DISCUSIÓN Y ELABORACION DE PROTOCOLOS SOBRE PREPARACION DE GENOTECAS

INTRODUCION.

Una genoteca (biblioteca génica) es una colección de clones de un microorganismo

huésped en el que se ha introducido (con un vector adecuado) todo el genoma del

organismo de interés. La genoteca genómica debe representar el genoma completo en

forma de fragmentos clonados, parcialmente solapados, de modo aleatorio y mantenidos

de forma estable.

Los pasos principales para producir una genoteca genómica son:

1. Digestión del ADN genómico del organismo de interés, con la finalidad de obtener

fragmentos aleatorios de tamaño medio adecuado a la capacidad del vector. Es

frecuente utilizar una enzima de restricción reconoce una secuencia de 4 pares de

bases (pb), como Sau3AI o de 6 pb como EcoRI, para hacer una digestión parcial del

ADN, controlando la dosis y el tiempo para que el tamaño medio de los fragmentos

este dentro del tamaño deseado (p. ej., 10 kb).

2. Se mezclan y ligan los fragmentos de ADN genómico del organismo de interés con un

vector digerido con la misma enzima de restricción. Se añade la ligasa de ADN, de

modo que cada trozo de ADN del organismo de interés se loga covalentemente con una

copia del vector. El resultado son miles de moléculas recombinantes, cada una consiste

en el vector unido a un trozo diferente del ADN genómico original.

3. Las moléculas recombinantes se introducen en un organismo o agente huésped: una

bacteria como E.coli, fagos, etc.

De este modo se logra la genoteca genómica y se dispone de miles de clones

independientes del huésped. Cada clon porta un vector recombinantes con un trozo de

ADN genómico del organismo de interés

A partir de la genoteca, se rastrean los clones que porten el AND con el gen o genes de

interés. Los métodos más frecuentes de identificación de clones recombinantes de

interés en una genoteca son: a) Hibridación del ADN usando alguna sonda marcada, b)

Rastreo inmunológico (uso de anticuerpos frente al producto de interés) y c) Rastreo o

selección de la actividad biológica de la proteína.

I. COMPETENCIAS.

1. Utilizar manuales para elaborar protocolos de preparación de genotecas

genómicas.

2. Propone protocolos para construcción de genotecas.

II. MATERIAL Y METODOS.

Materiales.

1. Catálogos de productos de Biología Molecular.

2. Papel y lápiz.

Procedimiento.

El siguiente protocolo ilustra la construcción de una genoteca:

1. Extracción del ADN genómico.

2. Digestión del ADN genómico.

3. Obtención de un vector de clonamiento bacteriano.

4. digestión del vector bacteriano con la enzima EcoRI.

5. Desfosforilación del vector.

6. Ligación de los fragmentos de ADN genómico con el vector digerido.

7. Transformación de las células huésped con el producto de la ligación.

8. Aislamiento de clones recombinantes.

9. Selección del clon o clones de interés. Uso de ondas marcadas.

DESARROLLAR

1. Utilice los catálogos de PROMEGA, NEW ENGLAND BIOLABS y FERMENTAS para obtener

la información referente a vectores de clonamiento, enzimas de restricción, ADN ligasas y

huéspedes bacterianos, entre otros.

2. elabore los protocolos pertinentes para construir genotecas genómicas de Deinococcus

radiodurans

Desinococcus radiodurans R1 genome is composed of two chromosomes (2,648,638 and

412,348 base pairs), a megaplasmid(177,466 base pairs), and a small plasmid (45,704

base pairs), yielding a total genome of 3,284,156 base pairs. D. radiodurans represents an

organism in which all systems for DNA repair, DNA damage export, dessication and

starvation recovery, and genetic redundancy are present in one cell.

Resolución.

1. Extracción del AND genómico.

Kit de Purificación de ADN Genómico

2. Digestión del ADN genómico.

10ug (1ug/µl) de ADN.

Volumen Rx 50ul.

BSA (1mg/ml).

EcoRI (10u/µl).

H2O ________________________________ 29µl.

Buffer E (10x) _________________________ 5µl.

BSA (1mg/ml) _________________________ 5µl.

ADN (cromosomal) (1ug/µl) _______________ 10µl.

Enzima EcoRI (10u/µl) ___________________1µl.

---------------------------------------------------------------------------------

Volumen final 50µl

Incubación: T° a 37°

Inactivación: T° a 65°C/20min.

Concentración final: 10ug/50µl = 0,2ug/µl

CINÉTICA DE DIGESTIÓN:

CADA 30min 60min 90min 120min 150min

50µl SACAR 10µl 10µl 10µl 10µl 10µl

Fragmentos

ALMACENAR A 0°C

3. Obtención de un vector de clonamiento bacteriano.

pUC 18_______ (0,5ug/µl) _____ 500ug

pGEM _________ 20ug liofilizado

Entonces para utilizar el vector

pGEM _____20ug agregarle 20µl de H2O 20ug/20µl = 1ug/µl

y 20ug agregarle 40µl de H2O 20ug/40µl = 0,5ug/µl

4. Digestión del vector bacteriano con la enzima EcoRI.

Digerir: 5 µg de ADN plasmidial

H2O ________________________________ 9,5µl.

Buffer (10x) ___________________________2,5µl.

BSA 10x (1mg/ml) ______________________2,5µl.

AND pGEM (0,5ug/µl) ___________________ 10µl

Enzima EcoRI (10u/µl) __________________ 0,5µl.

-------------------------------------------------------------------------------------

Volumen final 25µl.

Incubación 37°C por 4 horas

Inactivación 65°C por 20 minutos

Concentración final: 5ug ADN/25µl = 0,2ug/µl

5. Desfosforilación del vector.

Fosfatasa alcalina (CIAP) Calf Intestinal: size 1000u , concentración 1u/µl.

Componentes de la Reacción:

ADN vector digerido (0,2 µg/µl) ____________ 20µl.

Buffer CIAP 10x ________________________5µl.

CIAP (1u/µl) ___________________________1µl.

H2O _________________________________ 24µl.

---------------------------------------------------------------------------

Volumen final 50µl.

Incubación: 37°C por 30 min.

Inactivación: 85°C por 15 min.

Concentración final: 4ug/50µl = 0,08ug/µl.

6. ligación de los fragmentos de ADN genómico con el vector digerido.

ADN genómico (0,2ug/µl) __________________ 3.5µl.

ADN vector (0,08ug/µl) ____________________ 3µl.

Buffer 10x ______________________________ 1 µl.

AND T4 Ligasa (1-3u/µl)* ___________________ 2.5µl.

--------------------------------------------------------------------------

Volúmen final 10µl.

*(2u/µl) se le agrega 0,5µl demás para ya no medirlos de agua porque resultaría

muy difícil.

Trabajar la proporción:

Incubación: 4°C toda la noche.

Inactivación: 65°C /10 min.

SEGÚN CATÁLOGO FERMENTAS:

Para ligar 50 - 400 ng de mezcla use de 1-2u si se cortó con enzima que deja extremo

cohesivo (Sticky end) y 5u si corto con enzima que deja extremo romo (Blunt).

7. Transformación de células huésped con el producto de la ligación.

E. coli strain, bacterial strain JM109, usada para albergar a vectores de transformación de

pGEM.

E. coliJM109

Agitación 37°C/3horas

0,5 D.O. a 595 nm Centrifugar Eliminar el sobrenadante

(Fase logarítmica)

Pesar 0,55g de CaCl2 y adicionar 50 ml de agua fría

esterilizar por filtración.

6000rpm/10min.

1 HORA EN HIELO

PREPARACION DE CALDO L.B.:

Peptona (triptona) 1%

Extracto de levadura 0.5%

Nacl 1%

PREPARACION DE CALDO L.B.:

Peptona (triptona) 1%

Extracto de levadura 0.5%

Nacl 1%PREP. 50ML SOL. CACL2 0,1 M

Ca = 40 110g ______1L______1M

Cl = 70 11g _______1L______0,1M

110g X _________50ml

X = 0,55g

PREP. 50ML SOL. CACL2 0,1 M

Ca = 40 110g ______1L______1M

Cl = 70 11g _______1L______0,1M

110g X _________50ml

X = 0,55g

Colocar el Sedimento en Solución

de CaCl2

CENTRIFUGAR

QUTAMOS EL SOBRENADANTE

CONSERVAMOS EN HIELO

100µl

CONTROLES

50µl de células más 2 µl de Reacc. de ligacion.

(-) ADN (+) PLASMIDO CERRADO pUC

50µl de células

50µl de células

(-) (+)

Conservar en hielo 45 min.

41°C/90min.

SHOCK TERMICO

HIELO 2min.

Adicionar a los tubos 1ml de L.B. caldo

Incubar 37°C por 1 hora

6000rpm/10min.Sembrar por incorporación

el sedimento

8. aislamiento de clones recombinantes.

Sembrar en placa:

Agar L.B. + Amp. + X-Gal + IPTG (si viene con

represor)

Incubar a 37°C Por 24 Horas

(-) (+)

Agar L.B. + Amp. + X-Gal

Agar L.B. + Amp. + X-Gal

Picar la colonia con un mondadientes y picar en la nueva placa, se usa por ambos lados y se desecha.

COMPARAR

AGAR ALMIDÓN

37°C POR 24 HORAS

ADICIONAR LUGOL Y COMPARAR HALOS

GUARDAR LAS CEPAS

POSITIVAS EN AGAR

INCLINADO