• Electroforésis de ácidos nucleicos,

• Hibridación de ácidos nucleicos (southern blot)

• Amplificación enzimática del ADN (PCR o reacción en cadena de la polimerasa)

• Enzimas de restricción y RFLP

• Secuenciación de ácidos nucleicos

• Microarreglos de ADN

Herramientas y métodos para el Análisis del ADN

Electroforésis de ADN

Southern blotLos fragmentos de ADN se separan en un gel de agarosa y se transfieren a una membrana. El ADN problema esta en forma de cadena sencilla antes de que se agregue una sonda marcada (radioactiva). Si la sonda se une con su blanco o problema se puede detectar a través de su exposición a una película fotográfica. Se formará una banda (mancha) en una posición que corresponde a la hibridación sonda-blanco. El ADN que no hibridó es lavado

Northern Blot

Hibridación ARN - ARN

Western Blot

Hibridación Proteína-Proteína

1983 [24 años]

Kary Mullis desarrolla la técnica de la Reacción en Cadena de la Polimerasa

Reacción en Cadena de la Polimerasa

(PCR polymerase Chain reaction)

Ciclos de una PCR

Desnaturalización

Alineación

Extensión

Reactivos

ADN blanco o problema

Oligonucleótidos (primers, cebadores)

ADN polimerasa termoestable

Nucleótidos trifosfato (dATP, dGTP, etc)

Termociclador

Amplificación por PCR de un gen a partir de ADN genómico

Se diseñan dos primers que hibridan los extremos del gen en cuestión y se lleva a cabo la reacción de PCR (25-35 ciclos).El ADN del gen amplificado se visualiza a través de un gel de agarosa Junto al producto de PCR están marcadores de peso molecular

Producción teórica de ADN amplificado partiendo de una sola molécula blanco después de un experimento de PCR bien diseñado

RT-PCR.

La enzima Transcriptasa inversa usa un oligonucleótido complementario para iniciar la síntesis de ADN (ADNc) a partir de ARNm

Se produce una molécula de ADN de una sola hebra que se usa como templado para la síntesis de una segunda cadena complementaria.

Esta molécula sirve finalmente como blanco para la amplificación por PCR

PCR Anidada

PCR Multiplex

PCR en tiempo real

RT-PCR en tiempo real

EcoRI y EcoRV (obtenidas de Escherichia coli) y PstI (obtenida de Providencia stuartii) . Estas enzimas tienen especificidad para la secuencia reconocida (diana) y cortan a la misma liberando fragmentos con extremos cohesivos o romos.

ENZIMAS DE RESTRICCION

Detección de la mutación que causa anemia falciformemediante digestión con el enzima Mst I I .

mutación

homocigoto Arg-Arg

141 bp

homocigoto Pro-Pro

177 bp

heterocigoto Arg-Pro

Polimorfismo Arg/Pro del gen p53RFLP Polimorfismo en la longitud de los fragmentos de restricción

Detección fluorescente de los fragmentos oligonucleoídicos producidos por el método Dideoxy

Cada una de las cuatro mezclas de terminación de la cadena esta cebada con una marca que fluoresce a diferentes longitudes de onda (por ejemplo, azul para A). La secuencia se determina midiendo la fulorescencia a cuantro longitudes de onda (cuadro inferior)

L. M. Smith, J. Z. Sanders, R. J. Kaiser, P. Hughes, C. Dodd, C. R. Connell, C. Heiner, S. B. H. Kent, and L. E. Hood. Nature 321. (1986):674.]

Secuenciación de ácidos nucleicos

Se puede usar el análisis del ADN para establecer la culpabilidad en delitos.

Aquí, el DNA se aisló de las manchas de sangre en pantalones y camisa de un sospechoso y se amplifico por PCR. Se comparó el DNA del sospechoso con el de la victima y del propio sospechoso usando electroforésis en gel y autoradiografía. El DNA de las manchas de sangre de la ropa del sospechoso tiene un patrón similar al ADN de la víctima pero no al del sospechoso. La frecuencia de patron similar entre los DNAs de la ropa del sospechoso y el de la victima es de aproximadamente 1 en 33 millones.

Carril I, 1kb, y TS = muestras de DNA control; Carril D = DNA del sospechoso; jeans = DNA aislado de las manchas de sangre de los pantalones del sospechoso; shirt = DNA aislado de las manchas de sangre de la camisa del sospechoso (se analizan dos cantidades diferentes); V = Muestra del DNA de la victima

(Cortesía de Cellmark diagnostics, Germantown MD.)

MICROARREGLOS DE ADN

Microarreglos de ADN (Biochips)

Son dispositivos que consisten de miles de pequeños oligonucleótidos (8-15 mer) de secuencia específica unidos a una pequeña superficie de vidrio o silicio y que permiten el análisis de la secuencia nucleotídica de un gen de interés

Los microarreglos de ADN (Biochips o GeneChips) son sistemas microtecnológicos en los que se disponen miles de fragmentos de material biológico (DNA, RNA, proteínas) de una forma ordenada y conocida sobre un soporte sólido.

Microarreglo de DNA ó Biochip

Spotter (Arrayer)

Impresora de sondas de ADN

Scanner

Lector de fluorescencia

Microarreglos o Biochips comerciales

Microarreglos de Oligonucleótidos

Microarreglos de cDNA

(de expresión)

Protein Chips

Tissue Chips

PROCEDIMIENTO

Reutilizable y barato

Práctico

Fácil de interpretar

Sensible

Características de un biochip de DNA ideal

Desventajas

Análisis de un solo gen en un ensayo

Varios pasos

Tiempos prolongados

Aplicaciones de los biochips

Monitoreo de la expresión genética (Expresión espacio-temporal del mRNA durante el desarrollo. bacterias, hongos, plantas, mamíferos)

Detección de mutaciones y polimorfismos (Conocer cómo es la variación polimórfica entre una especie o un subgrupo)

Secuenciación de ácidos nucleicos (Conocer la secuencia primaria entre las regiones codificantes y las regiones reguladoras. Identificación de blancos, descubrimiento/optimización de fármacos, estudios toxicológicos )

Toxicología de fármacos (Analizar la respuesta fisiológica normal y durante la enfermedad)

Diagnostico clínico y detección de microorganismos

Se pueden detectar mutaciones y diagnosticar enfermedades mediante la hibridación de los productos de PCR marcados fluorescentemente de paciente a sondas apropiadas unidas al vidrio.

La detección y la definición de mutaciones presentes en oncogenes, genes supresores de tumores y otros genes ayudarán en la terapia anticancerígena.

Un solo microarreglo puede detectar las mutaciones más comunes en genes como p53, ras, brcA1, rb, bcr.abl, etc., que se hallan en cánceres de pulmón, mama, páncreas, leucemias y otros.

Seguimiento de terapia

Medicina preventiva

Estudios genéticos a gran escala

Microarreglos de DNA comerciales

Incyte Genomics IncMotorola biochips systems Nanogen IncAgilent Technologies IncAffymetrix Hyseq Perkin Elmer Life SciencesEppendorfNEN life SciencesQiagenF Hoffmann La Roche LTDStratagene Takara Bio Inc

Aprox. 40 empresas

LinfoChip®

GeneChip Maize Genome array ®

MammaPrint®

ViriChip®

DR Milk kit18®

DR HBV chip®

Oncotype DX®

PapilloCheck®

LipoChip®

Aprox 105 marcas

Biochips de proteínasBiochips de carbohidratosBiochips de tejidos

Las técnicas moleculares aplicadas en la identificación

de genes, han tenido un enorme desarrollo en la

medicina forense, preventiva y farmacológica

(farmacogenómica)

•Actualmente se basa en la clínica

•Detección de la enfermedad antes de que surja como entidad clínica (Neurodegenerativas, Autoinmunes, metabólicas)

•Diagnóstico en Infectocontagiosas: Se basa actualmente en métodos descriptivos o indirectos (cultivos, serología, etc).

DIAGNOSTICO MEDICO

¿Por qué diagnóstico Molecular?

• Detección y Diagnóstico– De agentes no cultivables o difíciles de cultivar– Necesidad de un resultado rápido– Métodos bioquímicos inadecuados Detección de la enfermedad ante de que surja como entidad clínica (Neurodegenerativas, Autoinmunes, Metabólicas, etc

• Pronóstico y tratamiento– Necesidad de información cuantitativa (carga viral)- Monitoreo de la respuesta terapéutica

• Detección de genes de resistencia, patogenicidad,etc– pruebas de susceptibilidad sin cultivo (resistencia a drogas)

Nuevos métodos molecularescomplementan más que

sustituyen a losmétodos diagnósticos

convencionales:incrementan significativamente

loscostos para el presupuesto del

laboratorio

Diagnóstico Molecular

¿En dónde estamos?• Las técnicas más utilizadas en este momento son: PCR, RT-PCR, Secuenciación de ADN, Microrreglos de ADN

• Existe una tendencia al uso de métodos automatizados y sistemas comerciales

• Se están implementando sistemas de QC (CLSI MM3-A2, 2006. “Colección transporte, mantención y preparación de las muestras para BM)

•http://webstore.ansi.org/ansidocstore/product.asp?sku=MM3-A2

Plataformas comerciales “más amigables”

Mayor posibilidad de acceder a las técnicas de BM

El diagnóstico Molecular tiene muchos usos

• Puede monitorear la eficacia del tratamiento

(tratamiento temprano) y seguimiento de la

enfermedad

• Puede proporcionar información para el diseño de

nuevos tratamientos (p.e detección del cáncer)

• Puede predecir la respuesta del paciente al

tratamiento (farmacogenética: tratamientos

personalizados)