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Inhibición enzimática y actividad antioxidante de polifenoles de frutilla nativa Chilena tras digestión in vitro
Samanta Thomas Valdés, MSc ,PhD
Escuela de Nutrición y Dietética
Universidad de Valparaíso, Valparaíso, Chile
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Declaración de Intereses: - No tengo ningún interés que declarar
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Introducción
Fragaria chiloensis spp. chiloensis f. patagonica
Elevado contenido de POLIFENOLES
Retamales et al (2005) HortScience, 40:1633–1634; Simirgiotis et al (2009) Food Chemistry, 113, 377–385
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Atribuciones de polifenoles
In
tr
od
uc
ció
n
Fotoreceptores
Agente antimicrobiano
Pigmentos
Repelentes
Anti-inflamatorio
Antioxidante
Inhibición enzimática
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Aguilera et al (2016) Phytochemistry Reviews, 15, 405–423.
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Biodisponibilidad y
procesos de metabolización
• Tamaño molecular
• Polimerización
• Glicosilación
• Solubilidad
• Conjugación con matriz alimentar
• Actividad enzimática
• Factores relacionados al indivíduo
• Microflora intestinal
• Otros
Métodos de digestión in vitro
Minekus et al (2014) Food & Function 5:1113-1124; Carbonell-Capella et al (2014) Comp Rev Food Sci Food Safety 13:155-171
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• Describir el perfil de compuestos fenólicos de la frutilla F. chiloensis spp. chiloensis f. patagonica tras la digestión in vitro
• Relacionar el perfil de fenólicos con su capacidad antioxidante in vitro y en modelo celular, y con inhibición enzimática
Objetivos
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Preparación de los extractos
Extracto PEE
Extracto Metanólico
Thomas-Valdés et al (2018) Food Res Int 105:10–18
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Simulación Intestinal
PEE
Fluido gátrico (30 min)
Ajuste del pH 4.5 con NaOH
Amiloglucosidasa
(30 min)
Centrifugado
(10 min)
Ajuste pH 6.9 con NaOH , α-
amilasa
(45 min)
Sobrenadante mantenido a -80 oC para demás analisis
Fluido intestinal (30 min)
Adición de lipasa y extracto biliar
(pH 7.5) (30 min)
Centrifugado
(10 min)
Sobrenadante mantenido a -80 oC
para demás analisis
Minekus et al (2014) Food & Function 5:1113-1124; USP 23-NF 18, 1995
Simulación Gástrica
Controles
1) Enzimas inactivadas
por temperatura
2) Estándares
Cianidina-3-hexosido,
(+)-Catequina, Ácido
clorogénico,
Ácido elágico
Quercetina-3-rutinosido
Digestión in vitro
Cartridge C18
Agitación constante, oscuridad, 37 oC
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Análisis de los extractos
Fenoles totales
Flavonoides totales
DPPH
FRAP
TEAC
Ánion superóxido
9 Simirgiotis & Schmeda-Hirschmann (2010) J Food Comp Anal
23:545; Simirgiotis et al (2013) Food Chem 139:289
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Inhibición enzimática
α-glucosidasa: p-nitrofenil-D-glucopiranosido
• Costamagna et al (2016) Food Chem 190: 392
α-amilasa: almidón
• Tan et al (2017) Food Chem 214: 259
Lipasa pancreática: p-nitrofenil palmitato
•McDougall et al (2009) Food Chem. 115: 193
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Citotoxicidad
Células AGS confluentes PEE
0-500 μg/mL
Viabilidad
celular
Cheli & Baldi (2011) J Food Sci. 76:197 11
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Citoprotección
Células AGS confluentes
PEE
overnight
Agente agresor (H2O2)
Viabilidad celular
Cheli & Baldi (2011) J Food Sci. 76:197 12
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Perfil de compuestos fenólicos
Tiempo ACN 1% HCOOH
0 5 95
60 25 75
70 60 40
75 5 95
Bomba: LC-20AT pump
Columna: 100 RP 18-5 μ, 250 × 4.6 mm,25 °C
Flujo: 1mL/min
Vol. inyección: 20 μL
Espectros UV-vis: 200 to 600 nm
Espectro masa: m/z 150 - 2000 amu
Ionización: modo negativo
Gas nebulizador: Nitrogeno, 27.5 psi, 365 °C
Flujo: 8 L/min
Colisión: helio
Identificación tentativa: tR, espectro UV-visible y patrón MS/MS
fragmentación comparado a literatura o con estándares 13
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RESULTADOS Fenólicos y flavonoides totales
Muestras TP
(g GAE/kg muestra) % rec.
TF
(g CE/kg muestra) % rec.
PEE
PEE-ND 301.1 ± 14.0a 214.1 ± 9.0a
PEE-DG 290.8 ± 15.5b 96.6 84.7 ± 8.2b 39.6
PEE-DI 171.7 ± 16.0c 59.0 19.5 ± 0.3c 23.0
Control enzima inactivada temperatura
PEE-ND 301.1 ± 14.0a 214.1 ± 9.0a
PEE-DG 229.1 ± 20.6b 76.1 131.9 ± 3.8b 61.6
PEE-DI 87.8 ± 7.1c 38.3 81.3 ± 4.9c 61.6
ND: no digerido; DG: digestión gástrica; DI: digestión intestinal; PEE: extracto enriquecido en polifenoles
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Actividad Antioxidante In vitro
Muestras DPPH
(SC50 µg/mL)
FRAP
(mmol TE/kg muestra)
TEAC
(mM TE/kg muestra)
Ánion Superóxido
(SC50, µg/mL)
PEE
PEE-ND 5.27 ± 0.97a 2550.72 ± 21.68a 3692.62 ± 100.77a 13.11 ± 0.64a
PEE-DG 12.56 ± 1.16b 1400.11 ± 30.06b 2241.89 ± 67.30b 23.09 ± 1.10b
PEE-DI 17.11 ± 0.98c 1250.70 ± 6.88c 1570.77 ± 82.17c 47.23 ± 0.56c
Control enzima inactivada temperatura
PEE-ND 5.27 ± 0.97a 2550.72 ± 21.68a 3692.62 ± 100.77a -
PEE-DG 13.19 ± 0.35b 1594.16 ± 5.47b 1887.02 ± 90.45b -
PEE-DI 17.68 ± 1.03c 1476.40 ± 13.44c 1324.68 ± 37.38c -
ND: no digerido; DG: digestión gástrica; DI: digestión intestinal; PEE: extracto enriquecido en polifenoles
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RESULTADOS Citotoxicidad
Ru
bu
s g
eo
id
es
• Todos los extractos analizados no presentaron citotoxicidad contra células AGS, con
IC50 > 250 μg/mL
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RESULTADOS Citoprotección frente H2O2
Giampieri et al (2014) Food & Function, 5, 1939–1948
Avila et al (2017) Oxidative Medicine and Cellular Longevity
13p. 17
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RESULTADOS Inhibición enzimática
Muestras
α-Glucosidasa
(IC50 µg/mL)
α-Amilasa
(% inhibición en 100
µg/mL)
Lipasa pancreatica
(% inhibición a 50 µg/mL o
IC50)
PEE-ND 0.80 ± 0.06a Inactivo 41.36 ± 0.30a
PEE-DG 1.16 ± 0.02b Inactivo 30.09 ± 1.20b
PEE-DI 1.82 ± 0.08c Inactivo 4.30 ± 0.60c
Compuestos de referencia
Acarbosa 120.86 ± 1.99 28.48 ± 0.29 -
Orlistat - - 0.04 ± 0.00
ND: no digerido; DG: digestión gástrica; DI: digestión intestinal; PEE: extracto enriquecido en polifenoles
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RESUTADOS Estadística
Fenólicos totales Flavonoides totales
Coeficiente de Pearson p valor Coeficiente de Pearson p valor
DPPH -0.876 < 0.01 -0.723 < 0.05
FRAP 0.865 < 0.01 -0.543 > 0.05
TEAC 0.945 < 0.01 -0.748 < 0.05
Ánion Superóxido -0.798 < 0.05 -0.755 < 0.05
α-Glucosidasa -0.723 < 0.05 0.100 > 0.05
Lipasa pancreatica 0.817 < 0.01 -0.202 > 0.05
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Identificación tentativa compuestos fenólicos
300
600
600
PEE-ND
PEE-GD
PEE-ID
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Comp Rt (min) [M-H]- MS/MS Identificación tentativa PEE
ND DG DI
1 10.2-11.9 783.73 481.00, 300.76 Bis HHDP hexosido 1 X X X
2 15.3 783.13 481.10, 300.90 Bis HHDP hexosido2 X X X
3 17.5-17.6 783.44 480.91, 300.75 Bis HHDP hexosido 3 X X X
4 20.2-21.4 577.30 451.10, 425.18, 289.40 (epi)C-(epi)C dimero X X X
5 21.8 467.47 303.80, 285.80 DHQ hexosido X X X
6 23.6 288.77 244.79, 205.16 (epi)catequina X X X
7 24.2-24.5 483.90 270.89 Pelargonidina derivativo X X X
8 25.0-26.1 633.00 463.00, 300.87 HHDP galoil hexosido 1 X X X
9 26.9 599.32 435.95, 303.00 DHQ hexosido pentosido X X X
10 27.3 633.96 463.10, 300.78 HHDP galoil hexosido 2 X X X
11 28.3 451.15 286.80 Cianidina hexosido X X
12 32.5 449.05 284.77 K hexosido 1 X X X
13 33.1-33.9 635.64 465.14, 301.00 HHDP galoil hexosido 3 X X X
14 34.0 611.61 447.97, 284.91 K dihexosido X X X
15 35.1 594.82 462.90, 300.90 Ác. elagico pentosido hexosido X X X
16 35.8 432.69 268.76 Apigenina hexosido X X
17 38.5-38.6 464.91 300.68 Ác. elagico hexosido X X X
18 38.5-38.8 935.05 633.26, 301.39 Bis-HHDP galoil hexosido 1 X
19 38.9-39.0 633.84 464.91, 316.05 Miricetina rhamnosido derivativo X X X
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Comp Rt (min) [M-H]- MS/MS Identificación tentativa PEE
ND DG DI
20 39.8-40.9 935.46 633.30, 301.49 Bis-HHDP galoil hexosido 2 X
21 43.7 933.91 631.04, 450.92, 300.80 Bis-HHDP galoil hexosido 3 X X
22 44.9-45.0 435.46 302.89, 150.70 DHQ pentosido 1 X X X
23 46.7 433.38 300.61 Q pentosido 1 X X X
24 47.0 579.47 447.05, 301.00 Q pentoside rhamnoside X X X
25 47.5 435.79 302.85, 150.80 DHQ pentoside 2 X X X
26 48.3-48.7 448.91 300.03 Q rhamnoside X X X
27 48.7-49.0 625.13 300.77 Q dihexoside X
28 49.3-49.7 435.22 302.88 DHQ pentoside 3 X X X
29 49.7 463.31 300.80 Q hexoside X X X
30 49.9-50.4 477.25 300.84 Q glucuronide X X X
31 55.0 433.89 300.82 Q pentoside 2 X X X
32 55.8-56.1 449.08 284.79 K hexoside 2 X X X
33 56.3 448.82 314.86 Isorh pentoside X X X
34 61.2 491.30 284.82 K acetyl hexoside X X X
35 67.9-68.2 593.55 446.98, 284.83 K rhamnoside hexoside X X X
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Cambios en el perfil de compuestos fenólicos
Digestión gástrica Digestión intestinal
Bis-HHDP galoil hexosido 1 (18) Cianidina hexosido (11)
Bis-HHDP galoil hexosido 2 (20) Apigenina hexosido (16)
Q dihexosido (27) Bis-HHDP galoil hexosido 1 (18)
Bis-HHDP galoil hexosido 2 (20)
Bis-HHDP galoil hexosido 3 (21)
Q dihexosido (27)
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• El contenido de fenólicos y flavonoides totales, y actividad antioxidante in vitro antes de la digestión presentaron mayores concentraciones y actividad
• Los PEEs no presentaron efecto citoprotector significativo contra el estrés inducido por H2O2 en células AGS
• El efecto inhibidor contra enzimas digestivas relacionadas al síndrome metabólico (α-glucosidasa y lipasa) fueron mayores antes de la digestión. Para α-glucosidasa, todos los PEEs mostraron valores de IC50 menores que el inhibidor comercial acarbosa
• Un total de 35 compuestos fueron identificados tentativamente, tras la digestión simulada:
- DG 3 compuestos no fueron identificados: Bis HHDP galloil hexosido y quercetina dihexosido
- DI otros 3 compuestos no estaban hexosidos de cianidina, apigenina y Bis HHDP galloil
Conclusiones
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Agradecimientos
Instituto de Química de Recursos Naturales
Dr. Guillermo Schmeda
Dra. María del Pilar Caramantin Soriano
Sra. Irene Manríquez y Sr. Sergio Reyes
Alberto Burgos
Facultad de Ciencias de la Salud
Cristina Theoduloz
Dr. Felipe Jiménez
CONICYT
FONDECYT 1120096
Beca Doctoral 2013-63130042
Universidad de Valparaíso
Escuela de Nutrición y Dietética
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¡Muchas gracias!