03b Pruebas en El Laboratorio de Hemostasia

PRUEBAS EN EL PRUEBAS EN EL LABORATORIO DE LABORATORIO DE

HEMOSTASIA HEMOSTASIA

XaVIII

Calicreina Precalicreina

XII XIIa

XIa

XIa

IXa

IX

X

VIIa VII

Ca++

Fosfolípidos

IIa

IICa++

Fosfolípidos

APC

Proteìna S

Proteína S

Inhibidor de Proteina CMonómero de fibrina

Fibrinógeno

Polímero de fibrina

Coágulo de fibrina

XIIIaCa++

Plasminógeno

Plasmina

PD Fibrina

UK, SK, tPA

-Antiplasmina

Antithrombina III

Proteina C

Thrombomodulina

Cofactor II Heparina

Injuria tisular

Factor tisularHK

Sistema intríseco Sistema extrínseco

V

IIa

IIa

Va

HK

VIIIa

IIa

Sistema hemostático Sistema hemostático

Pared vascular.Pared vascular.Plaquetas. Plaquetas. Factores de coagulación.Factores de coagulación.Sistema fibrinolítico.Sistema fibrinolítico.

Esquema de la Coagulación

Injuria vascular

Subendotelio expuesto

Adhesión, Liberación, Agregación, Tapón Plaq.

Coagulación ( Tapón hemostático) Formación de fibrina

FIBRINÓLISIS

HemostasiaPrimaria

HemostasiaSecundaria

Permeabilidaddel vaso

Hemostasia Primaria Hemostasia Primaria

Hemostasia SecundariaHemostasia Secundaria

Coagulopatías: Hereditarias y Adquiridas

Púrpuras VascularesCongénitos y Adquiridos

Alteraciones Plaquetarias Trombocitopenias

Coagulopatías Adquiridas:

Hereditarias:

HemofiliasE. Von WillebrandFactores Fase ContactoFactores Vit. K dependientesAlteraciones del Factor XIIIAlteraciones del FibrinógenoAlteraciones de la fibrinólisis•Plasminógeno•t-PA•Inhibidores

Déficit de Vit. K

Hepatopatías

C.I.D.

Neoplasias

Inhibidores espontáneos

Sindrome HemorrágicoSindrome Hemorrágico

Pruebas de laboratorioPruebas de laboratorioHemostasia Primaria:Hemostasia Primaria:

Recuento de plaquetas - Trombocitopenia.Recuento de plaquetas - Trombocitopenia.Frotis – macroplaquetas.Frotis – macroplaquetas.Tiempo de sangría - Función plaquetaria = 2- 4’Tiempo de sangría - Función plaquetaria = 2- 4’Test de agregación plaquetaria - disfunción Test de agregación plaquetaria - disfunción plaquetariaplaquetariaTiempo de retracción de coágulo - 60’Tiempo de retracción de coágulo - 60’

< 1.000/ul. < 1.000/ul. plaquetasplaquetas

Sindrome HemorrágicoSindrome Hemorrágico

Pruebas de LaboratorioPruebas de LaboratorioT. de Protrombina : F.II - vía extrínseca = 10-14’’ T. de Protrombina : F.II - vía extrínseca = 10-14’’ (70-100%).(70-100%).Tiempo de Tromboplastina Parcial activada - vía Tiempo de Tromboplastina Parcial activada - vía intrínseca = 29-43’’intrínseca = 29-43’’Tiempo de Trombina - vía común = 15-21’’ - Déficit Tiempo de Trombina - vía común = 15-21’’ - Déficit de de

fibrinógeno o presencia de heparina.fibrinógeno o presencia de heparina.Fibrinogenemia y Productos de degradación de Fibrinogenemia y Productos de degradación de Fibrinógeno y fibrina.Fibrinógeno y fibrina.

- C.I.D. , Fib = 200-400 mg%. Dímero D = < - C.I.D. , Fib = 200-400 mg%. Dímero D = < 0.2 ug/ml 0.2 ug/ml Cuantificación de factores de la coagulación Cuantificación de factores de la coagulación individuales, ejm. Déficit > 40% , en Hemofiliasindividuales, ejm. Déficit > 40% , en Hemofilias

Perfil de coagulaciónPerfil de coagulación

Pruebas de rutinaPruebas de rutina:: T. de protrombina, INR.T. de protrombina, INR. T. de tromboplastina parcial activado.T. de tromboplastina parcial activado. T. de trombina.T. de trombina. Dosaje de fibrinógeno.Dosaje de fibrinógeno. Rcto de plaquetas.Rcto de plaquetas.

Pruebas especiales:Pruebas especiales: Prueba de mezcla o de corrección.Prueba de mezcla o de corrección. Dosaje de factores: vía extrínseca e Dosaje de factores: vía extrínseca e

intrínseca.intrínseca. Dosaje de Factor von Willebrand.Dosaje de Factor von Willebrand. Anticoagulante lúpico.Anticoagulante lúpico.

Perfil trombóticoPerfil trombótico

Pruebas de rutina:Pruebas de rutina: Dímero D.Dímero D.

Pruebas especiales: AT III, proteína C, proteína S, AT III, proteína C, proteína S,

Plasminógeno, alfa 2 antiplasmina, F Plasminógeno, alfa 2 antiplasmina, F V Leiden, homocisteina.V Leiden, homocisteina.

XTIEMPO DE PROTROMBINA Via extrinseca

TIEMPO DE PROTROMBINA Via extrinseca

Tiempo de protrombinaTiempo de protrombina

TécnicaTécnica Plasma citratado, F VII, X, II y V.Plasma citratado, F VII, X, II y V. 1 min. a 37º C1 min. a 37º C Tromboplastina cálcica.Tromboplastina cálcica. VN: 10- 14 seg.VN: 10- 14 seg.

Pruebas de correcciónPruebas de corrección PN1 / PP1PN1 / PP1

Corrige : DeficienciaCorrige : Deficiencia

No corrige : InhibidorNo corrige : Inhibidor


Def de vit K.Def de vit K. Anticoagulación oral.Anticoagulación oral. Heparina: No a dosis terapéutica.Heparina: No a dosis terapéutica. Def. congénita de fact. cualitativa o Def. congénita de fact. cualitativa o

cuantitativa.cuantitativa. Def. de F I < 50 mg%.Def. de F I < 50 mg%. Inhibidor lúpico.Inhibidor lúpico. Inhibidor específico de factores.Inhibidor específico de factores.

Causas de alteración:Causas de alteración:


::

EXPRESIÓN DE RESULTADOS:EXPRESIÓN DE RESULTADOS: Seg.Seg. % de actividad. % de actividad. INR: ( PT pac. / PT control) ISIINR: ( PT pac. / PT control) ISI

Sensibilidad de las Sensibilidad de las tromboplastinas cálcicas tromboplastinas cálcicas

SENSIBILIDADSENSIBILIDAD

Muy alta.............Muy alta.............

Alta....................Alta....................

Mediana............Mediana............

Baja...................Baja...................

ISIISI

menor de 0.9menor de 0.9

0.9 a 1.10.9 a 1.1

1.2 a 1.31.2 a 1.3

mayor de 1.4mayor de 1.4

Qué es INR?

Qué es el ISI ?

Indice de sensibilidad internacional. Comparaciòn del reactivo de trabajo con respecto a tromboplastina referencial OMS. Dato que viene en el inserto del reactivo, varìa de acuerdo al lote, origen y equipo con el que se trabaje.

Tiempo de protrombina del plasma del pac. en seg. Tiempo de protrombina del plasma normal en seg.

ISI

INR =

Razón Internacional normalizadaRazón Internacional normalizada

TIEMPO DE TROMBOPLASTINA PARCIAL ACTIVADA

Via Intriseca

TIEMPO DE TROMBOPLASTINA PARCIAL ACTIVADA

Via Intriseca

APTT: TécnicaAPTT: Técnica

TécnicaTécnica Cefalina + activador.Cefalina + activador. Plasma citratado: Factores XII, XI, IX y Plasma citratado: Factores XII, XI, IX y

VIII.VIII. Incubación : 2’ a 37°C.Incubación : 2’ a 37°C. CaCl2 0,025M.CaCl2 0,025M.

Expresión de resultados:Expresión de resultados: Segundos, VN: 29- 43 seg.Segundos, VN: 29- 43 seg. Razón: APTT paciente/APTT normal Razón: APTT paciente/APTT normal

(media).(media).

Sensibilidad de reactivos de APTTSensibilidad de reactivos de APTT

Sensibilidad a factores vía intrínseca Sensibilidad a factores vía intrínseca FIX, XI y XII.FIX, XI y XII.

Sensibilidad a heparina.Sensibilidad a heparina. Sensibilidad a anticoagulante lúpico.Sensibilidad a anticoagulante lúpico. Sensibilidad a FVIII.Sensibilidad a FVIII. Por el tipo de fosfolípidos en su Por el tipo de fosfolípidos en su

constituciónconstitución Por el tipo de activador.Por el tipo de activador.

APTT: ComponentesAPTT: Componentes

Extracto de fosfolìpidos:Extracto de fosfolìpidos: Cerebro humano.Cerebro humano. Cerebro de conejo.Cerebro de conejo. Vegetales.Vegetales. Grano de soja.Grano de soja.

Activadores:Activadores: Particulados: Caolín, célite, sílica Particulados: Caolín, célite, sílica

micronizada, semicoidales ( Mg, Al, micronizada, semicoidales ( Mg, Al, silicato).silicato).

No particulados: Acido elágico.No particulados: Acido elágico.

APTTAPTT

Prolongado

Def. cong. De factores.Def. cong. De factores.Def de vit. K, ACO, RN.Def de vit. K, ACO, RN.Hepatopatìas.Hepatopatìas.Hirudina.Hirudina.Alt. por Fb. < 50 mg%.Alt. por Fb. < 50 mg%.Inhibidor lúpico.Inhibidor lúpico.Disfibrinogenemia.Disfibrinogenemia.Hematocrito > 60%.Hematocrito > 60%.

AcortadoAcortado

Hipercoagulabilidad.Hipercoagulabilidad. Extracción Extracción

deficiente.deficiente. Hematocrito < 20.Hematocrito < 20. Hemólisis.Hemólisis.

Prueba de mezcla: APTTPrueba de mezcla: APTT

Mezcla 1:1 del plasma paciente con plasma normalMezcla 1:1 del plasma paciente con plasma normal..

• Corrige : Corrige : Dosaje de factores.Dosaje de factores.• No corrige : No corrige : Búsqueda de inhibidores.Búsqueda de inhibidores.

Criterios:Criterios: Corrige No corrigeCorrige No corrige

• APTT pac – APTT normal < 5 > 5APTT pac – APTT normal < 5 > 5

• Razón P/ N < 1.2 > 1.2Razón P/ N < 1.2 > 1.2

XII

XIIa

XI

XIaIX

IXa

X

Xa

II

Va

VIIaFT

Ca+VIIIa

IIa

Fibrinógeno Fibrina

Ca+

Ca+FLFL

FL

TIEMPO DE

TROMBINA

TIEMPO DE

TROMBINA

Tiempo de trombinaTiempo de trombina

TécnicaTécnica Plasma citratado.Plasma citratado. Trombina 1.5 IU/ ml.Trombina 1.5 IU/ ml.

VN: 15- 21 seg.VN: 15- 21 seg.

ProlongadoProlongado Heparina.Heparina. Disfibrinogenemia.Disfibrinogenemia. Hipofibrinogenemia (congénita o Hipofibrinogenemia (congénita o

adquirida).adquirida). Hirudina.Hirudina. Heparinoide.Heparinoide. PDF alto.PDF alto.

Tiempo de reptilasaTiempo de reptilasa

TécnicaTécnica Plasma citratado.Plasma citratado. Reptilasa.Reptilasa. VN: 21 seg.VN: 21 seg. Cliva al fibrinopéptido A.Cliva al fibrinopéptido A.

ProlongadoProlongado Disfibrinogenemia.Disfibrinogenemia. PDF / pdf alto.PDF / pdf alto.

No se altera por heparina, ni hirudina.No se altera por heparina, ni hirudina.

Factor XIIIFactor XIII

2XIIIa-2XIIIb.2XIIIa-2XIIIb.

Solubilidad del coágulo en:Solubilidad del coágulo en:• Urea 5M.Urea 5M.• Ac. Monocloroacético 1%.Ac. Monocloroacético 1%.

Método Cromogénico.Método Cromogénico.

FibrinógenoFibrinógeno

Determinación de fibrinógenoDeterminación de fibrinógeno

Métodos:Métodos:

Cronométrico (Clauss). Fibrinógeno derivado. Ensayos en la proteína coagulable. Turbidimetría. Precipitación por calor. Inmunológico.

Calibración de fibrinógeno Calibración de fibrinógeno Concentración Concentración

(mg/dl)(mg/dl)• 880880• 610610• 360360• 250250• 120120• 7070

EstándaresEstándares

Concentración Concentración (mg/dl)(mg/dl)

• 1000.01000.0• 100.0100.0

Fibrinógeno derivado.Fibrinógeno derivado.

Promedio (seg)Promedio (seg)• 6.56.5• 7.9 7.9 • 12.612.6• 18.018.0• 50.650.6• 75.075.0

Promedio (mOD)Promedio (mOD)• 2899.02899.0• 180.0180.0

Dosaje de factoresDosaje de factoresMétodos:Métodos:

Coagulométrico en una etapa. Coagulométrico en dos etapas. Coagulométrico con act. Directa ven. Víbora.

Taipán IITaipán II

Russell XRussell X Cromogénico en dos etapas (lectura a

405nm). Inmunológico. Electroinmunodifusión ( Laurell). ELISA. Nefelometría. Aglutinación sobre partículas de látex.

Dosaje de factoresDosaje de factores

Plasmas sustratosPlasmas sustratos

Pac. con def. severa(<1%) del factor en Pac. con def. severa(<1%) del factor en estudio.estudio.

Plasmas inmunodepletados con Ac. Plasmas inmunodepletados con Ac. Monoclonales contra el factor a depletar.Monoclonales contra el factor a depletar.

Dosaje de F II,V,VII y XDosaje de F II,V,VII y X

VN: 70-120% act. - U/dl.VN: 70-120% act. - U/dl.

Plasma sustrato deficiente en el factor. Plasma del Pac. Dilución 1/10 Incubación a 37°C. Tromboplastina cálcica. Tiempo de coagulación en seg.

Dosaje de FVIII,IX,XI y XIIDosaje de FVIII,IX,XI y XII

VN: 50-150% act.-U/dlVN: 50-150% act.-U/dl

Rvo de APTT. Plasma deficiente en el factor. Plasma del Pac. Dilución 1/10.. Incubación a 37°C. CaCl2 . Tiempo de coagulación en seg.

CALIBRACIÓN FVIIICALIBRACIÓN FVIII

Concentración : 97%Concentración : 97%

Standard : Standard : DADEDADE

N° lote : N° lote : 502578502578

%ACTIVIDAD %ACTIVIDAD • 97%97%• 50%50%• 25%25%

• 10%10%

SEGUNDOSSEGUNDOS• 56.256.2• 64.764.7• 72.872.8• 82.082.0

vWD - Clasificación RevisadavWD - Clasificación Revisada

Tipo 1- Deficiencia cuantitativa, parcial de v WFTipo 2- Anormalidades cualitativas de v WF

2A - función plaquetaria, multímeros APM 2B - afinidad v WF-G Pb-IX 2M - función plaquetaria, c/ multímeros APM 2N - afinidad v WF-FVIII*

Tipo 3- “Ausencia” de v WFTipo 3- “Ausencia” de v WF

* * símil Hemofilia A símil Hemofilia A autosómautosómicaica

vWD - Diagnóstico

• Detección*T. Sangría, APTT (fVIII), Adhesividad.

• Diagnóstico - vW en plasma y plaquetasvWF: Ag, vWF: Rcof, CBA, Multímeros.

• ClasificaciónMultímeros, RIPA, Enlace vW/ fVIIIBiología molecular.

* Pruebas que no permiten excluir el diagnóstico de vW

Hallazgos de Laboratorio en los Hallazgos de Laboratorio en los tipos de von Willebrandtipos de von Willebrand

Tipo FVIIIFvW:

AgFvW:Rcof

RIPAPatrón Multimérico

(plasma)

1 onormal

Todos los tamaños presentes

2A Ausencia de multímeros detamaño intermedio y grandes

2B o

normal

onormal

Ausencia de grandesmultímeros

2M o

normal o

normalTodos los tamaños presentes

2N Normal Normal Normal Todos los tamaños presentes

3 Nodetectado

Nodetectado

Ausencia total del FvW

vWF - Pruebas Específicas

CUANTITATIVO CUALITATIVO

VWF: Ag SI NOVWF: Rcof SI SIVWF: CBA SI SIMultímeros SEMI SI

vWF - Inmunológico (vWF:Ag)

Inmunoelectroforesis

TÉCNICAS

ELISA

vWF - ELISA

1

a-vWF

4

Color-Abs

2

vWF

3

a-vWF-HRP

1. Anti-vWF inmovilizado.

2. Incubación con muestra o control.

3. Incubación con anti-vWF-conjugado.

4. Incubación con sustrato cromogénico.

Investigación Biológica de Investigación Biológica de TrombosisTrombosis Pruebas que descartan trombosisPruebas que descartan trombosis:

P.D. Fibrinógeno.P.D. Fibrinógeno. Dímero D.Dímero D. Complejo TAT.Complejo TAT. Fragmento 1+ 2 de ProtrombinaFragmento 1+ 2 de Protrombina

Pruebas que detectan riesgo trombótico: APC Resistencia Déficit: AT III, Prot. C, S, PLG, t-PA, PAI, F XII y

Cofactor II de Heparina. Alteración cualitativa de fibrinógeno. Presencia de Anticoagulante Lúpico. Presencia de Anticuerpo anticardiolipina.

Factores TrombofílicosFactores Trombofílicos

Factores de baja prevalencia:Factores de baja prevalencia: Aumento del PAI. Disfibrinogenemia. Def. de Cofactor II de heparina. Def. de Plasminógeno. Def. t – PA. Def. de F XII. Anticoagulante lúpico/ Ac. Antifosfolípido.

Factores TrombofílicosFactores Trombofílicos

Factores de alta prevalencia:Factores de alta prevalencia:

Mutación del Factor V Leiden. Mutación del gen de protrombina G20210. Deficiencia de Proteína C. Deficiencia de Proteína S. Deficiencia de AT III.

AT IIIAT III Trombina.Trombina. F Xa, XIa, XIIa, VIIa.F Xa, XIa, XIIa, VIIa. Cofactor para heparina.Cofactor para heparina.

Importancia:Importancia:• Dx. de trombofilia.• Terapia [ ] AT III y

monitoreo.• Evalúa riesgo trombótico.• Verifica efecto de heparina.

VN = 80-120%

TrombinaTrombina

FibrinógenoFibrinógeno FibrinaFibrina

Interacción de AT III con Factores de Coagulación

Interacción de AT III con Factores de Coagulación

XaXa

IXaIXaXaXa

VIIaVIIaXIaXIa

XIIaXIIa

AT IIIAT III

Dosaje de AT IIIDosaje de AT III

Método Funcional:Método Funcional:CromogénicoCromogénico

Dosaje de AT IIIDosaje de AT III

Método Funcional:Método Funcional:CromogénicoCromogénico

Proteína CProteína C F Va y F VIII a.F Va y F VIII a. Regula formación de Regula formación de

trombina.trombina. Modula PAI.Modula PAI.

Importancia:Importancia:• Riesgo tromboembólico.• Criterio dosis o anticoagulación oral.• Disfunción hepática.

VN= 70-140%

APC ResistenciaAPC Resistencia

Proteína C activadaProteína C activada Acción anticoagulante inhibe la cascada de la

coagulación clivando los factores Va y VIII a.

Resistencia APCResistencia APC Predisposición a la trombosis. 1993, se describe deficiente respuesta

anticoagulante a la APC en un ensayo de coagulación.


Causa de la resistencia APC Mutación en el factor V (Leiden).

Mutación en el Factor VMutación en el Factor V Substitución de la Arg 506 por

Glutamina (Q506).).

FrecuenciaFrecuencia 20% de pacientes con trombosis

venosa. 2 a 5% de la población normal. Deficiencia de AT III, Prot. C, Prot. S, 5-

10% de TVP.


Formas adquiridas no hereditarias:Formas adquiridas no hereditarias:

Embarazo: alta concentración F VIII y disminución de Prot. S.

Anticonceptivos orales: aumento de factores procoagulantes Fb, protrombina, VII, VIII, X, XII y XIII; disminución de Prot. S y ATIII.

AAF.


Diagnóstico de LaboratorioDiagnóstico de Laboratorio Genética molecular o por técnicas

hemocoagulativas. Realización de 2 tiempos APTT, uno con

plasma del paciente y otro con plasma del paciente en presencia de APC exógena.

Los resultados se expresan como relación (ratio) entre APC-APTT2/APTT1.

En caso de APC Resistencia este cociente es inferior a un determinado valor cut- off.

03b Pruebas en El Laboratorio de Hemostasia

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