ProPagación in vitro de vid variedad globo rojo

Micropropagación de vid variedad Red Globe

Universidad aUtónoma de CiUdad JUárez

Javier sánchez CarlosRector

david ramírez PereaSecretario General

Hugo staines orozcoDirector del Instituto de Ciencias Biomédicas

Martha Patricia Barraza de AndaCoordinadora General de Investigación y Posgrado

servando Pineda JaimesDirector General de Difusión Cultural

y Divulgación Científica

Universidad Autónoma de Ciudad Juárez

ProPagación in vitro de vid variedad globo rojo

Micropropagación de vid variedad Red Globe

Pedro osuna Ávila

carlos saucedo

CienCias agropeCuarias

CoordinaCión general de investigaCión y posgrado

Lisbeily Domínguez Ruvalcaba Coordinadora de la ColeCCión

osuna ávila, Pedro.

Propagación in vitro de vid variedad Globo rojo / Pedro osuna ávila, Carlos saucedo. Ciudad Juárez, Chih. : Universidad autónoma de Ciudad Juárez, 2010. (Colección textos Universitarios, serie investigación)

32 p.; 30 cm.

Colección Reportes Técnicos de Investigación ISBN: 978-607-7953-80-7serie iCB, vol. 6, isBn: 978-607-9224-01-1

La fuente de material vegetal para iniciar el proceso de propagación in vitro de vid variedad Globo rojo, fueron las yemas axilares y apicales, que se sometieron a un proceso de desinfección y a una estimulación de reguladores de crecimiento, para la rápida estimulación del desarrollo de nuevos brotes, donde las características agronómicas serán preservadas.

vid – Cultivo in vitro viticultura

sB387.65 o78 2010

Primera edición, 2011© 2011 Universidad autónoma de Ciudad Juárezav. Plutarco elías Calles 1210Fovissste Chamizal, C.P. 32310Ciudad Juárez, Chihuahua, méxicotel. +52 (656) 688 2260

http://www2.uacj.mx/publicaciones

d.r. © 2011 Pedro osuna ávila, Carlos saucedoLa edición, diseño y producción editorial de este documento estuvo a cargo de la Dirección General de Difusión Cultural y Divulgación Científica, a través de la subdirección de Publicaciones Corrección: Jorge Hernández martínezDiagramación: diana Prado GonzálezDiseño de cubierta: diana Prado González

Índice

Resumen 7

abstract

Palabras clave 9Usuarios potenciales 9Reconocimientos 9

i. introducción

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ii. Planteamiento

Marco teórico 13

iii. metodologÍa

Material vegetal 19Establecimiento aséptico del explante 19Multiplicación de brotes 20Enraizamiento de los brotes 20Etapa de aclimatación 20

iv. resultados

Asepsia del explante 21Selección del explante para la etapa de multiplicación de brotes 21

Evaluación del explante de yema axilar 22 en multiplicación de brotes 22Enraizamiento de los brotes 23Aclimatación a condiciones de invernadero 24

v. conclusiones

Bibliografía 27

Anexo 29Tabla 1. Número de hojas inducidas en el explante

de yemas axilares 30Tabla 2. Longitud de plantas a partir del explante

de yemas axilares 31

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resumen

La fuente de material vegetal para iniciar el proceso de propagación in vitro de vid variedad Globo rojo, fueron las yemas axilares y apicales, que se so-metieron a un proceso de desinfección y a una estimulación de reguladores de crecimiento, para la rápida estimulación del desarrollo de nuevos brotes,

donde las características agronómicas serán preservadas.el mejor tratamiento en la desinfección del explante, fue el de cloro al 50% durante 5 mi-

nutos, que indica que los explantes, tanto el ápice como las yemas axilares, no sufrieron da-ños físicos por el desinfectante y estuvieron listos para usarse en los siguientes estudios.

al observar el comportamiento de los tratamientos con benzilaminopurina en desa-rrollo, tanto del explante de ápices como de yemas axilares, se consideró al de yemas axilares como el explante para usarse en la etapa de la multiplicación de brotes.

La comparación de medias de tukey (α = 0.05), detectó que las mejores concentra-ciones de benzilaminopurina en la multiplicación de brotes, fue de 3 y 4 µm. Los brotes fueron exitosamente enraizados con el regulador de crecimiento de ácido indolacético.

Las plántulas sobrevivieron al transferirse de las condiciones del cultivo in vitro, al sustrato de suelo en condiciones de invernadero. Con base en los resultados, se pudo esta-blecer un protocolo de multiplicación in vitro para la variedad de vid Globo rojo, que po-dría diversificar los sistemas de producción en la región de Ciudad Juárez, Chihuahua.

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abstract

the source of this study began with the axilar buds and shoot apexes. Both explants where submitted into the disinfection process and were cultured on growth regulators to promote de novo shoots where the agronomic cha-racteristics are preserved. the best disinfection treatment of the explants

was 50% bleach for 5 minutes. this indicates that both explants (axilar bud and shoot apex) were healthy without any damages caused by the bleach product and were ready to use in the next experiments.

the mean comparison, according to tukey (α = 0.05), detected that the best treatments in the shoot multiplication stage were 3 and 4 µm of benzilaminopurine. the shoots were successfully rooting with the growth regulator of indolacetic acid.

the seedlings survived when they were transferred from in vitro culture to soil subs-trate on green house conditions. according with these results, the micropropagation protocol for grape variety red Globe established the possibility of diversifying the pro-duction systems in the region of Ciudad Juárez, Chihuahua.

Palabras clave:

Cultivo in vitro, uva, Red Globe.

Usuarios potenciales:

Fruticultores, agricultores, empresas privadas de producción agropecuaria, proce-sadores de alimentos, exportadores de productos.

Reconocimientos:

se agradece al estudiante Carlos saucedo, por su participación en el desarrollo del protocolo en el Laboratorio de Cultivo In Vitro de tejidos vegetales, así como a la Universidad autónoma de Ciudad Juárez (UaCJ), por instalar en uno de sus espa-cios este laboratorio.

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i. introducción

en la actualidad, el consumo de uva de mesa, especialmente de Vitis vinifera L. variedad Globo rojo, tiene una gran demanda a nivel mundial (Fao, 2004). españa es el país con el mayor territorio destinado al cultivo de uva, seguido por italia, turquía, China y estados Unidos.

La variedad de uva Globo rojo, fue obtenida en 1958 por olmo y Koyoma en davis, California, como resultado de una cruza múltiple de los genotipos (Hunisia x empe-ror) x (Hunisia x emperor x nocera). Los frutos de esta variedad, son esféricos, con un tamaño de 24 a 28 mm de diámetro ecuatorial, y con sabor neutro. Las caracterís-ticas de la baya son: colores rojo, rojo vino, rosa o rojo violáceo, pulpa crujiente y piel gruesa, resistente y fácil de desprender.

La mayoría de los frutos de otras variedades, son sensibles al manejo y al transporte, ocasionando fuertes pérdidas a la poscosecha. sin embargo, la uva variedad Globo rojo tiene características sobresalientes, que no son fáciles de encontrar en otras variedades de uva de mesa. Por ejemplo, el racimo es muy grande, cilíndrico, cónico y de semisuelto a semicompacto. estas características evitan la pérdida por presión entre las bayas. además, la vid presenta una buena conservación, tanto en la planta como en condicio-nes de refrigeración, que le permitiría adaptarse a las condiciones del mercado.

La variedad es resistente al manejo y al transporte a largas distancias, que podría extenderse a lo largo del mercado nacional e internacional. al producir esta variedad en Ciudad Juárez, se lograría bajar los costos de producción y mejores precios del producto al consumidor. esta variedad de uva es muy atractiva al consumidor, por el tamaño y color de su baya, y está por convertirse en la favorita a nivel mundial; de aquí la importancia de su propagación (exportadora san Juan, 2007).

La propagación comercial de la vid, no ha cambiado radicalmente por siglos, pero los métodos básicos usados hoy, son aquellos de nuestros ancestros. el método prin-cipal es mediante el enraizamiento de estacas dormantes de 15 a 20 cm de largo, técnica que ha sobrevivido a lo largo del tiempo. sin embargo, este método no nos permite un rápido abastecimiento de material vegetativo de uva, para nuevas áreas de siembra en la región.

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Propagación in vitro de vid variedad Globo Rojo

Con el éxito de los programas de selección clonal, los virólogos, quienes obtuvieron plantas libres de virus, o los fitomejoradores, que desarrollan nuevas variedades, tie-nen una gran necesidad de un rápido abastecimiento de especímenes únicos, así que los clones pueden estar disponibles en suficientes cantidades para el establecimiento de viñedos para producción comercial (Chee, et al., 1984).

Un método que se propone para cubrir estas demandas de producción comercial, es la llamada multiplicación vegetativa in vitro, que podría abastecer un gran núme-ro de clones en un periodo corto de tiempo, sin importar las estaciones del año. La técnica de multiplicación vegetativa in vitro, a partir de yemas axilares y apicales, se refiere a la rápida estimulación del desarrollo de brotes apicales (meristemos), a través de reguladores de crecimiento, donde las características agronómicas son pre-servadas (toro, 2003).

El presente estudio tiene como finalidad establecer un protocolo de propagación in vitro de vid variedad Globo rojo, que serviría de base para poder iniciar una produc-ción a mayor escala. esto podría convertir de nuevo a Ciudad Juárez en una entidad más de producción de uva en el país, con el potencial de diversificar la producción agrícola y abrir nuevas fuentes de empleo en el campo.

Propagación in vitro de vid variedad Globo Rojo 13

ii. Planteamiento

La uva variedad Globo rojo, es frecuente encontrarla en los mercados de con-sumo a lo largo del año, pero es muy atractiva para consumo en fresco en las épocas de fiesta internacional como la Navidad. Por sus cualidades únicas, es una uva de gran tamaño, de cáscara firme y cuerpo tierno con semillas

grandes, y al madurar, se caracteriza por su color rojo oscuro y un brillo ligero.Presenta una buena conservación, tanto en la planta como en condiciones de refri-

geración, que le permitiría adaptarse a las condiciones más exigentes del mercado. La fruta es resistente al manejo y al transporte a largas distancias, que podría exten-derse a lo largo del mercado nacional e internacional. al reintroducir esta variedad en Ciudad Juárez, se comercializaría al más alto precio con estados Unidos, ya que la mayoría de la producción proviene de argentina y Chile.

es la variedad favorita a nivel mundial y la hace muy atractiva, para capitali-zar los productos agrícolas del estado de Chihuahua. La herramienta más viable de abastecer continuamente de material vegetal a nivel comercial en menos tiempo, es la técnica in vitro de cultivo de tejidos vegetales.

Marco teórico

de acuerdo con el departamento de agricultura de estados Unidos, en 2004 la su-perficie cultivada para uva de mesa en México fue de 19 000 hectáreas, de las cuales 18 200 fueron cosechadas, obteniendo una producción total de 230 800 toneladas.

de acuerdo con la secretaría de agricultura, Ganadería, desarrollo rural, Pesca y alimentación (sagarpa) (2003), sonora cultiva el 90% de la vid de mesa. el creci-miento de la producción de China, lo mantiene como el principal productor de uva de mesa. se espera que este año las contribuciones de italia y méxico, se incrementen en 86 000 y 25 000 toneladas, respectivamente (inFoCir, 2005).

Chile es el principal proveedor durante el periodo noviembre-abril, y méxico, du-rante los meses de mayo, junio y julio. otra de las ventajas que le permiten a méxico

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Propagación in vitro de vid variedad Globo Rojo ii. Planteamiento

ubicarse como uno de los principales proveedores del mercado anglosajón, es la cerca-nía a la principal zona productora en estados Unidos, lo que le permite reducir costos en fletes y tratamientos poscosecha.

en Ciudad Juárez, durante el siglo Xviii, los más importantes lugares con viñe-dos de esta vasta región, fueron impulsados y privilegiados por la Corona española mediante la exención de impuestos. tales fueron los casos de santa maría de las Parras, cuya producción llegaba a más de 24 mil arrobas en 1777, y real Presidio del Paso del norte (Ciudad Juárez, Chihuahua) (Corona, 2004).

en el libro Historias cercanas, se menciona que la gente solía degustar los frutos producidos por los viñedos de Ciudad Juárez, Chihuahua, y revela que esta ciudad tiene una gran historia en el cultivo de la vid, ya que fue una de las regiones más importantes de éste, siendo plasmada en el escudo de Ciudad Juárez (Chávez, 1991; Pérez-López, 2003).

La uva tradicionalmente se propaga de manera vegetativa mediante acodos, ya sea aéreos o terrestres, e injertos, aunque las estacas leñosas maduras, se usan con mayor frecuencia para producir estacas arraigadas, para la propagación masiva de árboles femeninos de variedades selectas (Kartman y Kester, 1995). sin embargo, la herramienta biotecnológica del cultivo in vitro, se basa en el concepto de la totipoten-cialidad celular, donde cada célula tiene el potencial de producir una planta completa (margara, 1988).

el que cada célula pueda producir un clon, hace de la propagación tradicional una técnica con desventaja. Por ejemplo, Haberlandt (1902), con la idea de la totipotencia-lidad celular, desarrolla el primer cultivo in vitro de tejidos vegetales.

el cultivo de tejidos, como técnica, consiste esencialmente en aislar una porción de la planta (explante) y proporcionarle artificialmente las condiciones físicas y quí-micas apropiadas, para que las células expresen su potencial intrínseco o inducido y producir un mayor número de copias de la planta usada (Hurtado y merino, 1991).

el medio de cultivo, es la combinación sólida o líquida de nutrientes y agua. Usual-mente incluye sales inorgánicas, carbohidratos, vitaminas y aminoácidos. a menudo se denomina medio basal y puede ser suplementado con algún regulador de cremien-to, y ocasionalmente con otras sustancias con actividad hormonal.

Los nutrientes son esenciales para el crecimiento y desarrollo de una planta, ya que sin agua y nutrientes minerales no puede vivir in vitro ni in vivo. también se deben añadir azúcares al medio de cultivo, ya que las plantas (o sus fragmentos) no son completamente autotróficas cuando se desarrollan en estas condiciones (Aceves y Hernández, 1997; roca y santana, 1992).

Los reguladores de crecimiento (rC), son esenciales en los medios de cultivo, ya que orientarán al explante a la formación de nuevos brotes. Los rC son sustancias extraídas de algún tejido vegetal o sustancia sintética, que tienen el efecto de regular el crecimiento; de aquí la procedencia de su nombre como regulador del crecimiento vegetal. también se les conoce erróneamente como hormonas del crecimiento, tér-mino mal empleado, debido a que estos reguladores no son endógenos del material

Propagación in vitro de vid variedad Globo Rojo ii. Planteamiento

15vegetal, sino que son agregados al medio de manera exógena, para obtener un mejor desarrollo y crecimiento del material vegetativo. de tal forma que estos reguladores del crecimiento vegetal son, entonces, compuestos orgánicos distintos a los nutrien-tes, que en cantidades pequeñas aumentan, evitan o cambian de alguna manera el proceso natural y fisiológico en la planta.

de acuerdo a sus características y a los efectos que tienen sobre el material vege-tal, estos reguladores de crecimiento se dividen en tres grandes grupos (Hurtado y Merino, 1991). Existe una clasificación de los reguladores de crecimiento, de acuerdo al efecto que producen en el material vegetal, y pueden ser promotores de crecimien-to, por ejemplo: auxinas, citocininas y giberalinas.

Las auxinas son sintetizadas en el tallo y ápices, para luego ser transportadas a lo largo de toda la planta. La acción primaria de éstas, es la elongación de las cé-lulas. también estimulan la división y diferenciación celular, y en conjunto con las citocininas, regulan procesos de desarrollo muy importantes. en el cultivo de tejidos, son utilizadas conjuntamente con las citocininas para controlar la diferenciación y la morfogénesis.

Las citocininas promueven el crecimiento y desarrollo de las células. La primera citocinina en ser identificada, fue la cinetina, la cual fue aislada de muestras de adn de espermatozoides. esta citocinina ha sido la encargada de los incrementos en la división celular del cultivo de células de tabaco. subsecuentemente, la zeatinina fue aislada del maíz. Químicamente, las citocininas son derivadas de la base nitro-genada y son frecuentemente utilizadas en el cultivo de tejidos, y las más usadas son: cinetina, benzilaminopurina, zeatinina y adenina (evans et al., 2003; Hurtado y merino, 1991).

Las yemas axilares y apicales, son explantes comúnmente usados en la micro-propagación de las plantas. ibáñez et al. (2003) utilizaron varias citocininas, para la obtención de brotes de Vitis vinifera L. cv. Napoleon. de las citocininas ensayadas (6-benziladenina (BaP), kinetina (K), 2-isopenteniladenina (2iP), y tidiazuron (tdz), BaP fue la que produjo mejor respuesta morfogénica. Las mejores concentraciones de 6.67 y 8.9 µm de BaP, promovieron un 100% de proliferación de brotes.

Mesa (2001) realizó un ensayo, a fin de implementar una metodología de propaga-ción in vitro, para un nuevo cultivo de uva de mesa (Vitis vinifera L.). se utilizaron brotes en activo crecimiento de 40 cm de longitud desarrollados al aire libre. se obtu-vieron segmentos nodales de las regiones apical, media y basal, de 25 mm de longi-tud, las cuales fueron reducidas a microestacas de 10-15 mm con un nudo cada una.

el medio de cultivo utilizado fue el de murashige y skoog (1962) en todas las eta-pas, suplementado con 0.4 mg/i de tiamina, 100 mg/i de inositol, 170 mg/i de naH2-Po4 y sacarosa al 3%, para las etapas de establecimiento y proliferación. en la etapa de establecimiento, se consideraron las siguientes variantes: 2 mg/i de BaP, 1 g/i de gelrite y 1.8 g/i de agar merck. Para la fase de proliferación, se usaron: 1.1 mg/i de BaP, 80 mg/i de sulfato de adenina y 2 g/i de gelrite más 0.5 g/i de agar merck.

Propagación in vitro de vid variedad Globo Rojo ii. Planteamiento

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ii. Planteamiento

manzur (2005) para el medio de establecimiento de los ápices, utilizó ms al 50% de su concentración (2.2 g/l), adicionando sacarosa (30 g/l), hidrolizado de caseína (100 mg/l), BAP (0.6 mg/l), ácido ascórbico (50 mg/l), gelificantes con agar (Midesa) (3 g/l) y Phytagel (2 g/l). Para estimular el crecimiento de los ápices, utilizó ms completo (4.43 g/l), adicionando sacarosa (15 g/l), hidrolizado de caseína (100 mg/l), BaP (0.4 mg/l), hidroxiquinoleína (1.25 mg/l), PvP-40 (1 g/l), glicina (2 mg/l) y glutamina (600 mg/l). También usó gelificantes con agar (Midesa) (3.5 g/l) y Phytagel (2 g/l).

Para el enraizamiento de los brotes, generalmente son usadas las auxinas como re-guladores de crecimiento. ibáñez et al. (2003), en la fase de enraizamiento, utilizaron 0.4 mg/i de tiamina, 25 mg/i de inositol, 0.2 mg/i de aia, sacarosa al 1%, 150 mg/i de naH2Po4 y 1.5 g/i de gelrite más 0.5 g/i de agar merck.

en primer término, evaluaron el efecto del origen del explante en el establecimien-to in vitro de Vitis vinifera L. Los mejores resultados los obtuvieron en microestacas de origen apical, ya que consiguieron un mayor número de hojas y una alta tasa de proliferación potencial. también evaluaron el comportamiento in vitro en función del medio de proliferación y el origen del explante. Los mejores resultados del mayor cre-cimiento en número de hojas y número de raíces, los obtuvieron con concentraciones de 0.2 mg/i de aia, usando microestacas apicales y estacas disectadas en las partes medias de las plantas.

manzur (2005) promovió el enraizamiento, al utilizar el medio de murashige y skoog, adicionando sacarosa (15 g/l), hidrolizado de caseína (100 mg/l), aiB (0.5 mg/l), hidroxiquinoleína (1.25 mg/l), PvP-40 (1 g/l), glicina (2 mg/l), glutamina (600 mg/l) y gelificantes (3.5 g/l de Midesa y 2 g/l de Phytagel).

durante todo el cultivo in vitro, las condiciones en la cámara de crecimiento fueron de 16 horas luz (5000 lux) y 8 horas de oscuridad, y temperatura de 22 ± 5º C. se uti-lizaron frascos de vidrio de 15 cm de largo y 2.5 cm de diámetro con un volumen total de 60 ml, pero únicamente con 10 ml de medio, cubiertos con papel de aluminio.

Saffie y Dominique (2002) realizaron el enraizamiento in vitro, utilizando el medio de murashige y skoog (1962), con macro y micronutrientes al 100% y 50%, pero sin reguladores de crecimiento. Las plantas enraizadas deben de transferirse a suelo, bajo condiciones de invernadero, para que realicen su actividad normal de autótrofas.

Saffie y Dominique (2002) realizaron dos ensayos, entre abril de 2001 y marzo de 2002, con el fin de aclimatar plantas de vid propagadas in vitro. en el ensayo 1, se comparó el efecto de la preaclimatación y del enraizamiento in vitro versus ex vitro de plantas de vid propagadas in vitro en su respuesta a la aclimatación.

Usaron microestacas de 3 cm de largo, con tres a cuatro hojas verdaderas. Los tubos que se preaclimataron, los taparon con papel filtro y sobre éste se colocó papel aluminio, al cual se le hizo un orificio de 3 mm, aproximadamente, y luego los sella-ron con parafilm. Los tubos que no se preaclimataron, se taparon solamente con pa-pel aluminio y se sellaron con parafilm. se demostró en plantas de vid enraizadas in vitro, que preaclimatando se logran tasas de sobrevivencia más altas. sin embargo,

Propagación in vitro de vid variedad Globo Rojo ii. Planteamientoii. Planteamiento

17con respecto a la sobrevivencia de las plantas ya aclimatadas, no influye el tipo de enraizamiento, la preaclimatación ni el sustrato.

manzur (2005) llevó a cabo la aclimatación de explantes con al menos dos raíces primarias bien formadas y cuando éstas alcanzaron un tamaño superior a 3 cm, se extrajeron de los frascos de cultivo y se eliminaron los restos de agar de las raíces con chorro de agua corriente. Las plantas limpias se sumergieron en una solución de ridomil (0.5 g/l) o Captan (2.5 g/l) y se establecieron en bandejas de poliuretano (para 40 plantas en espacios de 7 x 7 x 8 cm).

el sustrato fue una mezcla (2:1) de turba/perlita estériles. La aclimatación fue en una cámara con condiciones ambientales (90% Hr, 24 ºC, fotoperiodo de 12 horas luz [3000 lux]). en esta cámara, las plantas permanecieron hasta que se presentó una hoja nueva desplegada (alrededor de tres semanas).

durante la primera semana, se abrió paulatinamente la tapa de la bandeja y luego se removió completamente. Las plantas se regaron dos veces por semana con 5 ml de solución nutritiva ms y agua destilada. Los cortes vegetativos, se pasaron a otra cámara climatizada (60% Hr, 22 ºC, fotoperiodo de 16 horas luz [3000 lux]) hasta que alcanzaron un tamaño de 12 cm y de dos a tres hojas desplegadas (3-4 semanas). es-tas plantas se encontraron en condiciones para ser trasplantadas a sustrato (tierra) y llevadas a un invernadero con un 90% de sobrevivencia. Con este marco de referen-cia, se inició el experimento para establecer un protocolo de micropropagación de vid variedad Globo rojo para la región de Ciudad Juárez, Chihuahua.

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iii. metodologÍa

el trabajo de investigación fue realizado en el Laboratorio de Cultivo In Vitro de tejidos vegetales de la UaCJ. Las instalaciones de la UaCJ cuentan con un invernadero de 10 x 20 m, con temperatura y humedad controlada, condiciones ideales para este estudio.

Material vegetal

Fueron donados sarmientos (segmentos de tallos) de uva de mesa variedad Globo rojo, por el doctor estéfano de la Universidad autónoma de Baja California, y colec-tados de viñedos del estado de California, eU.

Las fuentes de explantes para realizar este estudio, fueron plantas de seis meses de edad crecidas bajo condición de invernadero en macetas de plástico (12 x 20 cm), conteniendo una mezcla de peat moss con arena, con una proporción de 1:1. asimis-mo, fueron realizados riegos periódicos con agua corriente durante tres veces por semana. Las plantas fueron fertilizadas dos veces con urea (3 g/planta).

Establecimiento aséptico del explante

Fueron seleccionados esquejes de 1.5 cm de longitud en yemas axilares y ápices de 1 cm de longitud con el domo apical. ambos explantes fueron disectados de plantas crecidas bajo condiciones de invernadero. Las hojas fueron eliminadas de los esquejes para yemas axilares.

Los explantes fueron tratados con una solución de cloro comercial al 50% durante 5, 7 y 9 minutos, y se enjuagaron dos veces con agua destilada, para eliminar residuos

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Propagación in vitro de vid variedad Globo Rojo

de cloro. Las yemas axilares y ápices, se colocaron en frascos (2.5 x 18 cm) con el me-dio de cultivo de murashige y skoog (1962) al 100%.

dos explantes fueron cultivados por frasco, que representa la unidad experimen-tal. Cuatro repeticiones fueron usadas por tratamiento y el porcentaje de contamina-ción, fue evaluado.

Multiplicación de brotes

Una vez realizado el tratamiento aséptico, las yemas axilares de 1.5 cm de lon-gitud y ápices de 1 cm de longitud, fueron colocados en frascos (2.5 x 18 cm) con el medio de cultivo de murashige y skoog (1962), el cual fue suplementado con 3, 4, 5, 6 y 7 µm/l de BaP, con cuatro repeticiones por tratamiento.

el número de nudos y hojas, fueron contados, y la longitud de la planta, fue me-dida en centímetros. Los datos fueron analizados mediante un análisis de varianza (anova), y se usó tukey para determinar la comparación de medias.

Enraizamiento de los brotes

Para la etapa de enraizamiento, fueron seleccionados brotes de 10 cm de longitud, los cuales fueron disectados 2 mm debajo de su nudo basal y trasplantados vertical-mente dentro del medio hasta aquél.

Un brote fue plantado por frasco (5 x 18 cm) con el medio de cultivo de murashige y skoog (1962), y suplementado con 0.2, 0.4 y 0.6 mg/ml de ácido indolacético (aia). Fueron utilizadas dos repeticiones por tratamiento.

el número de raíz y la longitud de la planta, fueron medidos en centímetros. Los datos fueron analizados mediante un análisis de varianza (anova), y se usó tukey para determinar la comparación de medias.

Etapa de aclimatación

Fueron trasladadas plantas enraizadas hacia el invernadero, donde se destaparon los frascos y se removió el agar de las raíces con agua corriente.

Las plántulas fueron transferidas a vasos de poliestireno (12 oz), conteniendo un sustrato húmedo de peat moss. Las plántulas trasplantadas, se cubrieron con frascos de vidrio transparente y a los siete días, se removió el frasco para su aclimatación al nuevo medio ambiente del invernadero. La aclimatación, se evaluó en el porcentaje de supervivencia y el desarrollo de las plantas.

Propagación in vitro de vid variedad Globo Rojo 21

iv. resultados

Asepsia del explante

La asepsia de los explantes y las condiciones de esterilidad, donde se desarro-lla el proceso de establecimiento del material vegetal in vitro, es de vital im-portancia para el éxito de la técnica de cultivo de tejidos vegetales en vid.

Para mantener los explantes libres de contaminantes, se sometieron las yemas axilares y ápices de vid a 50% de cloro comercial, a tiempos de 5, 7 y 9 minutos. estos tres tratamientos mantuvieron a los explantes libres de contaminantes, que pre-vinieron el crecimiento de hongos y bacterias, que destruirían los tejidos vegetales.

al evaluar el porcentaje de contaminación en los explantes, se observó que el tra-tamiento con tiempo de exposición de 5 minutos, fue superior a los demás. esto indica que los explantes, tanto el ápice como las yemas axilares, estuvieron en un 100% libres de contaminantes y que , a la vez, no sufrieron daños físicos por el desinfectan-te. sin embargo, cuando los explantes fueron expuestos a mayor tiempo (7 minutos), presentaban daños por quemaduras, que necrosaban la parte basal del tejido. el peor tratamiento fue con tiempo de 9 minutos, donde sufrió una necrosis total conllevando a la muerte del explante.

toro (2003) utilizó fungicidas antes del tratamiento de cloro. en contraste, Ponce (2007) utilizó etanol, seguido del cloro al 15%, por 20 minutos.

Selección del explante para la etapa de multiplicación de brotes

Para definir el mejor explante en la etapa de la multiplicación de brotes, se evaluó el efecto de la citocinina de benzilaminopurina (BaP). Fueron cultivados explantes asépticos de ápices y yemas axilares en un medio de cultivo de murashige y skoog (1962), sumplementado con el rC BaP, a concentraciones de 3, 4, 5, 6 y 7 µm.

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Propagación in vitro de vid variedad Globo Rojo iv. resultadosiv. resultados

Las concentraciones del rC, tuvieron un efecto positivo en la formación de nue-vas yemas en ambos explantes el análisis de varianza, detectó que hay diferencias significativas dentro de los tratamientos de la categoría de número de nuevas yemas inducidas, tanto en el explante de ápices como de yemas axilares.

La comparación de medias de tukey (α = 0.05), nos indica que los tratamientos de 3 y 4 µm de BaP fueron superiores y consistentes, al promover 0.475 y 0.400 para yemas axilares, y 0.500 y 0.500 para ápices de nuevas yemas, respectivamente. La inducción de yemas es potencial para la formación de brotes.

La figura 1 muestra la imagen de la inducción de nuevas yemas, a partir del mejor tratamiento de 3 µm de BaP. Los nudos son muy visibles donde es inducido un nuevo brote, porque en condiciones naturales estas yemas son inactivadas por la dominan-cia apical. Las hojas desplegadas muestran la similitud con las formas verdaderas de una planta de uva crecida en el campo. en contraste, en las concentraciones a 5 µm, los brotes presentan una apariencia arrocetada, donde uno de los tallos se observa engrosado, lo cual se podría deber a un desorden hormonal.

es común que los explantes respondan a la aplicación de rC exógenos, con incre-mento de volumen de tallos y una reducción del tamaño de las hojas, debido a que se desconoce la concentración hormonal endógena, y una aplicación exógena de rC, trae como consecuencia anormalidades en la arquitectura de los brotes.

al observar el comportamiento en desarrollo, tanto del explante de ápices como de yemas axilares, se consideró al de yemas axilares como el explante para usarse en la etapa de la multiplicación de brotes, debido a que el explante de ápices es un meristemo, que, por su dominancia apical, indujo más elongación que inducir nuevos brotes laterales, tal como fue observado en el explante de yemas axilares. Por lo tan-to, el explante de yemas axilares se evaluará en la multiplicación de brotes, donde se evaluarán diferentes variables.

Evaluación del explante de yema axilar en multiplicación de brotes

Con el objetivo de determinar la consistencia, confiabilidad y repetitividad del pro-tocolo de micropropagación in vitro de la vid, se determinó usar el mejor explante del ensayo anterior, que fue el de yema axilar. Una vez determinado que el explante de yema axilar, será incluido en el establecimiento del protocolo de la multiplicación in vitro de la vid, se procedió a evaluar su respuesta a las mismas concentraciones de BaP (3, 4, 5 y 7 µm) con las siguientes variables: número de hojas, número de nudos y altura de la planta.

respecto a la variable de número de hojas, el análisis de varianza indicó diferen-cias altamente significativas entre los tratamientos (tabla 1). La comparación de me-dias de tukey (α = 0.05), mostró que las concentraciones de 3 y 4 µm de BaP fueron

Propagación in vitro de vid variedad Globo Rojo iv. resultados

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iv. resultados

superiores que en el resto de los tratamientos. ellos promovieron 3.7 hojas en prome-dio y mostraron hojas bien diferenciadas y expandidas.

ibáñez et al. (2003), mesa (2001) y Chee et al. (1984), utilizaron varias citocininas para inducir brotes múltiples en vid y observaron que la benziladenina fue la más efectiva (Jaskani et al., 2008).

Aunque Manzur (2005) modificó el medio de cultivo de Murashige y Skoog (1962), sus mejores tratamientos fueron 3 y 4 µm de benziladenina, que coinciden con los resultados de este estudio.

respecto a la variable de número de nudos, el análisis de varianza detectó que no existieron diferencias significativas entre los tratamientos. Sin embargo, los tratamien-tos de 3 y 4 µm fueron superiores al resto con 3.13 y 2.20 nudos, respectivamente.

La distribución de los nudos en cada hoja, a lo largo de la planta, contienen yemas que podrían ser potenciales de nuevos brotes (figura 1). El tratamiento con concen-traciones de 3 µm de BaP, continúa representando ser la mejor respuesta en la mor-fogénesis de la propagación in vitro de la vid.

La variable de longitud de la planta, es otra manera de evaluar los efectos de las concentraciones de BaP en el explante de yemas axilares. el análisis de varianza detectó que existen diferencias significativas entre los tratamientos (tabla 2). La com-paración de medias de tukey (α = 0.05), nos indica que los tratamientos de 3, 4 y 5 µm de BaP fueron superiores en la longitud de las plantas con 3.44, 1.88 y 1.05 cm, respectivamente, con el resto de los tratamientos ensayados. La figura 1 representa una de las plantas de mayor longitud, que refleja que todas las hojas y tallos conser-van el color verde característico de la juvenilidad de brotes de una planta de uva.

Enraizamiento de los brotes

es bien conocido que las auxinas son un factor esencial en la inducción y creci-miento de las raíces. La auxina aia, puede promover la organización de células en explantes de brotes para el enraizamiento de especies vegetales.

el análisis de varianza y la comparación de medias de tukey (α = 0.05), indicaron que no hubo diferencias significativas en la longitud de las raíces. A pesar de las ba-jas concentraciones de aia a 0.2, 0.4 y o.6 mg/l, pudieron promover raíces en todos los brotes ensayados (ibáñez et al., 2003; manzur, 2005).

esto podría explicar que los sarmientos, son la forma más antigua y tradicional de la propagación de la vid. Los sarmientos sin adición de rC, tienen un alto porcentaje de enraizamiento y son funcionales para establecer un viñedo en campo abierto.

Cualquier tratamiento ensayado en este estudio, puede ser utilizado para promover el segundo eje del brote, que es la raíz. Éste es el órgano importante de cualquier planta, para darle sostén, absorción de agua y nutrientes, que contribuirán al desarrollo y crecimiento de las plantas de la vid. Una vez que se formaron los dos ejes (brote y raíz), las plantas están listas para ser trasplantadas y aclimatadas en condiciones de invernadero.

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Propagación in vitro de vid variedad Globo Rojo

La figura 2 muestra una abundancia de raíces, que podrían ser suficientes para abastecer las necesidades de las plantas de la vid y llegar a cumplir su ciclo vegetati-vo, así como la producción de fruta.

Aclimatación a condiciones de invernadero

Las plántulas tuvieron un 90% de supervivencia en condiciones de invernadero, lo cual indica que fueron capaces de superar los cambios del lugar in vitro (condición heterótrofa) a las condiciones naturales de ser autótrofas (figura 3). Aunque la acli-matación fue gradualmente acondicionada al invernadero, también existe el uso de micorrizas para optimizar su aclimatación (alarcón et al., 2001).

Propagación in vitro de vid variedad Globo Rojo 25

v. conclusiones

el mejor tratamiento de asepsia, fue con cloro al 50% durante 5 minutos, donde ɶse obtuvo un 100% de supervivencia del explante.el mejor explante fue el de yema axilar, el cual fue usado en los siguientes ɶestudios de la multiplicación de brotes: las concentraciones de 3 y 4 µm, que fueron consistentes en las variables evaluadas de número de brotes, número de nudos, producción de hojas y longitud de las plantas.en aia tuvo una respuesta positiva en inducción de raíces de los brotes obte- ɶnidos en condiciones in vitro.Las plántulas se adaptaron exitosamente a las condiciones autótrofas del in- ɶvernadero.

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anexo

Figura 1. El explante de yema axilar mostrando nuevos brotes en la axila de cada hoja, 60 días después de su cultivo in vitro

Figura 2. Brotes de vid que muestran las raíces inducidas por el ácido indolacético

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Propagación in vitro de vid variedad Globo Rojo anexoanexo

Figura 3. Plántula de vid aclimatada al sustrato en condiciones de invernadero, funcionando su actividad autótrofa

Tabla 1. Número de hojas inducidas en el explante de yemas axilaresTukey (α = 0.05)

Tratamiento Hojas Grupo*

3 µM 3.783 A

4 µM 3.7 A

5 µM 0.222 A

6 µM 0 B

µM 0 B

*Las letras iguales no indican diferencia significativa a un α = 0.05

Propagación in vitro de vid variedad Globo Rojo anexo

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anexo

Tabla 2. Longitud de plantas a partir del explante de yemas axilaresTukey (α = 0.05)

Tratamiento Hojas Grupo*

3 µM 3.443 A

4 µM 1.889 A

5 µM 1.056 A

6 µM 0.333 B

µM 0 B

*Las letras iguales no indican diferencia significativa a un α = 0.05