de frecuencia

de las intensidades de la señal (TFUs) expresadas

en unidades fluorescentes arbitrarias.

Es una técnica cuantitativa de hibridación in situ por fluorescencia

Desnaturalizan e hibridan con una sonda CCCTAA (secuencia telomérica) marcada radiactivamente

La intensidad de la fluorescencia en cada telómero es calculada desde una camara digital utilizando técnicas de análisis de imagen.

DISTRIBUCION DE FRECUENCIAS DE LOS TFUs

Se observó un cambio significativo en la longitud promedio de los

telomeros mTR +/- y los mTR -/- G3

Se observó una longitud promedio similar mTR+/- i(F1) y mTR-/- i(F1)

Pero si existen diferencias significativas en el numero de

repeticones teloméricas

CONCLUSIÓNCONCLUSIÓN La telomerasa restaura la función

telomérica en los mTR+/- i(F1) por adición de repeticiones sobre los

telómeros mas cortos

Y no por elongación global

SE INVESTIGA EN QUE FASE DEL DESARROLLO OCURRE LA RESTAURACION DE LOS TELOMEROS

Utilizan fibroblastos embrionarios (MEF) de ratones de cada genotipo para analizar:

A) Extremos libres de los cromosomas (son detectados por Q-FISH como falta de señal telomérica)

B) Fusión de los cromosomas

C) Viabilidad de los MEF expuestos a radiación ionizante

en todos los genotipos.

TERCER EXPERIMENTOTERCER EXPERIMENTO

MÉTODOMÉTODO

Toman 5 embriones de 13 días de cada genotipo

Analizan 20 metafases de MEF en cada uno de los embriones

Sacan el Nº promedio de extremos libres y de cromosomas fusionados para cada

genotipo

WT mTR+/+, G3 mTR-/-, G6 mTR-/-, F1 mTR-/-, F1mTR+/-

Análisis de las señales libres en los extremos cromosómicos

El número de extremos libres en MFEs mTR-/- iF1 es significantemente más elevado que en mTR+/- iF1

F1i mTR-/- muestra un promedio de 1.34 cromosomas sin repeticiones telomericas. F1i mTR+/- muestra solo un promedio de 0.02 cromosomas sin repeticiones.

EXTREMOS LIBRES EN LOS CROMOSOMAS (Q-FISH)

FUSIONES CROMOSOMICAS

Análisis Citogenético de

mTR+/- iF1 y de mTR-/- iF1.

mTR -/- iF1 presenta 0,27 cromosomas fusionados por metafase

mTR+/- iF1 no presenta extremos fusionados.

Del análisis de las señales libres en los extremos cromosómicos y citogenético llevado adelante en cepas de diferente edad para los genotipos mTR+/- iF1 y mTR-/- iF1 se puede concluir que la restauración de la función de los telómeros ocurre antes del día13,5 del desarrollo.

Método para estudiar la viabilidad de los MEF despues de exponerlos a radiación

ionizante

WT mTR+/+, G3 mTR-/-, G6 mTR-/-, F1 mTR-/-, F1 mTR+/-

Toman 3 embriones de cada genotipo

De cada embrion se obtienen 2 cultivos independientes de MEF

Sin Irradiar

Se expone a dosis crecientes de

radiación ionzante

Calculan el porcentaje de viabilidad

RESULTADO

Mientras que el WY, mTR-/-G3 y mTR+/- iF1 MFEs muestran niveles similares de daño en su crecimiento,

mTR -/- iF1 MFEs y mTR-/-G6 sufren una significativa reducción en la supervivencia celular

Existe una íntima relación entre la long de los telómeros y la sensibilidad a la RI. Los telómeros cortos presentan una

menor supervivencia frente a radiaciones ionizantes.

CONCLUSIÓNCONCLUSIÓN

La función de los telómeros ocurre

antes del día 13,5 del desarrollo.

Los telómeros cortos presentan una menor

supervivencia frente a radiaciones ionizantes

Distribución no al azar de fusiones cromosómicas

CUARTO EXPERIMENTOCUARTO EXPERIMENTO

Generan dos líneas independientes de ratones

Knock Out mTR -/-

LÍNEA 114 individuos

y se analizan 26 metafases de esplenocitos

LÍNEA 211 individuos

y examinan 54 metafases

LÍNEA 114 individuos

y se analizan 26 metafases de esplenocitos

1) Identificar especificamente los cromosomas que estan implicados en las fusiones ( SKY)

Línea 1: Cromosoma 19 fusionado en 12 de 14 ratones. No presentan señal telomerica 9/9.Cromosoma 5 fusionado en 10 de 14 ratones. No presentan señal 7/9 Cromosomas 3, 9, 10 e Y nunca estan fusionados.

CONCLUSIÓNCONCLUSIÓN

No hubo una fusión en particular que fuera vista en todas las metafases de un ratón

dado , indicando que las fusiones ocurrieron de novo y no fueron heredados de una

generación previa

Las fusiones son generalmente en los brazos p

En esta linea los cromosomas mas frecuentemente involucrados en fusiones son

el 19 y el 5

QUINTO EXPERIMENTOQUINTO EXPERIMENTO

Chromosomes Frequently Chromosomes Frequently Involved in Fusions Have the Involved in Fusions Have the

Shortest TelomeresShortest Telomeres

ObjetivoObjetivo: Determinar si la presencia de telómeros : Determinar si la presencia de telómeros cortos esta relacionado con los eventos de fusión cortos esta relacionado con los eventos de fusión

cromosómica.cromosómica.

Se analizan esplenocitos de ratones mTR-/- (sin telomerasa), Se analizan esplenocitos de ratones mTR-/- (sin telomerasa), de generaciones tardías G4-G6 (mayor frecuencia de de generaciones tardías G4-G6 (mayor frecuencia de fusiones)fusiones)

Cromosomas analizados mediante Cromosomas analizados mediante QFISHQFISH

Ratones Wild –Type analizados muestran una señal en Ratones Wild –Type analizados muestran una señal en cada extremo telomérico.cada extremo telomérico.

Ratones mTR-/- (G4-G6), muestran un número Ratones mTR-/- (G4-G6), muestran un número aumentado de cromosomas sin señal detectable. aumentado de cromosomas sin señal detectable.

Análisis de cromosomas mediante Análisis de cromosomas mediante SKY Fish (spectral karyotyping).SKY Fish (spectral karyotyping).

Utiliza combinación de 24 Utiliza combinación de 24 sondas coloreadas, y sondas coloreadas, y fluorocromos distinguibles fluorocromos distinguibles por espectro de color.por espectro de color.

Se obtienen diferentes Se obtienen diferentes combinaciones de color porcombinaciones de color por

La mezcla de diferenctes La mezcla de diferenctes fluorocromos.fluorocromos.

Asigna a cada cromosoma Asigna a cada cromosoma un color específico.un color específico.

En este caso identifica qué cromosoma En este caso identifica qué cromosoma perdió su señal teloméricaperdió su señal telomérica

ResultadosResultados

Cromosoma 19 perdió la señal telomérica en 9/9 Cromosoma 19 perdió la señal telomérica en 9/9 ratones examinados.ratones examinados.

Cromosoma 5 perdió su señal en 7/9 ratones Cromosoma 5 perdió su señal en 7/9 ratones examinados.examinados.

Análisis estadístico para establecer la aparente Análisis estadístico para establecer la aparente relación entre cromosomas sin señal de relación entre cromosomas sin señal de telómero y eventos de fusión.telómero y eventos de fusión.

(en comparacion con probabilidad de que cada (en comparacion con probabilidad de que cada cromosoma se involucre en evento de fusion al cromosoma se involucre en evento de fusion al azar).=azar).=cromosomas sin señal telomerica tienen cromosomas sin señal telomerica tienen mayor probabilidad de evento de fusión.mayor probabilidad de evento de fusión.

CONCLUSIÓNCONCLUSIÓN

Cromosomas con telómeros muy cortos Cromosomas con telómeros muy cortos

( que perdieron la señal telomérica), son los ( que perdieron la señal telomérica), son los más propensos a sufrir fusión.más propensos a sufrir fusión.

Análisis de las fusiones Análisis de las fusiones cromosómicas que causan cromosómicas que causan

disfunción telomérica.disfunción telomérica.

SEXTO EXPERIMENTOSEXTO EXPERIMENTO

Analizan la secuencia nucleotídica que comprende la fusion de los cromosomas

Clonaron y secuenciaron empalmes de fusión.

Realizan una PCR utilizando primers que hibridan con las secuencias de los minisatélites

Amplifican DNA de esplenocitos de ratones WT y mTR -/- (G5 y G6)

El ensayo en WT no genera producto

Se generan bandas específicas

Secuencian el producto de PCR

El amplicón está compuesto sólo por repeticiones

de los minisatélites

Utilizan Q-FISH dirigido a los minisatélites para determinar si todas

las fusiones se originaban por mecanismos similares

Secuencia amplificada por PCR

Analizan 30 metafases de 2 ratones

ConclusionesConclusiones Las fusiones se producen directamente en los Las fusiones se producen directamente en los

minisatélites mediante mecanismos NHEJ (non-minisatélites mediante mecanismos NHEJ (non-homologous end joining).homologous end joining).

Las fusiones no contienen repeticiones Las fusiones no contienen repeticiones teloméricas.teloméricas.

Todas las fusiones mostraron una disminución Todas las fusiones mostraron una disminución en la intensidad de la señal en relación al valor en la intensidad de la señal en relación al valor promedio del total de las señales normales promedio del total de las señales normales (Rango= 2,5%-55%).(Rango= 2,5%-55%).

El promedio de disminución de la señal fue del El promedio de disminución de la señal fue del 21%.21%.

Esta pérdida de secuencias en los minisatélites Esta pérdida de secuencias en los minisatélites sugiere la ausencia de regiones teloméricas en sugiere la ausencia de regiones teloméricas en estas uniones.estas uniones.

SÉPTIMO EXPERIMENTOSÉPTIMO EXPERIMENTO

UNA LÍNEA (LÍNEA 2) M TR -/- INDEPENDIENTE TIENE DISTINTOS CROMOSOMAS CON TELÓMEROS CORTOS Y DIFERENTES

CROMOSOMAS FUSIONADOS.

ObjetivoObservar si el evento fundador de un clon, contribuye con la distribución no al azar de telómeros cortos

(C) Frecuencia de fusiones en cada cromosoma de la línea 2 de ratones. (SKY)(D) Frecuencia de señal de extremos de cromosomas libres en cada cromosoma de la línea 2 (Q-FISH)

Visualizamos la distribución no al azar de fusiones y se observa que: Los cromosomas fusionados eran más frecuentemente los que tenían telómeros cortos, sin embargo, la identidad de éstos era distinta a los de la línea 1 de ratones.

No existe ningún cromosoma en particular que presente los telómeros mas cortos o mas

largos en los ratones examinados

CONCLUSIÓNCONCLUSIÓN

OCTAVO EXPERIMENTOOCTAVO EXPERIMENTO

¿EL LARGO TELOMÉRICO EN RATONE W-T

ES CARACTERISTICO DE CADA

CROMOSOMA?

Este análisis pretende establecer si alguna distribución telomérica es significativamente

mas corto o mas larga que las otras distribuciones teloméricas

OBJETIVO

Determinar la distribución del largo de los telómeros en cada cromosoma de ratones W-

T utilizando la técnica de SKY y Q Fish.

Los datos son analizados por un método estadísitco

METODO

Toman 5 ratones Wild Type

Analizan 20 metafases de esplenocitos de cada ratón

Cuantifican el largo de los telómeros por Q-FISH e identifican a cada cromosoma por SKY

Es determinada la distribución del largo de los telómeros para cada cromosoma

La distribución del largo de los telómeros en cada brazo del cromosoma fue comparado con la distribución de todos los otros brazos de los cromosomas en cada ratón

No hay ningún cromosoma en particular que tenga una distribución de longitudes de telómeros más cortos o más largos en ratones WT.

C) Tabla final de todos los resultados

obtenidos por el test estadístico

Wilcoxan rank sum

De los 5 ratones nombrados como

A, B, C, D y E.

• Los círculos azules representan

los telómeros significativamente más largos

• Los puntos rojos, los significativamente más

cortos.

• Los asteríscos representan los largos de los

telómeros que fueron solo escasamente

significativos

• Un acortamiento crítico de los telómeros en un cromosoma es necesario y suficiente para producir los fenotipos vistos en las

generaciones tardías de los ratones mTR -/-

• Solo los cromosomas con telomeros cortos son los que están implicados en las fusiones .

• La reintroducción de la telomerasa restauró las repeticiones teloméricas en los cromosomas con telómeros cortos de los ratones

mTR +/- (F1).

• El rol de la telomerasa no es mantener el largo promedio de los telómeros sino el de mantener la función telomérica en los

cromosomas que presenten telómeros cortos.

CONCLUSIÓNCONCLUSIÓN

CONCLUSIONES FINALES • Un acortamiento crítico de los telómeros en un cromosoma es necesario y suficiente para producir los fenotipos vistos en las generaciones tardías de los ratones mTR -/-

•Solo los cromosomas con telómeros cortos son los que están implicados en las fusiones .

• La reintroducción de la telomerasa restauró las repeticiones teloméricas en los cromosomas con telómeros cortos de los ratones mTR +/- (iF1).

• El rol de la telomerasa no es mantener el largo promedio de los telómeros sino el de mantener la función telomérica en los cromosomas que presenten telómeros cortos.

• Dos cromosomas disfuncionales pueden sufrir degradación transitoria de sus extremos seguida de fusión cromosómica por mecanismos de NHEJ en regiones minisatelitales.

Línea 1: Cromosoma 19 fusionado en 12 de 14 ratones. No presentan señal telomerica 9/9.Cromosoma 5 fusionado en 10 de 14 ratones. No presentan señal 7/9 Cromosomas 3, 9, 10 e Y nunca estan fusionados.Línea 2: Cromosoma 6 fusionado en 6 de 14 ratones. Cromosoma 19 fusionado en 3 de 14 ratones. Cromosoma 5 no presenta fusión.

LÍNEA 114 individuos

y se analizan 26 metafases de esplainocitos

LÍNEA 211 individuos

y examinan 54 metafases

1) Identificar especificamente los cromosomas que estan implicados en las fusiones ( SKY)

2) Analizar si la presencia de telomeros cortos está correlacionada con la fusión de los cromosomas (Q-FISH)

Metafase analizada por la técnica SKY

Metafase analizada por la técnica DAPI

Identificacion de cromosomas fusionados

Metafase analizada por la tecnica Q-FISH

Metafase analizada por la tecnica SKY

Identificación de cromosomas con extremos libres

Pérdida de la señal teloméricaControl: analizan un Wild Type y

ven que muestra una señal en cada extremo del cromosoma

Observación: Las mTR -/- van incrementando el Nº de

cromosomas que no presentan señal en sus extremos al

incrementar las generaciones.Los cromosomas implicados en

fusiones presentan frecuentemente telomeros cortos

¿El largo de los telómeros en ratones Wild Type es característico de cada

cromosoma?

EXPERIMENTO CONTROLEXPERIMENTO CONTROL

Hipótesis: Cada cromosoma tiene una distribución del largo de los telómeros y en cada evento de fertilización se establece una

nueva distribución.

Este análisis establece si alguna distribución telomérica es significativamente más corta o más

larga que las otras distribuciones teloméricas

Determinan la distribución del largo de los telómeros en cada cromosoma de ratones Wild Type utilizando la técnica de SKY y Q-FISH. Los datos son

analizados por el metodo Wilcoxon´s Rank Sum (programa estadístico).

METODO

Toman 5 ratones Wild Type

Analizan 20 metafases de esplenocitos de cada ratón

Cuantifican el largo de los telómeros por Q-FISH e identifican a cada cromosoma por SKY

Es determinada la distribución del largo de los telómeros para cada cromosoma

La distribución del largo de los telómeros en cada brazo del cromosoma fue comparado con la distribución de todos los otros brazos de los cromosomas en cada ratón

La identidad de los cromosomas que carecen de señal telomérica se corresponde con la identidad

de los cromosomas implicados en fusiones

La identidad de los cromosomas difiere en las 2 líneas

Representa una distribución significativa de los telomeros mas largos

Representa una distribución significativa de los telomeros mas cortos

No existe ningun cromosoma en particular que presente los telómeros más cortos o más largos en los ratones

examinados.