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Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1996
IJIYIVERSIDAD DE ALICANTE
INSTITUTO DE NEUROCIENCIASDErARTAMBNToS DE NnuRoeuÍurcl y FrsrolocÍ¡,
ESTUDTo FIINCToNAL DE LA ct,rcopRorpÍNl-p(TRANSpoRTADoR nB uúr,TrpLES r¿huncos)TRANSPLAhITADA A ovocrros DB xenopus laeuis.
José Antonb Ferragut Rodrfguez
Andr6 Morales CatMn
TESIS DOCTORAL
Jordi Aleu Vilafta
Alicante, Junio 196.
Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1996
rNsrrruro oe uNrvEltstDAD DE AI-ICANTE.
NEURoCTENCÍAS 'fel.
96 / 565981 I Fa-\ 96 / 51)4 l i;1oE-030flo ALIcAN',rc
D. José Antonio Ferragut Rodríguez, Catedrático de Bioqqímica y Biología Molecular
de la Universidad de Alicante y D Andrés Morales Calderón. Profesor Titutar de
Fisiología de la Universidad de Alicante.
CERTIFICAN: Que el trabajo de investigación conducente a la obtención delgrado de Doctor titulado:
"Estudio funcional de la Glicoproteína-P (transportador de
múltiples fármacos) transplantada a ovocitos de Xenopus
Iaevis", del que es autor D. Jordi Alet¡ Vilalta" ha sidorediz¿do bajo su dirección en los Departamentos de
Neuroquímica y Fisiología de la Universidad de Alicante.
Para que conste y surta los efectos oportunos, firman el presente certificado en Alicante,
a29 de Abril de 1996.
: Jose Antonio Ferragut Rodríguez Fdo: Andrés Morales Calderón
Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1996
Fe no és esperar,
fe no és somniar.
Fe es penosa lluita per l'awi i pel dema.
Fe és un cop de falg
fe és donar Ia ma.
Ia fe no és uiure d'utt record passat.
I{o esperem el blat
sense haver sembrat,
no eq)eÍem que I'arbre doni fruits sense podar-lo,
I'hem de treballar,
I'hem d'anar regant,
encaÍa que I'osada ens faci maL.
Fragment de:. Cal que neixin flors a cada instant (üuís lJach).
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Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1996
Als meus pares
Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1996
AGRAIMENTS
En primer lloc vull expresar el meu agraiment al Dr. José Antonio Ferragut i
al Dr. Andrés Morales Calderón, directors d'aquesta Tesi Doctoral per I'ajuda
constant, I'ensenyanga, els consells i, sobretot la amistat. Sense ells no hauria estat
possible aquest treball.
De la mateixa manera, vull agrair en primer lloc la gran ajuda que he tingut en
tot moment dels meus companys de laboratori, des dels meus inicis amb Flori, Rosa i
Jaume fins avui en dia amb Isabel, Mavi, Beaúiz, María i Mariló, i la dels meus
companys del curs de doctorat i tota la gent que conforma els departaments deNeuroquímica i Fisiologia.
També vull agrair la col-laboració de la Dra. Carmen González i delDr.Valentín Ceña en la consecució del resultats de les mesures dels nivels de ATp enles cél-lules tumorals, i la dels Drs. Adolfo Campos i Javier Bauzá en els decitometria de fluix.
Un agraiment especial per al Jaume, per la Maite i per a tota la colla delbalneari, amb qui he compartit fabulosos Valldarques i nits inobtidables de disbauxa iavenfures, i per a tots els qui, d'una manera o una altra, m'han donat suport duranttots aquests anys.
Finalment, vull donar les grácies als meus pares, pel seu suport i per lapaciéncia que han tingut amb mi, i un record especial per als qui em van animar arealitzar aquesta tasca, tot i que avui ja no puc comptar amb la seva companyia(Grácies tatá i iaia).
Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1996
ABREVIATT]RAS
Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1996
Ahtcvínhttsc
'H-DNM: Daunomicina tritiada.
ABC: Familia de transportadores con sitio de unión de ATP.
ACh: Acetilcolina.
ADNc: Ácido desoxirribonucleíco complementario.
AMP: Adenosín monofosfato.
AMPq Adenosín monofosfato cíclico.
ARNc: Ácido ribonucleico complementarío.
ARNm: Ácido ribonucleico mensajero.
ATP: Adenosín trifosfato.
BSA: Albúmina sérica bovina.
CF"TR: Regulador Transmembrana de la Fibrosis Cística.
CIC-O: Canal de cloruro de Tbrpedo marmorata.
CHO: Células de Ovario de Hamster Chino.
DIDS: Ácido 4,4'-diisotiocianoestilbeno-2,2'-disulfónico.
DNM: Daunomicina.
DPBS: Tampón fosfato salino de Dulbecco.
EDTA: Ácido etilentriamino tetraacético.
fm: Fracción microsomal.
GTP: Guanosin trifosfato.
HBS: Tampón Hepes salino.
VV: Corriente/Voltaje.
IC5s: Concentración de fiírmaco que produce un 50Vo de la respuesta
máxima.
LL2IOz Línea celular linfocítica de ratón.
L1210/S: Sublínea parental sensible de la cepa Ll2t0.
Ll2l0l65z Sublínea derivada de las células L1210/S con fenotipo MDR, 65 veces
resistente al fármaco inductor DNM.
LL21:O1L60: Sublínea derivada de las células Ll2IOl65 con fenotipo MDR, 160
veces resistente al fármaco inductor DNM.
LDH: Enzima I¿ctato deshidrogenasa.
MDCK: Células Epiteliales de Hígado de Perro Madin-Darby.
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MDR: Resistencia a múltiples fiírmacos.
nAChR: Receptor nicotínico de acetilcolina.
NAI)-: Nucleótido de Nicotinamida y Adenina.
NAIIH: Nucleótido de Nicotinamida y Adenina Reducido.
NPPB¡ Ácido 5-nitro-2-(3-fenilpropilamino)-benzóico.
ORCC: Canales de cloruro que rectifican hacia afuera.
P-gp: Glicoproteína-P.
P1: Fracción insoluble obtenida tras la solubilización de la fracción
microsomal de las células L12101160 por Colato de sodio.
P388: Línea celular de neoplasma linfoíde
Pti88/S: Sublínea parental sensible de la cepa P388.
P388/20: Sublínea derivada de las células P388/S con fenotipo MDR, 20 veces
resistente al f,írmaco inductor DNM.
P388/100: Sublínea derivada de las células P388120 con fenotipo MDR, 100 veces
resistente al fármaco inductor DNM.
pHi: pH intracelular.
PMSF: Fluoruro de fenilmetanosulfonilo.
RH-45: Ringer de Rana hipotónico, 45 mM NaCl (95,5 mOsm).
RII-75: Ringer de Rana hipotónico 75 mM NaCl (150 mOsm).
RN: Ringer de Rana (224,5 mOsm).
RPMI 1640¿ Medio de cultivo celular Roswell Park Memorial Institute 1640.
RVD: Disminución regulada del volumen celular.
52: Fracción soluble resultante del tratamiento de la fracción Pl por
Zwittergent 3-12.
SDS-PAGE: Electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de dodecil sulfato
de sodio.
SDS: Dodecil sulfato de sodio.
SITS: Ácido 4-acetamido-4'-isotiocianoestilbeno-2.2'-disulfónico.
T¡o: Corriente de entrada de cloruro transitoria.
U.A.: Unidades arbitrarias.
YRP: Verapamil.
Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1996
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INDICE
Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1996
ín¡lioe
1- Características generales de la Glicoproteína-P. 15
2- Implicaciones clínicas. . . l7
2.1- Farmacología en MDR. 19
INTRODUCCION
3- Bstudios funcionales de Ia P-gp.
3. 1- Actividad ATP-ásica.
3.2- Actividad de transporte de f¿írmacos.
3.2.I- Modelos de la actividad transportadora de la P-gp. . . . .
3,3- Actividad de canal de ATP.
3.4- Actividad de canal de cloruro.
3.4.1- Canales de cloruro activados por hipotonicidad.
3.4.2- Actividad de la P-gp como canal. de cloruro activado
por volumen. . .
OB.IETWOS
MATERIAT,ES Y I\,TÉTODOS
I- Metodología referente a los cultivos celulares.
1.- Mantenimiento de los cultivos celulares.
2- Extracción de células procedentes de ratón.
3- Ensayos de viabilidad
4- Preparación de las disoluciones de DNM.
5- Ensayos de citotoxicidad. .
6- Ensayos de acumulación de DNM.
II- Metodologfa referente a la incorporación funcional de proteínas en la
membrana de los ovocitos de knopus laevis.
1- Extracción y aislamiento de la membrana celular que contiene la
proteína de estudio
1-l Obtención de membranas que contienen el nAChR.
2- Purificación de la proteína
2.1- Membranas enriquecidas en nAChR: Extracción alcalina. .
Pásl 4
2t
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Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1996
Ínüce
2.2- Purtficación del nAChR mediante cromatografía de afinidad 4l
2.3- Procedimiento de reconstitución. 42
2.4- Caracterización del nAChR purificado. 42
2.5- Determinación de proteína 43
3- Preparación de los ovocitos. . . 43
4- Microinyección. 44
5- Estudio funcional de la proteína insertada en la membrana del ovocito. 45
5.1-Registroselectrofisiológicos.. ". 46
5.2- Estudio de las corrientes activadas por acetilcolina. 49
5.3- Aplicaciones locales de acetilcolina. . 49
III- Metodologia referente al estudio funcional de la P,gp
1- Extracción y aislamiento de la membrana celular que contiene la P-gp
1.1- Obtención de la fracción microsomal
1.2- Determinación de proteína
1.3- Fraccíonamiento de proteína
1.4- Detección de la P-gp mediante Western-inmunotransferencia
2- Punftcación de la P-gp.
3- Estudio funcional de la P-gp insertada en la membrana del ovocito. .
3.1- Detección de la P-gp en la membrana de los ovocitos. . . . .
3.2- Medidas de actividad de hansporte de fármacos. . .
3.3- Medidas de osmolaridad.
3.4- Estudio de las corrientes activadas por hipotonicidad. . . . .
IV- Metodología ¡eferente al requerimiento energético de las células P388. . . .
1- Consumo de oxígeno. . .
2- Medidas de lactato
3- Medidas de ATP.
V- An¿flisis estadístrco.
CAPITUI,O I
¿PRESENTA LA P-gp ACTTVIDAD DE CANAL DE CLORURO?. . . . . .I- RESULTADOS.
1- Incorporación del nAChR en ovocitos de )bnopus laevis.
1.1- Respuesta nativa a ACh en ovocitos. . . .
1.2- Respuestas a ACh en ovocitos inyectados con membrana purificada
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Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1996
fndícc
procedente de Tbrpedo marmorata 65
1.2.1- Incorporación del nAChR en la membrana del ovocito. . . 65
I.2.2- Curso temporal de la incorporación del nAChR en la
membrana de los ovocitos. 66
1.3- Respuestas a ACh en ovocitos inyectados con el nAChR purificado
y reconstituido. . 67
1.3.1- Incorporación del nAChR en la membrana del ovocito. . . 68
I.3.2- Dependencia de la variedad de los donadores sobre la
respuesta de las muestras.
I.3.3- Dependencia del volumen de la muestra inyectada sobre la
amplitud de la corriente. .
t.3.4- Curso temporal de la incorporación del nAChR en la
membrana de los ovocitos.
1.3.5- Propiedades de1canal iónico asociado al nAChR.
1.3.5.1- Curva dosis-respuesta. .
t.3.5.2- Potencial de reversión. . . .
I . 3. 5. 3- Relación corriente-voltaje.
t.3.5.4- Desensibilización del nAChR.
69
69
70
72
72
73
74
75
t.3.6- I-ocalización de los nAChRs en la membrana del ovocito. 77
L.3.6.1- Distribución de los nAChRs en la membrana del
ovocito. 77
1.3.6.2- Orientación de los nAChRs en la membrana del
ovocito. 78
2- Punficación de la P-gp. 80
2.1- lL Etapa de purificación de la P-gp. 80
2.2- 2a Etapa de purificación de la P-gp. 83
2.3- Balance Global de las dos etapas de purificación de la P-gp. . . . . 85
3- Medidas de Funcionalidad de la P-gp 87
3.1- Incorporación de la P-gp en Ia membrana de ovocitos. . . . 87
3.2- Actividad de la P-g¡l como transportador de fármacos . . . 88
4- Corrientes iónicas evocadas por medio hipotónico 90
4.1- Corriente nativa activada por hipotonicidad. 90
4.1.2- Características de la corriente 91
4.L.3- Efecto de fármacos antitumorales sobre la corriente. . . . 94
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índiap
4.1.4- Efecto de la desfoliculación por colagenasa sobre Ia
corriente. 95
4.2- Cornentes en ovocitos inyectados con la P-gp. 97
4.2.1- Características de la corriente 99
4.2.2- Efecto del donador en la aparición de la corriente. . . . . . 101
II- DISCUSIÓN. IO2
1- Inco¡poraciín funcional de proteínas erl la membrana del ovocito 103
1.1- Incorporación del nAChR en la membrana del ovocito. 104
I.2- Cancterísticas funcionales del nAChR incorporado. . . . 1.07
2- Purificación de la P-gp. 1@
3- Incorporación funcional de la P-gp en la membrana del ovocito. 111
3. 1- Incorporación de la P-gp en la membrana del ovocito 111
3.2- Actividad de la P-gp como transportador de fármacos . . . 111
4- Actividad de la P-gp como canal de cloruro
4.1- Corriente nativa de los ovocitos activada por volumen. . . Tl4
4.2- Actividad de canal de cloruro de los ovocitos inyectados
con la P-gp. 116
CAPITTJLO tr
REQUERIMIENTOS ENERGÉTICOS DE LAS CÉLIJLAS P388.
I- RESULTADOS.
1- Requerimientos energéticos de las células P388 en condiciones basales.
2- Requerimientos energéticos de las células P388 en presencia de DNM
y/o VRP.
II- DISCUSIÓN.
l- Niveles energéticos de las células P388/S.
2- Niveles energéticos de las células P388/100.
3- Niveles energéticos de las células P388/20.
CONCLUSIONES.
APENDICES.I- Electrodo de Clark.
II- Ovocitos de Xenopus laevis.
t20
tzlt22
t23
t27
r28
r28
130
133
t36
t37
t39
1392.1- Generalidades.
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2.2- Morfología del folículo ovárico.
III- Receptor nicotínico de acetilcolina.
3.1- Descripción.
3.2- Aspectos funcionales.
IV- Principales propiedades de los detergentes empleados.
BTBLTOGRAIÍA.
l4l
r44
145t47
t49
150
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INTRODUCCION
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Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1996
Infroútcción
1- CARACTERÍSTICAS GENE,RALES DE LA GLICOPROTEÍNA-P.
F"rgura 1: Esquema de la Glicoproteína-P.(De Karher y Ling (3))
Se denomina con el nombre de
Glicoproteína-P (P-gp) a una familia de
fosfoglicoproteínas que se sobreexpresan en
la membrana plasmática de las células que
presentan el fenotipo de resistencia a
múltiples fármacos (MDR).
Estas proteínas fueron descubiertas en
t976 por Ling y cols. en la membrana
plasmática de las células de ovario de hamster
Chino (CHO) que presentan un alto nivel de
resistencia a fármacos (1, 2). [r pusieron el
nombre de Glicoproteína-P, en virfud a su
implicación con la barrera de Permeabilidad a
una amplia variedad de fármacos que
acompaña al fenotipo MDR.
I¿ estructura primaria de la P-gp se
obtuvo a partir de las secuencias completas de los ADNc de los genes que la codifican
(genes mdr). I"a primera publicación de las secuencias de los ADNc de los genes mdr
de ratón (4) y humano (5), condujo a proponer el modelo de la P-gp recogido en la
Figura 2 (6). Se trata de una proteína de 1280 amino¿ícidos, con 12 segmentos
transmembrana (según postula el modelo), constituyendo dos miades homólogas,
cada una de las cuales contiene seis regiones transmembrana y un laza
intracitoplasmático que codifica una zona de unión de ATP. Las secuencias de las dos
mitades de la proteína tienen entre sí un 43Vo de homología, si bien la falta de
homología en los lugares de los intrones (7), sugiere que cada una de las dos mitades
de la molécula ha evolucionado de forma independiente o que han desarrollado un
mayor movimiento de intrones después de un evento de duplicación (8). El hecho de
presentar en su estructura 12 segmentos transmembrana dificulta enormemente su
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Inlrnútrción
solubilización y es, junto a su condición de proteína minoritaria, causa de que aún no
haya podido ser purificada y reconstituida, a pesar de los enormes esfuerzos que los
diversos grupos de investigación esfín realizando para alcanzar este objetivo.
Figura 2: Modelo de la estructura de la P-gp basado en la secuencia de aminoácidos deducida a partir
del ADNc. I.os aminoácidos que son diferentes en las secuencias del gen humano y ratón están
representados en negro. Los sitios pot'enciales de gücosilación se señalan mediante espirales, y los sitios
de unión de ATP mediante círculos. (Adaptado de Gotüesman y Pastan (6))
I¿ P-gp pertenece a la superfamilia de los transportadores ABC, cuyas
iniciales provienen del inglés "ATP-binding-cassette", gus incluye una gran variedad
de transportadores de moléculas dependientes de ATP en procariotas y euc¿Iriotas.
Esta familia se caractÉrlza estructuralmente por ser un componente integral de
membrana con 10 ó 12 segmentos transmemb¡ana con estructura de cr-hélice y dos
regiones de unión de ATP (9). Dentro de esta gran familia de transportadores, se
encuentran el regulador de conductancia de la Fibrosis Cística (CFIR); la adenilato
ciclasa; transportadores bacterianos para azúcares, aminoácidos, peptidos, e iones
inorgrínicos (10); los transportadores Tap que transportan peptidos a través de la
membrana del retículo endoplasmático para la unión a moléculas MHC de clase I (11)
y una proteína de membrana en peroxisomas (12).
Desde el punto de vista funcional, son varias las observaciones experimentales
que apoyan el papel de la P-gp como transportador de eflujo activo de f,írmacos a
través de la membrana plasmática:
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Inhoútcción
i) Su localización en la propia membrana plasmática (requisito imprescindible
para poder ser una bomba celular).
ii) El an¡flisis mutacional demuestra que modificaciones en aminoácidos
específicos alteran la especificidad de unión de la P-gp a determinados fármacos (13,
14, 15) e inhiben la hidrólisis de ATP (fenómeno necesario para que exista actividad
de eflujo).
iiÍ) Frírmacos e inhibidores del eflujo se Lrnen mediante fotoafinidad a la P-gp
(16, 17) .
iv) Anticuerpos monoclonales anti-P-gp inhiben el eflujo de fármacos (18, 19,
20).
vl Vesículas de membrana plasmática de células MDR que expresan la P-gp
muestran un mayor nivel de transporte que aquellas procedentes de las membranas de
las células sensibles (21).
vil Ia prueba crucial y determinante de la P-gp como transportador de
fármacos, fue la demostración de que la sóla transfección de células con el gen mdr,
resultaba suficiente para conferir el fenotipo MDR (22, 23).
El hecho de que la P-gp sea el transportador responsabte del eflujo activo de
fármacos antitumorales en células MDR y por tanto de la mayoría de los fracasos en
el tratamiento por quimioterapia, indica el grado de importancia que tendría el
conocer los mecanismos de actuación de la P-gp para el diseño de nuevos fármacos
antitumorales que no fuesen reconocidos como sustratos por la bomba.
2. IMPLICACIONES CLÍMCAS.
El fracaso del tratamiento de diversos tumores por quimioterapia se debefundamentalmente a la presencia o desarrollo de resistencia celular a los fármacos
empleados. Existen dos tipos de resistencia: la intrínseca y la adquirida. Se habla deresistencia intrínseca cuando los tumores no responden inicialmente a la terapia con elfármaco o combinación de fármacos, y de resistencia adquirida cuando los tumoresque inicialmente eran susceptibles al tratamiento por quimioterapia, adquieren conposterioridad resistencia al fármaco inductor. Dentro de la resistencia adquirida, se
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presenta la resistencia celular a múltiples fármacos en el que las células tumoralespresentan resistencia cruzada a una gran variedad de agentes citotóxicos que no tienenuna estructura común. El fenómeno de MDR representa la mayor causa del fracaso dela curación del cáncer por quimioterapia. r,a búsqueda de las causas del fenotipoMDR ha ocupado la atención de numerosos grupos de investigadores en el campo delcáncer durante más de cuatro décadas.
A parrir de estudios molecula¡es realizados en el genoma de las células MDR,se observó la presencia de una pequeña familia de genes que codificaba la p-gp. Enhumanos, han sido identificados dos genes que codifican la p_gp: MDR1 (5) y MDR3(también denominado MDR2) (5,24,25); y en ratones tres: mdrl (o mdrlb), mdr3 (omdrla) y mdr2 (4, 26,27), siendo el producto del gen mdrl el objeto de estudio deesta Tesis.
un examen preliminar de más de 400 tipos de cánceres en humanosdemostraron una amplia expresión del gen MDR1 en los tumores con fenotiporesistente intúnseco o adquirido (28). Las P-gp codificadas por el gen humano MDR1o su coffespondiente en ratones, mdrl y mdr3, pueden transportar, desde el interiorde las células de mamífero al espacio extracelular, una gran variedad de fármacoshidrofóbicos (22,23,29,30). ra expresión intrínseca del gen MDR1 se encuenrra encánceres derivados de riñón, hígado, colon, páncreas y glándula adrenal (2g, 3r, 32,33, 34), üejidos que expresan de forma naturar el gen MDRI. Los niveres de ARNmdel gen MDRI también son elevados en tumores carcinoides y feocromocitomas, enleucemias agudas y crónicas en niños y adultos, linfomas del tipo no-Hodgkin,leucemia mieloide crónica en fase blástica, cáncer de pulmón de células no pequeñascon propiedades neuroendocrinas, neuroblastomas, sarcomas y astrocitom as (2g, 35,36, 37,39, 39, 40, 41., 42, 43, 44).
El incremento en la expresión del gen MDR1 es común en tumores tratadoscon quimioüerapia que han sufrido recaída durante el curso, o después del tratamiento.Ejemplo de ello lo constituye er cáncer de mama, cáncer de ovario, linfoma,leucemia, neuroblastoma, feocromocitoma, rabdomiosarcoma y mieloma múttipl e (2g,43' 44, 45, 46' 47, 48, 49, 50,51). En estos casos, se supone que un pequeñonúmero de células que expresaban MDRI al inicio de la terapia han sido seleccionadaspor el tratamiento y promueven la recaída, aunque también es posible que un efectodirecto del tratamiento hubiera inducido la expresión del gen MDRI.
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Inhnútcción
También se ha estudiado la distribución de la P-gp en diversos tejidos no
tumorales. Por ejemplo, mediante el empleo de anticuerpos monoclonales (52, 53, 54,
55), se han detectado niveles de P-gp procedente del gen MDR1 en la superficie
apical de células epiteliales en varios órganos secretores y en células endoteliales de
los capilares sanguíneos. Basado en estas zonas de localización de la P-gp en tejidos
de humanos y roedores, se ha propuesto que la principal función ñsiológica de la P-gp
procedente del gen MDR1 sea la defensa natural de las células frente a compuestos
xenobióticos. También se ha especulado con la posibilidad de que la P-gp esté
involucrada en el transporte de esteroides a través de la membrana plasmática (56, 57,
58, 59, 60, 61).
Las P-gp codificadas por el homólogo de MDR3 en ratón, mdr2, a diferencia
de las codificadas por MDRI, no presentan actividad de transporte de antineoplásicos
y recientemente se ha descubierto que esuín involucradas en el transporte de
fosfatidilcolina desde el hígado a la bilis (62).
2.1- FARMACOITOGÍA EN MDR.
El patrón usual de MDR incluye una gran variedad de agentes citotóxicos que
no tienen una estructura o una diana infracelular común. Existen docenas, y quizís
cientos, de productos hidrofóbicos naturales (derivados de plantas o microorganismos)
(63), anáJogos semisintéticos de tales productos natu¡ales y productos de síntesis
orgiínica (64) capac.es de inducir la aparición de MDR.
Entre los fármacos utilizados rutinariamente como agentes antitumorales,
destacan los pertenecientes a la familia de las antraciclinas. l¿s antraciclinas se
empz:rron a estudiar en los años 50 como antibióúcos pigmentados aislados a partir
de diferentes especies de hongos del género Streptomyces (65). Sin embargo, el uso
extensivo de antraciclinas como agentes antineoplásicos no comenzó hasta el
aislamiento de Daunomicina (DMvf) en 1963, procedente de dos especies de
Stteptomyces (5. coeroleorubidus y S. pucetius) (66). El descubrimiento de este
compuesto representó el comienzo del estudio de un nuevo tipo estructural dentro de
la familia de las antracicünas, ya que al confirmarse que tenía un efecto antineoplásico
potente, especialmente en el tratamiento de leucemias, condujo al desarrollo de
nuevos análogos semisintéticos. Asimismo, fue el desencadenante del estudio
T9
Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
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Infin¡hrcción
intensivo de los efectos biológicos de estos agentes en animales y humanos, en los que
se estudiaron los mecanismos de su acción en tejidos normales y malignos.
o o , o
ffi}'=, . . " ó 6 ¿ " i oaunor rc rnA
ñ= CX3
ADRI A I I IC INAR = C t t 2CH
. . oHCOOCH3
V l i lALAST l t tÁ R =CH¡v l t { C R l S T t t { A R : C H 3
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O-C{H¡tlo
R : C H 3 - V P - 1 6
"=4L vM-26
Bigura 3: Eskuchrra de algunos fármacos empleados en el tratamienüo de cáncer que conducen a la
adquisición del fenotipo MDR. (Corúesía de Clnaves (67))
El descubrimiento en 1982 por Tsuruo y cols. (68) de que el bloqueante de
canales de calcio verapamil (VRP), podía aumentar la üoxicidad de Vnca alcaloides en
células P388 resistentes, representa la primera de numerosas investigaciones cuyo
objetivo es el hallazgo de compuestos que sean capaces de revertir el fenotipo MDR.
Los quimiosensibilizadores descritos hasta el momento se pueden agrupar en seis
grandes categoías: Bloqueantes de canales de calcio; análogos de esteroides y
hormonas; análogos no citotóxicos de antraciclinas y Vnca alcaloides; compuestos
catiónicos hidrofóbicos, ciclosporinas y antagonistas de calmodulina.
Las distintas clases de fármacos con actividad quimiosensibilizadora parecen
actuar mediante diferentes mecanismos, pero comparten caracteísticas esfructurales
comunes. Los parámetros estructurales compartidos por diversos agenties reversores de
resistencia han sido estudiados en detalle pr T,amora y cols. (69).
c-oto
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Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
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Inhnútcción
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V E R A P A M I L
CH3COO
C H s
Figura 4: Estructuras moleculares de algunos de los fármacos más comrinmente usados como agentes
reversores de resistencia in vitro (Cortesía de Cánaves (67)).
3- ESTUDIOS FLINCIONALES DE LA P-gp
Las funciones adscritas a la P-gp son tres: Ia de transportador de fármacos
antineoplásicos, la de canal de ATP y la de canal de cloruro. P-gp constituye la
primera entidad molecular que supuestamente presenta función de transportador y de
canal. Esta bifuncionalidad hace incrementar más, si cabe, el interés científico de su
O C H 2 C H 2 N ( C H 3 l z
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C O O C H s
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21
Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1996
Intuvútcción
estudio, pero la asignación inequívoca de tal bifuncionalidad, así como su regulación,
requiere su purificación a homogeneidad y reconstitución funcional en sistemas
vesicula¡es apropiados. Hasta el momento se han utilizado diversas estrategias
encaminadas a la purificación de la P-gp, de entre las que destacan: la solubilización
parcial de P-gp por detergentes (70, 71, 72), inmunoprecipitación (73, 74), y uso de
distintos sistemas de purificación por cromatografía: de afinidad con lectinas (71, 75),
de intercambio iónico (71,76) y de inmunoafinidad (76,77).
Las distint¿s estrategias no han logrado la purificación a homogeneidad de la
P-gp, ya que cada una de ellas adolece de alguna limitación. Así, la solubilización por
detergentes implica purificaciones parciales de la P-gp. I-os métodos de
inmunoprecipitación conllevan la pérdida de la estructura espacial de la proteína con
la consiguiente alteración de la funcionalidad. I.os métodos cromatográficos de
afinidad con lectinas resultan de bajo rendimiento (75), mientras que las resinas de
intercambio iónico unen de manera casi irreversible a la P-gp, originando la
autoasociación de la misma (78).
El desarrollo de anticuerpos monoclonales específicos anti-P-gp (18, 79, 80,
81, 82, 83, 84, 85) ha abierto nuevas posibilidades de purificación de la proteína.
Asl, los métodos de inmunoafinidad estiín siendo desarrollados en cuanto ala ele¡;ción
de los detergentes a utilizar, disociación de la P-gp de los anticuerpos usados como
ligandos en cromatografía, etc.
Aunque aún no se ha conseguido la completa recnnstitución funcional de la
P-gp, si se ha conseguido cierto progreso en dos áreas: el estudio de la actividad
transportadora de f¿írmacos en vesículas aisladas y el estudio de su actividad
ATP-ásica.
3. 1- ACTMDAD ATP-ásica.
Poco después de la identificación de la P-gp, se descubrió que los inhibidores
metabólicos como cianuro de potasio, 2-4 dinitrofenol o azída de sodio,
incrementaban la acumulación intracelular de antineoplásicos (86), y dado que éstos
entran en las células por difusión pasiva, pareoía que la acción de los inhibidores
metabólicos implicaba un bloqueo del eflujo de los fármacos que era dependiente de
energía (87). Este hallazgo se consolidó con el clonaje de la P-gp confirmando la
, t
Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
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Intutútcción
existencia de dos lugares de unión de ATP en su estructura, además de presentar una
gran homología con la familia de proteínas transportadoras ABC (5, 88).
En 1988, Tsuruo y cols. (77) purificaron la P-gp mediante cromatografía de
inmunoafinidad empleando el anticuerpo monoclonal MRK-16 en presencia de1
detergente CHAPS y demostraron que dicha preparación presentaba trazas de
actividad ATP-ásica. l¿ actividad ATP-ásica de la P-gp se ha detectado
posteriormente mediante la sobreexpresión del producto del gen MDR1 en celulas de
insectos Sf9, presentando una alta actividad específica estimulada por la presencia de
f¿írmacos en la membrana plasmática (89, 90).
Recientemente, se ha demostrado la presencia de altos niveles de actividad
ATP-ásica en las fracciones que contienen la P-gp parcialmente purificada,
observiíndose que la presencia de ciertos sustratos de la bomba: daunomicina,
colchicina, progesterona, nifedipina, verapamil, eüc., producen un incremento de la
actividad ATP-ásica de las mismas (70,71,72).
3.2- ACTTVIDAD DE TRANSPORTE DE FÁRMACOS.
El transporte de fármacos antitumorales por la P-gp se ha demostrado,
mediante el empleo de vinblastina marcada con tritio, en vesículas de membrana
plasmática procedentes de células que sobreexpresan la P-gp (21, 91, 92). Se observóque el transporte no tenía lugar cuando las vesículas se preparaban a partir de las
membranas procedentes de células sensibles que no expresan la P-gp. Además, eltransporte dependía del constante suministro de una fuente de energía (o ATP, o un
sistema de regeneración de ATP o GTP) y era inhibido por agentes que revierten elfenotipo de MDR (verapamil, quinidina y diltiazen). Se pudo comprobar mediante
experimentos de fotomarcaje que estos reversores se unían a la P-gp, posiblemente
compartiendo el mismo sitio de unión que los fármacos antitumorales. En el caso deverapamil, los estudios realizados por Spoelstra y cols. sugieren que este fármaco
actúa como sustrato no competitivo de DNM para su transporte por la p-gp (93).
Estudios realizados en proteoliposomas que contienen la P-gp parcialmente
purifi.cada, han @ido demostrar conjuntamente la presencia de la actividadtransporiadora de fármacos y la actividad ATP-ásíca (72).
23
Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
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InAoútcción
3.2.1- Modelos de la actividad transportadora de la P-gp.
Se han propuesto varios modelos, todos especulativos, sobre los mecanismos
de acción de la actividad transportadora de la P-gp. Estos modelos, ilustrados en la
Figura 5, son: el "convencional" de bomba, el de aspiradora hidrofóbica, flipasa y el
de bomba de protones (6, 94).
El Modelo "convencionalr de bomba considera que los fármacos, vna vez
hubieran entrado en eI interior de la célula, se uniían a la porción citoplasmática de la
P-gp y serían expulsados al exterior celular a través de la P-gp mediante la hidrólisis
de ATP.
Este simple modelo presenta un problema conceptual: requiere que los
f¿írmacos citotóxicos se unan a la P-gp con mayor afinidad que a sus dianas
intracelulares. Este punto contrasta con el hecho de que estos fármacos han sido
seleccionados principalmente por su habilidad de unión a dianas intracelulares de
forma fuerte y selectiva (p.e. la citotoxicidad de colchicina y Vinca alcaloides es
como resultado de su fuerte unión a la tubulina). Además, puesto que la p-gp
reconoce un gran número de compuestos no relacionados entre sí que se unen a ella,
resulüa controvertido que su afinidad por cualquier compuesto individual sea muy alta.
El Modelo de aspiradora hidrofóbica, se basa en que los f¿írmacos seríandetectados y expulsados tan pronto como se hubieran incorporado a la membranaplasmática, explicando así el hecho de la disminucidn en la acumulación de f,írmacos
en el citosol. Este modelo se apoya fundamentalmente en:
i/ Datos cinéticos referentes al eflujo de fiírmacos (95, 96).
iilfa propiedad más importante de los fármacos a la hora de ser transportados
al exterior celular por la P-gp, es su índice de hidrofobicidad (69,97).
¡¡r) Rhodamina t23, una sonda fluorescente utilizada para marcar mitocondriasy que es un excelente sustrato para la P-gp (98), tiene diferenüe espectro de excitación
en células sensibles que en células resisüentes, siendo el espectro en las célulasresistentes más parecido al de la sonda en medio acuoso, sugiriendo que ésta ha sidoeüminada desde la membrana plasmática (99).
iu) l-a evidencia final de esüe modelo viene dada por la detección, mediante
experimentos de transferencia de energía, de la presencia de Adriamicina dentro de lasmembranas de las células sensibles, mientras que en las membranas de las célulasresistentes la antraciclina sólo se ha detectado asociada a la P-gp. Es decir, fármacos
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Inütútcción
como Adriamicina son eliminados directamente de la membrana plasmática por la
P-gp (100).
Modelo de flipasa. Según este modelo, una molécula de fármaco situada en la
capa interna de la membrana plasmática, se uniría a la P-gp y sería llevada a la capalipídica externa (donde difundiría al exterior celular) o directamente al espacio
extracelular por la P-gp, mediante un cambio conformacional de la proteína (101).
Bomba de protones. En este modelo, la hidrólisis de ATP estaría asociada al
transporte de H* al exterior de la célula a través del transportador, lo que conllevaría
un movimiento pasivo de iones Cl-. Estos iones arrastrarían moléculas de H2O a supaso a través de la P-gp y las expulsarían al exterior celular. Los fármacos anfipáticosque estuvieran dentro de la membrana se verían arrastrados con el movimiento de las
moléculas de H2O (6). El bombeo de H+ al exterior celular a través de la P-gpproduciría, además, un aumento en el pHi observado en determinadas células confenotipo MDR al exterior celular (102, 103).
lspacio Exbacehrlr
i Mry,_-h31,.,l=?;¡t-rizliii.iiiifi
Citoplesma
figura 5: Modelos de l¿ actividad hansportadora de la P-gp: A) Convencional de bomba, B) Aspiradorahidrofóbica, C) Flipasa y D) Bomba de proúones.
B
D
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Inl¡othrcción
3.3. ACTIVIDAD DE CANAL DE ATP.
En 1993, Abraham y cols. (104) observaron en las células CHO que
sobreexpresan la P-gp, la existencia de un transporte de ATP al exterior celular cuya
actividad em proporcional a la concentración de la P-gp en la membrana plasmática.
l,os autores especularon con la posibilidad de una función autocrina del ATP
extracelular que se uniría a receptores purinérgicos (105) y propusieron que los
movimientos de ATP observados dentro del retículo endoplasmático (106) y en
vesículas secretoras (107) podrían deberse a la P-gp.
3.4- ACTIVIDAD DE CANAL DE CLORURO.
3.4.1- C_anales de cloruro activados por hipotonicidad.
I-a mayoúa de las células, si no todas, responden con una disminución
regulada de su volumen (RVD) ante un incremento en el volumen celular producido
por su exposición a un medio hipotónico. Esta disminución de volumen suele ser
mediada por la salida de iones K+ y Cl- del citoplasma a través de canales específicos,
acompañados por un flujo de moléculas de HzO. los principales mecanismos
involucrados en RVD se muestran en la Figura 6 y son (108, 109):
i) Cornente producida por un flujo de iones K+ ylo Cl-.
Se han descrito canales de cloruro que se activan por hinchamiento celular en
una gran variedad de tipos celulares: linfocitos, células cromafines, neuroblastomas,
fibroblastos, células endoüeliales, ovocitos de &nopus, etc., y se caracterizan por su
inactivación a potenciales muy positivos ()+10 mV) y presentan una moderada
rectificación hacia afuera (110, 1 ll, ll2, ll3, 174, 11.5, 116).
En ovocitos de Xenopus laeüs, sistema celular experimental utilizado en el
desarrollo de la Tesis que se presenta, Ackerman y cols. (115) han descrito una
corriente de cloruro activada por hrpotonicidad denominada fcl-swe', que no depende
de voltaje, no es calcio dependiente y no es sensible a ácido niflúmico, y por tanto, es
claramenüe distinta a las corrienües de cloruro activadas por calcio y ala de los canales
mecanosensoriales no selectivos. [¿ corriente presenta una inactivación dependiente
de tiempo que se hace más evidente a despolarizaciones mayores de +30 mV, y que
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Inftoútcción
es sustancialmente acelerada con la disminución del pH extracelular. Presenüa una
dependencia extracelular de cloruro y se bloquea de forma reversible por dos
antagonistas de transporte aniónico no selectivos, SITS y DIDS, por un bloqueante
más selectivo de cloruro, NPPB, y es sensible a la presencia externa de cationes
lantánidos trivalentes y de nucleótidos.
ii) Cotransporte electricamente neutro de K+ y Ct-.
Este ha sido descrito en eritrocitos de varias especies, en células del tumor
ascítico de Ehrlich y en células epiteliales, y se caracteriza Wr el requerimiento
interdependiente de K* y Cl-, y porque su extrusión del citoplasma no altera de forma
detectable el potencial de membrana.
fii) Intercambio eléctricamente neutro de K+/H+ funcionalmente acoplado a
uno de C|/HCO3- produciendo una perdida de KCl sin cambio en el pH intracelular.
El intercambio de K*/H* acoplado a la regulación del volumen celular ha sido
estudiado extensivamente en eritrocitos de Amphiuma. El sistema es efe¡tivo siempreque exista en la célula sistemas que tamponen el pHi, tales como proteínas que fijan
H* o el intercambiador CI-/HCO"-.
Sistcma Conductivo
Sistcm¿s dc i¡fcrcanbio
Ftgura 6: Principales mecanismos implicados en la regulación de volumen (RVD). i) Corrientesproducidas por un flujo de K* y/o Cl, ii) Cotransporte electricamente neutro de K* y Cl- y iii)lntercasrbio electricamente neutro de K*/H* funcionalmente acoplado al intercambiador CI/HCOr'(Adaptado de Hoffinann y Simonsen (109).
Sistema de cotransporte
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Inhutú.tcción
3.4.2- Actividad de canal dq cloruro activado por volumen de la P-sp.
I-a P-gp y el CFTR son proteínas pertenecientes a la misma superfamilia de
transportadores ABC. Mediante la expresión del gen CFTR en sistemas heterólogos y
por mutaciones en la proteína que alteraban la selectividad iónica de esos canales
(117,I18, 119), se ha podido determinar que el CFIR presenta actividad de canal de
cloruro dependiente de AMPc. I¿ activación del canal requiere de la hidrólisis de
nucleótidos trifosfato en al menos uno de los dos sitios de unión de ATP de dicha
proteína (120). Recientemente, se ha descrito por Reisin y cols. (121) que CFTR
presenta; además de la actividad de canal de cloruro, una actividad de canal de ATP,
proponiendo que el transporte de ATP por CFTR podría facilitar la conductancia de
Cf de CFTR, la activación de la conductancia de los canales de cloruro con
rectiñcación hacia afuera (ORCC) (122) y posiblemente, la regulación de otros
canales iónicos, como el de sodio, cuya actividad está alterada en la fibrosis cística
(r23).I¿ P-gp y el CFTR tienen una similitud t¿nto en su estructura como en su
secuencia (124, t25), y presenüan patrones complementarios de expresión en varios
tejidos epiteliales (126). El CFTR, como miembro de la superfamilia ABC, se
caractenz.a estructuralmente, al igual que la P-gp, por poseer 12 segmentos
transmembnna y dos dominios que contienen las secuencias de unión de ATP, pero a
diferencia de P-gp, CFTR posee entre los dos grupos de segmentos transmembrana un
dominio R con varios sitios de fosforilación. Los genes de la P-gp y del CFTR en el
intestino poseen patrones de expresión complementarios, el gen CI¡'[R estií expresado
en células de las criptas mientras que el gen MDR1 estií expresado en células del
epitelio más diferenciadas como son el villi (126). Curiosamente, en células HT-29
que noffnalmente expresan CFIR, cuando se cultivan en presencia de Colchicina se
les induce la expresión de la P-gp y se reduce la correspondiente a CFTR (127).
Fundamentándose en estos hechos experimentales, surgió la hipotesis de que la
P-gp presentara actividad de canal de cloruro, y en 1992, apareció publicado en
Ilature el primer trabajo en el que se asocia a la P-gp con una acúvidad de canal de
cloruro reguladora de volumen celular. I-os autores, Valverde y cols. (128),
registraron una corriente de cloruro activada en medio hipotónico en fibroblastos
MH3T3 transfectados de forma permanente con el clon MDR-I humano, cuya
magnitud se reducía drásticamente mediante el bloqueo de la expresión de la P-gp por
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Inhtútcción
oligonucleótidos antisentido. Experimentos posteriores de transfección transitoria de la
P-gp con{irmaron los resultados anteriores, puesto que sólo se evocaba la corriente
activada por hipotonicidad en las células transfectadas. Por último, la farmacología de
la corriente era consistente con la observada para la P-gp: compuestos tales como
verapamil, didesoxoforscolina, nifedipina y quinidina, que inhiben el transporte de
fármacos a través de P-gp, también bloqueaban las corrientes de cloruro activadas por
volumen.
Posteriormente, Gill y cols. (129) propusieron un modelo bifuncional para la
P-gp, ba*índose en las siguientes observaciones experimentales:
i/ t¿ unión de ATP a la P-gp era suficiente para que se produjera actividad de
canal, mientras que el transporte de fármacos requería la hidrólisis de ATP por la
proteína.
ii) Ambas funciones, la de transportador y canal, se podían separar mediante
mutagénesis dirigida a los dominios de unión de ATP, donde la sustitución de un
residuo de lisina condujo a que la proteína perdiera su capacidad de hidrólisis de ATP,
generando una proteína que mantenía su actividad de canal de cloruro pero que había
perdido su actividad transportadora de fármacos.
iÍi) ta adición de sustratos de la P-gp en la pipea durante los registros
realizados en configuración de célula entera inhibían la activación del canal de
cloruro, revirtiéndose dicha inhibición mediante la empleo de anáiogos no
hidrolizables de ATP.
El modelo, ilustrado en la Figura 7, sugiere que una molécula de P-gp podría
funcionar, dependiendo de la osmolaridad del medio extracelular, como bomba
extrusora de fármacos o como canal, pero no simultáneamente. Acorde con el modelo
bomba-canal, la unión de sustrato conduciría a la molécula de P-gp a actuar como
bomba e inhibiría la activación del canal.
CHANNEHYPOIONIC¡IY
Pgp .ATP '
Figura 7: Esquema del modelo bifuncion¿l propues&o para la P-gp. (Ad¿ptado de Gill y cols. (129))
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OB.IETIVOS
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Obietiwts
Ler OB.IETIVO:
El primer y principal objetivo de esta Tesis es la dilucidación sobre la función
de canal de cloruro activado por hipotonicidad asignada a la P-gp. En el caso de que
la P-gp presente dicha actividad, se procederá a su estudio funcional, y se analizará el
efecto de bloqueantes de canales der.cloruro y sustratos de la bomba de P-gp sobre
dicha actividad.
JUSTIFICACIÓN
El hecho de que la P-gp pudiera presenüar actividad de canal de cloruro
ayudaría tanto a entender su papel fisiológico como al estudio de la regulación del
volumen celular, regulación de canales iónicos, mecanismos de MDR y al
conocimiento de una entidad molecular que presenta la doble función de canal y
transportador.
La asignación de la actividad de canal de cloruro a la P-gp se encuentra en la
actualidad muy controvertida ya que cuatro meses después de la asignación de dicha
actividad a la P-gp apareció publicado un trabajo realizado en células T84 en el que la
función transportadora de la P-gp era independiente de la regulación de volumen
celular (130), resultados que se contraponen a los descritos por Valverde y cols. (128)
y Gill y cols. (129).
DISENO EXPERIMENTAL
El estudio de la posible actividad de la P-gp como canal de cloruro se efectuará
empleando una metodología original que consiste en la incorporación funcional deproteínas en la membrana del ovocito. Esta metodología aporta la ventaja de poder
estudiar la protefna tal como fue sintetizada por la cétula origen, es decir, totalmente
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Obietivns
procesada, en un sistema, el de los ovocitos de &nopus laevis, que tantas ventajas ha
aportado al estudio de proteínas expresadas mediante la inyección de su
correspondiente ARNm o ADNc.
Ins principales aspectos a estudiar son los siguientes:
1- Validación de la nueva metodología utilizando una proteína de membrana
modelo, el receptor nicotínico de acetilcolina procedente de la electroplaea de Tbryedo
marmorata.
2- Aplicación de la misma al estudio funcional de Ia P-gp. Este apartado
conlleva la previa experimentación relativa a:
2.1- Purificación de la P-gp procedente de células tumorales.
2.2- Incnrpración y deúección de la P-gp en la membrana del ovocito
después de su inyección en el ovocito.
2.3- Actividad de transporte de la P-gp incorporada en la membrana del
ovocito.
2.4- Actividad de canal de cloruro activada por hipotonicidad de la
P-gp en los ovocitos que han incorporado la proteína.
2.5- Estudio y modulación de la actividad de canal de cloruro asociada
a la P-gp.
2O OBJETIVO:
El segundo objetivo propuesto consiste en la monitorización de los niveles
energéticos de las células que sobreexpresan la P-gp cuando éstas se incuban en
presencia de un fiírmaco antineoplásico.
JUSTIFICACIÓN
I-os datos bioquímicos, farmacológicos y estructurales indican que la P-gp
presenta una actividad extrusora de fármacos citotóxicos (13, 18, 21, 22). Sin
embargo, se desconoce el mecanismo exacto de eliminación de fármacos por la P-gp
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Obieüws
Y, Por tanto, la existencia de un acoplamiento entre la hidrólisis de ATP y la actividad
extrusora de fármacos. El estudio de los niveles energéticos permitirá profundizar en
el conocimiento del mecanismo de bombeo de los fármacos antineoplásicos.
DISENO EXPERIMENTAL
El estudio de los requerimientos energéticos de las células que sobreexpresan la
P-gp se rc,alizará mediante el anrflisis de los niveles de ATP, lactato y consumo de
oxígeno de las células P388/100, y sus valores se contrastar¿ín con 1os
correspondientes a una sublínea parental sensible (P388/S) y con otra sublínea
resistente (P388/20) que no sobreexpresa la P-gp. Inicialmente se estudiaran 1os
panímetros energéticos antes mencionandos en condiciones basales, para proceder
posteriormente a su estudio cuando las células se incuban en presencia de un inductor
de resistencia (DNM) y un reversor de la misma (VRP).
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MATERIALES Y NIÉTOI}OS
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Mabrials ytuIébdos
I.I\IETODOI,OGIA REFERENTE A I,1OS CULTTVOS CELULARES.
En este apartado se incluye la metodología empleada para la obtención y
mantenimiento de las distintas líneas celulares que se uttlizan como maierial biolégico
en los diversos estudios de esta Memoria.
1- MANTENIMM,NTO DE I,OS CT]LTIVOS CELTJLARES.
Las diversas sublíneas celulares, tanto de la cepa linfocítica de r, rtón LI2I0
como de la cepa de neoplasma linfoíde P388, también de ratón, se mantuvieron en
cultivo con medio RPMI 1640 (BioWhittaker) suplementado con 2 gl\ de
hidrógenocarbonato de sodio (Merck), LO% de suero fet¿l bovino (BioWhittaker), 10
¡rM B-mercaptoetanol (Bio-Rad), 2 mM Glutamina (Biowhittaker), 50 U/mlPenicilina y 50 p,glml Estreptomicina (BioWhittaker). El cultivo se mantuvo a 37oC
en atmósfera humidificada con el 5% de CO2 en una incubadora (B 5060 EK,Heraeus). Diariamente se diluyeron las células hasta una densidad de 3 x 10s
células/ml (131).
Las sublíneas resistentes de ambas cepas fueron desarrolladas en nuestro
laboratorio a parar de las líneas parentales Ll2l0 y P388 medianüe exposición aconcentraciones crecientes de la antraciclina Daunomicina (132). Ia estabilidad delfenotipo resistenúe se comprobó periódicamente y el cultivo se mantuvo homogéneomediante selección de la población celular por incubación a concentraciones deffrmaco apropiadas. I-a capacidad tumorigénica se preservó y comprobó mediantepases por ratón cadaZ ó 3 meses
2. EXTRACCIÓN DE CÉLULAS PROCEDENTES DE RATÓN.
Tanto para obtener células en grandes cantidades como pÍua comprobar el
carácter carcinogénico de las células LI2LA y P388, se inocularon 1 x 10ó células por
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Materials v Méhtúx
ratón mediante inyección intraabdominal en ratones jóvenes DBAlzlI de 6-8 semanas
suministrados por Iffa Credo (Barcelona). En un periodo de 10-12 días, tras el
desarrollo de tumores ascíticos masivos, se procedió a sacrificar los ratones por
dislocación de las vértebras cervicales. El fluido ascítico se recogió mediante lavado
de la cavidad abdominal con 10-15 ml de disolución tampón DPBS sin calcio
(Biowhittaker) y 1 mM EDTA.
La disolución que contiene las células extraídas se centrifugó inmediaüamente a
405 x g durante 7 min a 20oC (rotor de brazo basculante Gh-3.7, Beckman,
la50 rpm). Las células sedimentadas se resuspendieron en el mismo tampón, se
aplicaron a un gradiente discontinuo de Ficoll tipo 400 [Lymphoprep (Nycomed
Pharma)J y se centrifugaron a 450 x g durante 25 min a 20oC. I¿ interfase Ficoll-
PBS se recogió y mediante dilución 1:1 con tampón PBS se centrifugó a 405 x g
durante 10 min. El sedimento de células se resuspendió en tampón PBS
determinándose el número de ellas así como su viabilidad.
3- ENSAYOS DE VIABILIDAD.
Previamente a cualquier ensayo celular, a fin de garantizar la buena
disponibilidad de las células se realizaron ensayos de viabilidad celular mediante el
método de exclusión con Azul Tripano (Kodak), colorante azul que permea hasta el
citoplasma en el caso de que la membrana plasmática esté dañaÁ:,, criterio utilizadopara considerar la célula como no viable.
4 PREPARACION DE LAS DISOLUCIONES DE DNM.
Los niveles de resistencia y de acumulación de fármacos de las células
tumorales, así como los estudios de funcionalidad de P-gp, se realizaron empleando
Daunomicina. [¿s disoluciones concentradas de este fiírmaco se prepararon a partir de
2-3 mg de DNM (Sigma) que se disolvieron en 5 ml de agua bidestilada.
Posteriormente se tomaron alícuotas de la disolución anterior, se diluyeron en metanol
(concentraciones inferiores a 10 ¡rM para evitar la autoasociación de las moléculas del
fármaco) y se determinó su concentración midiendo la absorbancia a 480 nm usando
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úIaterials vMéhtdtx
como coeficiente de extinción molar 11500 M-tcm-r (133) en un espectrofotómetro
(DU 7500 Spectrophotometer, Beckman). I¿s disoluciones se guardaron en atmósfera
de nitrógeno a -20oC y periódicamente se comprobó su pureza mediante
aromatografía en capa fina en placas de silicagel 60, empleando como solvente de
desarrollo cloroformo: metanol : agua ( 80: 20: 3).
5- ENSAYOS DE CITOTOXICIDAD.
Estos ensayos tienen como objetivo el determinar el grado de resistencia a
DNM de cada una de las sublíneas de las dos cepas celulares a través del panímetro
IC56, Que se corresponde con la concentración de fármaco que inhibe el crecimiento
celular en un 50V0.
L¿s células se sembraron en placas de24 pocillos a una densidad de 1 x 105 ó
2,5 x 105 células/ml, según se tratase de la cepa LI2L0 o P388, en presencia de
concentraciones crecientes de DNM (cada una de ellas por duplicado). I¿s placas se
incubaron durante 48 h a 37oC y 5% de CO2, determinándose por triplicado el
número de células por pocillo empleando un contador electrónico (Counter HF-24,
Ibercell), basado en cambios de conductividad, que lleva incorporada una sonda
apropiada para el tamaño de las células.
A partir de los datos obtenidos se construyeron las curvas de crecimiento frente
las distintas concentraciones de fármaco, obteniéndose los valores de IC56 y a partir de
ellos, el grado de resistencia definido como cociente entre IC5s de las células
resistentes e IC56 de las sensibles.
G ENSAYOS DE ACUMULACTÓN DE DNM.
Células procedentes de las líneas parentales sensibles o de las sublíneas
resistentes fueron centrifugadas durante 7 min a 405 x g y lavadas en una disolución
compuesta de: Hepes 10mM pH 7,2 NaCl 130 mM, KCI 5 mM, CaCl2 1,8 mM(HBS). Tras una nueva centrifugación a 405 x g durante 7 min, se resuspendieron en
la misma disolución y se diluyeron a una densidad final de 1 x 10ó células/ml
incubándose en presencia de DNM 3 pM, a20"C. Cuando las células fueron tratadas
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Mabrtals v Mébús
con Verapamil (Sigma) 5 ¡rM, éste se adicionó 2 h antes de incubar con DNM. A
tiempos predeterminados se extrajeron alícuotas de la suspensión celular que se
analizaron por citometría de flujo en un instrumento Epics Profile I equipado con un
láser de argón y conectado con un sistema de adquisición de datos y análisis IBM.
Los datos analizados incluyen la cuantificación del- i) el número de células que
tienen un contenido significativo de DNM (se excluye la autofluorescencia y el
fármaco asociado a restos celulares), y ii) la intensidad media de fluorescencia que,
para una población dada, es proporcional a la concentraeiÍn de fármaco asociado a
cada célula. [,os histogramas resultantes corresponden a medidas realizadas en 10.000
células. Al final de los experimentos se analizaba la viabilidad celular (134).
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LIaMda vMtutu
tr. METODOLOGÍA RETERENID A LA INCORPORACIÓN FUNCIONAL DEPROTEINAS EN LA MEMBRANA DE L¡OS OVOCITOS DE Xe¿ap¡s /aens.
I^as actividad funcional de la P-gp se estudió en ovocitos de Xenopus laeuis
mediante un método novedoso que consiste en la inyección de fracciones purificadas
de la proteína. I"as principales etapas metodológicas son:
L- Extracción y aislamiento de la membrana celular que conúene la proúeína de
estudio.
2. Purificación de la protefna.
3. Preparación de los ovocitos.
4- Microinyección.
5- Estudio funcional de la proteína insertada en la membrana del ovocito.
Ibtynfuratunn&=@ sTl* -/ffiJ
-ffi-
- Iromogenizacidu
r--j
ffiffil--"--> w
o*!.-
/ ['&i],/ Crcrnatografia
-/ deAfinidad
Centrifugacién
Diálisis
Frgura E: Esquema de las diversas etapas de la que consüa la nueva metodología.
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Maerials vMébdos
Para la validación de esta nueva metodología, se partió del estudio funcional
del receptor nicotínico de acetilcolina, proteína mayoritaria en la electroplaca del
Tbtpedo marmorata y cuyas propiedades están perfectamente caracterizadas.
El esquema que resume las etapas correspondientes a la metodología empleada
se presenta en Ia Figura 8.
A continuación se detallan las diversas etapas recogidas en el esquema para el
estudio del receptor nicotínico de acetilcolina:
1. EXTRACCIÓN Y ATSLAMMNTO DE LA MEMBRANA CELTILAR QUECONTIENE LA PROTEÍNA NE ESTUDIO.
1.1- Obtención de membranas que contienen el nAChR.
Las membranas de receptor nicotínico de Acetilcolina (nAChR) se purificaron
a partir del tejido eléctrico de Tbrpedo marmorata. Ios peces fueron suministrados
por pescadores locales y guardados en el Acuario del Excelentísimo Ayuntamiento de
Santa Pola hasta el momento de su uso en el laboratorio.
Se homogenizaron 200 g de electroplaca de Tbrpedo marmorata en baño de
hielo en tampón de extracción Tris 10 mM pH 7,4 EDTA (sigma) 5 mM, PMSF(Sigma) 0,5 mM, Iodoacet¿mida (Sigma) 5mM. El homogeniz,ado se centrifugó 10
min a 1900 x g (rotor JA-14, Beckman, 3500 rpm). El sobrenadante se filtró a través
de seis capas de gasa y el filtrado se centrifugó 30 min a 70.000 x g (rotor 35,Beckman, 30.000 rpm). El sedimento (fracción de membranas crudas) se resuspendió
en 30 ml de tampón Tris 10 mM pH 7,4 NaCl 100 mM para su posterior purificación
(135). Todas las etapas se llevaron a cabo a 4oC.
2- PI.JRIFICACIÓN DE LA PROTEÍNA.
La purificación del nAChR a partir de las membranas obtenidas en el apartado
anüerior comprende los siguientes puntos:
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I|[abrials v Mé,lnúts
2.1"- Membranas enriquecidas en nAChR: Extraccién alcaüna.
I-a fracción de membrana cruda se diluyó con H2O hast¿ obtener A,6 mg/ml de
proteína total y se llevó a pH 11 con NaOH 0,1 M, agiuíndose durante 2 h a
temperatura ambiente. l¿s membranas alcalinizadas se sedimentaron a 70.000 x g
durante 30 min (rotor 35, Beckman, 30.000 rpm). El sobrenadante, que contiene la
mayor parte de las proteínas periféricas extraídas, se descartó y la parte superior del
sedimento (pequeño velo) se extrajo con 2 ml de tampón Hepes 10 mM pH 7,4
NaNO3 100 mM para eliminar la proteína periférica depositada (136). El resto del
sedimento corresponde a la fracción de membrana alcalina enriquecida en nAChR.
2.2- Purificación del nAChR mediante cromatoerafía de afrnidad.
[,a purificación de nAChR fue realizada por el grupo de1 Dr. Gonález*Ros y
se llevó a cabo ¡rcr cromatografía de afinidad con bromoacetilcolina (137).
I-a' fuacción de membranas crudas correspondiente a la preparación de 200 g de
electroplaca, se diluyóa2 mglml con tampón DB-l (Tris 10 mM pH7,4 NaCl 100
nM, EDTA 0,1 mM) y se solubilizó con Colato de sodio (Sigma) al L%
(concentración final). I.a, mez.cla se agitó suavemente durante 20 min y se centrifugó
durante 50 min a 70.000 x g (rotor 35, Beckman, 30.000 rpm). El sobrenadante
resultante se aplicó a una columna de Affigel 10 (ó a01) (Bio-Rad) derivatizado y
equilibrado con tampón DB-z (DB-1 + colato l%), manteniendo un flujo constante
de 1-1,5 ml/min.
Tras el lavado de la columna con 100 ml de tampón DB-3 (DB-2 suplementado
con 1 mg/ml de lípidos de asolectina), la elución del receptor se llevó a cabo con 50
ml de tampón DB-4 (DB-3 + carbamilcolina (Aldrich) 10 mM), recogiendo
fracciones de 1,5 ml y uniendo aquellas con mayor concentración de proteína. Ia
concentración de proteína eluída se determinó midiendo la absorbancia a 280 nm (1
U.A. corresponde aproximadamente a 0,6 mg/ml de proúefna (137)). El rendimiento
normal obtenido es de unos 12,5 mg de proteína purificada por 100 g de tejido
aproximadamente.
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Mabrials vMéftiúts
2.3- kocedimiento de reconstitucién
Ia reconstitución de nAChR se reaJiza por eliminación progresiva de
detergente por diálisis según los métodos descritos en (138, 139).
Inicialmente se prepararon las vesículas preformadas de asolectina empleadas
en la reconstitución del nAChR. Para ello, lípidos de asolectina de soja (tipo II de
Sigma) se disolvieron en cloroformo, se secaron en rotavapor y se sometieron a vacío
durante 3 h para eliminar el solvente orgánico. ta película seca de los lípidos, se
resuspendió en tampón Tris 10 mM pH 7,0 KCI 140 mM y se solubilizó con CHAPS
(Sigma) al 2-3Vo (concentración final). Mediante ciclos de agitación, sonicación en
baño (15 min) y sonicación con sonda de titanio (3 ciclos de 3 min) alternados con
enfriamiento en baño de hielo, se obtuvo un solubilirado transparente compuesüo
básicamente de micelas mixtas. Estas micelas se dializaron extensivamente obteniendo
vesículas útiles para reconstitución (140), que se dividieron en alícuotas y se
congelaron a -40oC.
El nAChR purificado, recién eluido de la columna, se meznló con lípidos de
asolectina o con vesículas de asolectina preformadas según apartado anterior, enpresencia de Colato de sodio al 4%. Estas mezclas solubilizadas de lípido y proüelna
se dializa¡on exhaustivamente frente a Tris 10 mM pH 7,4 NaCl 100 mM, EDTA
0,1 mM, NaN¡ 0,02% durante 36 h con 3 cambios de tampón (3 x 1 l). A
continuación se dializú frente Hepes 10 mM pH 7,0 KCI 140 mM duranüe 8 h en
condiciones de esterilidad. I-as vesículas resultantes son unilamelares y contienen
incorporado el nAChR con los sitios de unión de cr-Bungarotoxina orientados en m¿ís
de un W% hacía el medio extravesicular (1a1). l¿ muestra reconstituida se dividió en
alícuotas las cuales se utilizaron inmediatamente para inyectar en ovocitos o se
congelaron a -198oC en presencia de trehalosa (Merck) (5mg de trehalosa/mg
proteína).
2.4- Caracterización del nAChR purificado.
Una cuantiñcación más rigurosa del nAChR purificado se realizó mediante
solubilización de la muestra con SDS (Serva) tVo y post€rior precipitación con 10
volúmenes de la mez*la acetona:trietilamina:ácido acético 95:5:5 (v:v), formándose
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Mabrials vMfufus
un par iónico que permite que la proteína precipite quedando en disolución el
detergente y la asolectina (142). Tras centrifugar a 3500 rpm durante 10 min, el
precipitado se lavó con acetona para eliminar la trietilamina. Posteriormente la
acetona se eliminó mediante centrifugación a vacío. La proteína precipitada se
resuspendió en SDS I% y se determinó su concentración mediante el método descrito
por Peterson (143).
El perfil electroforético (en medio reductor) del nAChR purificado mostraba
las cuatro bandas prominentes coffespondientes a las subunidades del receptor,
apareciendo un componente minorit¿rio, de alto peso molecular, adscrito a un canal
de cloruro que copurifica c¡n el mismo (L42).
2.5- Defenninacién de proteftra.
I¿ concentración de protelna de las diversas fracciones de membrana se realizó
según el método descrito por [,owry y cols. (144), con la leve modificación de tener
que centrifugar las muestras para eliminar el detergente (Tritón X-100) utilizado en Ia
solubilización de las mismas, puesto que éste interfiere parcialmente con el reactivo de
Folin (Merck).
3. PREPARACIÓN DE LOS OVOCITOS.
Las hembras del sapo sudafricano Xenopus laeuiso suministrados por Blades
Biological en Edenbridge (Kent, G. B.) se anestesiaron mediante inmersión en un
baño de hielo durante unos 30 min. A continuación, y, en condiciones de asepsia,
mediante una incision abdominal se les extraía parte del tejido ovárico. Tras finalizar
se les cosía la herida y se les despertaba de la anestesia mediante la atemperación del
agua de lia cubet¿. El mismo animal podía volverse a utiliz:rr como donador enperfectas condiciones al cabo de varias semanas. El tejido ovárico extraído se
colocaba en una placa Petri que contenía una disolución modificada de Barth (145):
Hepes 10 mM pH 7,4 NaCl 88 mM, KCI I mM, NaHCO3 2,4 m}.4, MgSOr
0,82 mM, ca(No3)2 0,33 mM, caCl2 0,41 mM, suplementado con Gentamicina
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l|[abrials v Méfrtdos
(Sigma) 0,1 mg/ml o con Penicilina 100 U.I. y Estreptomicina (Sigma) 0,1 mg/ml
para limitar el crecimiento de bacterias.
Una vez en disolución modificada de Barth los folículos ováricos en estadios V
y VI de Dumont (146) se fueron separando manualmente con ayuda de unas pinz.as
finas de relojero. Se seleccionaron los folículos que se hallaban en buenas condiciones
y se mantuvieron en una incubadora (Hotcold-S, Selecta) a l6-l8oC, en viales de
centelleo de 5 ml que contenían disolución de Barth estéril con antibióticos.
En la mayoría de los casos, y salvo que se especifique lo contrario, los
ovocitos utilizados en el registro fueron separados enzimátícamente del resto de las
capas de células foliculares, con objeto de facilitar la introducción de microelectrodos
para el registro electrofisiológico y la microinyección de distintas sustancias en el
interior del ovocito. Para ello, los folfculos previamente seleccionados se traspasaron
a viales de centelleo que conüenían 0,8 ml de una disolución de colagenasa (tipo IA,
Sigma) a una concentración final de 0,5 mg/ml disuelta en una disolución de
composicíón: Hepes 5 mM pH 7,0 NaCl 115 mM, KCI 2 mM y CaCl2 1,8 mM
(Ringer). Durante el tratamiento, los viales fueron sometidos a una suave agitación
(agitador SBS, 5 rpm) a temperatura ambienúe durante aproximadamente 50 min. Tras
ese tiempo, con la ayuda de un vorúex, se desprendieron las diversas envolturas de los
ovocitos (147, 148). Posteriormente, los foliculos se lavaron 3 veces con disolución
Ringer y se guardaron en viales nuevos con disolución modificada de Barth estéril a
16oC. En algunas ocasiones el tratamiento no fue del todo efectivo y los folículos
quedaron apatentemente intactos. En esos c¿lsos, con la ayuda de una lupa de
disección (Nikon) se pudieron desprender fácilmente con unas pinzas de relojero la
capa epitelial y con ella la teca del folículo (149).
+ MICROINYECCIÓN.
Mediante la ayuda de un nanoinyector electrónico (A203XVZ, World
Precision Instruments), se inyectaron 50 ó 100 nl de muestra (1 ó 2 pulsos,
respectivamente) en cada uno de los ovocitos. El equipo de microinyección se
completa con una lupa de disección (Nikon) y una camarita para inyectar de diseño no
comercial.
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Para la inyección se utilizaron capilares de vidrio específicos para elnanoinyector convertidos en micropipetas (punta de 20-30 ¡^rm de Aext.) mediante unestirador de microelectrodos (PUL-I, world precision Instruments).
Figura 9: Esquema del sistema de microinyección en ovociüos. De izquierda a derecha se prese,ntan lafuenúe de luz fría, la camarita de inyección y la lupa binocular, y el nanoinyecüor elechónico.
La inyección se efectuó en el hemisferio vegetal, normalmente cerca delecuador del ovocito, evitando así inyectar en el núcleo de la célula localizado en elpolo animal. Al final de la inyección se desecharon aquellos ovocitos que no sellaronbien tras la inyección.
Cuando la microinyección se realiz¡ con muestras previamente congeladas, seefectuó una descongelación nlpida y las muestras se homogenizaron mediante 3 pasesa través de una jeringuilla tipo t{amilton de 100 pl.
5. ESTUDIO FTINCIONAL DE LA PROIE,ÍNA INSERTADA EN LAMEMBRANA DEL OVOCITO.
Para los estudios electrofisiológicos, los ovocitos se colocaron en una camaritade registro de metacrilato en donde podfan ser contínuamente superfundidos, bien condisolución Ringer de rana u otras disoluciones. La camarita de registro de formahusifome y 150 y.l de capacidad total tiene situado en su centro una pequeña base deacero inoxidable con forma de cono invertido (Aext : 1,2 mm) para que el ovocito,al ser una célula esférica, quede fijo.
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Mabrials -vMéfttfus
En un lado de la camarita se sitúa la entrada de las disoluciones, donde un
sistema de doble via permite superfundir contínuamente al ovocito con dos tipos de
disoluciones distintas sin que ello implique una mezcla de ambas. I-a disolución llega
a la camarita por gravedad desde los reservorios situados a una altura de 1 m sobre el
lugar de registro a través de tubos de Tygon y la velocidad de superfusión se controla
mediante unos reguladores de flujo (Dial-A-Flo, Abbottt). En la entrada de la
camarita, según las condiciones del laboratorio, se conectó una célula de Peltier que
calentaba o enfriaba las disoluciones hasta llegar a la temperatura deseada.
En el otro lado de la camarita, la disolucién era extraída mediante succión a
través de un capilar de vidrio unido por un tubo de Tygon a una red de vacío a través
de dos kitasatos.
La longitud de los tubos de entrada y salida de las disoluciones de la camarita
se miniminiza en lo posible para amofiguar los movimientos y vibraciones
reduciéndose así la posibilidad de introducir artefactos en el registro. Adicionalmente,
la camarit¿ de registro esuí fijada a la base de una lupa convencional (Nikon) colocada
sobre una mesa antivibratoria para evitar que posibles vibraciones dañaran el ovocitoduranüe el registro electrofisiológico.
Una vez preparada la camarita para el registro, se transfería el ovocito desde elvial de incubación a la base metálica de fijación mediante una pipeta Pasteur,colocándose en la posición deseada mediante una varilla de vidrio.
5.1- Registros electrofuiológicos.
I-os registros electrofisiológicos se realizaron mediante la técnica de fijación devoltaje (voltage-clamp) con dos microelectrodos (Figura 10). En esta té,cnica uno delos electrodos, electrodo de voltaje, se introduce en el ovocito y se conecta a unpreamplificador (VF-180, Biologic) y se utiliza para medir la diferencia de potencial
entre el interior del ovocito y la disolución de la camarita de registro que lo rodea, esdecir, el potencial de membrana. El otro elechodo, electrodo de corriente, seintroduce tambien en el ovociüo y se utiliza para pasar corriente. El tercer elementofundamental en el sistema es un amplificador diferenciat (CA-100, Biologic) utilizadopara comparar el voltaje que se quiere mantener (potencial comando) y el que posee elovocito; la diferencia, güo es el potencial de error, es la que va a hacer que el
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lVlabrials vMé&túts
amplificador de corriente (VF-1800, Biologic) permita el paso, en función de |aganancia, de una determinada corriente al ovocito hasta que la señal de error sea cero.
amplificador
electrodo de
registo devoltaje
ueregisto devoltaje
Figura 10: Esquema elechónico del sistema de regisho en "voltage-clampn con dos microelectrodos enovocitos.
Se utilizaron electrodos de Ag/AgCl para establecer el contacto eléctrico entrela tierra y los microelectrodos con la disolución salina de la cámara. Los electrodos detierra y del baño fueron de plata clorurada de lmm de sección con su extremo finalaplastado para aumentar la superficie de contacto. La disolución de la camarita seconectó con los electrodos de tierra y baño a través de un capilar de vidrio relleno conuna disolución de ag¿uosa al 2Vo en Ringer (puente de ágar); de esta forma lacomposición iónica del baño pudo cambiarse sin apenas modificaciones en el potencial
de referencia.
[.os microelectrodos fueron preparados por medio de un estirador demicroelectrodos utilizando vidrio de borosiliato de ñext : 1,5 mm y con unfilamento interno para facilitar su posterior llenado (World Precision Instruments). Elelectrodo utilizado para medir voltaje se rellenó con una disolución de KCI 3M y elutilizado para inyectar corriente se llenó con una disolución de CH3COOK 3M, yaque este ión permite pasar mejor grandes corrientes.
electodocorriente
ganancia del amplificador
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MabríalsyMébdos
[.a resistencia de los microelectrodos utilizados fue baja (de 2 a 5 MO para el
electrodo de voltaje y de 0,5 a 3 MQ para el de corriente). Para ello, se rompieron laspuntas de los electrodos rozánzolas ligeramente con la base de la camarita de registro
mientras se medía la resistencia. Resulta conveniente utilizar electrodos de baja
resistencia porque así se minimiza el ruido eléctrico introducido en el amplificador de
voltaje y se pueden inyectar grandes corrientes (hasta decenas de microamperios). En
Ia ptáctica, el tamaño de la punta de la pipeta y por tanto la resistencia del
microelectrodo, fue un compromiso entre una mejora de las características del registro
y el daño producido en la membrana del ovocito al introducir la punta delmicroelecffodo. Ovocitos obtenidos de determinados knopus resultaron más frágilesque los obtenidos de otros donadores, tolerando peor la introducción de los
electrodos. Normalmente el potencial de membrana y la resistencia de entrada
disminuyeron tras la introducción de los electrodos en el ovocito, por lo que antes deiniciar los registros se dejó un tiempo de recuperación, en general de unos pocos
minutos hasta que se consiguió una línea de registro estable (147). En algunosovocitos al introducir los electrodos se evocaron oscilaciones espontáneas que
desaparecieron al cabo de unos minutos.
En general, y a menos que se indique 1o contrario, el potencial de fijación fuede -60 mV, por ser en el ovocito, un valor muy alejado del potencial de equilibrio decualquiera de los iones presentes en el medio de superfusión.
Para analizar la dependencia de las corrientes objeto de estudio frente alvoltaje, se dieron pulsos despolarizantes o hiperpolarizantes respecto al potencial defijación mediante el empleo de un generador de pulsos programable con salida aislada(SMP-310, Biologic) conectado con el amplificador de fijación de voltaje (Figura 10).
La señal de corriente se filtró a 30-500 Hz mediante un filtro pasabajos tipoButterworth de 4 polos (VBF3, Kemo) y se monítonzí simultáneamente con elpotencial de membrana en un registrador de plumillas, un osciloscopio digital(Nicoler3l0, Nicolet) y, mediante una tarjeta analógico-digiral (DT-2801A, DataTraslation), en un ordenador PC-compatible (procesador 80486DX2) para sualmacenaje y posterior anrílisis mediante el uso de distintos programas informáticos:MCOLET ofrecido por Rico Miledi (University of California, Irvine), VCANofrecido por J. Dempster (University of Stathclyde, GB), Sigma plot (Jandel
Scientific). En todos los casos, la frecuencia de muestreo utilizada fue el doble de lafrecuencia máxima contenida en la señal (frecuencia de firtrado).
I
Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1996
Mabrials vfuIéfrtúx
Por convenio, se han considerado como comientes de salida ("outward")
aquellas debidas a la salida de cationes del ovocito y se representan como deflexiones
hacia arriba; mientras que las corrientes de entrada ("inward") son las producidas por
la entrada de cationes al ovocito y se muestran como deflexiones hacia abajo.
5.2- Estudio de las corrientes activadas por acetilcolina.
Se estudiaron las corrientes evocadas por la aplicación de acetilcolina (ACh)
(Sigma) tanto en ovocitos sin inyectar como en ovocitos inyectados con membranapurificada procedente de Tbrpedo o con el nAChR reconstituido en vesículas lipídicas
de asolectina.
Los registros de las corrientes se realizaron entre 4 y ñ h después de haber
teahzada la inyección. Durante el registro los ovocitos se superfundieron
continuamente con disolución Ringer a la que se le añadió sulfato de atropina (Fluka)
0,5 ¡,rM para evitar las respuestas muscarínicas que presentan ciertos donadores. [¿
concentración de ACh aplicada osciló entre 1 ¡¿M y 1 mM. I¿ velocidad de
superfusión fue generalmenüe de 3 mUmin.
5.3- Aplicaciones locales de acetilcoHna.
En algunos experimentos se realizaron aplicaciones locales de ACh, mediantemicropipetas de vidrio con ACh lmM conectadas a un sistema de inyección neumático(Picospritzer, General Valve Co.). Ia aplicación se reabzó medianüe pulsos de unos 2x 105 Pa durante 40 ms.
Las aplicaciones extracelulares se realizaban mediante la aproximación de laplpetla a la superficie del ovocito hasta que se podía observar una pe4ueña
deformación en su superficie a través de la lupa (40 aumentos), entonces se alejaba elmicroelectrodo aproximadamenüe 10 p,m y se apücaba el agonista.
En las aplicaciones intracelulares, la pipeta se acercaba hasta la superficie ycon sumo cuidado se inhoducía en el interior, muy cerca de la superficie del ovocito.Tras esperar el sello de la pipeta se aplicaba la disotución de ACh. Posteriormente se
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Wbriales v Mébdos
sacaba la pipeta del interior del ovocito y se comprobaba que la pipeta no se había
obstruído.
En la siguiente figura se esquematizan dichas aplicaciones.
APLICACION EXTRACELULAR APLICACION INTRACELULAR
Hgura 11: Esquema representativo de las aplicaciones locales de ACh en la membrana del ovociúo en elespacio extracelular y en el espacio intracelular. El tamaño del ovociüo con respecüo a la pipeta no estárepresentado a escala.
50
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Maferíalx v Mé.tn¡*x
III- METODOLOGIA REFERENTE AL ESTUDIO FTINCIONAL DE LA P-gp.
Una vez demostrada la validez del nuevo método de estudio en nAChR, se
procedió al estudio funcional de P-gp haciendo uso de una estrategia experimental
similar. las etapas de dicho estudio se corresponden con:
1. EXTRACCIÓN Y AISLAMM,NTO DE LA MEMBRANA CELULAR QTIECONTIENE LA P-gp.
1.1- Obtención de la fracción microsomal.
Para la obtención de la fracción microsomal de las células LLZIA se utilizaron
indistintamente células propagadas en cultivo o en ratonesDBN21J (150).
Las células se resuspendieron en tampón de extracción de composición: Tris-
HCI 10 mM pH 7,4 Nacl 200 mM, EDTA 5 mM, PMSF 0,5 mM e Iodoaceramina
5mM y se lisaron en una bomba de cavitación gaseosa tipo Parr (Parr Instr.),
mediante nitrógeno a 5,5 x 106 Pa durante 60 min.
La suspensión resultante se procesó en un homogenizador de cuchillas Polytron
(Kynematica), durante 3 periodos de 90 s al70% de potencia. Este homogenizado se
sometió a un proceso de centrifugación diferencial:
i) A 450 x g durante 5 min en una centrífuga refrigerada de mesa (GS-6R,
Beckman, 2.000 rpm.) a fin de sedimentar células enteras y fracción nuclear.
ü) El sobrenadante de la fracción anterior se centrifugó a 25.N0 x g duranúe
20 min (rotor 35, Beckman, 17900 rpm.).
iii) EI nuevo sobrenadante se sometió a una tercera centrifugación a 200.000 xg durante 60 min (rotor TFT-70.38, Kontron, 50.000 rpm).
El sedimento obtenido en esta centrifugación representa la fracción microsomal
(membrana plasmática, fragmentos de retículos endoplasmático liso y rugoso, y
complejo de Golgi básicamente). Dicho sedimento se resuspendió en tampón de
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fuIabriala vMéhtúts
composición adecuada, dependiendo del tipo de proceso a que iba a ser sometido
posteriormente, y se homogenizó mediante un homogenizador tipo Potüer-Elvehem.
1.2- Determinacién de proteÍna.
El contenido en proteína de las distint¿s muestras se determinó mediante el
método de Bradford (151). Este método se basa en el desplazamiento del máximo de
absorbancia del colorante Azul Coomassie Brillanúe G-250 desde 465 nm a 595 nm
cuando forma complejos con proteínas. Como patrón de proteínas se utilizó Gamma
Globulina (Bio-Rad).
1.3- Fraccionamiento de proteína.
El fraccionamiento del componente proteíco de la fracción microsomal se
realizó por electroforesis en geles de poliacrilamida en presencia de SDS (SDS-
PAGE) según el método descrito por Laemmli (152), empleando un equipo de
electroforesis Miniprotean (Bio-Rad). I-as muestras se desnaturalizaron mediante la
adición de tampón de desnaturalización Tris-HCl 62,5 mM pH 6,8 glicerol 5%, SDS
2%, azul de bromofenol 0,005% en condiciones reductoras (p-mercaptoetanol 5%).
El grado de reticulación fue de 7,5Vo en el gel separador y del 4Vo en el concentrador.
[¿ electroforesis se realizó empleando un voltaje constante de 80 V para el gel
concentrador y 180 V para el gel separador.
Para el revelado de las bandas de proteína, los geles se tiñieron con una
disolución de Azul de Coomassie R-250 (metanol 40%, ácido acético l0%, AzuI de
Coomassie R-250 A,LTo). I"a destinción se realizo mediante repetidos lavados con
metanol 4A%, ácido ac'étíco 7 Vo .
1.4- Dgtección de la P-gp mediante Western-Inmunotransferencia.
El análisis de la presencia de la P-gp se llevó a cabo por western-
inmunotransferencia mediante el método descrito por Towbin y cols. (153) empleando
52
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Mahrínlx vMé.lnúts
el anticuerpo monoclonal específico C-2L9 (Centocor Inc.) que reconoce un epítopo
interno de la P-gp cercano a la zona de unión de ATP (79). Finalizada la
electroforesis, las proteínas se transfirieron a soportes de nitrocelulosa mediante el
método de elución electroforética, que consiste en sumergir el conjunto gel-membrana
en una cubeta llena con tampón de transferencia Tris 50 mM, Glicina 380 mM, SDS
0,1% y Metanol 20%. La transferencia se realizó duranüe 3,5 h a 4oC y a corriente
constante de 150 mA.
Posteriormente la membrana se bloqueó con un tampón compuesto de DPBS
(Biowhittaker), Tween-2O (Bio-Rad) O,lVo,leche desnatada en polvo 0,5% y azida de
sodio 0,01% durante t h a temperatura ambiente, para evitar la unión del anticue{po a
la superficie de la membrana. Tras el bloqueo, la membrana se lavó con DPBS,
Tween-20 0,1%, azida de sodio 0,0I% y seguidamente se incubó con el anticuerpo
monoclonal C-219 a una dilución I:250 en el tampón anterior suplementado con
2 mg/ml de BSA (fracción V, Sigma) durante toda la noche, a temperafura ambiente
y con agitzción contínua. La membrana se sometió a cuatro lavados, de 5 min cada
uno, con el tampón de lavado anterior, y se procedió a la fase de detección del
anticuerpo primario, que dependiendo del método utilizado (fosfatasa alcalina o ECL)
ésta podía desarrollarse como:
i) Fosfatasa alcalina: La membrana se incubó con un segundo anticuerpo IgG
de cabra antirratón conjugado con fosfaüasa alcalina (Boehringer), a una dilución
1:3.000 (0,4 p.glml) en el mismo tampón que el primer anticuerpo durante t h a
temperatura ambiente y con agitación. La membrana se lavó con tampón Tris-HCl
100 mM pH 8,8 NaCl 100 mM, Mgcl2 5mM durante tres periodos de 5 min. La
actividad enzimátíca de la fosfatasa alcalina se detectó mediante revelado con una
disolución que contenía 4-nitro azul de tetrazolio 3,75% y 5-Bromo-4-Cloro-3-
Indolilfosfato (Boehringer) l5Vo. Ia" reacnión se detuvo lavando la membrana con
agua.
ii) Sistema de detección ECL (Enhanced chemical luminiscence, Amersham).
En este método, la membrana se incubó con un segundo anticuerpo anticueqpo IgG de
oveja antirratón marcado con peroxidasa de rábano (Amershan) a una dilución 1:1000
en el mismo tampón que el primer anticuerpo durante t h a temperatura ambiente y
con agitación. A continuación, la membrana se lavó con tamñn Tris-HCl 50 mM pH
7,5 NaCl 150 mM, Tween-2O 0,1% durante un periodo de 15 min y dos de 10 min.
Seguidamente, la membrana se incubó con los reactivos A v B del Kit de detección a
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Mabrials vMéttús
una relación 1: 1 y tras el secado de Ia misma, se puso la membrana en contacto con
una película de autoradiografía (Hyperfilm-Ecl, Amershan) durante un tiempo que
osciló entre 1 v 20 min.
2- PIIRIFTCACTÓN DE LA P-gp.
La purificación de la P-gp requiere de la solubilización de la frapción
microsomal en la que se encuentra. Para ello, se procedió a un proceso de dos etapas
sucesivas de solubili zación.
En la primera etapa, se realizaron ensayos de solubilidad con tres detergentes
distintos: dos de tipo zwitteriónico, Zwittergent 3-12 (Calbiochem) y CHAPS (Sigma)
y uno aniónico derivado de las sales biliares, Colato de sodio (Sigma), frecuentemente
empleado en la solublLizaciún de diversas proteínas de membrana (137).
El tiempo de solubilización apropiado se determinó utilizando diversas
alícuoüas de fracción microsomal que se solubilizaron con distintas relacionesproteína:deüergente, desde L:0,25 hasta 1:15 (w:w), a intervalos de tiempo de 30 y
60 min respectivamente. El proceso se realizó a 4oC y con suave agitación duranteperiodos de 15 min. Transcurrido el tiempo de solubilizacíón, las muestras sesometieron a centrifugación a 200.000 x g durante 2O min (TFT-70.38, Kontron,
50.C)00 rpm) en una ultracentrífuga refrigerada (154). I-a, ftacción insoluble seresuspendió en tampón Tris 10 mM pH 7,0 KCI 140 mM.
Las distintas fracciones (soluble e insoluble) obtenidas de la solubilización conlos diversos detergentes se analiza¡on mediante la determinación del contenido deproteína, por el método de Bradford (151), y la detección de los niveles de P-gp por
Western-Inmunotransferencia ( I 53).
I-a fracción que contenía la P-gp se sometió a una segunda etapa desolubilización en las que se utilizaron los siguientes detergentes: CHAPS, NonidetP-40 (Sigma), N-Octilglucósido (Calbiochem) y Zwinergent 3-L2.
Al igual que 1o descrito en la primera etapa, se analizaron las fracciones
obtenidas tras centrifugar las muestras en cuanto a su contenido relaúvo en P-gp.
La reconstitución de la P-gp parcialmente purificada se realizó por eliminacióndel detergente de las muestras solubilizadas mediante diálisis exhaustiva frente at¿mÑn Hepes 10 mM pH 7,0 KCI 140 mM. Previamente a la diáIisis. las muesrrras se
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Mabrial* vMéútúx
suplementa.ron con 5 mg de lípidos de asolectina por mg de proteína para evitar la
precipitación de las proteínas de membranas, particularmente de Ia P-gp.
3- ESTUDIO FTINCIONAL DE LA P-gp INSERTA-DA EN LA MEMBRANA
DEL OVOCITO.
Tras la preparación de los ovocitos y la microinyección de las distintas
muestras enriquecidas en P-gp (ver apartados II-3 y II-4), se procedió al estudio
funcional de la P-gp insertada en la membrana del ovocito.
3.L- Detección de la P-gp en la membrana de los ovocitos.
Las membranas procedentes tanto de ovocitos sin ínyectar como de ovocitos
que fueron previamente inyectados con fracciones que contenían lu P-gp, se aislaron
manualmente según el procedimiento descrito por Sadler y Maller (155). Para 1o cual
los ovocitos se incubaron en una disolución hipotónica de composición Hepes 10 mM
pH 7,0, NaCl 10 mM en baño de hielo y se les efectuó un pequeño corte para que el
contenido intracelular pudiera salir at exterior. Al cabo de 20-30 min se cogían las
membranas con la ayuda de unas pinzas de relojero el ovocito y se elevaban hasta
llegar a la superficie de la disolución donde la tensión superficial arrastraba el
citoplasma que aún se mantenía unido a la membrana celula¡. Tras lavado de las
membranas, éstas se sedimentaron mediante una centrifugación a 15.000 x g durante
5 min a 4oC (Biofuge 1"5, Heraeus, 13.000 rpm). Las membranas se resuspendieron
en tampón de desnaturahzacíón y alícuotas correspondientes a muestras de 20
membranas, se procesaron mediante Western-Inmunotransferencia para la detecciónde P-gp, tal como se ha descrito anteriormente en el apartado III-1.4.
3.2- Il,ledidas de actividad de transporte de fármacos,
A fin de deüeminar la capacidad transportadora de la P-gp, las diversas
alícuotas obtenidas en las dos etapas de purificación anteriores (apartado III, 2), se
sometieron a ensayos de actividad de transporte de fármacos antitumorales.
JJ
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Mabrialu vMétodtx
[¿s muestras que contienen la P-gp: fracción microsomal, fracción insoluble
obtenida tras el tratamiento con Colato y fracción solubilizada por Zwittergent 3-L2 y
dializada, se microinyectaron en ovocitos de knopus. Muestras control, procedentes
de células L1210/S fueron procesadas en las mismas condiciones que las procedentes
de las células resistentes Ll2l0llffi.
Transcurridas 20-30 h de la inyección, grupos de 10 ovocitos se incubaron con
DNM 0,6 pM conteniendo 1 ¡rCi de H3-DMvI (NEN Products). La temperatura de
incubación fue de 25oC, el volumen total de muestra de 0,5 ml siendo el tampón
empleado Ringer pH 7,4. A los 90 min los ovocitos se trasvasaron a viales de
centelleo conteniendo 200 ¡rl de SDS al 27a. Una vez solubilizados, se les añadió 5 ml
de líquido de centelleo [Ready Micro, (Beckman)] a cada viat y se procedió a su
medida en un contador B (LS 2800, Beckmann). En los experimentos de reversión del
transpofte por VRP, éste se adicionó 60 min después de la DNM y se mantuvo
durante 30 min.
Los niveles de acumulación de DNM se presentan como el porcentaje de
radioactividad del contenido intracelular de los ovocitos con relaeíón a la
radioactividad total añadida en el pocillo respectivo. El transporte de DNM al exterior
celular se expresa como diferencia entre los niveles de DNM acumulada por los
ovocitos inyectados con muestra cont¡ol respecto de los inyectados con muestra que
contiene P-gp.
3.3-Medidas de osmolaridad.
La osmolaridad de las disoluciones empleadas en el estudio de la actividad de
canal de cloruro activado por hipotonicidad se realizó en un osmómetro Knauer, que
se basa en el ciflculo de la conductividad eléctrica de una disotución cuando ésta pasa
del estado líquido al sólido. Para calibrar el aparato se utiliza H2O desionizada como
valor 0 mOsm y una disolución de NaCl al1,2687% en H2O desionizada como valor
400 mOsm.
3A
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Mnle¡ínls v Mélndx
3.4- Estudio de las corrientes activadas por hipotonicidad.
El estudio de las corrientes activadas por hipotonicidad se realizó mediante el
método de fijación de voltaje con dos electrodos. Tanto las células no inyectadas
como las inyectadas con muestras control o con aquellas con P-gp, se sometieron a un
protocolo de pulsos despolarizantes de 800 ms de duración, desde -100 mV (potencial
de fijación) a -60 mV, -20 mV, +10 mV, +40 mV y +80 mV. I.os pulsos se
aplicaron en Ringer Normal isotónico (RI$, y en dos medios hipotónicos derivados
del anterior donde únicamente se disminuye la concentración de NaCl, pasando de
115 mM a 75 y 45 mM (RH-75 y RH-45, respectivamente). Los pulsos
despolarizantes se aplicaron tras 5-10 min de haber cambiado la disolución para
asegurar que el intercambio de los medios en la camarita fuera tot¿l.
Las relaciones corriente/voltaje de la corriente activada por hipotonicidad se
presentan como el valor medio de las corrientes evocadas en medio hipotónico, eü€previamente habían sido normalizadas mediante la asignación de lffiVo al valor
máximo de corriente. Las corrientes netas debidas al medio hipotónico se calcularon
mediante la diferencia entre las corrientes evocadas en medio hipotónico y en medio
isotónico. En los pulsos a +4A y +80 mV aplicados en medio hipotónico, el valor de
c¡rriente se extrapoló a t: 0, debido a que el componente capacitativo de la
membrana del ovocito impidió el registro de la corriente iónica en los primeros 5-20
ms.
El cálculo de las amplitudes de la corriente evocada Wr medio hipotónico, se
efectuó en los pulsos a +80 mV, extrapolando la corriente a t: 0 para evitar su
inactivación. Esta determinación se realizó únicamente en aquellos experimentos
donde se aplicaron pulsos en medio isotónico anúes y después de su aplicación en
Ringer hipotónico.
En las corrientes nativas del ovocito activadas por hipotonicidad, se analizó el
efecto de diversos f,ármacos sustraúos o moduladores del transporte por P-gp (DNM,
vRP).
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Mabrials vMéb&ts
TV. METODOLOGÍA REFERENTE AL REQUERIMM,NTO ENERGÉTICO DE
LAS CÉLTJLAS P38S.
I¿ P-gp transporta f¿írmacos al exterior celular mediante la hidrólisis de ATP.
Para estudiar los requerimientos energéticos de la P-gp como bomba activa del eflujo
de f¿írmacos, se han estudiado algunos aspectos relativos al metabolismo energético en
las células P388. Las determinaciones experimentales comprenden:
1- CONSUMO DE OXÍGENO.
I¿s medidas de consumo de oxígeno se realizaron de forma amperoméffica
mediante un oxígrafo (YsI-5331, Yellow Spring Instruments) que emplea un
electrodo de Clark, uno de los más selectivos que existen. Sus especificiones se
recogen en el ,Afrndice I.
Las muestras celulares se mantuvieron aisladas para prevenir el intercambio de
02 entre la cámara de muestras y la atmósfera mediante el cierre entre el soporte del
electrodo y las paredes de la cámara de muestras. Antes de cada experimento seprocedió al calibrado del aparato. EI rcU% representa al tampón saturado de oxígeno
a la temperatura del experimento y el 0% a una disolución saturada de tiosulfito de
sodio en dicho tamprón. La temperatura de la cámara de muestra y el dispositivo del
electrodo se manfuvieron constantes a 37oC mediante el empleo de un baño de
temperatura circulante de precisión * 0,1oC (K, Haake).
Las suspensiones de células en HBS se llevaron a una densidad finat de 1 x 106
células/ml (condiciones basales). Alícuotas de 6 ml en la cámara de muestra se
equilibraron al aire con agitación suave y continua durante 7,5 min. A continuación seintrodujo el electrodo en la camara y se selló. Tras la espera de otros 7,5 min, tiempo
requerido para alcanz-ar el equilibrio térmico de todo el sistema, se procedió al
registro contínuo del consumo de oxígeno duranüe 10 min.
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Mabrials vMéhtúts
La adición de glucosa (Merck) 10 mM o azida de sodio (Merck) 10 mM como
efectores del metabolismo energético, se realizó inmediatamente antes de introducir el
electrodo en la cámara de muestra.
Para analizar el efecto de DNM en el metabolismo energético, suspensiones de
células en condiciones basales se incubaron con el fármaco a una concentración final
de 3 ¡rM a 37oC y se procedió al registro de consumo de oxígeno a diversos tiempos:
0, 30, 60 y 90 min. I-os experimentos en presencia simultiínea de DNM y VRP se
llevaron a cabo preincubando con VRP a una concentración de 5 pM durante
120 min. Al finat de cada experimento se efectuó el correspondiente ensayo de
viabilidad celula¡.
2- MEDIDAS DE LACTATO.
El procedimiento empleado fue de tipo enzimático basado en la reducción de
NAD+ por la enzima lactato deshidrogenasa (LDH) que tiene como sustrato al ácido
lactíco. La ecuación que rige el proceso es la siguiente (156):
Lactata + NAD+.- lactato deshi4logt$3- piruvato + NADH + H+
El NADH tiene un miíximo de absorbancia a 340 nm, propiedad utilizada para
cuantificar la cantidad presente de lactato en la reacción mediante espectrofotometría.
El ensayo se llevó a cabo partiendo de suspensiones de 10 rnl de células de
densidad 1 x 106 celulas/ml en medio HBS a 37oC (condiciones basales). Tras
centrifugación a 405 x g durante 10 min a temperatura ambiente, el sedimento se
resuspendió en ácido perclórico aI l0% con el fin de liberar el contenido
citoplasmático y precipikr la proteína así como las diversas estructuras celulares.
Posteriormente, todo ello fue sedimentado mediante dos centrifugaciones sucesivas a
15.000 x g durante 1 y 5 min respectivamenúe (Biofuge 15, Heraeus, 13.000 rpm).
Del extracto citoplasmático se tomaron diversas alícuotas que se incubaron durante
30 min a37oC con una disolución tamponada con glicina apH9,2 que contiene el
enzima (LDH de músculo de conejo, Boehringer) y NAD+ (grado II, Boehringer). I-a
absorbancia de NADH se registró con un espectrofotómetro (Ultrospec III, Pharmacia
LKB).
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Ma@iak v Métutus
Las incubaciones con efectores del metabolismo energético y las referidas a
VRP y DNM se efectuaron de la misma forma como se describe en el apartado IV-1.
3- MEDIDAS DE ATP.
Estas medidas se realizaron mediante un ensayo bioluminométnco que se basa
en la luminiscencia de oxiluciferina que se genera en la siguiente'reacción catzlizada
por la enzima luciferasa obtenida de Photinus pyralis ( American firefly) (157):
ATP + D-luciferina* o.1-!y9lrgt1tl!'tg2t* oxiluciferina+ ppi + AMp + cor * luzL
El método es altamente sensible y permite la determinación de niveles de ATP
comprendidos entre los rangos de 1 x 10-8 a 5 x 10-13 M.
Para ello se parte de suspensiones de células con una densidad de 1 x 106
células/ml en medio HBS a 37oC (condiciones basales). Alícuotas de 50 f¿l se
incubaron con la mezrla de reacción 1:1 (v:v) [Kit ATP bioluminiscence HS,(Boehringer)1, y se midió la luminiscencia al solubilizar la membrana de las células
con Tritón-Xl00 (Bio-Rad) a una concentración final del lVo (w:v). I¿s medidas deluminiscencia se realizaron en un luminómetro LKB-1250 de alta sensibilidad.
I¿s medidas de ATP en presencia de glucosa, azida de sodio, vRp y DNM seefectuaron en las mismas condiciones especificadas en el apartado IV-l.
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Mabrialw vMébdos
v- eNÁr,rsrs nsrloÍsrrco.
Los datos de los experimentos fueron analizados según el siguiente tratamiento
estadístico:
i) Determinación de la media aritmética (;) y error esuíndard de la media (e.
s .m. ) .
iil Aplicación del criterio t de Student para determinar si dos medias eran o no
significativamente diferentes.
iiíl Construcción de histogramas de distribución de frecuencias de los valores
experiment¿Ies dentro de una población.
iv) Anrílisis de la varianza ANOVA para comprobar las diferencias entre los
valores de los distintos grupos. Si los grupos comparados mostraban diferencias
significativas (p< 0,05), se utllirn la prueba de Student-Newman-Keuls para
discriminar entre qué grupos existían diferencias. Cuando los valores presentaban una
variabilidad consíderable entre ellos, y no se ajustaron a una distribución normal, para
comparar diferencias entre grupos se utilizó el test de Wilcoxon. Cuando hubo que
establecer si más de dos grupos eran diferentes o ño, se utilizó el test de
Kruskal-Wallis. Las diferencias significativas entre grupos se han representado según
la siguienúe nomenclatura:
(*) p ( 0,05
(**) p ( 0,01
(***) p ( 0,001
61
Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1996
CAP.ITT]LO I
¿PRESENTA LA P-gp ACTIVIDAD DBCANAL DE CLORURO?
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REST]LTADOS
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CarútuIo I
1.1- RESPTJESTA NATIVA A ACh EN OVOCITOS.
I-os ovocitos de algunos donadores responden a la aplicación de ACh con una
reducción del potencial de membrana (158). En la Figura 12 se muestra la corriente
evocada por ACh debida a la activación de receptores muscarínicos nativos del
ovocito. El carácter muscarínico de esta respuesta se demostró con el bloqueo
completo de la corriente al añadir sulfato de atropina 0,5 ¡rM a Ia disolución de
superfusión. La aplicación de pulsos hiperpotarizantes justo después de la activación
de la corrienúe muscarfnica evocó la corriente T¡oo como consecuencia de la activación
de la cascada de los inositoles fosfato y del consiguiente incremento de La
concentración de calcio intracelular (149, 159). I¿ ausencia de esta corriente se utilizo
como control de que las respuestas producidas por la aplicación de ACh no eran
debidas a receptores muscarínicos.
Ftgura 12: Corriente de cloruro evocada por ACh 100 pM en un ovociüo de Xenopus laevis a tn
potencial de me¡nbrana de -60 mV. La flecha indica la aplicación de Ach. El recuadro muestra la
corrienúe T¡" inducida por pulsos hiperpolarizanfes, desde {0 mV hasta -140 mV en incrernenüos de
20 mv, tras evocarse la respuesta muscarÍnica- El potencial de filación fue de -20 mv.
Ar
f oo nAl_2 c
úl
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Rer;ulkfus
r.2'RESPI.]ESTAS A ACh EN OVOCITOS INYECTADOS CON MEMBRANAPURIFICADA PROCEDENTE DE Toryetu mamnrata.
1.2.1- [rcorporación del nAChR en Ia membrana del ovocito.
En ovocitos previamente inyectados con membrana purificada de electroplaca
de Tbrpdo marmorata y con el potencial de membrana fijado a -60 mV, la aplicación
de ACh 100 ¡rM en el medio de superfusión evocó en un 64% de las células (30 de
47), una respuesta compleja, como se muestra en la Figura 13A. Esta corriente podría
estar formada por la suma de la corriente activada por los receptores muscarínicos
nativos del ovocito y la corriente del canal iónico asociado al receptor nicofnico
inyectado, si bien el primer componente de la corriente podría ser, por su morfología,
el componente D1 de la corriente muscarínica.
10 nA I20E
Flgura 13: Corrientes evocadas por la adiciÍn de ACh l0o pM al baño de superfrrsión en un ovociüoinyectado con membrana purificada. El potencial se fiió a -60 mV. A) En ausencia de sulfaüo deahopina. B) Tras la incubación con zulfaüo de akopina 0,5 ¡rM. I a* barras indican el tiempo deaplicación de ACh 100 ¡rM.
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Capíútlo I
Para discernir entre si dicho componente pertenecía al canal asociado al
receptor nicotínico exógeno o bien era sólo parte de la corriente asociada a la
activación de los receptores muscarínicos nativos, se incubó el mismo ovocito con
sulfato de atropina 0,5 ¡rM. En la Figura 138 se muestra la corriente evocada por
ACh tras la incubación con sulfato de atropina. Obsérvese que tras abolir la respuesta
muscarínica permanece una corriente con las características de la descrita para el canal
asociado al receptor nicotínico de Tfupedo.
1.2.2- Curso temporal de la incorToración del nAChR en la membrana de los
ovocitos.
Después de comprobar que la membrana purificada fusionaba con la membrana
del ovocito, el siguiente punto de interés fue determinar la amplitud de las respuestas
en función del tiempo transcurrido tras la microinyección de la muestra. Para ello, seregistraron las corrientes evocadas por ACh 100 pM a un potencial de membrana de-60 mV a distintos tiempos tras inyectar la membrana purificada en el ovocito. I¿Figura 14 muestra un histograma de frecuencia tridimensional en el que se representa
la amplitud de la corriente nicotínica en función del tiempo de registro tras lainyección.
IN 20
Tierpo (horas)160fonpl itu¿ (r¡A) ZOO
-- O
Figura 14: Histograma de frecuencia 3D en el que se expresa la amplitud de las distintas respuestas conel tiempo hanscurrido has la inyección con membrana puriñcada. [¿ corriente se evocó con ACh 100¡rM fljando el poúencial a -60 mV.
Tt:ta)riil,1¿,,:,'
it;:I1tlri:!!i¿"]
ii,l*
6
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Rutilhdm
Del histograma se deducen varias observaciones:
i) Ia mayoría de las respuestas fueron menores de 40 nA, siendo el valor
medio de23 t 7 nA (n: 47).
ii)87 rango de las mismas osciló entre los 0 y los 178 nA.
iii) I-as amplitudes máximas se localizaron entre las 16 y Ias 24 h.
De los experimentos de inyección de membrana purificada procedente de la
electroplaca de Tbryedo nnrmorata se deduce que existe una fusión entre las
membranas inyectadas y la propia membrana del ovocito. I-os receptores incorporados
en las membranas mantienen su c¿rpacidad funcional, pero el tamaño de las corrientes
(de sólo unas decenas de nanoamperios), no permite realízar un estudio exhaustivo de
las propiedades de los receptores transplantados a la membrana de los ovocitos en
cuanto a analizar si éstas han sufrido algún tipo de modificación durante el proceso.
Ello nos llevó a purificar el receptor nicotínico de ACh medianüe columnas de
afinidad, reconstituirlo en una matriz lipídica artificial de composición definida e
inyectarlo en los ovocitos para su estudio electrofisiológico.
1.3- RESPUESTAS A ACh EN ovoclTos INYECTADOS coN EL nAchRPI]RIFICADO Y RECONSTITUIDO.
1.3.1: Incorpor?ción del nAChR en la membrana del ovocito.
En ovocitos inyectados con receptor nicotínico purificado y reconstituido en
lípidos totales de asolectina, se evocaron corrientes iónicas en presencia de ACh
100 ¡rM mientras se mantenfa el potencial de membrana a -60 mV. L¿ respuesta se
observó en un 89Vo de los 200 ovocitos registrados, siendo el valor medio de la
corriente de 139 + 19 nA (Rango: 0- 1,6 ¡¿A). Ia inyección del receptor nicotínico
purificado aportó valores de amplitud de corriente considerables, posibilitando los
estudios funcionales del receptor, hecho que no sucedía cuando el receptor seinyectaba mediante membranas purificadas.
En la siguiente figura se muestran las corrientes obtenidas en un mismo
ovocito mediante la aplicación de dos concentraciones distintas de ACh, donde se
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eaffitlo I
puede apreciar que al incrementar la
aumento tanto en la amplitud de
desensibilización.
concentración del agonista, se produce
la corriente como en la velocidad
un
de
ACh 10 ¡M ACh lo0 pM
figura 15: Bjemplos representativos de corrientes evocadas por dos concenhaciones de ACh a un
poüencial de fijación de -60 mV en un mismo ovocito inyectado con nAChR reconstituido. En el baño se
adicionó zulf,ato de atropina 0,5 ¡r.M para abolir la respuesta muscarínica de receptores nativos.
1'3'2- Dependencia de la variedad de los donadores sobre la resmresfa de lss
mu€stras.
Una de las posibles variables que podría afectar a la incorporación de los
receptores en la membrana de los ovocitos, y por tanto, al valor de la amplitud de la
corriente evocada por ACh, es el donador. Dicha posibilidad se analizó en diversos
donadores haciendo uso de una misma muestra en la inyección de receptores. En
todos los ovocitos se inyectó un mismo volumen de muestra de 100 nl, y la corriente
fue siempre evocada por ACh 100 ¡rM. [¿ muestra recién procesada se utilizó en elprimer donador (Xenopus-rcm%) y se guardó congelada en nitrógeno líquido enpresencia de un crioprotector (trehalosa) para ser usada en los siguientes donadores
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Res¡ulá'dos
tras una descongelación nípida y homogenización. En la siguiente tabla se presentan
los datos de la corriente nicotínica obtenida en los diversos donadores.
DONADOR CORRJENTE (nA) CONGELACIÓN
Xenopus-l60293
Xenopus-010693
Xenopus-l40693
319 + 87 (n:4)
307 + 77 (n:7)
209 + 54 (n:6)
425 + 163 (n:7)
NO
SI
SI
SI
Tabla 1: Corrientes evocadas por ACh 100 ¡rM en ovocitos de diferenúes douadores mantenidos a
-60 mV. El volumen de invección fue de 100 nt.
El estudio estadístico de los resultados de las amplitudes de las corrientes
señala que no existen diferencias significativas (p> 0,05). Es decir, los diferentes
donadores utilizados no influyen en Ia amplitud de la respuesta. Asimismo, no se
observaron diferencias significativas (p> 0,05) entre la muestra recién obtenida y tras
haber sido descongelada y homogeneizada.
1.3.3- Dependencia del volumen de la muestra inyectada sobre la amplitud de la
corriente.
Para estudiar el efecto del número de los nAChRs inyectados sobre la amplitud
de la corriente iónica, se emplearon dos volúmenes distintos, 50 y 100 nl, de una
misma muestra. Los ensayos se realizaron en un mismo donador al que se le inyectó
el nAChR reconstituido en asolectina con una concentración final de proüeína de
0,34 mg/ml. Las corrientes obtenidas al aplicar ACh 10 ¡¿M a -60 mV a ovocitos
inyectados con 50 ó 100 nl de la muestra fueron de 79 + 24 nA (n: 13) y de 457 +
I37 nA (n: 9) respectivamente (p( 0,01). Debido al incremento en la respuesta
obtenido al aumentar el volumen de inyección de 50 a 100 nl, en los siguienües
experimentos se tomó como volumen normal de invección este último. esto es.
100 nl.
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CapítuIo I
1.3.4- Curso temporal de la incorporación del nAChR en la membrana de los
ovocitos.
El estudio de las amplitudes de las corrientes inducidas por ACh en función del
tiempo transcurrido tras la microinyección, se realizó en 14 células de un mismo
donador e inyectadas con la misma muestra. En todos los experimentos la corriente se
evocó con ACh 100 ¡rM y fijando el potencial a -60 mV. Los tiempos estudiados
fueron de 4, 8, 12, 16, 24, 36 y 48 h tras la inyección. Se desecharon tanto aquellos
ovocitos que no superaron los 10 nA de respuesta máxima, como aquellos ovocitos en
los que no se registraron más de 4 tiempos distintos.
+h th 12 h 2+h
50 nA l_
B16 h 24h
l0 s
56hth
lr \rT11 20 nol_
u
10 I
figura 16: Corrientes registradas en 2 ovociüos a distinúos tiempos has inyectar el receptorreconstituido. I¿s barrx indican la apücación de ACh 100 pM. El potencial de fijación fue de -60 mV.A) Ejemplo de ovocitos que presentan un pico de corrienüe. B) Ejemplo de ovociüos que presentan dospicos de corrienüe.
La respuesta de los ovocitos aumentó normalmente hasta un máximo parÍr
luego disminuir, aunque en algunos ovocitos se observó más de un pico de respuesta,
es decir, la corriente presentaba fluctuaciones con el tiempo. Estos dos
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comportamientos se presentan en la figura anterior, ilustrando en el panel A ia
respuesta típica de los ovocitos que dieron un sólo máximo de corriente y en el panel
B un ovocito representativo de una respuesta con doble pico de corriente.
Los valores de corriente obtenidos en esos 14 ovocitos se normalizaron
respecto del valor máximo de la corriente evocada en cada ovocito (100%) y sepresentan en la Figura 17.
100
-xI
f 7 5al¡lJa-v,l¡¡É' go
¡¡¡cll¡¡?
É25-t4(,É,oIL
0
o f0 20 50
T|ETPO TRAS tNYECCtOt¡ (h)
50
Figura l7: Porcentaje de la corriente máxima evocada con ACh 100 pM frenúe al tiempo transcurridodespués de la inyección del receptor nicotínico purificado. El poúencial de membrana se fijó a -60 mV(n: 14).
Como se puede observar en la Figura anterior, la miíxima respuesta se obtuvoalrededor de las 16 h, valor que coincide con el obtenido cuando la microinyección delos nAChRs se realizó con la membrana purificada (16 a 24 h). Además, se observadespués del pico de amplitud una meseta de respuesta de aproximadamente un 25Vodel valor máximo que perdura hast¿ el final del tiempo estudiado.
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Canítulo I
1.3,5- hopiedades del canal iónico asociado al nAChR.
En este apartado se plantea comprobar si las propiedades funcionales de los
nAChRs transplantados en el ovocito, eran similares o no a las descritas mediante los
estudios de la inyección del clon o del ARNm correspondiente, puesto que la
composición lipídica de las vesículas en las que el receptor había sido reconstituido,
podía haber alterado sus propiedades como canal. Por ello, se analizaron la relación
dosis-respuesta, potencial de reversión, dependencia de voltaje de las corrientes
evocadas por ACh y desensiblhz.aciún del receptor.
1".3.5, 1- Curva Dosis-Respuesta.
La primera propiedad que se estudió fue la dependencia de la corriente iónica
con la concentración de agonista utilizada. Para ello se aplicaron concentraciones
crecientes de ACh, desde 1 ¡rM hasta 1 mM, en cuatro ovocitos inyectados con dos
muestras diferentes de nAChR. Las registros se realizaron fijando el potencial de
membrana a -60 mV. Los resultados obtenidos se muestran en la Figura 18 donde serepresenta el porcentaje de la corriente m¿íxima evocada por ACh frente a la
concentración de ACh utilizada. Tras ajuste de los puntos a una curva sigmoidea, se
obtuvo un coeficiente de Hill de 2,08 y un IC56 de 72 ¡rM, valores que concuerdan
con los datos descritos en la bibliografía para este receptor $6A, rcI, rcZ).
A partir de la amplitud máxima de las corrientes inducidas por una alta
concentración de ACh (1 mM), es posible estimar el número de receptores nicotínicos
incorporados en la membrana del ovocito, asumiendo una conductancia del canal en la
disolución Ringer de 40 pS. (163, 164). Durante el pico de corriente, el cambio deconductancia observado (pico de corriente/(potencial de membrana-potencial dereversión)) fue de 40 ¡rS lo que significa la presencia de al menos I x 106 receptores
funcionales en la membrana del ovocito en un momento determinado.
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Ruulhfus
=.=
Éootnl¡¡3o-v,l¡¡É, +oIl¡lctxza
-6 -+ -3Loc [Ach]
Figura 18: Relación dosis-respuesta. [¿ curva representa el porcent4ie de la mríxima corriente inducidapor diferen&es dosis de ACh a un potencial de fljación de -60 mV en 4 ovocitos (cada uno representadopor un sinbolo diferente) inyectados con nAChR reconstituido.
1.3.5.2- Potencial de Reversión.
Una de las propiedades que caracterrza a los canales iónicos es su selectividad
iónica. La comprobación de que la selectividad iónica del canal no se alteró durante elproceso de transplante al ovocito se efectuó mediante la estimación del potencial dereversión de la corriente. Así, se registraron a diversos potenciales, las corrientes
evocadas por ACh utilizando aplicaciones breves y una baja concentración de ACh (10
¡rM), para evitar la desensibilización del receptor.
El valor medio del potencial de reversión obtenido fue de -5 mV, (el rango
osciló entre -17 y +4 mV) (n: 5), valor próximo a los descritos con la inyección delARNm o ADNc del nAChR en ovocitos (165, 166).
En la Figura 19 se representan las corrientes evocadas por ACh a diversospotenciales de fijación en un ovocito. Si se inteqpolan los valores de corriente
obtenidos a -20 y + 10 mV se obtiene, que para ese ovocito, el potencial de reversión
es de -2 mV.
t
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CaoítuIo I
ACh l0 ¡rll
* 1 0 m V-2O mV-¡f0 mV-80 mV-EO mV
- 1 0 0 m V
II roo na
f 0 ¡
Figura 19: Corrientes evocadas en un mismo ovociüo por aplicaciones breves de ACh a distinüospoüenciales de fijación (indicados en el lado izquierdo de cada regisro). Nótese que el sentido de lacorrienúe cambia entre los valores de +10 y -20 mV. Labarl señala la aplicación de ACh 10 ¡rM. Elnivel de base de los registros de corriente para cada potencial ha sido desplazado arbibariamente.
1.3.5.3- Relación Corriente-Voltale.
La relación corriente-voltaje (I/V) sirve para conocer en todo momento la
conductancia de los canales ionicos. Dicha relación se obtuvo mediante Ia aplicación
de pulsos cortos a distintos potenciales antes y durante la meseta de corriente inducida
por la aplicación de una baja concentración de ACh (10 pM).
En la Figura 20 se muestra en la parte superior del panel A la corrienúe
evocada por la aplicación de ACh en el baño de superfusión y el lugar de aplicación
de los pulsos de voltaje; en la parte inferior, los diversos pulsos de corriente obtenidos
a distintos poüenciales (de -120 a 60 mV en saltos de 20 mV). En el panel B se
representan las relaciones corriente-voltaje tanto instantánea (t: 0) como estacionaria
(medida al final del pulso).
Se observa que la relación coffiente instantánea-voltaje sigue una relación
lineal, lo que significa que la conductancia del canal no es voltaje dependiente. Sin
embargo, cuando se considera la corriente en la fase estacionaria, se obserya una clara
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rectiftcaeión hacia dentro, es decir, el canal pasa más corriente a potenciales más
negativos de -60 mV. Este fenómeno, posiblemente debido a un incremento de la vida
media de apertura del canal con la hiperpolarizacíón, se observó en todos los ovocitos
registrados, aunque su magnitud fue bastante variable.
Aü
I I
re | ñ -Y fq I'no
2 0 s
5OO nA
Corr iente (nA)
Ftgura 20: Dependencia de Voltaje de las corrienües evocadas por ACh 10 ¡rM. A) En la parte zuperiorse muesha la meseta de corrienüe evocada por ACh donde se aplicaron los pulsos y e,lr la parte inferior,las respuestas a pulsos de volt4ie antes (negro) y durante la meseta de corriente inducida por ACh l0 ¡r.M(rojo)' B) Representación de la corrienüe instantínea (0) y estacionaria (o) frente al voltaje, en el mismoovociüo que A. Nótese la marcada rectificación a potenciales negativos en la corrienüe estacionaria.
ResuIá.d¿ts
1.3.5.G Desensibilización del nAChR.
Otra característica bien conocida de los receptores nAChR de Torpedo es surápida desensibiliracíón cuando se aplican pulsos de ACh de larga duración (167,
168). Esta propiedad se ha conservado en los nAChRs reconstituidos e incorporadosposteriormente en la membrana del ovocito. [¿ desensibilización de estos receptoresinducida por aplicaciones prolongadas de ACh 100 ¡rM mostró al menos dos
Voltoje
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CaoítuIo I
componentes y fue similar en magnitud a la que ha sido previamente descrita (167,
168).
La gentamicina, un antibiótico frecuentemente utilizado en el medio de
incubación aumenta la desensibilización de los nAChRs procedentes de clones de
ADNo de Tbrpedo (169). Su presencia afectó la cinética de desensibilización de los
nAChRs reconstituidos (comparar A y B en la Figura 21). Por esta razón,la mayoría
de los registros se reaJizarcn en ovocitos cultivados en presencia de
penicilina/estreptomicina, antibióticos que tienen sólo un pequeño efecta sobre la
desensibilización del receptor nicotínico (comparar A y C en la Figura 21).
c
Figura 2t": Efecúo de los antibióticos en la desensibilización de las corrientes inducidas por ACh(100¡rM). A) Regisko de un ovociüo no expuesüo a antibióticos. B) Corriente evocada en un ovocitoincubado con gentamicina (0,1 mg/ml). C) Ovocito incubado con penicilina (100 UI/ml) yestreptomicina (0,1 mg/ml). D) Ovociúo del mismo donador, incubado en las mismas condiciones que C,e inyectado con receptores reconstituidos congelados en presencia de trehalosa (5 mg/mg proüelna). Lasbarras indican la aplicación de ACh.
Sorprendentemente, aquellos ovocitos que esfuvieron en presencia de
penicilina/estreptomicina y se inyectaron con muestras de nAChR reconstituidas que
habían sido congeladas en presencia de trehalosa, mostraron una desensibilización
significantemente más lenta (ver C y D de la Figura 21).
BA
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Rer,ulá.dos
En la siguiente tabla se presentan los valores de desensibilización de los
diversos grupos, calculados como el porcentaje de reducción de la corriente, medida a
dos tiempos distintos, respecto al valor alcanzado en el pico:
Medio de Incubación Tiempo
10s 40s
No de
Ovocitos
Sin antibiéticos
Gentamicina
Penicilina/estreptomicina
Penicilina/estreptomicina
* Trehalosa
78+ 17
96+6*
83r9
75 + t3#
94+4
N.D.
97+3
92+7#
12
19
28
2A
Tabla 2: Porcentaje de la desensibilización del nAChR inducida por ACh 100 ¡iM. * p( 0,05 enhe Sin
antibióticos y cualquier otro grupo. y p( 0,05 enhe los grupos de penicilina. N. D. : No determinado.
1.3.6 Localización de los nAChRs en la membrana del ovocito.
1.3.6.1- Distribucién de los nAChRs en la membrana det ovocito.
Se analizó la distribución de los receptores a 1o largo de la superficie del
ovocito para saber si se distribuían de forma homogénea o se localizaban en zonaspróximas al lugar de inyección. Para explorar este punto se realizaron aplicacioneslocalizadas de ACh en la superficie del ovocito.
La aplicación de ACh evocó corrientes en ambos hemisferios del ovocito.
animal y vegetal, obteniéndose respuestas cuyo rango de amplitud era de 7 a 2A5 nA y
de 10 a 150 nA respectivamente, para cada hemisferio (10-20 ensayos por ovocito,n: 3). Un ejemplo representativo se muestra enlaFigvra22.
Las respuest¿s a la aplicación de ACh no fueron homogéneas a lo largo de la
superficie del ovocito, existiendo zonas que presentaban claras respuestas y zonas
cercanas a las anteriores que resultaron silentes. Este patrón de respuesta sugería unadistribución de los receptores en "parches" a 10 largo de toda la superficie del ovocito.Analizando las respuestas, se encontró que algunas de las evocadas cerca del lugar deinyección tenían mayor duración que las evocadas en zonas más alejadas. Las
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Caoítulo I
derivadas de las corrientes indicaron que las respuestas evocadas cerca del lugar de
inyección tenían dos componentes, mientras que las evocadas en otros puntos
presentaban un único componente.
j50nA
Figura 22: Aphcaciones de ACh en el hemisferio animal (A) o vegetal (B). C) Derivada de lascorrientes mostradas en A y B en una escala de tiempo expandida. Aparecen dos picos en la derivada dela corrienúe evocada en el hemisferio vegetal, y uno cuando la aplicación se hizo en el hemisferio animal.[¿s flechas indican la apücación de ACh.
1.3.6.2- orientación de los nAChRs en la membrana del ovocito.
Una vez comprobadas las propiedades funcionales de los receproresmicroinyectados, se procedió al estudio de la orientación de los mismos en lamembrana del ovocito.
Para ello, se aplicó en 3 ovocitos, mediante una pipeta y de forma localizada,ACh I mM en las proximidades de la membrana, primero en el espacio extracelular ydespués en el intracelular (ver lVkteriales y lWtodos, apartado II-5.3). Un ejemplorepresentativo se presenüa en la Figura 23.
BA
C
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RxuIbfu
Del experimento se deduce que, al menos la mayoría de los receptores
funcionales esf,ín orientados de la forma correcta, es decir, con la parte extracelular
del receptor dirigida al espacio extracelular, ya que sólo se evoca respuesta cuando la
aplicación se realiza en la superficie externa del ovocito. La aplicación intracelular
originó unos picos en el registro de corriente, que representan artefactos debidos al
incremento de la presión en el interior del ovocito por la aplicación del agonista.
C
Figura 23: Aplicaciones locales de ACh en el hemisferio vegetal de un ovocito cuyo potencial demembrana se flió a -60 mV. A) I¿s aplicaciones de ACh en el espacio exhacelular inducen una corrientetransitoria' B) Las aplicaciones de ACh en el espacio intracelular no producen ningún efecto. Nóúese losnípidos arüefacúos que siguen a los pulsos de ACh. C) Las respuestas se repiten tras volver a aplicar AChen el espacio extracelular. I¿s flechas indican el momento de la aplicación de ACh.
A
B
2 0 s
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Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1996
CanítuIo I
La purificación de la P-gp utilizó como material biológico de partida la
sublínea Ll2t0/160 de leucemia de ratón, gu€ presenta una elevada expresión de la
P-gp en su membrana celular (103).
La fracción celular de partida la constituyó la fracción microsomal de dichascélulas obtenida de acuerdo con el procedimiento descrito en Iulateriales y trulétodos,
apafiado III-1.1. I¿ selección de los detergentes empleados en los estudios desolubilización se hizo atendiendo a aquellos que preservan la actividad ATP-asa de la
P-gp (2, 70,71,72,76).
2.t- 1" ETAPA DE PURIFTCACIÓN DE LA p-gp.
La elección de las condiciones para la solubilización de la fracción microsomalse realizó en base a la eficacia de sotubilización por cada detergente de la proteína
total y de la P-gp.
El estudio de la solubilización de la fracción microsomal de las células LI2l0se inició con Colato de sodio, un detergente derivado de las sales biliares y de carácteriónico. Se eligió como tiempo de solubilización 30 min, émpleando criterios basadosen experiencias anteriores y en datos que aparecen en la literatura (154, 170).Posteriormente, experimentos puntuales a 60 min, confirmaron que la eficaciasolubilizadora del detergente no mejoraba con el tiempo de incubación, si bien sepodla favorecer la desnaturalización de la proteína debido al carácter iónico deldetergente.
Seguidamente se procedió al estudio del efecto de la relaciónproteína:detergente (w/w) en la solubilización. Alícuotas a concentraciones deproteína de l, 2 y 5 mg/ml se solubiüzaron empleando distintas relacionesproteína:detergente (w/w) en un rango entre 1:0,25 y 1:15. De forma global, larepresentación del porcentaje de proteína solubilizada por Colato de sodio utilizando
8t)
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muestras con distinta concentración de proteína y a distintas relacionesproteína:detergente se presenta en la siguiente figura:
IPROTEINAI (mglml)
F gura 24: Represenüación del porcentaje de proteína solubilizada por Colaüo de sodio de la frawiónmicrosomal de las células LI2LalL6a, a distintas concenhaciones de proteína y diversas relacionesproteína: detergente (dw).
I-a' ptoteína solubilizada represenüa alrededor del 20 7o cuando se utiliza unabaja relación proteína:detergente (1:1). Conforme se incrementa la proporción deldetergente en dicha relación, el porcentaje de proteína solubilizada aumenta y paravalores de 1:10 y 1:15, el porcentaje de proteína solubilizada se situa entre el75-80%.
En base a los resultados anteriores, se escogió para solubilizar la fracciónmicrosomal, una relación 1:10 (protefna:detergente) debido a que si se emplea menosdetergente, el porcentaje de proteína solubitizada disminuye. por el contrario,relaciones mayores podían favorecer los procesos de desnaturalización.
A continuación se determinó si la P-gp se tocalizaba en la fracción solubilizadapor Colato de sodio o por el contrario permanecía en la fracción insoluble. En laFigura 25 se presentan las inmunotransferencias correspondientes a los sobrenadantesy sedimentos de muestras de la fracción microsomal de las élulas Ll2\Ollffi tras eltratamiento con el detergente en una relación proteína:detergente de l:10 y posteriorcentrifugación.
NFl
f-r-¡
a
zt r'l
F
s
pmt:det (w:rv)I l : l. l sa l:10Y 1:15
v ^ y ¡ t r ¡ a- ^
l f a
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t¡r
E1
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CanltuIo I
f - h $'p**$ ' l l
Figura 25: Deúección de la Fgp por inmunotransferencia usando el anticuerpo monoclonal C-219 en lafracción microsomal (fm) y en las fracciones soluble (S) e insoluble (P) de Colato de sodiocorrespondiente alas células LIAAlrc0. Las calles contienen 1O ¡rg de proteína y fueron solubilizadascon una relación proúeína:detergente de 1:10. (*) indica la banda que corresponde a la P-gp.
En la Figura 25 se puede observar que toda la P-gp presente en la fracción
microsomal apare,c,e enla fracción insoluble, no detectándose la presencia de la misma
en la fase soluble de Colato, a pesar de la elevada relación proteína:detergente (1:10)
(w/w) capaz de solubilizar un 80% de la proteína total de la fracción microsomal.
A continuación se probaron otros dos detergentes, CHAPS y Zwittergent 3-12,
detergentes de tipo zwitteriónico con escaso efecto sobre la desnaturalízaciín de lasproteínas. Los estudios se basaron en los experimentos previos de la solubilización por
Colato de sodio, de este modo se eligió el tiempo de incubación de 30 min y elproceso se realizó a 4oC.
Alicuotas de 2 mg/ml se solubilizaron a distinfas relaciones proteína:detergente
(w/w) que oscilaban entre 1:1 y 1:10. Los resultados de la solubilización de la P-gp
contenida en la fracción microsomal de las células LL2lDlLffi por cada uno de los
detergenües en función de Ia relación proteína:detergente se muestran en la Figura 26,
donde se presentan las alicuotas más representativas de dicho estudio.
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Rer,ulá.dm
ün;
l':m -,Ft P2
m*gtt
figura 26: Detección de la P-gp por inmunotransferencia en la fracción microsomal (frn) y en lasdistintas fracciones solubles (S) e insolubles (P) obüenidas tras la solubilización con: A: CHAPS a lasrelaciones proteína:deiergente: 1:0,5 (1) y 1:10 (2) y B: Zwittergent 3-12 a las relacionesproüeína:detergente 1:1 (1) y 1:3 (2). I.as calles contienen 10 pg de proteína. (*) indica la banda quecorresponde a la P-gp.
De la Figura 26 *, desprende que tanto CHAPS como Zwittergent 3-12
solubilizan sólo parcialmente la P-gp en todo el rango de las relaciones
proteina:detergente (w/w) estudiadas, no produciéndose en ningún momento una
solubilización preferencial de la P-gp en una de las dos fases.
Consecuentemente, de los tres detergentes utilizados, CHAPS, Zwittergent 3-
12 y Colato, el escogido va a ser Colato de sodio, debido a que toda la p-gp
detectable aparece exclusivamente en Ia fraccíón insoluble del. detergente, que
representa aproximadamente eI2O% de Ia protefna total.
2.2- 2 ETAPA DE PIIRTFICACTÓN DE LA p-gp.
Después de haber solubilizado el 80% de la proteína inicial en la fracción
microsomal y haber "concentrado" toda la P-gp en el sedimento insoluble por Colato
de sodio, se procedió a la búsqueda de un detergente aapaz de solubilizu la P-gp. En
esta etapa se volvieron a emplear los otros dos detergentes, CHAPS y Zwittergent
3-12, usados en la primera etapa de purificación.
Las condiciones fueron las mismas que se emplearon en la primera etapa, es
decir, 30 min de incubación a 4oC. Iá concentración de proteína inicial se mantuvo
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Capíútlo I
entre 1 y 2 mglml a distintas relaciones proteína:detergente en un rango que iba desde
l : I hasta 1: 15.
A continuación se presentan en las siguientes inmunotransferencias los
resultados más representativos de la solubilízación de la P-gp por cada uno de los dos
detergentes:
rsr#iE
f;ii *
Flgura 27: Inmunodeüección de la P-gp en distintas fracciones solubles (S) e insolubles (P) por: A:CHAPS a relaciones 1:5 (1), 1:10 (2) y 1:15 (3). tás calles contienen 10 ¡rg de proteína. B: Zwittergent3-12. Ia primera calle contiene Q pg y la segunda 10 pg de proteína. Se empleó una relaciónproúeína:detergenúe de 1:5. (*) indica la banda que corresponde a la p-gp.
Tal como se observa en la Figura 27, la incubación de la fracción insoluble por
Colato con CHAPS solubiliza muy poca P-gp, y no se consigue mejorar el grado desolubilización cuando se disminuyelarelación proteína:detergente (panel A, calles 2 y3). En cambio, cuando la incubación se realiza con Zwittergent 3-12, aparece la P-gpexclusivamente en el sobrenadante, no detectándose en la fracción insoluble (panel B).
El empleo de N-octilglucósido o Nonidet P-40, dos detergentes de tipo noiónico utilizados también en el aislamiento de complejos proteícos y estudios dereconstitución, no mejoró el rendimiento de solubilización de la P-gp de la fracciónresulüante del primer paso de purificación.
Por tanto, de los detergentes estudiados para la solubilizaciÍn de la P-gpprocedente de la fracxión insoluble por colato, se elige Zwittergent 3-12, por ser elúnico capaz de conseguir solubilizar con un alto rendimiento la p-gp.
M
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Rer¡uIfa.d¿ts
2.3. BALANCE GLOBAL DE LAS DOS ETAPAS DE PURIFICACIÓN DE LAP-gp-
En la siguiente figura se esquematiza el resultado de la purificación parcial de
la P-gp a partir de la fracción microsomal (fm) de las células Ll2l0ll60. La primera
etapa supone un tratamiento por Colato de sodio (relación proteína:detergente de 1:10
(w/w)) y obtención de la P-gp en ta fracción insoluble del detergente (P1). I¿
segunda etapa de solubilización de la fracción Pl por Zwittergent 3-12 (relación
proteína.detergente de 1::5 (w/w)) rindió la P-gp en la fracción soluble (S2).
12 3 4 5
1."'
6 kDa
- 200
- 116*97
66
Figura 28: Inmunodeüección de la P-gp en las distintas fracciones empleadas en la purificación de laP-Sp. 1) fracción microsomal de las células L1210/S, 2) fracción microsomal de las células LI2LO/I60,3 y 4) fracciones insoluble y soluble procedentes de la la etapa de purificación (solubilización conColato de sodio), 5 y 6) fracciones insoluble y soluble procedentes de Ia 27 etapa (solubilización conZwittergent3-12). I.as, calles L-4 contienen 5 ¡*g de proteína y las S y 6lO p"g.
El balance global del contenido relativo de la P-gp en cada una de las etapas depurificación se recoge en la siguiente tabla:
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(aoúhtlo I
Contenido relativo
de proteína
Contenido relativo Factor de purificación
FRACCION
fm
P1
S2
1,0
0,2
0,1
de P-
1
* l
: Y I
aparente de P
I
=5
^ ,10
Tabla 3: Valores relativos de proüeína üotal y P-gp en cada una de las etapas de purificación de la P-gp.
I-os resultados de la purifiqción parcial de la P-gp concluyen que en la
fracción solubilizada con Zwittergent 3-12 (S2), la P-gp se encuentra purificada unas
10 veces con respecto a la fracción microsomal de partida (fm). Dado que no se
detecta la presencia de la P-gp por Western-Inmunotransferencia en ninguna de las dos
fracciones desechadas en la purificación (S1 y P2), el rendimiento conseguido en la
purificación puede considerarse satisfactorio.
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Reslulá.dos
3- MEDIDAS DB FUNCIONALIDAD DE LA P-gp,
3.1- TNCORFORACTÓN On LA p-gp EN LA MEMBRANA DE OVOCTTOS.
El anrílisis de la funcionalidad de la P-gp se efectuó a través de la nueva
metodología que se presenta en esta Memoria (apartado II de Materiales y luIétodos) y
cuya efectividad ha sido comprobada en otra proteína de membrana, el nAChR (ver
págs 64-79 del apartado de Resultados de este Capítulo).
I-as muestras procedenúes tanto de la fracción microsomal de células L1210(fm) como de la primera etapa de purificación con Colato de sodio (Pt) (ver páginas
80-83) se inyectaron directamente en los ovocitos, mientras que las procedentes de la
solubilización por Zwittergent 3-12 (S2) (ver páginas 33-84) se sometieron,
previamente a ser inyectadas, a dirflisis exhaustiva para eliminar el detergente de la
muestra.
Inicialmente se procedió a determinar la inco¡poración de la P-gp en la
membrana del ovocito, púa lo cual, la membrana plasmática del ovocito se aisló
siguiendo el método descrito por Sadler y Maller (155). La presencia de la P-gp se
detectó mediante Western-Inmunotransferencia, tal como se ha venido describiendo enel apartado de Purificación de la P-gp.
ü
2Mw_ 200
t ' ' r ' t { - l 1 6
. -979 -66
_45
Figura 29: Irrmunodeüección de la P-gp en las Buestras de las membranas de: 1) 20 ovocitos sinnyetat. 2) 2O Ovociüos inyectados con 450 ng de proteína de Ia fracción Pl. (*) indica la banda quecorresponde a la P-gp.
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CanítuIo L
Se puede observar en la figura anterior la presencia del marcaje
correspondiente a la P-gp únicamente en la calle 2, que es la que corresponde a los
ovocitos inyectados con la fracción Pl. De este resultado se desprenden dos hechos
importantes:
i) la membrana de los ovocitos no presenta niveles detectables de la P-gp.
ii) la P-gp inyectada se incorpora en la membrana del ovocito.
Además, aparece marcada una proteína de unos 90 kDa en las dos muestras, es
decir, una proteína perteneciente a la membrana nativa de los ovocitos. Se ha podido
comprobar que el marcaje se debe a que el anticuerpo secundario se une a dicha
proteína.
3.2- ACTTVIDAD DE LA p-gp COMO TRANSPORTADOR DE FÁRMACOS.
I¿ actividad de la P-gp como transportador de f¿írmacos se comprobó mediante
la incubación de los ovocitos inyectados con la fuaeción microsomal, P1 o 52
procedentes fanto de las células L121.0/160 (expresan P-gp) como de las células
L121.0/S (ovocitos controles), con una mezclade DNM y 3H-DNM.
En el 71,43 % de los ovocitos inyecados con fm, 85,7I% de los inyectados
con Pl y en el 83,33% de los inyectados con 52, se obtuvo una menor acumulación
de DNM en aquellos ovocitos que fueron inyectados con muestras que contenían la
P-gp. Los niveles de acumulación de DNM en ovocitos control (inyectados con
muestras sin la P-gp) y en ovocitos sin inyectar, fueron similares.
La adición de vRP (10-100 ¡rM), un reversor de Ia acumulación de
antraciclinas en las células MDR (68) al medio de incubación, provocó un incremento
en los niveles de acumulación de DNM en los ovocítos inyectados con la P-gp
respecto a los ovocitos controles. Curiosamente, los niveles de acumulación de DNM
en los ovocitos inyectados (independientemente de que la muestra inyectada
contuviera o no la P-gp) y tratados con VRP eran menores que los referentes a los
ovocitos sin inyectar.
A partir de los niveles intracelulares del fármaco, se calcularon los valores de
DNM transportada por la P-gp mediante la diferencia de los niveles intracelulares de
la antraciclina entre los ovocitos controles y los ovocitos inyectados con la P-gp. Tras
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Rxulbdt¡^s
la norrnalización de estos valores frente a la cantidad de proteína inyectada se obtiene
Ia siguiente tabla:
Transporte de DNM
(pmoles DNNf/mg proteína)
MUESTRA DNM DNM + VRP
fm
P1
S2
236 + 33 (n: 5)
707 t 123 (n:10)
1554 + 336*** (n: 4)
153 + 55 (n:4)
259 + 165 (n:2)
N.D.
Tabla 4: Eflujo de DNM por la P-gp en ausencia y presencia de VRP (10-100 ¡rM) en ovocitos
inyecüados con fm (fracción microsomal), Pl (muestra procedente del ler paso de purificación) y 52(muestra producto del 20 paso de purificación). N. D. : No Deüerminado
I-os datos presentados en la Tabla 4 indican que:
i) los ovocitos inyectados con fracciones de membrana que contienen Ia P-gp
presentan actividad de transporte de DNM.
ii) Ia actividad transportadora se incrementa con el enriquecimiento de P-gp
en las muestras inyectadas: los ovocitos inyectados con la fracción 52 presentan una
mayor actividad transportadora que los inyectados con P1, y éstos a su vez una mayor
actividad que los inyectados con ftn (en este último caso el nivel de significación entre
los dos grupos se sitúa muy cerca de 0,05 concretamente p: 0,053).
iü) El transporte de DNM por la P-gp se ve reducido por la presencia de VRP
en el medio, confirmando un efecto específico del reversor sobre la actividad
transporüadora de la P-gp.
Una vez confirmada que las diversas muestras enriquecidas en P-gp yposteriormente inyectadas en ovocitos de knopus presenüan actividad de transporte defármacos, se procedió al estudio de la actividad de canal de cloruro reguladora devolumen celular asignada a la P-gp (128).
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Caoftub I
4.I.- CORRIENTES NATTVAS ACTIVADAS POR HIPOTONICIDAD.
El aniílisis de la actividad de la P-gp como canal de cloruro activado por
volumen, se inició con el estudio de las corrientes nativas que se podían inducir en los
ovocitos de Xenopus laeuis en respuesta a cambios hipotónicos.
Las disoluciones empleadas para la activación de corrientes de cloruro por
hipotonicidad derivan de la disolución Ringer de Rana (RN), donde se ha disminuído
la concentración inicial de NaCl, de 115 mM en RN a 75 y 45 mM y de ahora en
adelante se denominaftín RH-75 y RH-45 respectivamente. En primer lugar se calculó
el valor de las osmolaridades de estas tres disoluciones, obteniéndose, para n: 2, los
siguientes valores: 220,5 + 3,5 mosm para RN; 150,0 + 0,0 mosm para RH-75 y
95,5 + 0,5 mOsm para RH-45, con 1o que se dispone de dos medios hipotónicos cuyas
osmolaridades se corresponden respetivamente con eI70Vo y 45% de la osmolaridad
del medio isotónico (RI.D.
El 48Vo (9 de 20) de los ovocitos a los que se les eliminó el epitelio ovárico
interno respondieron ante la exposición a un medio hipotónico (RH-75 o RH-45) con
la activación de una corriente iónica que, en general, se inicia con un componente desalida, debido fundamentalmente al movimiento a través de la membrana plasmática
de iones potasio (único ión cuyo potencial de equilibrio se sitúa a un valor más
negativo que el potencial de fijación de la membrana) seguido por un segundo
componente de entrada. Tanto la amplitud como los tamaños relativos de las dos fases
de la corriente fueron muy variables entre los ovocitos de diferentes donadores. [¿s
corrientes eran totalmente reversibles cuando el medio volvfa a ser RN y podían
evocarse varias veces en el mismo ovocito, aunque la amplitud en algunos ovocitos
disminuía tras las contínuas superfusiones con medio hipotónico. ["a Figura 30 ilustra
un registro contínuo del nivel de corriente y el cambio de conductancia de lamembrana de un folículo cuando se expone al medio hipotónico RH-45. Se pueden
observar en esta fi.gura los dos componentes de la corriente, el incremento de la
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Res;ulk&x
conductancia en la membrana en el medio hipotónico y cómo la corriente regresa al
nivel inicial cuando se vuelve a superfundir con el medio isotónico.
RH-45
0 m V
Figura 30: Cambio en la conductancia de la membrana de un folículo ovárico al c¡mbiar el medio desuperfusión de RN a RH-45. El potenciat de membrana osciló continuamente en pulsos cuadrados entre-50 y -70 mV.
4.1.2- Características de Ia corriente.
En la Figura 31A se presenta un folículo al que se le aplicaron pulsos
despolarizantes de voltaje desde -100 mV hasta *80 mV, primero en el medioisotónico RN y a continuación en los medios hipotónicos RH-75 y RH-45 en los que
se observa una corriente que desaparece cuando se vuelve a superfundir con el medioisotónico (RN post.). Nótese que la amplitud de la corriente se incrementa con elgrado de hipotonicidad del medio de superfusión.
La Figura 318 representa el porcentaje de la corriente m¿íxima en función delvoltaje aplicado en dos medios con distinto grado de osmolaridad (RH-45 y RH-75).Como se puede observar en la curva UY,la corriente exhibe una cierta rectificación
hacia fuera.
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RItl post
%CDRRIB{TEMAXIMA
-r-RH-75-o- RH45
Flgura 31: A) Corrienües evocadas por pulsos de voltaje de 800 ms en un ovociüo superfrrndido conRinger Normal (RN), Ringer Hipotónico (RH-75) y tras su vuelta a Ringer Normal (RN post) sesuperftrndió con Ringer Hipotónico (RH-45). En esta figura y en las que siguen, el nivel de base de losregistros de corriente en los medios hipotónicos ha sido desplazado hasta el misno nivel de loscorrespondienúes a los medios isotónicos. B) Relación I/V de las corrienües nehs evocadas en medioshipotónicos en 4 ovociios.
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Res¡ulkús
El umbral de activación de la corriente se situó por encima del valor deosmolaridad del medio RH-75 (150 mosm) puesto, de estar presente, pudo sersiempre evocada en dicho medio.
El valor medio de la conductancia de la corriente activada por mediohipotónico, calculada entre -50 y -70 mv, fue de 4,10 + 1,00 pS (Rango: 2,65- 6,g0pS) en 4 ovocitos superfundidos en el medio hipotónico RH-75 y de 7,80 + 1,83 pS(Rango: 4,65- lz,w pS) en 4 ovocitos superfundidos en el medio RH-45 (p< 0,05test t de Student pareado).
'', La amplitud miíxima de las cofrientes activadas por RH-75 y RH-45 a *g0mV fue calculada mediante la extrapolación a t: 0, incluyéndose únicamente aquellosovocitos que fueron superfundidos previa y posteriormente con RN. El valor medio dela amplitud nr¡íxima fue de 1859 + 31.1 nA (Rango: 1134- 2997 nA) en 5 ovocirossuperfundidos en el medio hipotónico RH-75 y de 2326 + 4I9 nA (Rango: 1015- 3760nA) en 6 ovocitos superfundidos en el medio RH-45.
I'a cornente presenta una inactivación tiempo-voltaje-dependiente a potencialesmás positivos de + 10 mV (Figura 31A), es decir, su inactivación con el tiempo seincrementa con el aumento del potencial de membrana. La constante de tiempo deinactivación (c) calculada a +80 mV, es de 367 ms (n: l) en RH-75 y de 510 t 170ms (n: 4) en RH-45.
El potencial de reversión fue de -54 t 4 mv (n:4) para RH-45 y de -4g + 3mV (n: 4) par:a RH-75, (p< 0,05 test t de Student pareado). Esfos valores se sitlíanentre los valores de los potenciales de reversión de los iones potasio (-105 mV) ycloruro (próximo a 0 mV), 1o que implica la contribución de al menos dos canales enesta corriente, uno de potasio y otro de cloruro. I-os valores del potencial de reversiónobtenidos indican que la corriente presenüa una mayor conductancia relativa a potasioen el medio más hipotónico.
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CapíAlo I
4.1.3- Efecto de fámracos antitulrrorales sol¡re la corriente.
La adición en el baño de superfusión de VRP 100 FM, o Quinidina 100¡rM,
sustratos que son transportados por la P-gp y que han sido descritos como inhibidores
de las corrientes activadas por volumen en las células NIH-3T3 que sobreexpresan
P-gp (128), no alteró las corrientes generadas en los folículos por el medio
hipotónico. Del mismo modo, la adición de otros sustratos transportados por P-gp
como DNM 3 ¡rM o Forskolina 100 pM, tarnpoco alteraron la corriente, aunque en el
caso de la Forskolina se observó una pequeña reducción en la amplitud de la
corriente. En la Figura 32 se ilustra un ejemplo represenlativo de un ovocito al que se
aplicó DNM 3 ¡rM después de haber activado la corriente mediante la superfusión del
mismo en RH-45. Posteriormente y tras lavado con el medio RN, el mismo ovocito se
superfundió por segunda vez en el medio RH-45 y entonces se aplicó VRP 100 ¡rM.Nótese que la presencia de estos sustratos no alteró la corriente activada por
hipotonicidad.
a.II-4s
5oo nA l_
fll mV70 mV
l min
DNM
Figura 32: Carnbio de conductancia de la membrana de un folículo ovárico al pasar de RN a RH-45. l¿aplicación de DNM 3 ¡,cM o VRP 100 pM en el medio RH-45 no produjo alúeraciones en la corriente
activada por hipotonicidad. El potencial de membrana se hizo oscilar entre -50 y -70 mV me<liantepulsos de corüa duración.
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Besulttúts
4.1.4- Bfecto de la desfoliculación por colagenasa sobre la corriente.
Los folículos de knopus laeuis sufren un proceso de desfoliculación mediante
un tratamiento enzimático por colagenasa (apartado II-3 de lVfateriales y lWtodos)
antes de ser microinyectados con las distintas muestras.
Una vez tratados con colagenasa, se redujo tanto el porcentaje de los
donadores como el de los ovocitos que respondieron ante un medio hipotónico (RH-75
o RH-45) con la activación de una corriente iónica: de un 69% al25% (8 de 32) en
los donadores y de un46Vo all9Vo (15 de 77) en el caso de los ovocitos. También la
amplitud de la corriente disminuyó con respecto a los folículos, así, a + 80 mV y
t:0 ésta pasó desde 1859 + 311 nA hasta 752 +254 nA en 3 ovocitos
superfundidos en el medio RH-75, y desde 2326 + 419 nA hasta 939 +226 nA en 6
ovocitos superfundidos en el medio hipotónico RH-45, es decir, la amplitud se redujo
en un 6AVo debido al tratamiento de desfoliculación por colagenasa. Se han excluído
del cálculo de la amplitud de coniente, los ovocitos de un donador (XEN-250496) que
tuvieron corrientes especialmente grandes (hasta 8,8 ¡rA).Las demás características de la corriente no se alteraron con la desfoliculación
enzímática. En la siguiente figura se ilustra en el panel superior un ejemplo de los
registros de corriente de dos ovocitos desfoliculados enzimáticamente a los que se les
aplicaron pulsos despolarizantes de voltaje, desde -100 mv hasta +80 mV, en elmedio isotónico RN y en el medio hipotónico RH-45. En A se presenta un ovocitoque no respondió ante la exposición al medio hipotónico con la activación de unacorriente iónica, y en B un ovocito que si la presentó. Obsérvese que en este último
caso, la corriente presenta la misma morfología que la evocada en un ovocito al que
se le eliminó manualmente el epitelio oviírico, como se muestra en la Figura 31A. En
el panel inferior de la Figura 33, se presentan las curvas VV de ambos ovocitos, enlas que no se aprecia una variación de la conductancia del ovocito A ante la
exposición del mismo a un medio hipotónico, mientras que si se aprecia en el caso del
ovocito B. Nótese que la curva I/V correspondiente al ovocito del panel inferior es
similar a la obtenida en los folículos (Figura 31B).
9s
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Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1996
{:asihtfu I
VOLTAJE (mV)
F¡gur¿ 33: Corrientes evocadas por pulsos de voltaje de 800 rns en dos ovocitos desfoliculadosenzimáticamente y superfundidos con Ringer Normal (RN), Ringer Hipotónico (RH-45) y vuelta aRinger Nonnal (RN post). Obsérvese la aparición de una corriente activada por cambio de volumencuando se superfrrnde el ovocito A con el medio RH-45 y la ausencia de ta misma cuando essuperfundido con el mismo medio el ovocito B. C) Relación VV de las corrientes evocadas por mediohipotónico en los dos ovocitos A y B.
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RcsulA&s
4.2- CORRIENTES EN OVOCITOS INYECTADOS CON LA P-gp.
Después de haber estudiado las corrientes nativas activadas por hipotonicidad,
se procedió al estudio de este tipo de corrientes en ovocitos previamente inyectados en
muestras que contienen la P-gp y los resultados se compararon con los obtenidos con
el estudio de las corrientes nativas. El estudio se amplió a ovocitos inyectados con
muestra procedente de las células sensibles que no conúene la P-gp, (control) y a
ovocitos inyectados con muestra de diversos grados de riqueza en P-gp (Pgp+). El
medio hipotónico empleado en la rnayoría de los,estudios fue RH-45 puesto que el
tamaño de las corrientes evocadas son mayores en este medio que en el medio RH-75.
En el 90Vo (36 de 40) de los ovocitos control y en el 94% (169 de 179) de los
ovocitos Pgp+ no hubo activación de una corriente cuando las cáulas se
superfundieron en el medio RH-45. Este hecho podría deberse a que las muestras
inyectadas hubieran perdido su funcionalidad en el proceso de obtención, purificación
o se hubieran hidrolizado en el interior del ovocito.
\ ih:-100mV
RH-75
40mVl250 ms
RH.45
25onAL500 rrs
Figura 34: Ausencia de la acüvación de rna corrriente por cambio de volumen en un ovocito inyectadocon fracción Pl, zuperñrndido con medio isotónico (RN) y con dos medios hipotónicos (RH-75 yRH-45). l:s corrientes se registraron mediante la aplicación de pulsos de voltaje desde -l0O mV hesta
* 80 mV (margen zuperior derecho).
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eaúailo t
No obstante, se pudo comprobar que las muestras mantenían al menos la
funcionalidad transportadora de la P-gp mediante registros simult-¿íneos de transporte
de fármacos y de corriente activada por hipotonicidad. Así, en 6 experimentos donde
se obtuvo una menor acumulación intracelular de DNM en los ovocitos inyectados con
la P-gp (74% de acumulación) con relación a los ovocitos controles (100% de
acumulación), hecho que evidenciaba la incorporación funcional de la P-gp en el
ovocito, no se evocó corriente alguna en el medio hipotónico. En la Figura 34 se
ilustra un ejemplo de un ovocito Pgp+ perteneciente a un grupo en el que se
comprobó la actividad transportadora de DNM y que no se evocan corrientes de
membrana al superfundir la célula con medios hipotónicos.
Vl¡= -lfi) mV
Figura 35: Corrientes evocadas por cambio de volumen en: (A) ovocito control y @) ovocito inyectadocon fracción Pl en RH-45. l¿s corrientes se registraron mediante la aplicación de pulsos de voltajedesde -100 mV hasta + 80 mV (margen superior derecho).
A pesar de que el resultado recogido en la Figura 34 es el mayoritariamente
obtenido, en algunos casos se pudo observar una corriente inducida por choquehipotónico. Así, en el 6% (8 de L25), 4% (2 de 50) y 0% (0 de 4) de los ovocitos
tratados con colagenasa e inyectados con muestras de las fracciones fm, Pl y 52
RII45 Rl{ post
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Rxulkdos
respectivamente, y en el l0% (4 de 40) de los inyectados con muestra control, se
evocó una corriente activada por el medio hipotónico RH-45. En la Figura 35 se
ilustra un ejemplo de un ovocito control y uno Pgp+ que respondieron ante la
superfusión en un rnedio hipotónico con un incremento en la conductancia de la
membrana.
4.2.1"- Características de 14 corriente.
Las características de la corriente evocada en medio hipotónico en los ovocitos
Pgp+ son indistiguibles de las de la corriente nativa, tal como se puede comprobar en
la Figura 36.
%ORRIA\TEMÁXIMA
-r-Noiny.-O*tgr+
Ftgura 36: Relación VV de las corrientes netas evoc¿das en medios RH-45 en ovocitos tratados concolagenasa y no inyectados (n: 13) y en ovoci0os Pgp+ (n: 8).
[¿s dos curvas I/V se solapan a 1o largo de todo el rango de voltaje analizado.
I-a constante de tiempo de inactivación (t) en medio RH-45 a *80 mV fue de 621 X
57 ms (n* 2) y 354 + 63 ms (n: 10) respectivamente para los ovocitos control y
Pgp+. Estos valores no difieren significativamente (p> 0,05) de los obtenidos en los
ovocitos no inyectados (331 + 47 ms, n: 13), lo que significa que las características
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Capífrtlo I
del canal sllpuestamente adicionado en las muestras inyectadas coinciden con las del
canal nativo de los ovocitos.
Como la arnplitud de las corrientes es directamente proporcional al número de
iones que cruzan la membrana celular, la cantidad de corriente debería ser
proporcional al número de canales existentes. De acuerdo con ello, si la P-gp fuese un
canal, la amplitud de la corriente evocada en medio hipotónico debeía ser mayor en
los ovocitos inyectados con la P-gp y además debería correlacionarse con el grado de
riqueza en P-gp de las muestras inyectadas.
Para comprobar si realmente la amplitud de la corriente se veía afectada por la
presencia de la P-gp en la membrana de los ovocitos, se inyectaron muestras con
distinto grado de contenido en P*gp, (fm y Pl) y se calculó la amplitud de la corriente
en medio RH-45, en las mismas condiciones en las que se determinó la corriente
nativa. Los resultados obtenidos se muestran en la Tabla 5:
FRACCIÓN AMPLITUD (nA)
793 x lW (n: 2)
893 L269 (n: 7)
788 x253 (n: 2)
Tabla 5: Valores de arnplitud de la corriente (nA) evocada en medio hipotónico RH-45 a un potencial de+ 80 mV y a t:0 en función del grado de riqueza en P-gp de las mueshas inyectadas en los ovocitos.
Los valores de la amplitud de la corriente en los ovocitos inyectados confracción fm o Pl no difieren significativamente (p> 0,05) de los obtenidos en los
ovocitos inyectados con muestra control y los no inyectados y tratados con colagenasa(939 t 247 nA). Es decir, la incorporación de la P-gp en la membrana del ovocito no
altera en absoluto la amplitud de la corriente nativa. Consecuentemente se deduce que
la P-gp no represente un canal iónico activado por volumen.
control
fm
P1
r00
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Rer¡ul&tfus
4.2.2- Efecto del donador en la aparición de la corriente.
En el pequeño porcentaje de ovocitos inyectados con la P-gp en los que se
indujo una corriente por hipotonicidad, se analizó la respuesta en función del donador
(ovocitos extraídos de un sapo en una fecha determinada). L,os result¿dos se recogen
en la siguiente tabla:
DONADOR NO
INYECTADO
INIYECTADO
CONTROL
INYECTADO
Pgp+
xEN-28/09/92
xEN-12/10/92
xEN-19/10/92
xEN-23/11/92
0(0de2)
0 (0de1)
0 (0de3)
0 (0de2)
2 (2de3)
1 (1de3)
0 (0de5)
0 (0de1)
1 (1de5)
3(3de6)
2(2de3)
2 (2 de23)
2(2de9)
2Qdea)XEN-03/10/94 2 (2 de2)
Tabla 6: Número de casos entre diversos donadores en que se evocó corriente activada porhipotonicidad. Sólo se tabulan aquellos donadores que dieron corriente en ovocitos inyectados con laP-gp.
En 3 de los donadores, aparece corriente activada por hipotonicidad además delos ovocitos inyectados con la P-gp, en los ovocitos de uno o los dos otros grupos. En
cambio, en 2 de los donadores, XEN-1yrc192 y XEN-23111192 sólo aparece la
corriente activada por hipotonicidad en los ovocitos inyectados con muestra que
contiene la P-gp. Pero, dada que la probabilidad estimada de aparición es del 9% para
XEN-19/10192 y del 22Vo para XEN-23111192, se deberían de haber analizado unmínimo de 11 y 5 ovocitos control o no inyectados en cada uno de los donadores parapoder estadísticamente detectar la corriente activada por medio hipotónico en algúnovocito.
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DISCUSIÓN
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&pítuIa I
DEL OVOCITO-,
La incorporación de proteínas de membrana a través de sistemas vesiculares en
células huesped por microinyección representa una vía original que abre nuevas
posibilidades en la caracterización de la actividad funcional de las proteínas de
membrana y de sus mecanismos de regulación.
Esta vía de incorporación funcional de proteínas en células huésped, como
alternativa a la inyección del correspondiente ADNc o ARNm puede resultar
especialmente útil en:
i/ El estudio de los receptores heteroméricos, donde se requiere tanto de la
expresión de cada una de las diferentes subunidades que 1o componen como de su
posterior correcto ensamblaje con la estequiometla adecuada para que sean
funcionales (1.71, 172). Existen en laliteratura cont¡adicciones en resultados a partir
de experimentos aparentemente similares, de expresión de receptores heteroméricos,
por ejemplo distinto número de conductancias en ovocitos inyectados con los ARNm
de las subunidadeS cr, F, y y 6 del nAChR de ratón (173, 174).
ii) Aquellos casos donde el procesado del producto final, esto es la proteína,
pueda experimentar modificaciones postransduccionales. El sistema de los ovocitos
ampliamente utllizado en experimentos de transfección (175), podría no disponer o no
suministrar la requerida maquinaria celular para la elaboración correcta de la proteína
a expresar. Esto podría conducir a que las propiedades de la proteína expresada en los
ovocitos fueran distintas de las de la proteína nativa. Por ejemplo, el nAChR de la
electroplaca de Tbrpedo expresado en ovocitos contiene menor número de residuos de
manosa y oligosac¿{ridos complejos que el receptor nativo, desconociéndose si estos
alteran las características funcionales del canal (176). Por otra parte, el canal de sodio
de Electrcphorus no puede ser funcionalmente expresado en ovocitos debido a una
deficiencia en el procesamiento (177). Otro ejemplo 1o constituye el canal de sodio de
cerebro de rata que presenta diferencias en la cinética de inactivación una vez
expresado en ovocitos (178, 179, 180).
103
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Discusión
iii) El estudio de los mecanismos
membranas en una célula viva, ya que la
vehículo lipídico a tal fin.
La validación de esta nueva estrategia experimental de transplantar proteínas se
ha realizado mediante el empleo del nAChR. La elección de este receptor se basó en
los tres siguientes hechos: ser el mejor canal iónico catacterizado; tratarse de una
proteína mayoritaria en la electroplaca del pez Tbrpedo marmorata, lo que facilita su
purificación; y poder ser ser aislado y reconstituído en membranas artificiales
manteniendo sus propiedades funcionales (181, 182, 183).
1.1- INCORPORACIÓN DEL NAChR EN I,A MEMBRANA DEL OVOCITO
La incorporación del nAChR en la membrana del ovocito se demuestra de
forma explícita mediante el bloqueo con atropina de los receptores muscaínicos
nativos (Figura 13). Este proceso se efectúa en pocas horas, puesto que la presencia
de los nAChRs puede ser detectada electrofisiológicamente transcurridas 4 horas de la
microinyección, no descaruíndose la presencia de algunos receptores en la membrana
con anterioridad a ese tiempo. De hecho, Marsal y cols. (184) describen, de formaparalela a nuestros resultados, la presencia de los nAChRs entre 1 y 2 horas después
de la inyección de membranas enriquecidas en los ovocitos. La razón por la cual no serealizaron registros anteriores a las 4 horas estriba en la fragilidad de las células por
presentar aún la herida de la inyección y en la necesidad de que presenüasen una larga
supervivencia para poder realizar el estudio temporal de la incorporación en la misma
célula.
Se obtuvieron respuestas a ACh en los ovocitos inyectados hasta 60 horasdespués de haber inyectado la muestra, observándose un máximo en las respuestas
entre las 16 y 24 horas (membrana alcalina) y 16 horas (nAChR reconstituído),
valores que no se diferencian de los obtenidos por Marsal y cols. quienes describenque las respuestas permanecen durante varios días produciéndose un incremento de laamplitud a 1o largo de las primeras L6 horas (184). Estos resultados sugieren que la
composición lipídica de las diversas muestras inyectadas no parece ser determinante
del curso temporal de la incorporación, puesto que las distintas muestras presenran
una diferente composición lipídica.
implicados en los procesos de fusión
proteína exógena a incorporar utiliza
de
un
r04
Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
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Canítulo I
Las amplitudes de las respueslas evocadas por ACh en los ovocitos fueron muy
variables, tanto en los ovocitos inyectados con membrana purificada como en los
inyectados con receptor reconstituído, coincidiendo también con los datos de Marsal y
cols. (184). Se observa, sin embargo, que éstas dependen del grado de pureza de las
muestras y de la cantidad de muestra inyectada: al duplicar tanto la concentración del
nAChR (de 4 a 8 nmoles de a-bungarotoxina (142)), como el volumen de las
muestras (de 50 a 100 nl), el tamaño de las respuestas se multiplica por 6.
Adicionalmente, no todos los ovocitos presentaron un sólo máximo de corriente,
observándose en algunos de ellos la presencia de dos máximos relativos. Por el
momento se desconocen los motivos que implican tal diversidad en la respuesta,
pudiendo ser la heterogeneidad de las vesículas inyectadas, tanto en su tamaño como
en la cantidad de receptor, uno de los factores que influiían en la amplitud de las
respuestas, puesto que se ha demostrado que ovocitos de distintos donadores se
comportan de forma similar (Tabla 1).
Aunque las amplitudes de la corriente asociada a los receptores incorporados
son grandes, usualmente de cientos de nanoamperios, las respuestas corresponden sólo
a un número pequeño de los receptores microínyectados. De hecho, el número
estimado de receptores funcionales incorporados a partir de los registros
electrofisiológicos se corresponden con unos pocos millones de los aproximadamente
6 x 1010 receptores que se inyectan en el ovocito (determinados por la unión de
o-bungarotoxina). Es decir, sólo 1 de cada 105 receptores inyectados aparece como unreceptor funcional en la membrana del ovocito. Esta observación puede deberse a:
i) Infuaestimación del número total de los receptores funcionales incorporados
debido a la nípida desensibilización inducida por altas concentraciones de ACh.
Usando la ecuación de Hill y asumiendo un coeficiente de Hill de 2 (i85) se puede
estimar una mayor amplitud de la corriente, entre 2 y 3 veces mayor que la medidadirectamente.
iil fa' inserción de algunos nAChRs en diferentes organelas intracelularespuede conducir a registros electrofisiológicos silentes.
iiil Que una vez que los receptores se insertan en la membrana citoplasmáticapueden sufrir una r:ípido recambio que resultaría en una menor respuesta de laesperada tras la simultiínea incorporación de todos ios receptores inyectados(recordemos que las respuestas permanecen más de 60 horas después de lamicroinyección).
10s
Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1996
Díscusíón
irl Que algunos de los nAChRs pueden ser "silentes", Íro filncionales, tal como
ha sido propuesto para los nAChRs de músculo expresados en la membrana del
ovocito después de la inyección de poli-A (160) o a que han sufrido desnaturalizacíón
durante los procesos de purificación y reconstitución.
v) Una tápida degradación de los receptores dentro de la célula, por 1o que
sólo una pequeña fracción de ellos alcanzaría la membrana.
Desde luego, es posible que más de uno de estos factores contribuyan a la
discrepancia observada. Estas y otras posibilidades van a requerir un mayor estudio,pero es evidente que el número de receptores incorporados es suficientepara permitir
su estudio funcional en detalle. :
Está perfectamente demostrado que los nAChRs resultantes de la inyección delos correspondientes ARNm, se orienüan coraectamente en la membrana del ovocito y
no se distribuyen de forma aleatoria en la superficie de la célula (136). Cuando semapeó la incorporación de los nAChRs reconstituidos en la membrana del ovocito se
encontró que aparecen como pequeños parches distribuídos de forma desigual en losdos hemisferios del ovocito, apareciendo una mayor densidad de parches cerca de lazona de inyección, probablemente debido a la mayor concentración de vesículas quecontienen el receptor en esa zona. La densidad de nAChRs en cada parche fueprobablemente similar en ambos hemisferios debido a que las corrientes evocadas por
aplicaciones locales de ACh en las ¿íreas estudiadas, mostraron las pendientes
máximas similares.
Aunque los ensayos con ACh inyectada indican que los receptores seincorporan con la orientación corcecta, no se excluye completamente la posibilidad deque se presente una incorporación errónea en aquellas áreas donde la respuesta a AChextracelular resultó muy pequeña o nula. Se descarta, sin embargo, que la ausencia derespuesta al inyectar ACh en el interior del ovocito se deba a la hidrólisis de la mismapor esterasas intracelulares, puesto que no se conoce la presencia de acetilcolinesterasaen los ovocitos. Además, la hidrólisis por esterasas inespecíficas del ovocito, debidotanto a su baja especificidad relativa por la ACh como a la cantidad que se inyecta, nosería 1o suficientemente rápida como para impedir la apertura de aquellos canalesiónicos asociados a los receptores que estuvieran próximos al lugar de aplicación.
IM
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Caoíútkt I
1.2- CARACTERISTICAS FUNCIONALES DEL nAChR INCORPORADO.
Las propiedades funcionales de los nAChRs incorporados resultan similares a
las previamente descritas para los nAChRs de Tbrpedo expresados en ovocitos a partir
de sus ARNm o ADNc (160, 164). Así, de la curva dosis-respuesta se obtiene un
coeficiente de Hill cercano a 2 lo que implica una cooperatividad de unión de ACh a
cada una de las dos subunidades c[ presentes en cada receptor para la apertura del
canal (161). El potencial de reversión de -5 mV indica que la permeabilidad del canal
es similar a la previamente descrita para los nAChRs procedentes tanto de ADNc
como de ARNm de Tbrpedo en ovocitos (165, 166), confirmando que la mayor parte
de la corriente parece debida al paso de iones sodio y potasio. Podría tambien tener
cierta permeabilidad a iones calcio pero ésta parece ser menor que la que describen
Mishina y cols. (187) quienes activaban una corriente nativa de cloruro dependiente
de calcio y aumentaban el potencial de reversión a valores más negativos.
La relación I/V obtenida durante la meseta de la corriente inducida por una
baja dosis de ACh (Figura 20B) muestra un potencial de reversión similar al obtenido
en el pico de la corriente, indicando una selectividad iónica similar en ambas fases de
la respuesta. Por otra parte, es de destacar la marcada rectificación de los canales delos nAChRs a potenciales más negativos de -60 mV, hecho que no se ha descritopreviamente en los nAChRs expresados en ovocitos a partir det ADNc de Tbrpedo,que presentan una relación casi lineal (164). Sin embargo, una rectificación similar seha descrito para los nAChRs procedentes de músculo cuando se expresan en ovocitos.Este hecho ha sido adscrito a una dependencia de voltaje del tiempo medio de aperturadel canal (160, t64). La razón por la que se presenta una alta variabilidad en larelación I/V esüí aún por determinar. No obstante, es muy sugerente especular que
esta diferencia funcional entre los nAChRs sintetizados en el ovocito a partir delADNo y aquellos directamente "transplantados" de la electroplaca pudiera deberse a ladistinta glicosilación que posean ambos (176, 188).
La rápída desensibiliz.ación de los nAChRs de Tbrpedo (168) ha sido asimismoobservada en los nAChRs incorporados vía vesicular. De manera interesante, losefectos de los antibióticos como Gentamicina o Penicilina-Estreptomicina en lascorrientes inducidas por ACh, fueron similares a las descritas en el caso de losreceptores procedentes de ADNc (169). Este hecho podía deberse a una directa
107
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Discusión
acción sobre el mismo nAChR, o sobre un efector que regule al receptor, en lugar de
alguna alteración en el procesamiento del receptor por parte del ovocito.
El efecto delatrehalosa en la desensibtlización de la corriente se observó sólo
en aquellos ovocitos incubados con Penicilina-Estreptomicina. Puesto que la trehalosa
sin la presencia de antibióticos no produjo ningún efecto en la desensibilización,'se
sugiere que el crioprotector podría actuar sobre el mismo mecanismo por el cual
Penicilina-Estreptomicina inducen u na rápida desensibili zación.
Finalmente, el sistema de incorporación de proteínas de membrana a través de
sistemas vesiculares admite el uso de muestras recién procesadas y muestras
congeladas, ya que no se han observado diferencias significativas entre las respuestas
obtenidas cuando la muestra se inyectó recién obtenida y cuando se inyectó después de
ser congelada en nitrogeno líquido en presencia de un crioprotector (trehalosa). Así, apartir de varias alícuotas de una misma muestra se pueden rcalizar un gran número de
ensayos sin la incomodidad de tener que inyectar material recién procesado.
Los resultados obtenidos con el nAChR de Tbrydo inyectado vía vesicular en
ovocitos posibilita el estudio de la función y regulación de proteínas de membrana(enzimas, canales o receptores) en un sistema celular distinto del nativo. Como
ejemplo de ello, en la presente Memoria, se recogen los estudios funcionales
efectuados con la Glicoproteína-P, proteína involucrada en el fenotipo de resistencia a
múltiples fármacos que presentan las células tumorales.
r08
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Capltulo I
2- PURIFICACION DE LA P-sp.
Los diversos grupos de investigación dedicados a la purificación de la P-gp se
han encontrado con numerosas dificultades para su consecución: desde la formación
de agregados y unión irreversible (en el caso de columnas de intercambio iónico (77,
78)); a una pobre eficacia (cromatografía de inmunoafinídad (77)); heterogeneidad en
la glicosilación (cromatografía de afinidad con lectinas (2)). Por todo ello, se escogió
como estrategia de purificación una solubilízación secuencial con dos detergentes
distintos.
Se utilizó como material de partida la fracción microsomal de las células
Ll2l0/160 resistentes a Ia antraciclina Daunomicina en lugar de la fracción de
membrana plasmática para minimizar tanto las pérdidas en proteína como el tiempo de
experimentación. I¿ elección de los detergentes empleados se basó en estudios previos
de purificación de la P-gp por otros grupos (2,70,71,72,76), en los que se concluyeque los detergentes que mejor preservan la función ATP-ásica de la P-gp son CHAPS,
Colato de sodio, Tritón x-100, Lubrol PX, c12E8, Zwittergent 3-lZ, quedando
controvertida la acción de N-octilglucósido (71). Por nuestra pafie, los detergentes
utilizados fueron CHAPS, Colato de sodio y Zwittergent 3-12 cuya acción sobre la
actividad transportadora de la proteína es desconocida. Zwittergent 3-12 aparcce comoun detergente prometedor, dado que se ha determinado su gran eficacia solubilizadora
de P-gp en membranas de células CHRB3O (76).
Los resultados de la solubilización de Ia P-gp por CHAPS a partir de fracción
microsomal coinciden con los obtenidos por ei grupo de Doige y cols. (70) en cuanto
a que no se consigue la solubilización total de la P-gp (Figura 26A), a pesar deutilizar altas concentraciones de detergente. Los datos de solubilización con Colato desodio discrepan de los obtenidos por Hamada y Tsuruo (77) en cuanto a que esrosautores logtan una cierta solubilización de la P-gp, hecho no reproducido en nuestro
caso. Del mismo modo, Zwittergent3-12 que parece solubilizar totalmente a la P-gp apartir de membranas de células CHRB3O, sólo consigue solubilizarla parcíalmente dela fracción microsomal de las células Ll2l0lt60 (Figura 268). Estas diferencias en la
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Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1996
Discusión
solubilización de la P-gp son probablemente debidas a la diferente composición
lipídica de las membranas de las células empleadas como material biológico de
partida.
De todo el proceso de purificación, cabe reseñar que:
il Se ha obtenido en dos etapas sucesivas de solubilización una muestra
enriquecida =10 veces en P-gp, lo que supone un notable avance debido al hecho de
que se trata de una proteína minoritana y fuertemente anclada en la membrana
(recuérdese que presenta en su estructura 12 segmentos transmembrana).
iil Se dispone de tres fracciones con distinto grado de riqueza en P-gp, con las
que se puede estudiar la funcionalidad de la misma mediante la nueva técnica de
incorporación funcional de proteínas en ovocitos.
iu) EI coste de la purificación no es elevado, puesto que se reaJíza en poco
tiempo y económicamente resulüa apropiado comparativamente al empleo de, por
ejemplo, anticuerpos monoclonales.
v) La fracción 52 se presenta como un buen material de partida para lapurificación de la P-gp mediante cromatografía de inmunoafinidad: la proteína esüí
solubilizada en presencia de un detergente tipo zwitter y se ha eliminado gran parte de
la proteína inicial.
110
Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1996
Capítulo I
ovocrTo.
3.1- TNCORPORACTÓN nn LA p-gp EN LA MEMBRANA DEL OVOCITO.
':' Antes de realizar cualquier estudio funcional de la P-gp, se procedió a
demostrar que la membrana de los ovocitos no inyectados no contiene la P-gp y que
su presencia es debida a la microinyección en los ovocitos de membranas que la
contienen.
Para la detección de la P-gp, las membranas aisladas del ovocito se aislaron
manualmente en lugar de utilizar procesos de centrifugación diferencial. El método si
bien es más tedioso, supone una garantía con respecto al aislamiento de la membrana
por centrifugación en gradientes de densidad, dado que en este último caso, la
fracción de membrana aislada pudiera verse conüaminada con las vesículas utilizadas
en la inyección, dando falsos resultados positivos respecto de la presencia de la P-gp.
3.2- ACTIVIDAD DE LA P-gP COMO TRANSPORTAD{OR DE FIíRMACOS.
Una vez demostrada la incorporación de la P-gp en la membrana de losovocitos, se procedió a La comprobación de la funcionalidad de la misma mediante
estudios de acumulación intracelular de ffumacos.
En nuestro caso, y considerando que el acceso del f¿írmaco al citoplasma del
ovocito no se ve alterado por el trpo de muestra inyectada, y que además se produce
por difusión pasiva (190), como se ha descrito en otros sistemas celulares (191), la
asignación de que la proteína responsable del eflujo de DNM en los ovocitos es la
P-gp, se ha fundamentado en las siguientes observaciones:
Ii l
Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
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Discusión
i) La acumulación de DNM es menor en aquellos ovocitos que fueron
inyectados con la P-gp, incrementándose la actividad transportadora de DNM a
medida que las muestras con las que se inyectaban los ovocitos se enriquecían en P-gp
No obstante, el incremento de la actividad de transporte de fármacos no
siempre se corresponde con el incremento en los niveles de la P-gp en dichas
muestras: mientras que en el segundo paso de la purificación, la fracción SZ es 2
veces más concentrada en P-gp y presenta una actividad transportadora 2 veces
superior que la fracción Pl, en el primer paso, la fracción Pl presenta 5 veces más
P-gp que fm, pero su actividad de transporte es sólo 3 veces superior. Esta falta de
correlación:i podría deberse fundamentalmente a procesos de desnaturalizacíón ylo
hidrólisis parcial de la bomba por parte de Colato de sodio, acontecimientos que en
presencia de Zwittergent 3-12 quedarían más preservados por la naturaleza del
detergente. A pesar de una pérdida en la actividad transportadora durante el primer
paso de purificación, ésta es inferior a la descrita por Sharon y cols. quienes
estimaron una pérdida del 60% durante la solubilización de la P-gp por CHAPS y la
reconstitución de la misma en proteoliposomas (72).
Aunque en principio se pudiera pensar en diferencias debidas a una distinta
cinética de incorporación de la P-gp en la membrana del ovocito, bien por las
características de las vesícuias, bien por presentar una distinta composición lipídica, la
hipótesis o parece sustentarse con mucha fuerza. Primero porque los tiempos
escogidos para el estudio de la actividad transportadora de la P-gp se situaron
alrededor de las 24 horas tras la inyección (en base al estudio reaiizado con el nAChR
cuya respuesta máxima se situó alrededor de las 16-24 horas, independientemente del
tipo de muestra inyectada: membrana alcalina, vesículas de asolectina). Esta premisa
sugiere que la incorporación de las distintas muestras enriquecidas en P-gp van apresentar una cinética parecida de inco¡poración. Segundo, se ha podido comprobar,
en una serie de experimentos con el nAChR reconstituído en vesículas con distinta
composición lipídica, la incorporación funcional del receptor en la membrana del
ovocito, sin que se observasen diferencias en las amplitudes de las respuestas (192).
ii) gt empleo de VRP, un reversor de acumulación de antraciclinas en células
con fenotipo MDR, incrementa la acumulación de DNM en los ovocitos invectados
con P-gp.
Si bien en estos estudios de reversión, se ha observado una disminución en los
niveles de DNM en todos los ovocitos inyectados, tanto con P-gp como con muesm
t12
Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
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Canftulo I
controi, la acumulación intracelular de DNM en presencia de VRP resultó menor en
los primeros. [,a explicación a este hecho no es clara si bien es posible que
alteraciones en la dinámica de las bicapas inducidas por VRP pudieran dar cuenta de
las modificaciones en la permeabilidad de las membranas de los ovocitos a DNM
(1e3).
l,os resultados ponen de manifiesto que tanto en los procesos de purificación
como en los de fusión con ia membrana del ovocito, se preserva en alto grado, la
actividad de la P-gp, pudiendo demostrarse que se ha producido una incorporación
funcional de la mismaren la membrana del ovocito. Por ello, no se puede descartar la
existencia en la membrana de las células Ll2l0ll60 de otras moléculas con actividad
extrusora de fármacos que además pudieran copurificar con P-gp, si bien por el
momento no hay evidencias de la existencia de tales bombas. No obstante, la
asignación inequívoca de que la función transportadora observada en el ovocito
inyectado es específica de P-gp, requiere de la purificación a homogeneidad de la
proteína y su posterior reconstitución funcional.
113
Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
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Discusión
4- ACTIVIDAD DE LA P-ep COMO CANAL DE CLORURO.
4.L. CORRIENTE NATIVA DE LOS OVOCITOS ACTIVADA FOR
VOLUMEN.
Una vez demostrada la incorporación funcional de la P-gp en la membrana del
ovocito, se procedió al análisis de su controvertida actividad como canal de cloruro
activado por volumen (128). Para ello, se inició el estudio de la corriente nativa
activada por volumen en el ovocito.
Los folículos de Xenopus presentan una corriente nativa activada por volumen
cuyas características hemos podid<l comprobar que concuerdan con las descritas en la
bibliografía (115, 116). Esta corriente fue someramente descrita en los folículos de
Xenopus por primera vez en 1993 por Arellano y Miledi (116), quienes observaron
corrientes de cloruro y potasio inducidas en folículos superfundidos con medios
hipotónicos, cuyas propiedades fueron detalladas en 7994, por Ackerman y cols.(115). En nuestros experimentos, iniciados previamene a la aparición de los trabajos
antes mencionados, (Figura 30) se observan dos fases en la corriente inducida por
hipotonicidad. La primera fase la constituye una corriente de salida, que sólo puede
deberse a iones potasio debido a que es el único ión cuyo potencial de reversión esmás negativo que -70 mV (valor al que se fijó el potencial de membrana del ovocito).La segunda fase, que no siempre aparece, es una corriente de entrada que suele ser demayor amplitud que la primera y se debe a tanto a la entrada de iones cloruro como ala salida de iones potasio, debido a que el potencial de reversión de la corriente enesta segunda fase, alrededor de -50 mV, se sitúa entre los potenciales de reversión depotasio (-105 mV) y cloruro (-25 mV determinado experimentalmente en nuestros
ovocitos), y lejos del potencial de reversión de sodio.
Curiosamente, el potencial de reversión en lugar de desplazarse hacia valoresmenos negativos a medida que disminuye la concentración de cloruro, lo hizo desde-48 mV a -54 mV al pasar desde el medio RH-75 at RH-45. Este cambio en elpotencial de reversión sugiere la existencia de una diferente contribución de las
114
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eapífrilo I
conductancias a los iones potasio y cloruro en los dos medios hipotónicos, en el
sentido de que permean proporcionalmente más iones potasio que cloruro en RH-45
respecto a RH-75. Ello supone la activación por choque hipotónico de al menos dos
tipos de canales, uno de ellos para iones potasio y otro para cloruro, cuyo grado de
activación variaría en función de la osmolaridad del medio.
La corriente se pudo evocar tanto en folículos como en ovocitos desfoliculados
mediante colagenasa, aunque tanto el porcentaje de aparición como la amplitud de la
corriente disminuyó con la desfoliculación. Esta última observación discrepa en cierto
modo con la descrita por otros grupos (115, 1,16) quienes dicen abolir completamente
la corriente con el tratamiento enzimático, si bien las diferencias se puedan deber
posiblemente a una baja eficacia en la eliminación de las células foliculares por la
enzima.
El hecho de que la corriente activada por volúmen dependa del tratamiento de
desfoliculación (manual o por colagenasa) así como del tiempo transcurrido después
de la obtención de los ovocitos (suele desaparecer a los 2-3 días), sugiere que su
actividad est¿í relacionada con la presencia de las células foliculares. Este hecho
parece confirmarse con los resultados obtenidos en el amplio estudio realizado por
Arellano y Miledi (116, 194) quienes inhibieron mayoritariamente la corriente
activada por volumen mediante ei empleo de un bloqueante de las uniones de tipo gap.
A pesar de estas evidencias, todavía se desconoce si los canales estín localizados enlas células foliculares o en la membrana del ovocito, puesto que existe ta posibitidad
de que laproteína que conforma el canal y la que constituiría el sensor osmótico sean
diferentes y estén localizadas en compartimientos separados.
Las identidades moleculares, tanto de los canales que intervienen en la
regulación del volumen intracelular como las de algunas proteínas reguladoras de los
mismos, se desconocen hasüa el momento. Se ha propuesto por diversos autores que
un homólogo de la proteína de mamífero plcm podría intervenir en el proceso de
regulación del volúmen intracelular. pI6¡,, es una proteína de pequeño tamaño (235
aminoácidos) que se clonó a partir de las células de hígado de perro Madin Darby(MDCK), cuyos primeros estudios se realizaron mediante su expresión en ovocitos de
knopus (195) y a la que se le ha propuesto una estructura de cuatro hojas B sin que
se le haya podido predecir la presencia de hélices transmembrana. El papel que
I6
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Discusüq
tendría esta proteína dentro de los procesos de regulación de volírmen está siendo
debatido en la actualidad. Así, Krapivinski y cols. (196) proponen que pI.6 es un
regulador, basándose en los hechos de que la proteína se localiza en el citoplasma y
forma cornplejos con otras proteínas citosólicas, incluyendo la actina y que además, la
sobreexpresión de dicha proteína en células Sf9 no proporciona una actividad de canal
de cloruro. En cambio, Gschwentner y cols. (197) apoyan el papel de pl6¡n como
canal de cloruro, basándose en consiguen abolir las corrientes de cloruro inducidas
por hinchamiento celular mediante el empleo de oligonucleótidos antisentido.
La falta de efecto bloqueante de sustratos transportados por la P-gp
(daunomicina, verapamil, forskolina o quinidina) sobre la corriente activada por
hipotonicidad, es consistente con lo descrito en varios tipos celulares: folículos de
knopus, fibroblastos y en células epiteliales de intestino delgado de humanos,
independientemente de la presencia de la P-gp (115, 1 16, 197 , lg9, Z0I, ZI7).
4.2. ACTIVIDAD DE CANAL DE CLORURO DE I,OS OVOCITOS
INYECTADOS CON LA P-gp.
Los resultados presentados son concluyentes respecto de que la P-gp NOpresenta actividad de canal de cloruro activada por volumen, en base a que:
i) No se ha observado la aparición de una nueva corriente en los ovocitos
inyectados con la P-gp.
iil No hay un incremento en la amplitud de la corriente nativa al inyectar a la
P-gp (Tabla 5).
iii) Cuando aparece, la corriente detectada en ovocitos inyectados con la P-gppresenta idénticas características a las observadas en ovocitos sin inyectar y en los
ovocitos inyectados con membranas control desprovistas de la p-gp.
Si la P-gp fuese un canal de cloruro, hubiera sido esperable que el aumento enel número de canales activados por volumen en la membrana del ovocito tras laincorporación de la P-gp, se hubiera correspondido con un incremento en la amplitudde la corriente macroscópica en medio hipotónico y modificación del potencial deinversión de la corriente desplaz¡índose a un valor más próximo al de cloruro.
El bajo porcentaje de los ovocitos Pgp+ que presentan la corriente activadapor volumen no parece debido a que la proteína hubiera perdido su funcionalidad
IT6
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Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1996
CapítuIo I
durante los procesos de purificación, inyección y fusión en la membrana del ovocito,
puesto que la actividad transportadora de la P-gp se mantiene. De hecho, de ser un
canal de cloruro, la actividad del mismo se hubiera puesto de manifiesto con mayor
nitidez que la actividad como bomba, pues debido a los gradientes iónicos a un lado y
otro de la membrana, el número de iones/s que pueden atravesar la membrana a través
de canaies es muy superior al eflujo de f:írmacos. Además, se dispone de técnicas
electrofisiológicas de excepcional sensibilidad (nuestro sistema posiblemente sea capaz
de detectar la actividad sincrónica de 103 moléculas (canales), asumiendo una
conductancia unitaria de 20-40 pS).
En relación con la discrepancia entre nuestros resultados y los obtenidos por
Valverde y cols. (128), es interesante indicar que Mastrocola y cols. (200)
demostraron la activación de una corriente de potasio y cloruro por shock hipotónico
en fibroblastos de humanos mediante la superfusión de sus células con un medio de la
misma osmolaridad que el utilizado por Valverde y cols. (128). Posteriormente, en
1994, Ehring y cols. (201) registraron una corriente de cloruro activada por
hipotonicidad tanto en los fibroblastos MH3T3 transfectados con MDR-1 como en no
transfectados (control), empleando la mismas condiciones experimentales que otros
autores (728, 129, 198). Recientemente Gschwentner y cols (197) también describen
en sus experimentos la presencia de una corriente endógena inducida por cambio de
volumen en las mismas células. Estas observaciones indican la existencia de una
corriente nativa en los fibroblastos y por tanto oscurecen el papel de la P-gp como
canal de cloruro tras la transfección de los mismos con el gen mdrl.
Por otro lado, nuestros resultados concuerdan con otros estudios que han sido
realizados de modo simultiíneo al tiempo de realización de esta Tesis. Así, Rasola y
cols. (202), no encontraron diferencias entre las corrientes de cloruro activadas por
hipotonicidad en cuatro líneas distintas de células de epitelio que presentaban distintos
niveles de P-gp. McEwan y cols. (130) mostraron valores similares de secreción
transepitelial de vinblastina, fármaco transportable por la P-gp, independientemente de
la activación o no del canal de cloruro activado por volumen en células de
adenocarcinoma de colon T84, que expresan la P-gp (203). Altenberg y cols, (204) no
encontraron canales de cloruro activados por volumen en fibroblastos de hamster
Chino con fenotipo MDR y altos niveles de P-gp. [,os mismos autores describen que
en células humanas de cáncer de mama transfectadas con el gen MDR1 se evoca una
corriente en respuesta a un choque hipotónico, pero concluyen que su presencia no
117
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Discusión
puede contribuir de forma significativa ala regulación del volumen celular (205). En
células de eritroleucemia sensibles y resistentes a vinbiastina tampoco se ha observado
una correlación directa entre los niveles de expresión de la P-gp y la corriente de
cloruro activada por volumen (206,207,208). Recientemente Morin y cols. (209),
concluyen resultados similares utilizando ovocitos de Xenopus para estudiar la
funcionalidad de la P-gp, pero a diferencia del presente estudio, la expresión de la P-
gp se llevó a cabo vía la correspondiente inyección del ARNc.
Kirk y Kirk Qrc) sugieren que sería la existencia de proteínas como
calmodulina o componentes celulares que presentan características similares a ésta y
no la P-gp tal como se había sugerido por otros grupos (128, 2lI, 212, 213), las que
interaccionarían con inhibidores de la P-gp controlando la actividad de canal de
cloruro regulador de volumen.
Quizás el paralelismo (homología estructural, localización, etc.) entre la
proteína producto del gen de la Fibrosis Cística (CFTR) y la Glicoproteína-P, ambos
miembros de la superfamilia de transportadores ABC (214), haya contribuído a ia
adscripción de ciertas funciones a esta última sin el suficiente apoyo experimental.
En la actualidad, la evidencia experimental de diversos grupos apoya la
conclusión recogida en la presente Memoria en cuanto a que la Glicoproteína-P no es
por sí misma un canal de cloruro regulador del volumen celular. Su posible papel
como regulador de tales canales mediante la fosforilación de la P-gp vía proteína
quinasa C (2L5,216) resuita más controverfido, si bien nuestros estudios indican que
üampoco la P-gp modulaía los canales nativos del ovocito implicados en la regulación
de volumen. No obstante, dada la inherente dificultad experimental para elucidar
dicha actividad que razonablemente implicaría interacciones proteína-proteína,
posiblemente interacciones con proteínas de citoesqueleto, etc., la adscripción de una
función reguladora de canales de cloruro a la P-gp necesita un estudio más detallado.
Aunque, los resultados obtenidos por Tominaga y cols. (199) descartan también esta
posibilidad, puesto que la utilización de activadores de la proteína quinasa C no tuvo
ningún efecto sobre la corriente activada por hipotonicidad.
Finalmente, señalar que recientemente, durante la redacción de esta Memoria,
nuestro grupo ha conseguido incorporar funcionalmente en la membrana del ovocito el
canal de cloruro de Tbrpedo CIC-0 (284), mediante microinyección con vesículas
lipídicas. El hecho de que tres proteínas distintas tanto estructural como
funcionalmente se incorporen eficazmente a la membrana del ovocito, confirma la
1r8
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Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1996
CaoítuIo I
potencialidad de esta nueva metodología en el estudio de proteínas de membrana en
ovocitos de Xenopus.
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Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1996
CAPITULO II
REerrBRril{rENTos Er\ERcÉrrcos DE LAScÉr,ur,As p3gg.
Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1996
RESI]LTADOS
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Caoiútlo II
CONDICIONES BASALEü
El estudio de los requerimientos energéticos de las células de la línea P388 se
ha realizado mediante el an¿flisis de los niveles de ATP, consumo de oxígeno y niveles
de lactato. [,os experimentos se realizaron en un medio salino isotónico, en ausencia
de sustratos metabólicos como glucosa y glutamina presentes en RPMI-1640 (medio
habitual de cultivo). [,os resultados se presentan a continuación:
Figura 37: Medidas de los niveles de ATP, lactato y consumo de oxígeno de la línea P388 encondiciones Basales. [¿s barr¿s de error representan la e. s. m. de 1l ( n ( 79.
De esta figura se deduce que:
i) Las células que sobrexpresan P-gp, P388/100, manifiestan niveles de ATP
mayores que las células sensibles indicando que poseen una mayor disponibilidad de
esta molécula, suministradora de la energía necesaria para el eflujo activo de
fármacos. (Recordemos que P-gp tiene dos centros de unión de ATP). Además, los
niveles de ATP de las células resistentes P388/20 son indistinguibles de las células
P388/100 y significativamente mayores que los de las células sensibles.
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P388/S P388/20 P388/100
P388/S P388/20 P388/100
P388/S P388/20 P388/100
122
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Rer,ulá.dos
ii) El patrón de consumo de oxígeno entre las distintas sublíneas celulares es
paralelo al de los niveles de ATP: las células resistentes consumen más oxígeno que
las células sensibles mientras que no se aprecian diferencias significativas entre las dos
sublíneas resistentes. En ensayos realizados en presencia de azída, se comprobó que se
reducía drásticamente el consumo de oxígeno en todas las sublíneas.
iiil No existen diferencias significativas en los niveles de lactato entre las
células resistentes y sensibles, con 1o que se desprende que la víaanaeróbica no parece
influir de modo relevante en las diferencias establecidas en los niveles de ATP entre la
sublínea sensible y las sublíneas resistentes.
Inicialmente se realizaron una serie de experimentos dirigidos a monitonzar el
efecto aislado del fármaco VRP sobre los niveles energéticos de las células P388. Para
ello, las células P388 se incubaron con VRP 5 ¡rM a37oC y transcurridos 120 min se
extrajeron diversas alícuotas en los que se estudiaron los parámetros energéticos antes
mencionados. Los resultados se presentan en la siguiente figura:
a
e8
vá
xVx
a
9i
Y
l<oo:L
fj
<l
3000
o
Itv-
Y!ac)7^
2000
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, 0
0,05
0,04
0,03
0,02
0,0r
q00
1,501 ) S
1,00
0,75q50
0,25
0,00
figura 38: Niveles de ATP, lactato y consumo de oxígeno de la línea P388 en condiciones Basales(barras blancas) y tras incubación con VRP 5 ¡rM durante 120 min. (barras grises). Las barras de errorrepresentan la e- s. m. de 11 1 n 1 79.
PRESENCIA DE DNM Y/O VRP.
P388/S P388,20 P388/100
P388/20
123
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Capítulo II
De la Figura 38 se desprende que:
il La incubación de las células sensibles con VRP durante 120 min no produce
alteraciones significativas en el metabolismo energético de las mismas. En cambio,
altera los correspondientes a las células resistentes: incrementa los niveles de lactato y
disminuye los niveles de ATP y consumo de oxígeno.
ii) VRP anula las diferencias en los niveles de ATP y consumo de oxígeno
entre las sublíneas resistentes, que de este modo se igualan además a los niveles
mostrados por las células sensibles.
888/5
---r-DNM---¡-vf,P+
Hts8/100
ü ¡oooI
.9 zooo
k rO{n
0,04
l------L.t. +
\ \-j
J--- Tt --t-i-l
ffi
Tr==\
\-I!
I-I-I==_I
ffi0 3 0 6 0 9 0 ffi ffi
T
¡-l----l-------¡-_-1-.-¡-¡
60 ffi
,1,¿ f l f l?Á ) '
Yx
0,01
I r sY
x I,uh¡
I i t t \
1
o t )
{--r:-1 ----j--l
-T -r-I5?.--.-....-{..-- ' -rI.-I=-\ lE*_\!.-!
f f i f f i f f iIIDltFo(mn)
Figura 39: Niveles de ATP, lactaúo y consumo de oxígeno de las células P388 en función del tiempo deincubación con DNM 3 pM, en presencia o no de VRP 5 ¡rM preincubado durante 120 min.(4<n< 16). Los símbolos que representan los diferentes grados de signiñcancia colocados encima de unpunüo de la gnifica denota diferencias entre ese valor y el correspondienüs a t=0, mientras que lossituados en el eje de abcisas indican diferencias entre los valores en presencia o no de VRP.
121
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Rer,ultudos
Después de haber determinado los parámetros energéticos mencionados en
presencia de VRP, se procedió al an:ílisis de los requerimientos energéticos de las
células P388 en presencia de DNM en las mismas condiciones en las que se realizan
los ensayos de acumulación de fármacos (131).
De los resultados representados en la Figura 39, se deduce que:
i) La incubación con DNM no afecta de forma significativa, al menos en los
primeros 90 minutos, el nivel de ATP en las células sensibles ni en las células
P388/20,1o que hace suponer que DNM no activa ningún proceso que requiera gasto
energético. En la sublínea más resistente (P388/100) la incubación con DNM reduce
de forma significativa, a partir de los 60 min, los niveles de ATp, 1o que
tazonablemente podría asignarse a la actividad extrusora de fármacos por parte de
P-gp.
d) DNM no altera significativamente el consumo de oxígeno en ninguna de las
líneas celulares. No obstante, los valores en los distintos intervalos de tiempopertenecientes a las células P388/100 presentan una p:0,08 con lo que posiblemente
un incremento en el número de casos estudiados hubiera permitido obtener una
disminución significativa del consumo de oxígeno con el tiempo de incubación.
iii)ta' incubación con DNM tampoco afecta de forma significativa los niveles
de lactato en las células sensibles ni en 1as resistentes. Sólo aparece una disminución
estadisticamente significativa (p< 0,01) en las células P388/100 a los 90 min.
Tras determinar los requerimientos energéticos de las células P388 enpresencia de DNM, se estudió a continuación el efecto de una preincubación con VRPen los mismos. l,os resultados se presentan en la Figura 39, ftazo tojo, e indican que
la presencia de DNM tras la preincubación con VRP durante t20 min, no modificólos niveles de ATP, consumo de oxígeno y niveles de lactato en ninguna de las líneascelulares. Las diferencias entre la preincubación o no con VRP se centranfundamentalmente en las células resistentes, que salvo ciertas excepciones, seproducen durante los primeros minutos en las células p3B8/20 y durante 60 min en lasP388/100.
Como resumen de los resultados obtenidos, se ha confeccionado la siguientetabla donde se esquematízan los efectos aislados de DNM (60 min), VRP (120 min) yDNM (60 min) tras preincubación con VRP (120 min):
r2s
Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d'Alacant. 1996
CapítuIo II
BASAL
DNM
VRP
DNM + VRP
BASAL
DNM
VRP
DNNI + VRP
BASAL
DNM
YRP
DNM + VRP
NIVELES
ATP
CONSUMO
DE'Az
NTvELES
LACTATO
P388/S
r tr l ¡rT I I I
r I I I I
I I I I I
oaaooaottaaaaaaaa,oaa
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P388/20
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P388/r00
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Tabla 7: Esquema de los resultados obtenidos durante el estudio los niveles energéticos de las célulasP388, en condiciones basales, en presencia de DNM (60 min), VRP (120 min) y DNM (60 min) haspreincubación con VRP (120 min).
I-a tabla pone de manifiesto que:
i) La incubación con DNM disminuyó de forma significativa los niveles de
ATP en las células P388/100 manteniendo inalterables tanto el consumo de oxígeno
como los niveles de lactato. Por otro lado, produjo una disminución del consumo de
oxígeno en las células P388/20 que no se refleja en los niveles de ATP y que tampoco
se ve compensado por un incremento en el nivel de lactato.
ü) L'a incubación con VRP disminuyó los niveles de ATP sólo en las células
resistentes, no observándose variaciones en dichos niveles cuando se realizó
posteriormente una incubación con DNM. L¿ disminución del consumo de oxígeno
por VRP en las células resistentes se acompaña de un incremento del metabolismo
anaeróbico.
iii) L'as células sensibles sólo sufren una alteración en el nivel de lactato
cuando se incuban con DNM después de haber sido preincubadas con vRP.
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Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
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DISCUSIÓN
Estudio funcional de la Glicoproteina-P transplantada a ovocitos de Xenopus laevis. Jordi Aleu Vilalta.
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Capítulo II
El estudio de los requerimientos energéticos de las distintas sublíneas de las
células P388 va a permitir profundizar en el conocimiento de los mecanismos de
resitencia a múltiples fármacos. El estudio se ha realizado mediante el an¿ílisis de los
niveles de ATP, consumo de oxígeno y niveles de lactato de las células P388/1@ y su
valor se ha contrastado con el obtenido tanto en las células P388/S (células tumorales
que no presentan el fenotipo MDR) como en las células P388/20 (células resistentes
que no sobreeexpresan en su membrana la P-gp).
1- NTVELES ENERGÉTTCOS DE LAS CÉr,rN¡.S P388/S.
La incubación de las células de la sublínea parental sensible con los diversos
efectores antitumorales no ocasiona variaciones en los niveles basales energéticos
estudiados (AT?, consumo de oxígeno y lactato), lo que indica que esias células no
present¿n mecanismos activos de destoxificación de fármacos.
2- NTVELES ENERGÉTTCOS DE LAS CÉr,UI,NS P3E8/1OO.
Las células P388/100 requieren de un mayor aporte energético que las
parentales sensibles, lo que significa que estas células presentan procesos activos (que
requieren energía) para eliminar a los fiírmacos antitumorales como DNM. Ia
principal fuente suministradora de este aporte extra de energía va a ser la vía aeróbica
del metabolismo energético, de igual forma como se ha establecido en otros tipos
celulares con fenotipo MDR (218, 219, 22A, 221, 222).
Al contrario de 1o observado en las células sensibles, la presencia de DNM
disminuyó de forma significativa los niveles de ATP, indicando que el fi{rmaco
promueve la activación de procesos que requieren energía. Teniendo en cuenta que
esta sublínea es la que presenta una menor acumulación intracelular del fármaco y una
sobreexpresión en su membrana de la P-gp, parece razonable suponer que al menos
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Discusión
parte del aporte energético extra de estas células se deba al bombeo extracelular de
DNM Wr parte de la P-gp con la hidrólisis concomi¿ante de ATP.
[¿s vías aeróbica y anaeróbica del metabolismo energético no presentan
variaciones significativas con la incubación de DNM. El consumo de oxígeno presenta
ligeras variaciones tendentes a diminuir, al igual que las otras dos sublíneas,
mimetizando un efecto "veneno" de la vía aeróbica. Tal disminución, sin embargo, no
parece compensarse por la formación de ATP vía lactato cuyos niveles permanecen
prácticamente inalterados. No parece fácilmente explicable el mayor gasto de ATP en
estas células, sin que exisüa un incremento en la actividad de las vías aeróbica o
anaeróbica. Es posible que las sensibilidades de los métodos empleados en el an:ílisis
del contenido de lactato o consumo de oxígeno sean menores que la correspondiente a
la medida de ATP por bioluminiscencia.
El incremento observado del consumo de ATP por parte de VRP descrito en
varias líneas celulares humanas con el fenotipo MDR (223,224), confirma su papel
de sustrato de la bomba (225). No obstante, a diferencia de recientes observaciones
realizadas por Spoelstra y cols (93), nuestros resultados sugieren que VRP representa
un sustrato competitivo de DNM para su transporte por P-gp, ya que su coincubación
con DNM no incrementa significativamente el consumo de ATp.
La disminución de los niveles de ATP por parte de VRP se acompañó de una
reducción en el consumo de oxígeno, esto es, de la actividad de la vía aeróbica, de
igual forma como se ha descrito en células P388 resistentes a Adriamicina (218) y enmicrosomas de hígado de rata (226). El aporte energético para el transporte de VRPpor P-gp parece suministrarse por vía anaeróbica, que compensaría así la disminución
del metabolismo energético oxidativo al igual que se ha descrito va¡ias líneas celulares
humanas MDR (223, 227, 228).
Aunque la adscripción del principal mecanismo de resistencia celular se deba ala sobreexpresión de la P-gp en la membrana de estas células, no se puede descartar lapresencia de otras proteínas extrusoras de fiírmacos antitumorales, como pudieran serlas proteínas MRP descritas recientemente en células pequeñas de pulmón (229,23q.
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Caoítulo II
3- NIVELES ENERGÉTTCOS DE LAS CÉLULAS P3E8I2O.
El mayor nivel de ATP determinado en las células P388/20 sugiere que éstas
han desarrollado, al igual que las células P388/100, unos sistemas de resistencia a los
fármacos que no presentan las células sensibles, y para los cuales requieren de un
aporte extra de energía.
El empleo del reversor de resistencia a múltiples fármacos VRP, disminuyó en
estas células los niveles de ATP, cuya reposición parece implicar la formación extra
de lactato, al igual que sucedía con la sublínea más resistente P388/100.
A diferencia de 1o que ocurre en las células P388/1m, h presencia de DNM
no alteró de forma significativa los niveles de ATP, aspecto interesante puesto que
estas células no sobreexpresan en su membrana al transportador P-gp.
El hecho de que las células P388/20 no sobreexpresen P-gp en su membrana,
conlleva a plantear que el requerimiento extra de ATP con respecto 1as células
sensibles deberá asignarse a mecanismos de resistencia distintos de la expresión del
transportador. Nuestro grupo ha descrito modificaciones del pH intracelular (pHi)
(103) en estas células, habiendo est¿blecido que éstas tienen un pHi más alcalino que
las P388/S (103), alteración observada asimismo en otras líneas celulares (231, 232,
233,234). Roepe y cols. investigando los mecanismos que causan la alcalinización del
pHi, observaron que la actividad del intercambiador Na*/H* era mayor en las células
resistentes que en las células parentales sensibles, lo que en un principio jusüficaría el
mayor pHi de las primeras. Sin embargo, la expresión de este intercambiador no se
correlacionaba con el incremento del pHi, que a su vez parecía hacerlo con la
expresión de la P-gp (235), indicando que esta última podía actuar también como
bomba extrusora de H+. Posteriormente, observaron que la sobreexpresión de los
genes que codifican estas proteínas dependía del grado de resistencia de las células:
cuando el nivel de resistencia era bajo, se sobreexpresaba principalmente el gen de
Na*/H* y en células con mayores riiveles de resistencia, el correspondiente a P-gp
(235). Estos datos apuntan a que parte de los requerimientos extra de ATP que
presentan las células P388/20 se dediquen a una mayor actividad biosintética por parte
de las células resistentes entre los que se puede encontrar, entre otros, la expresión
acentuada del intercambiador Na*/H*.
1"30
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Discusi6n _
La trascendencia del incremento del pHi sobre la actividad farmacológica deDNM se pone de manifiesto al analizar que DNM presenta en su estructura un grupo
amino ianizable con un pKa entre 7,6 y 8,2 (236), con lo que variaciones en el pH
pueden alterar la proporción entre las especies cargadas y neutras del fármaco. De este
modo, la alcalinización del pHi podía favorecer la menor acumulación de DNM en
las células resistentes mediante:
i) Disminución del influjo de los fármacos: L¿s antraciclinas permean la
membrana por difusión pasiva (236). Habida cuenta de que el gradiente
electroquímico de DNM va a ser la fuerza motriz para la entrada del fármaco en las
células, y puesto que los experimentos de acumulación de DNM realizados por
nuestro grupo en las células P388 se establecen en condiciones de gradiente de
aproximadamente 0,3 unidades de pH en el caso de las células sensibles (P388/S), 0,1unidades de pH en las P388/20 y practicamente 0 en las P388/100 (103), es de
esperar que la facilidad de captación de DNM por las células sensibles resulte mayorque la que presenten las células resistentes. Estas consideraciones concuerdan con lasaportadas por Skovsgaard y Nissen (236) quienes señalan que un incremento en el pH
del medio extracelular con relación al del citoplasma, favorecería el influjo de DNM,incrementándose la acumulación de f¿írmaco, un hecho que ha sido observado envesículas lipídicas artificiales que presentan un gradiente transmembrana de pH(interior acídico) (237). Aunque controvertido, se ha descrito que VRp puede
disminuir el pHi (234) en una línea resistente de células de cáncer de pulmon humanoSw-1573, provocando un aumento en el influjo de los fármacos, y por tanto unincremento intracelular del fármaco antineoplásico.
ü) Aumento del eflujo de los fármacos: Se ha establecido que lasantraciclinas se acumulan en el interior de organelas acídicas (238, 239), un eventoque se vería favorecido en las células resistentes por el mayor gradiente de pH entre elcitoplasma y dichas organelas. También se ha descrito que los compartimentosendosomales acídicos de las células P388 resistentes son mayores que los de lascélulas P388 sensibles (240). Como consecuencia, se favorecería el mecanismo dereducción de fármaco intracelular propuesto por Sehested y cols. (24I), por el cual losfármacos atrapados en el complejo endosomal-lisosomal seían expulsados al exteriorcelular mediante exocitosis, reduciendo el nivel intracelular del mismo, pudiendo sereste último proceso dependiente de energía. Por otra parte, se ha descrito en células
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Capítulo II
MDR que VRP inhibe de forma significativa la exocitosis (242),1o que disminuiría el
eflujo de los fármacos, por tanto, incrementando su concentración intracelular.
iii) Menor unión de DNM en las distintas organelas: Se ha descrito que la
afinidad de unión de los f¡írmacos a las organelas intracelulares es mayor en las
especies protonadas de los mismos. En las células que presentan un mayor pHi, el
equilibrio entre las formas protonada y neutra de DNM se ve desplazado hacia la
formación de especies neutras, con 1o que el fármaco ve disminuída su afinidad de
unión en estas células.
Nuestras observaciones de que la incubación de las células P388/20 con VRP
incremente la hidrólisis de ATP, implicarían mecanismos distintos a la sobreexpresión
de la P-gp. Entre ellos podríamos citar: inhibición del tráfico vesicular intracelular
(ver iÍi ), implicación de otras proteínas extrusoras de fármacos antitumorales (MRP),
incremento en los procesos de destoxificación mediados por el sistema del Glutation
(243,244,245), procesos de reparación de DNA por Topoisomerasas (246,247), etc.
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CONCLUSIONES
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Canclusions
1- l,a microinyección de vesículas de membrana de Tbrpedo marmorata conteniendo
el receptor nicotínico de acetilcolina en ovocitos de knopus laevis, conduce a la
incorporación funcional del mismo en la membrana del ovocito. Tal aproximación
experimental supone una alternativa original y eficaz a la expresión de proteínas de
membrana en el ovocito mediada por los correspondientes ADNc o ARNm.
2'Ia metodología anterior es extensiva a la microinyección de proteínas de membrana
reconstituídas en vesículas lipídicas de composición controlada, como vehículos de
incorporación ala membrana del ovocito.
3- El número de receptores nicotínicos de acetilcolina incorporados por esta vía
resulta lo suficientemente grande así como su estabilidad en la membrana del ovocito,
como para poder realizar estudios detallados de sus propiedades funcionales.
4 Ins receptores se distribuyen por toda la superficie del ovocito, agrupiíndose en
"parches" y orientándose correctamente en Ia membrana, si bien parece existir una
tendencia a localizarre preferentemente en lugares próximos aI sitio de
microinvección.
5- IA microinyección en ovocitos de vesículas conteniendo proteínas de membrana
minoritarias resulta asimismo útil en estudios funcionales de las mismas. Esta
posibilidad se ha explorado utilizando membranas de células tumorales con fenotiporesistente a antineoplásicos, que expresan Glicoproteína-P, proteína ausente en la
membrana del ovocito.
6La incorporación via vesicular de la Glicoproteína-P en la membrana del ovocito seha llevado a cabo con fracciones de membrana progresivamente enriquecidas en laproteína. I¿ actividad transportadora de f¡írmacos de la Gticoproteína-P en el ovocito
se incrementa con el nivel de enriquecimiento de la proteína en las muestras
inyectadas y es modulada por el reversor de resistencia verapamil.
t34
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Canclusionx
7-Los folículos de Xenopus laevis poseen canales de potasio y cloruro que se activanpor hipotonicidad. La desfoliculación de los mismos con colagenasa disminuye o
elimina estas corrientes.
8- En los ovocitos que no responden ante un medio hipotónico con la activación de
una conductancia iónica, la incorporación de la Glicoproteína-P no supone un cambio
en la respuesta silente del mismo a condiciones que promueven el hinchamiento
celular.
I En los casos en los que el ovocito presenta actividad iónica de cloruro y potasio en
medios hipotónicos, la posterior presencia de la Glicoproteína-P en el mismo, no
altera en absoluto las propiedades nativas de las mencionadas conductancias.
10'De las conclusiones anteriores se deduce que la Glicoproteína-P no representa un
canal de cloruro regulador del volumen celular.
II- Las sublíneas de la cepa P388 con fenotipo de resistencia a múltiples fármacospresentan unos requerimientos energéticos superiores a los de la sublínea parental
sensible. El hecho de que la presencia de daunomicina promueva una disminución delos niveles energéticos en las células más resistentes (P388/100), resulta compatible
con: i) el bombeo del ftírmaco al exterior celular por la Glicoproteína-P con lahidrólisis concomitante de ATP; ii) Ia disminución intracelular de daunomicina conrespecto al nivel presentado por las células sensibles.
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npÉworcES
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ANnüca;
I- ELECTRODO-DE CLARK
El electrodo de Clark es uno de los electrodos más selectivos que existen.
Como se muestra en la Figura 40, el conjunto del electrodo está compuesto de: los
elementos del electrodo moldeados en un tapón de epóxido y cubierto por una
+-membrana de teflón, un
soporte de lucita que ajusta
cómodamente en una cámara
de muestras de vidrio. la
cámara de muestras de vidrio y
un agitador magnético de
forma de disco plano que se
ajusta al fondo de la cámara de
muestra. El mismo electrodo
posee un cátodo de platino y
dos ánodos de plata, bañados
BURBUJAS
SOPORTE DE LUCITA
BLOQUE DE EPO)O
CANAL DE ESCAPE
CAMARA DE VIDzuOPARA LA MUESTRA
KCI
MEMBRANA DE TEFLON
MUESTAA
AGITADOR MAGNÉTICO
por una disolución
semisaturada de cloruro de
potasio. Una delgada
Figura 40: Electrodo de clark y montaje de la cámara de membrana de teflón se sujeta
muestra. (Modificado de Brown y Mebine (248)). tensamente sobre el final del
electrodo por una junta tórica
de goma, que aísla así la disolución de cloruro de potasio del electrodo de la muestra
y sirve como dispositivo de selectividad. El teflón es permeable a algunos gases,
permítiéndoles pasar a través y tomar contacto con el cátodo de platino.
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AÉndics
Si un potencial polarizador de 0,8 V se aplica a través de los elementos del
electrodo, el oxígeno reacciona con el cátodo de acuerdo con la siguiente reacción:
02 + 2e- + 2H3O+ <> [H2O2] + 2H2O
[HzOz] *2€ +2H3O+e 4HrO
suma: 02 + 4e- + 4H3O- <f 6H2O
El circuito se completa por la siguiente reacción que ocurre en el ¿ínodo de
plata:
4Ago + 4Cl-e 4AgCl * 4e-
total: 4Ag0 + 4Cl- + 4H+ + Oz <> 4AgCl + 2:HzO
El flujo de corriente es, por tanto, directamente proporcional a la cantidad de
oxígeno que difunde a través de la membrana de teflón, dependiendo de la
temperatura de la membrana de teflón y de la presión parcial de oxígeno en la cámara
de muestra.
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Apénücq
II- OYOCITQS DE Xenopts laevis.
2.1-- GENERALIDADES.
Xenopus laeuis (Daudin) es un sapo sudafricano de la familia Pipidae y de la
subfamilia Xenopiae, que se caractenza. a diferencia del resto de anuros criados en
laboratorio, por ser capaz de iniciar ciclos reproductores en cualquier época del año y
mediante la administración de gonadotrofina coriónica (HCG) a hembras adultas
prov@ar la ovulación y ovoposición sin dependencia esüacional. Ofra característica esque posee un desarrollo asíncrono de ovocitos por lo que se pueden encontrar en un
sóLo Xenopus ovocitos en distintos estadios del desarrollo. Estas características han
hecho que los ovocitos de knopus sean, desde hace varias décadas, muy utilizados
por embriólogos pues a partir de ovocitos de una sola hembra se pueden investigar la
Fgura 41: Fotografía de un sapo hembra knopus laeuis.
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Aúndics;
morfología y cambios citológicos que ocurren durante el crecimiento, maduración y
ferttlización del ovocito y posterior desarrollo del embrión (249).
En la década de los 60 y 70 se utilizaron como células para estudiar los
mecanismos de regulación de división celular (250,25I). A partir de los estudios dereiniciación meiótica, maduración de los ovocitos y su fertllización se descubrió que
tanto el potencial de membrana, como las concentraciones iónicas intracelulares y
ciertas características de la membrana del ovocito cambian con el desarrollo de éste.El conocimiento de estos fenómenos estimuló a los electrofisiólogos a realízarregistros en ovocitos para conocer sus propiedades de membrana y el tipo de canalesiónicos responsables de estos cambios durante el desarrollo. Esto llevó a conocer que
los ovocitos además de canales dependientes de voltaje, poseen en su membrana otrosactivados por neurotransmisores (252). De esta forma el ovocito se convirtió en un
excelente modelo donde estudiar los mecanismos celulares en respuesta aneurotransmisores y entre ellos los mediados por segundos mensajeros.
Con el enorme desarrollo de la biología molecular de los últimos años, losovocitos se comenzaron a utilizar en los estudios de expresión genética. Eldescubrimiento de que el ovocito es capaz de sintetizar adecuadamente proteínas
exógenas a partir de la inyección de ARNm foráneo (253) abnó las puertas a suutilización, fundamentalmente en neurociencias, en la década siguiente. Así, aprincipios de los años 80 se demostró en ovocitos eI ensamblaje correcto de lasdistintas subunidades del nAChR (188) y la expresión funcional de receptores aneurotransmisores y a canales iónicos (165,255).
En la actualidad el ovocito de knopus laeuis es un modelo experimentalampliamente utilizado para estudiar canales dependientes de voltaje o activados porligandos bien propios de su membrana o bien incorporados a ella tras la inyección dematerial genético exógeno (tanto ARNm como ADI.[). La proliferación en los últimosaños de grupos que utilizan el ovocito como modelo para el estudio de lascaracterísticas de canales iónicos se debe a sus ventajas experimentales: fáciladquisición, manejabilidad, célula eléctricamente compacta, interrelación con otrascélulas de su entorno, etc. Además los ovocitos son células grandes (hasta 1,3 mm dediámetro), y su gran tamaño permite utilizar distintas técnicas en una célula única:microdisección de ovocitos aislados; penetración con diversos microelectrodos tantopara registro electrofisiológico (fijación de voltaje con dos microelectrodos) comopara inyectar distintas sustancias y de esta forma controlar la concentración
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Aúndics
intracelular de diversos componentes celulares o de fármacos; utilización de técnicas
bioquímicas así como registros ópticos en célula aislada.
2.2- MORFOLOGÍA DEL FOLÍCUIJO OVÁRICO.
El ovario de una rana se halla constituido por diversos lobulillos o sacos
ováricos (ver Figura 42), los cuales se hallan unidos por diversos tejidos,
principalmente conectivo. En estos lobulillos se encuentran las células germinales
femeninas. Estas células entran en meiosis cuando la rana se encuentra en estadío
larvario tardío, pero la meiosis queda intemrmpida en la primera profase (arresto de
la primera meiosis) y es cuando estas células germinales femeninas pasan a llamarse
ovocitos u ovocitos inmaduros. Cuando la rana se hace adulta estos ovocitos
comienzan a crecer y en ese crecimiento se pueden diferenciar diversos estadíos.
Figura 42: Fotografía de un lobulillo procedenüe del ovario de vn Xenopus taevis (Adzptado de Ivorra(14e)).
Como se ha comentado previamente y se puede observar en la Figura 42 en
knopus laevis es posible encontrar ovocitos en distintos estadíos de crecimiento.
Existen diversos estadiajes realizados por varios autores pero en &nopus laeuis el más
utilizado es el de Dumont (146) que clasifica a los ovocitos inmaduros en seis estadíos
según su morfología, relación con otras capas celulares o acelulares, tamaño y
captación de distintas tinciones o substancias. Para la mayor parte de los estudios de
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Apénücu
expresión de proteínas exógenas se utilizan ovocitos inmaduros que han alcanzado su
mayor grado de crecimiento, estadíos V y VI de Dumont. En eslas etapas los ovocitos
(Figura 43A) tienen un tamaño de I a 1,3 mm y su superficie se halla recubierta por
un gran número de microvellosidades; se caracteizan por tener dos mitades o
hemisferios bien diferenciados y separados por una banda central clara que se
denomina ecuador. El hemisferio llamado animal posee un color marrón oscuro
debido a la gran concentración de melanosomas justo por debajo de la superficie del
ovocito, debajo de una zona submembranosa y agranular; en este hemisferio se halla
su gran núcleo o vesícula germinal. Además es la zona del ovocito en la cual los
lípidos de membrana poseen mayor movilidad, exigten mayor número de estructuras
contráctiles y, cuando el ovocito ha madurado es el lugar donde el espermatozoide
puede introducirse. El hemisferio vegetal, de color amarillento, carece o posee un
escaso número de vesículas con vitelo (que confieren al ovocito energía sufi.ciente para
su maduración); en este hemisferio existe una mayor concentración de ARN que en el
animal. Estas diferencias estructurales confieren al ovocito una polaridad funcionalque se manifiesta en una distribución espacial irregular de los canales iónicos y
receptores de membrana nativos.
Ftgura 43: (A) Foüograffa de un folículo ovárico de Xenopus laevis. (B) Esquema de las diversas capas
que componen un folículo ovárico (Adaptado de Ivorra (149).
Es importante mencionar, sin embargo, que los ovocitos tanto en el ovariocomo cuando son separados manualmente del tejido ovárico no son células aisladas
sino que se hallan conformando los folículos ováricos. El folículo ovárico cuando elovocito está en su estadío V-VI se halla formado por diversas capas (véase Figura
B
he¡riefsr*¿o
4nirmI
hecicfecí1o
YEgetat
BeEbrs¡lávitr¡1ir¡a
E@bÉf¡n¡plÉ€.r{tica
cé!"ula iolicular
142
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AÉaüces
43B) que conviene tener en cuenta tanto por su importancia en el desarrollo del
ovocito como experimentalmente.
Estas capas son:
i) Membrana Vitelina: es una capa acelular fibrosa que se halla unida a la
membrana plasmática del ovocito y recubre toda su superficie.
ii) Capa de células foliculares: estas células, que son nucleadas y poseen gran
número de nucleolos, present¿n numerosos contactos con la membrana del ovocito. A
través de la membrana vitelina, los microvilli de estas células contactan con los
microvilli del ovocito estableciendo uniones comunicantes tipo gap (254, 256) que
permiten el paso de moléculas de hastá 1000 Da y por supuesto la conexión eléctrica
directa con el ovocito. Estas uniones "gap" se hallan controladas hormonalmente, su
permeabilidad y número aumentan al ser estimulado el folículo ovárico con hormona
luteinizante o con gonadotrofina coriónica que sirve al ovocito para reiniciar su
proceso meiótico (254,256). Además las células foliculares poseen en su membrana
una gran variedad de canales y receptores a neurotransmisores y hormonas asociados a
dichos canales. Gracias a las uniones tipo "gap", que permiten el paso a través de
ellas de segundos mensajeros, la información recibida por las células foliculares va a
ser transmitida al ovocito.
iii)ta, Teca: es una capa de tejido conectivo que posee colágeno, fibroblastos,
células musculares lisas, vasos sanguíneos y fibras nerviosas. Además en su interior
pueden estar embebidas células germinales que no han iniciado su división meiótica(2s7).
iu) Capa epitelial o tejido ovárico interno: cubriendo todas las capas anteriores,
es una continuación del resto del epitelio ovárico que constituye el lobulillo ovárico(2s7).
[¿ existencia de estas capas envolventes del ovocito, en ocasiones supone un
doble problema para el estudio de canales iónicos en ovocitos, por una parte va a
dificultar la aplicación de algunas técnicas de registro electrofisiológico y por otro
lado pueden "contaminar" con sus corrientes nativas aquellas originadas en la
membrana del ovocito. Por ello, (véase en el apartado II-3 de kíateriales y Métodos)
se utilizan métodos enzimáticos (colagenasa) o mec¿ínicos u osmóticos para aislar el
ovocito del resto de las capas envolventes.
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ANndices
los canales mediados por ligandos están especializados en mediar las nípidas
transmisiones en las sinapsis químicas. Estos canales se activan por un
neurotransmisor químico específico, como puede ser la acetilcolina, glutamato, glicina
o ácido y-aminobutírico, siendo los activados por acetilcolina los mejor estudiados.
Existen dos tipos básicos de receptores de acetilcolina: Nicotínicos y
Muscarínicos. Ambos unen acetilcolina, pero los dos receptores se pueden distinguir
farmacológicamente mediante el empleo de agonistas (fármacos que imitan las
acciones de la acetilcolina, p.e. nicotina o muscarina) que se unen de forma exclusiva
a un tipo de receptor (258). Asimismo, los canales nicotínicos se pueden clasificar
según su localización en: muscular y neuronal. El tipo muscular se encuentra en la
placa neuromuscular de vertebrados o en el órgano eléctrico de ciertos peces, mientras
que el neuronal se localiza en ganglios del sistema simpático o parasimpático y en
varios tipos de neuronas del cerebro.
Los receptores nicotínicos de acetilcolina fueron los primeros en ser descritos
en términos moleculares, solubilizados a partir de sus membranas, purificados hasta
casi homogeneidad molecular (259, 260) y reconstituídos mediante la reinserción de la
macromolécula purificada en membranas lipídicas (261). También fueron los primeros
canales en los que se determinó las secuencias de aminoácidos y nucleótidos (262), y
en ser expresados en células foráneas mediante inyección de los ARNm en ovocitos(186, 188). Finalmente fueron los primeros en los cuales se analizó su corriente
unitaria mediante la técnica de análisis de canal único (patch-clamp) (189).
El hecho de que el nAChR sea el receptor de membrana mejor conocido se
debe fundamentalmente a dos factores que han facilitado su caracterizacíón:
i/ El nAChR se encuentra en abundancia en las electroplacas de diversas
especies de peces eléctricos (Tbrpedo marmorata, Tbrpdo californica, Electrophorus
electricus).
lrÍ4
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Apénüces
ii) La presencia de cr-neurotoxinas en venenos de serpientes, que resultan ser
ligandos muy específicos del nAChR y que aportan un modo fácil de realizar
determinaciones cuantitativas mediante ensayos de unión a equilibrio.
3.1. DESCRIPCION.
El receptor nicotínico de acetilcolina es una glicoproteína transmembrana de
peso molecular de 294 kD, compuesto de cuatro distintas subunidades ensambladas en
un pentiímero heterólogo a2py6. Las cuatro cadenas polipeptídicas tienen unos pesos
moleculares aparentes de 40 kD (a), 48 kD (P), 58 kD (6) y 64 kD (6). Só1o la
subunidad ct, une ACh con alta afinidad. Las cuatro subunidades del AChR estiín
glicosiladas, presentando restos de manosa, galactosa, glucosa, n-acetilgalactosamina
y ácido n-acetilsi:ílico en un total de sesenta y cinco residuos de hidratos de carbono
por molécula de receptor (260). La inhibición de la glicosilación durante la
biosíntesis, así como la mutagénesis dirigida del Asn-141 de la cadena a, posible sitio
de glicosilación, hacen que el AChR pierda su funcionalidad. I¿s cinco subunidades
del AChR se encuentran fosforiladas en distintas regiones, pero principalmente en el
dominio intracitoplasmástico. Hay un total de siete grupos fosfato en la molécula del
AChR (263).
Citoplasma
Figura 44: A) Estructura tridimensional del receptor de ACh, donde se mueshan las 5 subunidades. B)Imagen reconstruída de la sección tranversal a través del tubo. C) Imagen a gran ampliación del nAChR,mostrando su posición y tamario respecto a la bicapa lipídica. (Adaptado de Toyoshima y Unwin (264).
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Aúndices
El nAChR posee dos sitios de unión para la ACh que pueden ser ocupados por
agonistas, antagonistas y c{,-neurotoxinas. los agonistas y antagonistas se unen al
nAChR de forma reversible y mutuamente excluyente, mientras que las
c¿-neurotoxinas se unen de forma prácticamente irreversible (265). Mediante
experimentos de mutagénesis dirigida y marcaje químico se han determinado que los
sitios de unión de ACh se encuentran cerca de dos residuos de cisteína localizados en
la región hidrofóbica de la subunidad a expuesta al espacio extracelular (266).
Las reconstrucciones de las imágenes obtenidas mediante microscopía
electrónica a una resolución de 1,7 nm por Toyoshima y Unwin (264) confirmaron
que el canal consta de un poro central cuyas paredes estarían formadas por las
distintas subunidades del receptor. El complejo canal-receptor esÍí dividido en 3
regiones: una gran región de entrada en la superficie externa de la membrana, una
región estrecha trartsmembrana que puede determinar la selectividad catiónica y una
gran región de salida en la superficie de la membrana interna.
Figura 45: Cada una de las subunidades que configuran el nAChR contienen 4 fragmentostransmembrana, Ml, M2, M3 y M4. (Adaptado de Kandel y Siegelbaum (267)).
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Aúndics
Examinando la distribución de los aminoácidos polares y no polares, se han
obtenido irnportantes pistas sobre la unión de las distintas subunidades en la bicapa
Lipídica. Cada una de las cuatro subunidades presenta cuatro regiones hidrofóbicas de
20 aminoácidos denominadas Ml, M2, M3 y M4. Sus secuencias aminoacídicas
sugieren que las subunidades están simétricamente unidas de tal forma que crean un
canal central. Numa y cols. (268) propusieron que cada una de las cuatro regiones
hidrofóbicas formaban una hélice cr que atravesara Ia membrana. Posteriores análisis
realizados por Numa y Sakmann (269) índícaron que las paredes del poro del canal
están formadas por las regiones M2 y los segmentos que conectan M2 con M3. Se
piensa que la selectividad catiónica del canal deriva de 3 anillos de carga negativa que
flanquean la región M2. Un primer anillo, cerca de la boca interna, formado por
aminoácidos en la región citoplasmática que conecta los segmentos M1 y M2; un
anillo central formado por aminoácidos dentro del segmento transmembrana M2; un
tercer anillo pertenecieiite a la cara externa de la membrana, formado por aminoácidos
enlarcgión extracelular que conecta los segmentos M2 y M3 (270).
3.2. ASPECTOS Ft.]NCIONALES.
Cuando un potencial de acción actúa sobre los terminales nerviosos de una
placa neuromuscular, libera ACh al espacio sináptico a una concentración local de
0,1-1 mM.
Para abrir el canal es necesaria la unión de dos moléculas de ACh (27I), de
hecho, una molécula de ACh se debe unir a cada una de las dos subunidades cr para
que el canal se abra eftcazmente. Si bien la unión de los ligandos no es cooperativa, silo es la apertura del canal, como 1o indica el valor del coeficiente de Hill,
aproximadamente igual a 2 (272). En cada subunidad cr se encuentra un lugar de
unión de agonistas, que une ACh con relativa baja afinidad (KD : 0,1-l mM) (273).
Ambos lugares de unión no presentan propiedades simétricas, diferenciándose en las
cinéticas de unión de agonistas Q7Q y antagonistas (275). La presencia continuada de
agonista modifica la consüante de afinidad para el mismo, disminuyendo la Kp de 3 a
5 órdenes de magnirud (276).
La unión de ACh al receptor produce pequeñas rotaciones de las subunidades
en el dominio extracelular que dispara un cambio en la configuración de las hélices a
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Aúnüces
que constituyen el poro (217). La apertura ocurre en unos 2A ps (278) y está
provocada por la unión cooperativa de dos moléculas de ACh al receptor. La apertura
del canal es un fenómeno que parece responder a la ley del todo o nada, con lo que
sólo se deberían observar estados abiertos o cerrados. Sin embargo se han observado
algunos subestados de conductancia Q4AD. La duración media de apertura depende del
potencial de membrana, de 1a temperatura y, sobre todo, del tipo de agonista
utilizado: 1 ms para carbamilcolina, 2,4 ms paÍa acetilcolina y 5,6 ms para
suberildicolina. Las aperturas se ven interrumpidas por cierres muy breves de 50 ¡rsque son transiciones a estados no conductivos (164). A través del canal tiene lugar un
influjo neto de cargas positivas que despolartza la fibra muscular produciéndose
finalmente la contracción del músculo (162). La translocación de los cationes es un
fenómeno puramente pasivo: Na*, K* y algo de Caz* fluyen a través del poro acuoso
de acuerdo a su gradiente de potencial electroquímico.Ia conducüancia del canal en la
disolución de Ringer es de 40 pS, lo que, a un potencial de membrana de -60 mV,
corresponde a unos 1,45 x 104 iones transportados por ms, asumiendo un potencial de
reversión de -2 mV. El cierre del canal es esponláneo y está producido por la
disociación de una de las dos (o las dos) moléculas de ACh. El neurotransmisor se
elimina por difusión o por la acción de la acetilcoiinesrerasa (266).
La presencia continua de agonistas induce el fenómeno conocido como
desensibilización, que es un estado no conductor del nAChR donde no hay respuesta
para los agonistas. El proceso de desensibilización se acompaña por un incremento de
la afinidad hacia el ligando, probablemente producido por un cambio conformacional
del receptor (desensibilización específica). Este fenómeno es reversible,
recuperándose la actividad completa del receptor cuando se elimina el agonista. El
fenómeno de la desensibilización se observa tanto en membranas nativas enriquecidas
en nAChR (279) como extraído de su ambiente nativo (280), o si se expresa mediante
ingeniería genética, inyectando en ovocitos los diferentes ARNm de las subunidades(281), indicando que la desensibilizaciún es una propiedad intrínseca del AChR, así
como de otros receptores de membrana activados por ligando, como el nAChR
neuronal, AChR muscarínico, receptores de GABA, glutamato, etc. (282). El
significado fisiológico del estado desensibilizado es desconocido: se propone que es un
mecanismo defensivo de las células o tejidos frente a una sobreexposición del agonista(283).
I4¿t
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Apéndices
IV. PROPTEDADES DE LOS DETERGENTES UTILIZADOS.
En la siguiente tabla se resumen las propiedades más importantes de los
diversos detergentes empleados en los estudios de purificación de la P-gp:
Detergente Tipo CMC Mw Número de Estruchrra(mM) Agregación
CHAPS zrvitteriónico 4 614.9 4-14*-1,,^.J,2.,-,-..[_o
Colato iónico 10 430.6 2-4.8
Zwittergent iónico3 - t2
3.6 335.6 55
cH-l * " ?
\,-\_..\_,z\-r\..^\-4\__^._ i - o
CTL U
6o --'\./\''-'-.
Nonidet P-40 no iónico 0.25 606 t40
N-octil no iónicoglucósido
t4.5 292.4 20-25
Tabla 7: Propiedades de los detergentes utilizados (285).
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