REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)

Dr. Dante Flores

PCR

La reacción en cadena de la polimerasa es una técnica de biología molecular que permite la amplificación in vitro de una secuencia de DNA, al ser delimitada por un par de cebadores que la flanquean

PCR

Desarrollada pro el investigador Dr. Kary Mullis en 1983.

Permite el copiado in vitro de ADN y ADNc

RequerimientosMuestra, molde de DNA o cDNACebadores, iniciadores, primersDNApol termoestableIones metálicos cloruro de magnesio Desoxinucleotidos trifosfatoTampón y cloruro de potasio

Agua (grado biología molecular)

Agua libre de RNAsas y DNAsas

Provee el medio en el cual se llevaran a cabo las reacciones para la replicación del material genético

CATION DIVALENTE

Los iones de magnesio estimulas a la enzima , para incorporara los dNTPs ( actúa como un coofactor).

Desoxinucleotidos

Provee de nucleotidos a la reacción para la sintesis del DNA

Se incorpora a un DNA molde de manera complementaria.

Deben ser usados en concentraciones equivalentes para minimizar los errores

Tampón y Sales

Deberá tener un pH óptimo para que la enzima actúe. Tris HCl pH 8 .8,8

Las sales proporcionan la fuerza iónica adecuada para la actividad de la enzima . KCl menor a 50mM(Inhibición )

Deberá considerarse la Tm de hibridación.

Oligonucleotidos Iniciadores son secuencias cortas de 18 a 25

bases.Moléculas lineales con un grupo hidroxilo con

un extremo 3´Son secuencias complementarias al DNA

Enzima La Taq polimerasa fue aislada de la bacteria

Thermus aquaticus en 1976Es termoestable y actúa en la presencia de

iones de magnesio a temperaturas elevadas.Concentración recomendada de 1 a 2,5

unidades por 100 ul.

TERMOCICLADOR DE DNA

Equipo que controla en forma cíclica la temperatura para la amplificación del DNA es programable.

Etapas de la PCR

DESNATURALIZACIÓN

HIBRIDACIÓN

REPLICACIÓN

Desnaturalización

Las cadenas del DNA son separadas por calentamiento.

Consiste en llevar la reacción hasta temperaturas de 94 a 96 °C.

ALINEACIÓN

Se lleva a cabo por enfriamiento de la mezcla de reacción, después de la desnaturalización

Solo se establecen emparejamiento cuando la cadena concuerda con el complemento.

Extensión o elongación La Taq polimerasa se une al templado de

DNA y comienza la polimerización, a la temperatura optima de la enzima.

PCR

CRECIMIENTO EXPONENCIAL DE LA PCR

ANALISIS DE LA PCREl DNA clonado es colocado en un gel de

agarosa, para realizar el corrimiento electroforético y observar con luz ultravioleta.

Tinción El bromuro de etidio es un colorante

fluorescente que tiene la capacidad de intercalarse entre las bases nitrogenadas. Es un agente muta génico.

PCR

Diagnóstico de Enfermedades Hereditarias y

Cáncer Diagnóstico de Infecciones

Aislamiento de Genes

Investigación Forense

Aplicaciones de la PCR

Estudios de Evolución

Estudios de Identidad y Filiación

VENTAJAS

Rapidez en la obtención de resultados

Alta especificidadAlta sensibilidadAmplio rango de muestras

biológicas

DESVENTAJAS

Contaminación por arrastre de secuencias inespecíficas –falsos positivos

Inhibidores de la muestra – falsos negativos.

Electroforesis en gel de agarosa

100bp

200bp

300bp

MPM C-C+

MPM C-C+

LSSP - PCR

elevada cc de taq, 1 solo primer y baja Tº de annealing

RT- PCR

RNA Una sola hebra Sensible al calor

Transcripción Reversa antes de la PCR

a partir de una copia de la hebra de RNA

cDNA (DNA complementario) estable al calor resistir PCR

PCR MULTIPLEX

Muchas gracias Hasta pronto