TENDENCIAS EN TENDENCIAS EN

CITOMETRÍA DE FLUJOCITOMETRÍA DE FLUJO

TENDENCIAS EN CITOMETRÍA DE FLUJO

1. Cuantificación del número de moléculas por célula

2. Determinación de moléculas solubles

3. Enumeración celular

4. Nuevas formas de marcaje4.1 Marcaje de receptores con ligandos fluorescentes

4.2 Marcaje intracelular

4.3 Marcaje de proteínas totales

1) CUANTIFICACIÓN DEL

NÚMERO DE MOLÉCULAS

POR CÉLULA INDIVIDUAL

Cuantificación del número de moléculas por célula individual

• Cuantificación del número medio de

moléculas por célula

• La cantidad de antígeno que contiene cada

célula se expresa en ABC (antigen binding

capacity) o capacidad de unión antigénica

CUANTIFICACIÓN DE ABC

1.1) QUIFIKIT

1.2) RAINBOW BEADS

1.1) QUIFIKIT: FUNDAMENTO

• Micropartículas de calibración con cantidades determinadas de IgG unidas.

• Se emplea un segundo anticuerpo fluorescente anti-IgG. La fluorescencia por micropartícula es proporcional a la cantidad de IgG unida

• Se realiza una curva de calibración entre la intensidad media de fluorescencia frente a la capacidad de unión de anticuerpo (ABC)

PROTOCOLO DE MARCAJE

PROTOCOLO DE MARCAJE

QUIFIKIT

QUIFIKIT

REALIZACIÓN DE LA RECTA ESTÁNDAR

• Unión media bruta (ABC media bruta) relaciona la intensidad de fluorescencia con la capacidad de unión

• Se obtiene la formula de la recta que nos permitirá deducir la ABC media bruta de cada célula a partir de su intensidad de fluorescencia media

RECTA DE REGRESIÓN

log ABC (antigenicbinding capacity)

3 4 5 6

log

MF

I (m

ean

flu

ores

cen

ce in

ten

sity

)

0

1

2

3

4voltage 453 (r2=0.999)

voltage 463 (r2=0.999)

voltage 473 (r2=1)

voltage 483 (r2=0.999)

voltage 493 (r2=0.999)

1.2) RAINBOW BEADS

Micropartículas con número conocido de moléculas de fluorocromos unidos covalentemente

RAINBOW BEADS

Patrón Problema

RAINBOW BEADS

R5

R4

M1M2

M3M4M5

M6

M1M2M3M4M5M6

Marker Left, Right Events % Gated Mean CV Peak ChAll 1, 9910 12943 100.00 518.70 128.03 1826

M1 1512, 2350 2213 17.10 1826.46 1.80 1826M2 730, 1219 2164 16.72 871.87 2.58 873

M3 189, 359 2046 15.81 245.10 3.77 245M4 57, 129 2259 17.45 89.29 5.96 87

M5 24, 53 2115 16.34 34.50 8.71 34M6 1, 7 2140 16.53 1.66 38.55 1

Gate: G2 X Parameter: FL1-H FL1-Height (Log)

M1M2

M3M4M5M6

Marker Left, Right Events % Gated Mean CV Peak ChAll 1, 9910 12943 100.00 1107.52 133.97 4104

M1 3191, 5777 2213 17.10 4107.18 1.56 4104M2 1446, 2187 2165 16.73 1723.37 1.64 1730

M3 328, 667 2046 15.81 472.42 2.32 474M4 127, 281 2258 17.45 178.55 3.20 177

M5 42, 100 2116 16.35 62.57 4.23 63M6 1, 6 1674 12.93 1.81 30.19 1

Gate: G2 X Parameter: FL2-H FL2-Height (Log)

M1M2M3M4M5M6

Marker Left, Right Events % Gated Mean CV Peak Ch

All 1, 9910 12943 100.00 688.33 151.53 2890M1 2091, 4614 2213 17.10 2882.30 2.09 2890

M2 655, 1407 2165 16.73 885.87 2.96 897M3 124, 352 2048 15.82 189.72 5.41 191

M4 47, 107 2257 17.44 67.86 6.99 67M5 16, 47 2117 16.36 28.19 12.08 27

M6 1, 8 2081 16.08 2.58 33.76 2

Gate: G2 X Parameter: FL3-H FL3-Height (Log)

Marker Left, Right Events % Gated Mean CV Peak ChAll 1, 9910 12943 100.00 682.85 123.80 2371

M1 1778, 3995 2216 17.12 2362.49 3.27 2371M2 710, 1811 2172 16.78 1097.54 4.92 1094

M3 241, 599 2050 15.84 321.76 7.22 324M4 109, 241 2480 19.16 145.60 11.41 145

M5 47, 109 1896 14.65 81.83 12.68 82M6 1, 47 2140 16.53 20.57 22.46 21

Gate: G2 X Parameter: FL4-H FL4 (Log)

CÁLCULO DE LA DENSIDAD ANTIGÉNICA POR CÉLULA

• Asunción: el control negativo tiene cero moléculas del antígeno

Problema: emite fluorescencia inespecífica

• Hay que tener en cuenta el número de fluorocromos por anticuerpo

CÁLCULO DE LA DENSIDAD ANTIGÉNICA POR CÉLULA

• La capacidad de unión específica (ABC específica o neta) es igual a la cantidad de moléculas antigénicas expresadas por cada célula. Experimentalmente se determina como la ABC media para el anticuerpo específico menos la ABC media del control negativo

DIFERENCIACIÓN DE POBLACIONES EN BASE A UNA DETERMINADA MOLÉCULA

• En linfocitos CD4 activados disminuye la

intensidad de expresión del correceptor CD4. En

linfocitos CD8 activados aumenta la expresión del

correceptor CD8

• Activación TCR modulación de CD3

• La apoptosis reduce la expresión de determinados

antígenos de linaje

2) CUANTIFICACIÓN DE

CONCENTRACIONES DE

MOLÉCULAS SOLUBLES

FUNDAMENTO

El numero medio de moléculas de citocina capturadas por cada partícula se relaciona con la concentración de la citocina en el sobrenadante

PROTOCOLO

Incubación Lavado

Marcaje

Lavado

DETERMINACIÓN DE CITOCINAS SOLUBLES

Citocina

- +

Citocina

- +

SSC

CUANTIFICACIÓN DE CONCENTRACIONES DE MOLÉCULAS

SOLUBLES

• Más rápido y sensible que el ELISA. 90

min. Sensibilidad fentomolar: 10-15 M

• Multiparamétrico

3) ENUMERACIÓN CELULAR

ENUMERACIÓN CELULAR

- Los métodos anteriores proporcionaban una cifra relativa de las células que están proliferando

- Este método ratiométrico permite calcular el número absoluto de células con respecto a las que sembramos inicialmente

CULTIVOS CELULARES

Medio PHA

Células

Tras cultivoTras cultivo

R1

R2

BasalBasal

R2R2

R1R1R1R1

R2R2

R1R1

R2R2

CÉLULAS TCÉLULAS TCÉLULAS BCÉLULAS B

MICROPARTÍCULASMICROPARTÍCULAS

MuerteMuertecelularcelular

CrecimientoCrecimiento

ENUMERACIÓN CELULAR

ENUMERACIÓN CELULAR

Tras

Cultivo

Apoptosis

Crecimiento

CÁLCULO DEL NÚMERO ABSOLUTO DE CÉLULAS

N0 = concentración celular inicialNt = concentración celular a tiempo t

Nt = (Ratiot / Ratio0) * N0

Ratiot = (Célst / Partículast)

Ratio0 = (Céls0 / Partículas0)

t. Partículas = cte.

Nt = (Célst / Céls0) * N0

ENUMERACIÓN CELULAR

R1

R8

R1

R8

R1

R8

Células 2000Partículas 2000

= = 1

40002000

= 2

10002000

= 0.5

Crecimiento

Apoptosis

Basal

20002000

= 50.000 céls

1 50.000 céls2 x

x = 100.000 céls

=

1 50.000 céls0.5 x

x = 25.000 céls

=

FACTORES QUE INFLUYEN EN LA ENUMERACIÓN CELULAR

• Centrifugación

• Sedimentación de células y micropartículas

• Número de células y de micropartículas adquiridas

CENTRIFUGACIÓN CELULAR

Número de lavadosNúmero de lavados00 11 22 33

% d

e %

de

recu

per

ació

nre

cup

erac

ión

celu

lar

celu

lar

00

1010

2020

3030

4040

5050

6060

7070

8080

9090

100100

300 g300 g

200 g200 g

SEDIMENTACIÓN DE CÉLULAS Y MICROPARTÍCULAS

Ratio Céls/Micropartículas Ratio Céls/Micropartículas

0.00.0 .2.2 .4.4 .6.6 .8.8

1.Adquiridas 1.Adquiridas inmediatamenteinmediatamente

Tras 20 minutos:Tras 20 minutos:2. Adquirir2. Adquirir

3. Agitación manual.3. Agitación manual.

4. Vortex4. Vortex

*

*

NÚMERO DE CÉLULAS Y MICROPARTÍCULAS ADQUIRIDAS

Ratio células/partículasRatio células/partículas

0.10.1 11 101000

22

44

66

88

1010

1212

1414

100100

CV

del

rat

io

CV

del

rat

io

VALIDACIÓN DEL MÉTODO

• Precisión – Coeficiente de variación (CV)

• Sensibilidad– Límite de sensibilidad

• Exactitud– Linealidad

ESTUDIO DE LA PRECISIÓN Y DE LA SENSIBILIDAD

ContadoresContadorescelularescelulares

Células/ml x 10Células/ml x 10-3-311 1010 100100 10001000

CV

(%

)C

V (

%)

00

1010

2020

3030

4040

5050

6060

MicroscopíaMicroscopíaCitometríaCitometría

de flujode flujo

ESTUDIO DE LA EXACTITUD

ContadoresContadorescelularescelulares

Ratio céls/micropartRatio céls/micropart

00 22 44 66 88 101000

200200

400400

600600

800800

10001000

r= 0.9997r= 0.9997

Nº

abso

luto

de

célu

las

x 10

Nº

abso

luto

de

célu

las

x 10

-3-3

Nº medio deNº medio decélulas x 10células x 10-3-3

00 200200 400400 600600 800800 10001000

r= 0.9891r= 0.9891

Nº medio de célulasNº medio de célulaspor campopor campo

00 1010 2020 3030 4040 5050 6060 7070

r = 0.9956r = 0.9956

MicroscopíaMicroscopíaCitometríaCitometríaDe flujoDe flujo

ENUMERACIÓN DE CÉLULAS APOPTÓTICAS

• Las células apoptóticas se fragmentan en cuerpos apoptóticos

• Las células apoptóticas pierden la expresión de antígenos específicos de linaje.

FRAGMENTACIÓN CELULAR

Una célula apoptótica se fragmenta en varios cuerpos apoptóticos.¿Cuál es el límite en FSC entre las células apoptóticas y los cuerpos apoptóticos?

FRAGMENTACIÓN CELULAR

Aunque se pudiera precisar el límite, perdemos células ya fragmentadas que escapan del gate de análisis.

Per

mea

bil

idad

de

mem

bra

na

Tamaño celular

INCIDENCIA DE LA APOPTOSIS

PrevalenciaPrevalencia = = apoptóticas /apoptóticas /viablesviables+apoptóticas+apoptóticas = (1/5) = (1/5)

20% = prevalencia de la apoptosis20% = prevalencia de la apoptosis

Incidencia = (Incidencia = (apoptóticasapoptóticas + + fragmentadasfragmentadas+ + pérdidaAgpérdidaAg)) / / totaltotal = (6/10) = (6/10)

60% = incidencia de la apoptosis 60% = incidencia de la apoptosis

INCIDENCIA DE LA APOPTOSIS

(1/10) = 10 % prevalencia (1/10) = 10 % prevalencia

Incidencia = (1/10) 10%

APOPTOSIS TEMPRANA

(4/9) = 44% prevalencia (4/9) = 44% prevalencia

Incidencia (5/10) = 50%

(1/5) =(1/5) =

20 % prevalencia20 % prevalencia

Cuerpos apoptóticosCuerpos apoptóticos

Fragmentacióncelular

Incidencia = 60%

APOPTOSIS TARDÍA

IMPACTO DE LA FRAGMENTACIÓN CELULAR EN LA MEDIDA DE LA APOPTOSIS

Hours of culture

0 6 12 18 24

% o

f Apo

ptot

ic c

ells

0

10

20

30

40

50

60

70 Apoptosis incidence Apoptosis prevalence

0 hours0 hours

24 hours24 hours

6 hours6 hours

PÉRDIDA DE ANTÍGENOS PÉRDIDA DE ANTÍGENOS ESPECÍFICOS DE LINAJE (AEL)ESPECÍFICOS DE LINAJE (AEL)

Si las células apoptóticas pierden su AEL, la prevalencia de la apoptosis en la población positiva será menor que su incidencia en la población original

APOPTOSIS INDUCIDA POR CICLOHEXIMIDA

CD3 CD8 CD4 CD190

20

40

60

80

100

AI TOTAL AI HIGH AI MED AI LOW

Por

cen

taje

de

célu

las

apop

tóti

cas

ALLBRIGHT

DIMNEG

AEL

MFI061

MFI004

MFI015

Células Células viablesviables

ApotóticasApotóticastempranastempranas

ApoptóticasApoptóticastardíastardías

ApoptóticasApoptóticasintermediasintermedias

CD19 on B-CLL leukemic cells

MFI131

Estudio de la expresión de AEL en células en Estudio de la expresión de AEL en células en diferentes estadios de la apoptosisdiferentes estadios de la apoptosis

Viablecells

EarlyApoptotic

IntermediateApoptotic

LateApoptotic

MF

I

20

40

60

80

100

120

140

ESTADIO DE LA APOPTOSIS

PÉRDIDA DE LA INTENSIDAD MEDIA DE FLUORESCENCIA DE ANTÍGENO ESPECÍFICO DE LINAJE (CD19)

POR CÉLULA INDIVIDUAL

CD8

Stage of apoptosis

Viable EA IA LA

MF

I

0

100

200

300

400

500CD56

Stage of apoptosis

Viable EA IA LA

MF

I0

50

100

150

200

250

300

PÉRDIDA DE LA INTENSIDAD MEDIA DE FLUORESCENCIA DE ANTÍGENO ESPECÍFICO DE LINAJE (CD8 Y CD56)

POR CÉLULA INDIVIDUAL

Stage of apoptosis Stage of apoptosisCD3

Stage of apoptosis

Viable EA IA LA

MF

I

0

100

200

300

400

500

600CD5

Stage of apoptosis

Viable EA IA LA

MF

I

0

50

100

150

200

PÉRDIDA DE LA INTENSIDAD MEDIA DE FLUORESCENCIA DE ANTÍGENO ESPECÍFICO DE LINAJE (CD3 Y CD5)

POR CÉLULA INDIVIDUAL

Antígeno específico de linaje

CD5 CD3 CD8 CD19 CD56

% P

érd

ida

de

an

tíg

en

o (

Via

ble

s-E

A)

0

20

40

60

80

100

PORCENTAJE DE PÉRDIDA DE AEL ENTRE LAS CÉLULAS VIABLES Y LAS APOPTÓTICAS TEMPRANAS (EA)

REPERCUSIÓN EN LA INCIDENCIA DE LA REPERCUSIÓN EN LA INCIDENCIA DE LA APOPTOSIS DE LA FRAGMENTACIÓN APOPTOSIS DE LA FRAGMENTACIÓN

CELULAR Y DE LA PÉRDIDA ANTIGÉNICACELULAR Y DE LA PÉRDIDA ANTIGÉNICA

APOPTÓTICAS + NEGATIVAS + FRAGMENTADAS___________________________________________________________

VIABLES + APOPTÓTICAS + NEGATIVAS + FRAGMENTADAS

≤≤

AIAPOPTÓTICAS

VIABLES + APOPTÓTICAS

_________________________________=

REPERCUSIÓN EN LA INCIDENCIA DE LA REPERCUSIÓN EN LA INCIDENCIA DE LA APOPTOSIS DE LA FRAGMENTACIÓN APOPTOSIS DE LA FRAGMENTACIÓN

CELULAR Y DE LA PÉRDIDA ANTIGÉNICACELULAR Y DE LA PÉRDIDA ANTIGÉNICA

APOPTÓTICAS

VIABLES + APOPTÓTICAS

APOPTÓTICAS + NEGATIVAS + FRAGMENTADAS

VIABLES + APOPTÓTICAS + NEGATIVAS + FRAGMENTADAS

≤≤

2

6 + 2

2 + 1 + 3

6 + 2+ 1 + 3= 0.25 = 0.5<<

AR vs. AI

Subpoblación linfocitariaCD19CD19 CD56CD56 CD8CD8 CD4CD4 CD3CD3

% d

e cé

lula

s ap

optó

tica

s

0

20

40

60

80

100AI

AR

4) NUEVOS MÉTODOS DE

MARCAJE

4) NUEVOS MÉTODOS DE MARCAJE

4.1 Marcaje de receptores con ligandos fluorescentes

4.2 Marcajes intracelulares

4.3 Marcajes de proteínas totales

4.1) MARCAJE DE

RECEPTORES CON LIGANDOS

FLUORESCENTES

4.1) MARCAJE DE RECEPTORES CON LIGANDOS FLUORESCENTES

• Estudio de receptores con ligandos solubles (citocinas, factores de crecimiento). Para medir la capacidad de unión de ligando por célula individual.

• Se emplean ligandos marcados con moléculas fluorescentes

• Buffer de marcaje especiales optimas para unión del ligando a su receptor específico

4.1) MARCAJE DE RECEPTORES CON LIGANDOS FLUORESCENTES

Ligando-FITC

4.1) MARCAJE DE RECEPTORES CON LIGANDOS FLUORESCENTES

Ligando-FITC

Ligando

4.1) MARCAJE DE RECEPTORES CON LIGANDOS FLUORESCENTES

Ligando-FITC

Dominio de unión

4.1) MARCAJE DE RECEPTORES CON LIGANDOS FLUORESCENTES

Ligando-FITC

Unión inespecífica

4.2) MARCAJE DE MOLÉCULAS

INTRACELULARES

4.2) MARCAJE DE MOLÉCULAS INTRACELULARES

• Mitocondriales (Bcl-2, Apo-2) de gránulos de secreción (citocinas, perforinas, granzimas)

• Detección de receptores presentes en citoplasma pero no expresados en superficie

• Caracterización multiparamétrica de las células que producen las citocinas en poblaciones de células mononucleares

4.2) MARCAJE DE MOLÉCULAS INTRACELULARES

• Permite el estudio de gran número de células y realizar medidas estadísticamente significativas:– 10 → error = 33%

– 100 → error = 10%

– 10.000 → error=1%

• Aporta información sobre producción de citocinas por células individuales caracterizadas por inmunofenotipo

LIMITACIONES DE LAS TÉCNICAS DE MARCAJE INTRACELULAR• Sensibilidad limitada:

– cantidad mínima de citocina detectable en cada célula

– frecuencia mínima de células positivas discriminable del fondo

• Para marcar intracelularmente hay que matar las células

SENSIBILIDAD

SOLUCIONES CANTIDAD MÍNIMA DE CITOCINA DETECTABLE EN CADA CÉLULA

• Anticuerpos marcados con APC para aumentar la intensidad de fluorescencia media por célula

• Aumentar el número de fluorocromos por anticuerpo

• Inhibidores del transporte celular para aumentar las concentraciones intracelulares

FRECUENCIA DE CÉLULAS POSITIVAS DISCRIMINABLES

+S, -E -S, +E

AMPLIFICACIÓN ENZIMÁTICA DEL MARCAJE INTRACELULAR• Se marcan las células con anticuerpos conjugados

con peroxidasa de rábano (HRP)• La HRP produce radicales inestables tiramina

conjugados con biotina que se depositan alrededor del lugar de catálisis

• La adición de estreptavidina conjugada con HPR amplifica la señal

• Se incrementa 15 veces la relación señal-ruido

AMPLIFICACIÓN CATALÍTICA DEL MARCAJE INTRACELULAR (CARD)

Sustrato

Radical tiramina

Tiramina

+

Biotina

HPR

AMPLIFICACIÓN CATALÍTICA DEL MARCAJE INTRACELULAR (CARD)

Estreptavidina-HPR

+

EXPRESIÓN EN MEMBRANA DE CITOCINAS

• IL-10 e IFN se expresan en membrana plasmática en un número bajo de copias (<300 copias/membrana)

• Sistemas de amplificación– Liposomas magneto-fluorescentes 1 x 105

IL-10 2.3 34.8IFN 12.5 12.5

EXPRESIÓN EN MEMBRANA DE CITOCINAS

IL-10 2.3 34.8

IFN 12.5 12.5

EXPRESIÓN EN MEMBRANA DE CITOCINAS

IL-10 2.3 34.8

IFN 12.5 12.5

MARCAJE EXTRACELULAR CON ANTICUERPOS BIESPECÍFICOS

• Uso de anticuerpos biespecificos anti-CD45-anti-citocina para la captura de las citocinas producidas por células individuales

• Se pueden fabricar también con fragmentos Fab

MARCAJE EXTRACELULAR CON ANTICUERPOS BIESPECÍFICOS

CD45 Anti-citocina Citocina

MARCAJE EXTRACELULAR CON ANTICUERPOS BIESPECÍFICOS

• Permite la separación de las células viables productoras de una citocina determinada por FACS o por separación inmunomagnética

• Estas células se pueden analizar por otros métodos o cultivarse para obtener clones

4.3) MARCAJE DE PROTEÍNAS

TOTALES

RELACIÓN ENTRE LA PROLIFERACIÓN CELULAR Y LA APOPTOSIS

Proliferación

Todas se dividenuna vez

1 cél. apoptosis1 se divide 3 veces

½ apoptosis½ se dividen 2 veces

HISTORIAL DE DIVISIONES: CFSE

- Carboxifluorescein diacetato succinimidil ester (CFSE)

- Sonda fluorescente que se une a proteínas intracelulares

y que se reparte por igual entre las células hijas

HISTORIAL DE DIVISIONES: CFSE

HISTORIAL DE DIVISIONES: CFSECFSE

XX

Fluorescencia / célulaFluorescencia / célula

X / 2X / 2 X / 4X / 4

DespuésDespuésdel cultivodel cultivo

BasalBasal

M1

MARCAJE CON CFSE

CULTIVOS CELULARES

Medio PHA

Células

HISTORIAL DE DIVISIONES: CFSE

R2R3

No proliferantes

Proliferantes

HISTORIAL DE DIVISIONES: CFSE

PHA+IL-2

Nº de divisiones celulares

0 1 2 3 4

FS

C

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

500

550

600

HISTORIAL DE DIVISIONES: CFSE

Combinación con antígenos de superficie:

relación procesos de diferenciación con procesos

de proliferación

PHA

PHA +

IL-2

R2

R2

3% 59%

38%

3% 53%

44%

3 días de cultivo

PHA

PHA +

IL-2

R2

R2

23% 48%

29%

15% 48%

37%

5 días de cultivo

PHA

PHA+

IL-2

R2

R2

71% 19%

10%

37% 40%

23%

7 días de cultivo

MARCAJE CON CFSE

• Estudios in vivo

• Estudios ex vivo

• Estudios in vitro