1. TITULO:

ESTUDIO DE LOS ASPECTOS MORFOLÓGICOS Y BIOLÓGICOS DE POBLACIONES COLOMBIANAS DE Anastrepha obliqua (Mcquart).

2. AUTORES:

Ítem Nombres Cargo Identificación

1 MARIA DEL ROSARIO CASTAÑEDA

Estudiante Doctorado en Ciencias Agrarias. Universidad de Caldas

65.782.899

2 NELSON A. CANAL DAZA Director Proyecto. I.A

Msc.,PhD. en Entomología 93.368.088

3 ALBERTO SOTO Coodirector Proyecto. I.A

Msc.,PhD. en Entomología.

3. RESUMEN EJECUTIVO

Debido a la creciente importancia económica que tienen las pérdidas ocasionadas por las moscas de las frutas en Colombia, es necesario buscar alternativas que resuelvan los problemas de los productores de frutas, partiendo de un conocimiento taxonómico y de bioecológico, incluyendo sus plantas hospederas y su distribución geográfica, de tal manera que se pueda obtener toda la información necesaria para implementar Programas de Manejo de la Plaga. Anastrepha obliqua es una especie común en Colombia, plaga importante del mango y otros frutales en todas las regiones; esta especie pertenece al grupo fraterculus y se han encontrado especies crípticas en este grupo particularmente en la especie nominal A. fraterculus (Wiedemann), las cuales presentan problemas de estatus taxonómico, de plaga y compatibilidad sexual. Observaciones realizadas muestran algunas poblaciones de A. obliqua con variaciones morfológicas, biológicas y en el uso de hospederos. Estos datos, aún no conclusivos, sugieren que esta especie nominal también puede representar un complejo de especies crípticas. Por tanto, se plantea determinar la existencia de especies crípticas de A. obliqua en Colombia a través de estudios morfométricos, cariotípicos y reproductivos, provenientes de frutos colectados en los Departamentos de Valle, Tolima, Cundinamarca, Meta, Casanare, Córdoba y Bolívar. Pasados 14 días de los frutos se extraerán las larvas y pupas que luego serán sometidas a los análisis y pruebas de laboratorio. Para los análisis morfométricos, se medirán 44 variables del ala, tórax y aculeus de 20 hembras adultas, de 5 días de emergidas. Se medirán las variables taxonómicas de 15 larvas de cada una de las poblaciones. Para el estudio del cariotipo se emplearán cromosomas mitóticos obtenidos de ganglios cerebrales de larvas de tercer instar. Se realizarán pruebas de aislamiento

reproductivo con hembras y machos vírgenes, realizando cruces intra e interespecificos de las poblaciones colectadas. Los datos morfométricos serán sometidos al análisis Multivariado - análisis cluster- en el programa estadístico INFOSTAT u otros similares. Los datos experimentales de las pruebas de aislamiento reproductivo serán sometidos al análisis de varianza ANOVA, siendo las medias comparadas por la prueba de significancia de Tukey (p= 0.05). Se espera obtener diferencias morfométricas, cariotípicas y biológicas en las poblaciones estudiadas para la definición de áreas libres o de baja prevalecía y para la definición de protocolos para actividades cuarentenarias.

4. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

En Colombia, la fruticultura ha presentado un 15% de participación a nivel nacional en el 2002 y un 0.7% en la participación mundial, con un crecimiento del 1.6% para el 2005; pasó de generar 152.037 empleos en el 2002 a 171.794 empleos en el 2007, con un índice de empleo directo por hectárea de 0.62%. Según estadísticas del Ministerio de Agricultura (Junio, 2008) la superficie sembrada en frutales paso de 243.540 ha en 2002 a 271.490 ha en 2007, con una producción de 2.571.646 t en 2002 a 3.326.961 t en 2007. Este mercado en el país se ve seriamente afectado por los daños causados por las moscas de las frutas y especialmente por la no existencia de planes de manejo que garanticen seguridad cuarentenaria (Canal, 2004).

Las verdaderas moscas de las frutas son dípteros de la familia Tephrtidae que tienen importancia económica a nivel mundial por los daños directos causados en las frutas y por las restricciones curentenarias hacia este tipo de plagas. Existen alrededor de 4.000 especies de tefrítidos en 500 géneros (White y Elson-Harris 1992). De estos el género Anastrepha es el más diverso en el Neotrópico (Norrbom et al. 1999, Hernández-Ortiz 2003) y contiene siete especies cuarentenadas, con cinco presentes en el país (Hernández-Ortiz y Aluja 1993, Vélez 1997, Norrbom et al. 1999, Canal 2010a). Mangan et al. (2011), reportó que la mosca de las Antillas o de las Indias Occidentales, Anastrepha obliqua, ataca frutos de importancia económica de las familias Anonnaceas, Myrtaceae, Oxalidaceae, Pasifloraceae y Sapotaceae. En Colombia es la principal plaga de mango, presentando daños hasta del 70% (Barón, 2004).

Para el adecuado manejo y control de esta plaga cuarentenaria en Colombia, se hace necesario como primera medida, la correcta identificación de los individuos y su estatus como plaga; se ha encontrado especies crípticas en el grupo fraterculus, particularmente en la especie nominal A. fraterculus, las cuales presentan problemas de estatus taxonómico, de plaga y compatibilidad sexual (Vera et al. 2006). Observaciones realizadas por el Grupo de Investigación en Mosca de la Fruta de la Universidad del Tolima GIMFRUT, sugieren la existencia de una población de A. obliqua con una pequeña variación morfológica, pero que además cuando se intentó establecer en cría artificial, presentó comportamiento

biológico diferente a la población comúnmente establecida, indicando la posible existencia de especies crípticas en Colombia (Canal, 2010b). Los datos existentes hasta el momento son apenas parciales y para nada conclusivos, sin embargo, de existir especies crípticas, es un factor importante para la toma de decisiones en programas de manejo. Por lo tanto, se plantea realizar estudios que permitan aclarar la existencia o no de especies crípticas de A. obliqua en Colombia.

5. MARCO TEORICO Y ANTECEDENTES

LA FRUTICULTURA EN COLOMBIA

Al analizar la demanda por productos agrícolas se puede observar que esta ha dependido de la tasa de crecimiento poblacional, pero se espera que en el futuro esta demanda este influenciada por otros factores, especialmente lo referente al aumento del ingreso per cápita y, estos a su vez, serán determinados por el nivel de desarrollo de los países (COLCIENCIAS, 2005), siendo que en los países desarrollados la demanda por los productos cárnicos, las frutas y las hortalizas aumentará significativamente (COLCIENCIAS, 2005). El mismo documento indica que en los países en desarrollo aumentará la demanda de cereales, tubérculos, oleaginosas por parte de los sectores de menores ingresos, pero los de mayores ingresos deberán aumentar la demanda por cárnicos, lácteos, huevos, frutas y hortalizas. Pfaeffle (2003) elaboró un documento para un foro internacional de agronegocios de frutas tropicales, donde claramente mostró el crecimiento acelerado de la demanda del mercado internacional por frutas frescas resaltando además, que uno de los principales inconvenientes para este mercado son las restricciones sanitarias. Entre 1981 y 1991 la proporción de frutas y hortalizas frescas importadas por Estados Unidos paso del 15 al 25% y, en Francia estos productos ocupan el segundo lugar en los gastos de alimentación; se prevé que pasando la primera década del siglo XXI el consumo de frutas y hortalizas frescas se habrá duplicado y el consumo de pulpas congeladas y jugos crecerá un 25% (Duarte y Malavasi, 2000)

Los frutales se presentan como una alternativa de reconversión para el agricultor colombiano, pues además de las 187.210 hectáreas sembradas en el año 2003, 350.000 has son potenciales para el desarrollo de la fruticultura (COLCIENCIAS, 2005), principalmente para el ofrecimiento de frutas frescas en el exterior. Siete frutas se consideran primarias, pero en total 16 se consideran de buen potencial. Según las estadísticas agropecuarias recientes del Ministerio de Agricultura (Junio 2008), la superficie sembrada en frutales (excluyendo banano y plátano) paso de 243.540 ha en 2002 a 271.490 ha en 2007, con una producción de 2.571.646 t en 2002 a 3.326.961 t en 2007. En ese mismo periodo la siembra de frutales de la apuesta exportadora paso de 70.764 a 92.386 ha. Sin embargo, las exportaciones de frutas diferentes a banano y plátano apenas alcanzaron cerca a 6.000

toneladas en 2002 y 31.000 en 2007 con costos de 16 millones de dólares FOB en el primer año y 54 millones en 2007.

Frutas frescas colombianas no pueden ser vendidas en los grandes mercados del mundo (Estados Unidos y Japón - ver información de agronet por productos) ni en muchos mercados medios por la presencia de moscas de las frutas y, especialmente, porque no se han planteado alternativas de manejo que garanticen la seguridad cuarentenaria necesaria, alternativas que deben partir del hecho que las poblaciones de moscas de las frutas en Colombia tienen particularidades propias del Neotrópico y la zona andina (Canal 2004).

La fruticultura genera en promedio 108 jornales directos/ha durante 173 días/año, con un índice de empleo/ha de 0,62 y, además, genera 216 jornales indirectos/año durante 173 días, con un índice de empleo indirecto de 1,25. El aumento de las exportaciones de frutales generaría un aumento en el ingreso del productor, en el área sembrada y en la generación de empleo directa e indirecta.

LAS MOSCAS DE LAS FRUTAS

Las verdaderas moscas de las frutas son insectos del orden Díptera, familia Tephritidae, cuyas hembras colocan sus huevos dentro de tejidos vegetales, particularmente flores y frutos. Existen alrededor de 4.000 especies de tefrítidos en 500 géneros (White y Elson-Harris 1992), de estas aproximadamente 861 especies se encuentran en el continente americano (Hernández-Ortiz y Aluja 1993). Los géneros Rhagoletis, Bactrocera, Dacus, Ceratitis, Anastrepha y Toxotrypana contienen especies de importancia económica pues las hembras utilizan frutos como hospederos para oviposición y desarrollo de sus larvas (Norrbom 2002).

Anastrepha es el género más diverso en el Neotrópico (Norrbom et al. 1999, Hernández-Ortiz 2003), se extiende desde el sur de Estados Unidos hasta el norte de Argentina (Aluja 1994, Aluja et al. 1996). Las especies pertenecientes al género Anastrepha son la de mayor distribución e importancia en Colombia (Canal 2004). En el género Anastrepha se encuentran descritas más de 230 especies para el Continente Americano (Norrbom y Korytkowski, 2011), siete de ellas consideradas de importancia económica, de las cuales cinco están presentes en Colombia, A. fraterculus, A. grandis (Macquart), A. obliqua, A. serpentina (Wiedemann 1830) y A. striata Schiner 1868 (Hernández- Ortiz y Aluja 1993; Norrbom et al. 1999; Canal 2010).

Algunas especies de Anastrepha son especialistas, estando relacionadas a una familia botánica en particular como A. grandis que infesta algunas especies de la familia Curcubitaceae y A. barbiellinii Lima que hasta el momento solo fue descrita infestando una única especie de la familia Cactaceae. En el otro extremo están las especies generalistas como A. fraterculus y A. obliqua. La distribución y la

importancia económica de esas especies son variables. Anastrepha fraterculus es la especie de distribución más amplia, sin embargo, solo presenta estatus de plaga al Sudeste y Sur del Brasil, en Argentina y Uruguay y algunas áreas del Norte de Suramérica. Anastrepha striata presenta mayor importancia económica en América Central, Colombia y Venezuela. La especie A. obliqua también presenta amplia distribución, pero se considera plaga secundaria a lo largo de su distribución, excepto al sur del Caribe, Colombia y Venezuela. Las especies A. suspensa y A. ludens son especies importantes en Centroamérica y varias islas del Caribe (Malavasi et al., 2000).

Las especies de Anastrepha se han agrupado en 17 grupos infragenéricos (Norrbom et al. 1999; McPheron et al. 1999) cuyas relaciones filogenéticas no están totalmente claras. El grupo fraterculus está conformado por 29 especies y en él se incluyen un número significativo de especies de importancia económica, por lo cual ha recibido gran atención en los últimos años (Aluja 1994, Selivon y Parondini 2007). Existen varias especies morfológicamente similares a A. fraterculus lo que puede indicar que este grupo puede tener una historia evolutiva reciente, sin embargo, han surgido dificultades en su estudio por el hecho que la especie nominal A. fraterculus comprende en realidad un complejo de especies cripticas (Selivon y Parondini 2007).

Mayr (1970) definió especies crípticas como “poblaciones morfológicamente similares o idénticas, aisladas reproductivamente”. A esta definición Futuyma (1996) le adiciono “difieren en otras características biológicas”. Las especies crípticas son de gran importancia en biología aplicada (como en el control de plagas agrícolas y la entomología médica) como en estudios de biología básica (Mayr, 1970). McPheron (1998) al explicar la importancia de las especies crípticas en el manejo de plagas, particularmente refiriéndose a las moscas de las frutas, dice que si las especies son lo suficientemente diferentes para no tener cruzamientos, los métodos de manejo que visen la biología reproductiva de una determinada especie puede no ser exitosos con otras especies del mismo grupo.

Existe poca información sobre cómo se originan las especies y cuáles son las causas genéticas y sus modos de especiación, siendo que, conocer las bases hereditarias de la formación de nuevos biotipos y especies de moscas de las frutas es muy importante en los programas de control integrado (Frias 2007). Se ha propuesto que las especies surgen luego del origen de nuevos mecanismos de aislamiento reproductivo que impida el flujo genético entre los taxones emergentes, sin embargo, quedan muchos factores por resolver incluyendo la forma como los mecanismos aisladores deben surgir, incluyendo alopatría, parapatría y simpatría (Frias 2007). En algunos géneros de importancia económica se han encontrado especies crípticas cuya resolución taxonómica ha sido difícil, particularmente por su similitud morfológica (Frias 2007, Selivon y Parondini 2007).

Las Técnicas Morfometricas Multivariadas han sido útiles en la detección de diferencias morfológicas entre poblaciones en una variedad de organismos (Willing

et al. 1986). Para Hernandez-Ortiz et al. (2004), tales métodos son frecuentemente empleados en investigaciones para diferenciar especies relacionadas estrechamente, justificar sinonimias, demostrar variación morfológica a lo largo de un gradiente altitudinal o geográfico, y proponer nuevas especies.

Para la identificación taxonómica del género Anastrepha se utilizan caracteres de la cabeza, tórax, mesotórax, alas y genitalia femenina, más específicamente la morfología del aculeus de las hembras adultas (Zucchi 2000). Estructuras de la genitalia del macho, larvas de tercer instar (Frias, 2006; Frias et al. 2008; Rodríguez et al. 2004) y morfología de huevos (Selivon e Perondini, 1998; Selivon et al. 1997; 2005 a), han sido indicadas para la identificación de especies, sin embargo, estos estudios no son suficientes (Aluja 1994, Murillo y Jirón 1994, Selivon y Perondini 1998, Norrbom et al. 1999).

Para la correcta identificación del status taxonómico de especies crípticas se ha recurrido a la caracterización morfológica de larvas (Rodríguez et al. 2004, Frias et al. 2008) y adultos (Araujo et al. 1998), la realización de cariotipos (Solferine y Morgante 1987, Cevallos y Nation 2004, Selivon et al. 2005b), estudios de aislamiento reproductivo, compatibilidad sexual y de apareamiento entre poblaciones (Selivon et al. 2005a, Meza-Hernández y Díaz-Fleischer 2006, Vera et al. 2006). En estos estudios se ha encontrado la existencia de variaciones entre poblaciones de diferentes regiones así como diferencias en uso de huéspedes y status de plaga (Aluja et al. 2000, Selivon y Perondini 2007, Silva y Barr 2008).

La realización de algunos trabajos en base a análisis discriminantes en la morfometría de las alas, patrón alar de bandas, aculeus, y tórax de las hembras adultas (Hernández-Ortiz et al. 2004), ha dado como resultado diferencias en el complejo de la especie nominal A. fraterculus, sugiriendo que las poblaciones de México, Colombia, Brasil y Argentina corresponden a tres entidades taxonómicamente diferentes. Sciurano et al. (2007), reportan que el ancho de ala y el largo de tórax en A. frateruclus serían los blancos más probables de selección sexual, y describen una asociación no lineal entre el éxito copulatorio y cada uno de estos dos rasgos. Hernández-Ortiz et al. (2004), a través de estudios morfométricos demostraron que una población de A. fraterculus de México es quizás una especie diferente y puede no ser de importancia económica.

Araujo et al. (1998) determino que el análisis discriminante de cuatro de ocho medidas del aculeus en las especies A. fraterculus, A. obliqua, A. sororcula y A. zenildae sirve para determinar patrones de variación interpoblacionales relacionados a algunas variables ambientales y así mismo para corroborar con otros tipos de análisis ya aplicados en determinadas poblaciones.

Aislamiento reproductivo precigoticos fueron determinados por Selivon y Morgante (1997) entre Anastrepha bistrigata y A. striata, dos especies estrechamente relacionadas, encontrando además diferencias en los tiempos de actividad de cortejo y copula. La compatibilidad para el apareamiento de poblaciones de A. fraterculus fueron estudiadas mediante el índice de aislamiento sexual por Vera et

al. (2006) encontrando que la mayoría de las poblaciones fueron no compatibles y consecuentemente estuvieron aisladas entre sí, las poblaciones estuvieron sexualmente activas en distintos momentos del día: Tucumán, Concordia y Piracicaba presentaron un pico de actividad al amanecer, La Molina y Piura + La Molina al mediodía e Ibagué (Colombia) al atardecer.

A través de estudios moleculares, morfológicos y biológicos se han separado tres poblaciones de A. fraterculus en el Brasil, las cuales pueden corresponder a especies diferentes y además, presentan diferencias en cuanto a la utilización de hospederos (Selivon y Parondini 2007). Otros estudios genéticos y biológicos hechos a 10 poblaciones brasileñas de A. fraterculus, mostraron que estas se pueden ubicar en dos cluster diferentes, el primero en áreas costeras y el segundo en áreas de altiplano (Selivon 2005a).

En un análisis comparativo de la evolución cariotípica de cuatro especies de Anastrepha, se presentaron sistemas Robertsonianos de fusiones-fisiones que tuvieron efecto en el número cromosómico (2n), autosomas y heterocromosomas. Considerándose que A. serpentina dio lugar a los restantes cariotipos de Anastrepha: A. ludens, A. obliquia y A. striata (Ibañez et al. 2010).

En el caso del complejo Bactrocera dorsalis (Hendel), Adsavakulchai et al., (1988) determinó la diferencia entre especies, usando características del ala. El uso de herramientas morfológicas y biológicas permitió aclarar el estatus taxonómico de tres especies simpátricas de Rhagoletis (Frias 2007). Yee et al. (2011), encontraron que al combinar la forma y tamaño del aculeus se puede hacer una buena discriminación entre las hembras R. pomonella y R. zephyria.

LA MOSCA DE LAS ANTILLAS

La mosca de las Indias Occidentales o de las Antillas, Anastrepha obliqua hace parte del grupo fraterculus, es la mayor plaga de frutas en México, América Central, la zona tropical de América del Sur y muchas Islas del Caribe. Los principales hospederos de esta especie son frutos de la familia Anacardeaceae como el mango (Mangifera L.) y mombin (Spondias L.), sin embargo, ataca otras familias de importancia económica incluyendo las Anonnaceas (anona, Anona cherimola Mill.), Myrtaceae (gayaba, Psidium L.), Oxalidaceae (carambola, Averrhoa carambola L.), Pasifloraceae (granadilla, Passiflora quadrangualris Mill.) y Sapotaceae [sapota, Pouteria sapota (Jacq.) H. E. Moore & Stearn]. (Mangan et al. (2011).

La revisión de la historia taxonómica y registros de hospedero evidencian el gran número de errores taxonómicos por las sinonimias existentes con otras especies, lo cual condujo a registrar hospederos equivocados para A. obliqua. Macquart en 1835 se describió originalmente en Cuba como Tephritis obliqua. En 1909 fue trasferida al género Anastrepha aunque para esta época se le consideró una

sinonimia junior de A. frateruculus y para el siguiente cuarto de siglo este fue el nombre científico que mantuvo en la región Caribe. En 1934 se consideró que A. acidusa era el nombre correcto de la mosca de la fruta de las indias occidentales y sus cultivos hospederos el mango, mombin, pomarrosa (Syzygium jambos L.) y guayaba. Actualmente se conoce a A. acidusa con el nombre científico de A. suspensa referida como la mosca de la fruta del Caribe y A. frateruclus como la mosca de la fruta de Sur América. Incongruentemente, se identificó A. obliqua descrita en Cuba, como una especie frecuente en cultivos de Quariribea asterolepis Pittier. (Bombacaceae) en América Central; pero actualmente se refiere a esta especie como Anastrepha crebra Stone. En 1939 se determinó que la verdadera Trypeta acidusa Walker era una especie rara endémica de Jamaica asignada al nuevo género Lucumaphila (ahora grupo dentata de Anastrepha). En 1942 se uso el nombre A. mombinpraeoptans como una variedad de A. fraterculus frecuente en la isla de Puerto Rico. Fue en 1975 y 1977 cuando finalmente se reconoció la sinonimia de A. mombinpraeoptans y obliqua, este último nombre es la nomenclatura que ha sido aceptada y usada desde entonces (Mangan et al., 2011).

Poco se conoce de las poblaciones de A. obliqua y de las asociaciones que estas tengan con sus hospederos, solo se sabe de su cariotipo por el trabajo realizado por Solferini y Morgante (1987) y Selivon et al. (2005b). A través de análisis filogenético del citrocromo oxidase mitocondrial, se presume la separación de muestras en dos agrupamientos regionales (Smith-Caldas et al. 2001). Frias et al. (2006) describieron la larva de A. obliqua y sugieren que existen diferencias con una descripción realizada por White y Elson-Harris (1992).

MANEJO DE MOSCAS DE LAS FRUTAS

Las moscas de las frutas se cuentan dentro de las más importantes plagas a nivel mundial, debido al daño directo que causan y a las severas restricciones cuarentenarias impuestas por los países importadores de frutas (Aluja, 1994; Aluja y Mangan, 2008). Tradicionalmente el manejo de las moscas de la fruta se ha realizado utilizando aspersiones de cebos tóxicos y medidas culturales; estas labores en realidad han sido poco efectivas y han acarreado problemas de contaminación (Aluja, 1994). Existen otras alternativas de manejo más amigables con el medio ambiente, una de ellas es la Técnica del Insecto Estéril (TIE), cuyos resultados han sido muy exitosos (Enkerlin, 2005). También se han referido programas de control biológico exitosos, bien sea utilizando solo enemigos naturales (Montoya y Liedo 2000) o en programas integrados a la TIE (Montoya y Cancino, 2004), y recientemente se ha planteado la posibilidad de utilizar cepas de hongos entomopatogenos (Hernández Díaz-Ordaz et al. 2010).

Un insecto cuarentenario es una plaga de importancia económica potencial para un área en la que no existe o existe pero no está ampliamente distribuido y se considera oficialmente controlado (Follet y Neven, 2006). Un tratamiento

cuarentenario es el procedimiento por el cual se elimina, mata o esteriliza la plaga cuarentenada en un producto a exportar (Follet y Neven, 2006); los tratamientos cuarentenarios generalmente se refiere a acciones postcosecha, sin embargo, también deben considerarse sistemas cuarentenarios pre y postcosecha que parten de la premisa que puede existir riesgo de infección cero (Duarte y Malavasi, 2000; Follet y Neven, 2006).

Las moscas de las frutas es una de las principales plagas cuarentenadas en todos los países del mundo. Para permitir la exportación de frutos frescos, e impedir el ingreso de moscas de las frutas a los países libres de ellos o de alguna especie en particular, se establecieron los tratamientos cuarentenários, inicialmente químicos, seguidos posteriormente por tratamientos térmicos, de atmósferas modificadas o de radiación (Malavasi, 2000; Duarte y Malavasi, 2000; Follet y Neven, 2006). Estos tratamientos, en general, pueden presentar ciertas restricciones y además, pueden ser costosos y en muchos casos difíciles de mantener, por lo cual, los enfoques modernos más promisorios se refieren a procedimientos que garanticen la seguridad cuarentenaria en precosecha, siendo las áreas libres o de baja prevalencia las alternativas de mayor proyección (Malavasi, 2000; Follet y Neven, 2006).

Más recientemente se ha introducido el concepto de “System Aprroach” en el manejo de moscas de las frutas. El “System approach” puede ser definido como la integración de prácticas en la pre y poscosecha usadas en la producción, cosecha, empaque y transporte que gradualmente alcanza las exigencias de seguridad cuarentenaria. Integra factores biológicos, físicos y operacionales que pueden afectar la incidencia, viabilidad y potencial reproductivo de una especie (Malavasi, 2000; Follet y Neven, 2006; Aluja y Magan, 2008).

Aluja y Mangan (2008) y Follet y Neven (2006) refieren aspectos biológicos que pueden ser utilizados en el análisis de riesgo, sugiriendo otros conceptos que pueden dar seguridad cuarentenaria como la no preferencia hospedera u hospederos poco adecuados, factores climático-ecológicos-cultivo que afectan el comportamiento de infestación de la mosca. Malavasi (2000) y Aluja y Mangan (2008) describe los requerimientos de conocimientos para el establecimiento de programas de Systems Approach.

El manejo de moscas de las frutas en Colombia sigue usando hasta hoy el modelo tradicional de uso de medidas culturales, trampeo y uso de insecticidas (Canal 2004). Se ha intentado avanzar en la utilización de otras técnicas como áreas libres o de baja prevalencia y uso de tratamientos poscosecha, pero la necesidad de profundizar en los estudios básicos no han permitido el desarrollo de estas propuestas (Canal 2004).

6. OBJETIVOS

Objetivo general:

Determinar la presencia de especies crípticas de Anastrepha obliqua (Wiedemann) en Colombia.

Objetivos específicos:

1. Comparar diferentes poblaciones colombianas de A. obliqua mediante estudios de morfología de huevos, larvas de tercer instar y hembras adultas.

2. Estudiar los cariotipos de diferentes poblaciones colombianas de A. obliqua. 3. Estudiar la compatibilidad sexual entre diferentes poblaciones colombianas de

A. obliqua. 7. METODOLOGÍA Obtención de individuos

Se seleccionaran sitios de muestreo en los Departamentos de Valle, Tolima, Cundinamarca, Meta, Casanare, Córdoba y Bolívar. En cada Departamento se intentara obtener poblaciones de A. obliqua de al menos dos localidades con características climáticas distintas y hospederos diferentes (según la disponibilidad de los mismos). La localización del sitio de muestreo deberá ser realizada a través de GPS. Los frutos colectados serán llevados al invernadero del laboratorio de Entomología de la Universidad del Tolima, donde serán pesados y puestos en cajas con vermiculita; pasados 14 días la vermiculita será examinada para extraer las larvas y pupas que luego serán sometidas a los análisis y pruebas de laboratorio.

Análisis Morfométrico de Adultos

Para los estudios morfológicos se tendrá en cuenta la metodología descrita por (Hernández- Ortiz et al. 2004; Selivon et al. 2005 a, Norrbom y Korytkowski, 2009). Se utilizaran hembras adultas de 5 días de emergidas obtenidas de los frutos colectados de cada uno de los sitios muestreados, tomando 20 adultos al azar por hospedero y/o localidad (cada muestra corresponde a insectos colectados en la misma fecha, hospedero y localidad). Se hará el montaje definitivo, en láminas portaobjeto, del ala y el acauleo utilizando bálsamo de Canadá. En el acauleo, tórax y ala, de la hembra se medirán 44 variables morfométricas (fig. 1, 2, 3, 4 y 5).

Figura 1: Aculeo de Anastrepha con las variables morfométricas a medir. A1: Proporción A2/A3; A2: Largo de la punta basal del aculeo (desde el margen del área esclerotizada en el sitio ventral al inicio de la sección serrada); A3: Largo del ápice del aculeo (largo de la sección serrada); A4: Ancho del final de la margen esclerotizada en el lado ventral; A5: Ancho al inicio de la sección serrada; A7: Longitud total del aculeo; A8: Número de dientes en cada lado; A9: Proporción de la longitud de la punta del aculeo (A2+A3) y longitud total del aculeo (A7)= (A2+A3)/A7.

Figura 2. Tórax de Anastrepha con las variables morfométricas a medir. M1: largo del mesonoto; M2: ancho del mesonoto al nivel de la seta postsutural supraalar; M3: largo del tórax desde el ápice del escutelo hasta la seta postsutural supralar.

A6

A4

A2

A5

A3

M1

M2

M3

Figura 3. Ala de Anastrepha que muestra las longitudes a medir. W1: Longitud del ala desde el extremo basal de la nervadura costal hasta el ápice; W2: Ancho del ala; W3: Ancho de la banda S desde la unión de la banda S y la Vena R4+5 perpendicular a la costa; W4: Ancho de la base del brazo proximal de la banda V; W5: Conexión de la banda S y V entre las venas R2+3 y R4+5 (1= presente; 2= ausente); W6: Conexión de los brazos proximales y distales de la banda V entre las venas R4+5 y M (1= conectada; 2= no conectada); W7: Proporción del largo y ancho del ala = W2/W1.

Figura 4. Ala de Anastrepha que muestra las variables morfométricas a medir. V1: cruce de la vena humeral; V2: rama sectorial de la vena radial R1; V3: rama sectorial de la vena radial R2+3; V4: rama sectorial de la vena radial R4+5; V5: vena media; V6: primera rama de la vena cubital anterior CuA1; V7: segunda rama de la vena cubital anterior CuA2; V8: unión de la vena media y CuA1

W2 W5

W6

W3

W4

W4

CuA2

a Cua1

dm

m

r5

r3

M

r bm

bm-cu

2C

1C

sc

SC

R2

BS

h

BC

C

R2+3

R4+5

M

BV

CuA1

bcu

dm-cu

r-m

Figura 5. Ala de Anastrepha que muestra los segmentos a medir. D1= V1 a V2; D2= V2 a V3; D3= V3 a V4; D4= V4 a V5; D5= V5 a V6; D6= V6 a V7; D7= V7 a V8; D8= V8 a V1; D9= V2 a V7; D10= V3 a V6; D11= V1 a V7; D12= V2 a V8; D13= V2 a V6; D14= V3 a V7; D15= V3 a V5; D16= V4 a V6; D17= V1 a V8 a V1.

Morfología de Larvas

Se realizarán estudios de las larvas de las poblaciones estudiadas siguiendo la metodología y caracteres descritos por Frias et al. (2006; 2008). Las observaciones se realizaran en microscopio óptico y electrónico de barrido. Se colectarán individuos en campo los cuales serán criados en laboratorio (ver pruebas de aislamiento reproductivo); de cada una de las poblaciones se obtendrán treinta larvas de tercer instar, las cuales serán muertas en agua hirviendo por dos minutos y conservadas en alcohol 70% hasta el momento de la preparación para estudios. Una parte las larvas serán colocadas en KOH 10% por 24 horas, luego serán disectadas en solución salina para retirar el esqueleto cefalofaringeo, los cuales serán montados en laminas portaobjetos. Por medio de microscopia de luz se tomarán datos de formas y tamaños del diente apical, la mandíbula, el apodema dorsal, cornua y el esclerito labial. Con otra parte de las larvas se realizarán estudios de microscopía electrónica de barrido, donde se observarán segmento cefálico y el segmento caudal, particularmente el complejo antenomaxilar, el órgano preoral, el diente apical, el borde oral, los espiráculos y tubérculos posteriores y la presencia de espínulas (fig. 6).

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Figura 6. Vista lateral del esqueleto cefalolaringeo de una larva de tercer insatar de Anastrepha. AS= esclerito anterior; AT= diente apical; DA= apodema dorsal; DB= Puente dorsal, DC= cuerno dorsal; DS= esclerito dental; HB= puente de la hipofaringeo; HS= esclerito hipofaringeo; LS= esclerito labial; MD= mandibula; MN= cuello mandibular; PB= barra parastomal; PS= esclerito faringeo; PT= diente preapical; VA= apodema ventral; VB= puente ventral; VC= cuerno ventral.

Morfología externa de huevos

Los huevos serán obtenidos siguiendo dos métodos, descritos por Selivon et al. (2003). En el primero, hembras sexualmente maduras, cerca de 10 a 15 días después de la emergencia, serán diseccionadas y los huevos maduros aislados para posterior fijación. Los huevos colectados serán fijados por la técnica ya estandarizada para Anastrepha (Selivon e Perondini, 1998). En resumen, la fijación será hecha en glutaraldeído a 2,5 %, en tampon cacodilato 0,1 M y pH 7,4 y los huevos perforados para la penetración de la solución fijadora. Los huevos serán pósfijados en solución acuosa de ósmio a 1%, sometidos a secado de punto crítico e cubiertos por una fina capa de oro (“sputtering”). Serán analizados por microscopia electrónica de barrido (MEB). Serán analizadas 5-10 huevos de cada muestra poblacional de cada especie. Las macrofotografías serán editadas por el programa AdobePhotoshop 6.0.

Análisis de Cariotipos

Los cromosomas mitóticos serán obtenidos de los ganglios cerebrales y discos imagínales de cinco larvas hembras y cinco larvas macho que se encuentren en tercer instar de cada una de las poblaciones colectadas, teniendo en cuenta la

metodología descrita por Selivon y Perondini (1997) y por Selivon et al. (2005b). Los pasos a seguir serán los siguientes:

PREPARACIÓN DE CROMOSOMAS

1. Para la obtención de los ganglios cerebrales, cada larva será diseccionada en 0.9% NaCl sobre laminas portaobjetos.

2. El material será transferido a citrato de sodio 2% por 4 min. y fijado en una solución de Metanol/Acido acético (3:1) durante 30 minutos.

3. Las células serán disgregadas por inundación de la lamina en acido acético 60%, dejándose secar a temperatura ambiente (en el proceso de disgregación se utilizaran agujas finas o por aplastamiento).

TINCION BANDA C

1. La etapa de tinción se hace inundando la placa portaobjetos en HCl 0.2N a temperatura ambiente por 10 min., seguidamente se lavará con agua destilada.

2. Las placas se transferirán a una solución saturada de Hidroxido de Bario a 50 °C por 2 minutos.

3. Las placas se lavarán con agua acidulada (agua destilada más unas pocas gotas de ácido acético) y luego trasferidas a una solución de 2 x SSC ( 0.3 M NaCl; 0.003 M de citrato de trisodio) a 60 °C por 30 min en cámara húmeda.

4. Por último, se lavará con abundante agua destilada y el material será teñido con Giemsa 5% en buffer Sorenses pH 7 por 60 - 90 minutos.

Las láminas serán observadas y fotografiadas en microscopio óptico. La imágenes serán editadas en PhotoShop. Las mediciones se harán en 20 mitosis de cada sexo de individuos diferentes.

Prueba de aislamiento reproductivo

Para la realización de esta prueba se seguirá la metodología de cría artificial de Anastrepha descrita por Nuñez y Guzmán (1999), y por medio de la cual se mantiene la cría artificial de A. obliqua desde hace siete años en el laboratorio de Entomología de la Universidad del Tolima. En este ensayo se seguirá la metodología descrita por Selivon y Morgante (1997) y Selivon y Parondini (2007) con 5 hembras y 5 machos vírgenes, realizando cruces intra e interespecificos de las poblaciones colectadas (machos de la población 1 [M1] x hembras de la población 1[H1] control”, machos de la población 1 [M1] x hembras de la población 2 [H2], ...M5xH5). Las moscas se mantendrán en cámaras bioclimáticas con condiciones controladas (24°C, 12 horas luz y 70% HR). Dentro de jaulas tipo EUGO (González et al. 1997) se pondrán parejas de moscas adultas de un día de edad, las cuales serán alimentadas con dieta artificial para adultos y agua a saciedad. A los 12 días de edad, se ofrecerá medio de oviposición (mango o

papaya), el cual será reemplazado cada dos días por seis días. Las frutas serán transferidas a bandejas plásticas por 15 días, donde se realizará la disección de las frutas para la obtención de las larvas, y estas se llevarán a medio de pupación (vermiculita), para la obtención de los adultos. Se ofrecerán medios sintéticos de oviposición en tres ocasiones para cada cruzamiento y los huevos serán puestos en dieta artificial. Este mismo procedimiento se realizará hasta la segunda generación (F2). Los datos obtenidos de los ensayos serán número de huevos, larvas, pupas, adultos y razón sexual. Para determinar el comportamiento de cortejo y copula se harán observaciones periódicas. Terminado el período de oviposición las hembras serán diseccionadas en alcohol al 70% y las espermatecas serán observadas para determinar la presencia de espermatozoides y de esta manera, determinar el tipo de aislamiento reproductivo (pre y postcigotico). Se realizará un diseño completamente al azar con cuatro repeticiones por cruce.

Análisis Estadístico

Los datos morfométricos serán sometidos al análisis Multivariado - análisis cluster- en el programa estadístico INFOSTAT u otros similares. Los datos experimentales de aislamiento reproductivo serán sometidos al análisis de varianza ANOVA, siendo las medias comparadas por la prueba de significancia de Tukey (p= 0.05).

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9. CRONOGRAMA

ITEM ACTIVIDAD DESDE HASTA TIEMPO

1 Ubicación, a través de información secundaria, como son la información de colecta de Anastrepha en el ICA, de las áreas de colecta en los departamentos del Valle, Cundinamarca y Eje Cafetero.

1 3 Meses

2 Recolección de frutos hospederos para los estudios moleculares, morfológicos y biológicos.

4 30 Meses

3 Estudios morfométricos de adultos 6 24 Meses

4 Estudios de morfología de larvas de poblaciones

12 24 Meses

5 Estudios biológicos de compatibilidad sexual

18 32 Meses

6 Estudios de cariotipos de poblaciones 12 18 Meses

7 Elaboración de informes 12 36 Meses