607_970_MP Bacteriología y Micología

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Manual de Prcticas de Laboratorio

Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia Subdireccin Acadmica rea de Docencia de Salud Pblica

MANUAL DE PRCTICAS DE LABORATORIO DE

BACTERIOLOGA Y MICOLOGA

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CONTENIDO Pgina

I. INTRODUCCIN 3 II. BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO 4 III. PRCTICAS

1. Procedimientos de rutina para identificar bacterias y hongos 7

2. Mtodos de inoculacin y siembra de bacterias en medios de cultivo 13

3. Toma, conservacin y envi de muestras para anlisis bacteriolgico y micolgico 21

4. Aislamiento e identificacin de enterobacterias 26

5. Aislamiento e identificacin de bacterias no entricas (bacterias que afectan el tracto respiratorio:

Pasteurella, Mannheimia, Bordetella) 30

6. Aislamiento e identificacin de bacterias Gram positivas (cocos pigenos) 33

7. Aislamiento e identificacin de agentes micticos 37

8. Determinacin de la susceptibilidad in vitro a los antimicrobianos 42

9. Procesamiento de muestras enviadas al laboratorio de bacteriologa y micologa 47

IV. BIBLIOGRAFA 51

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I. INTRODUCCIN

La microbiologa tiene numerosas reas o ramas con fundamentos tcnicos comunes, pero cada

rama tiene sus caractersticas particulares, dado que hay diversos tipos de microorganismos

hallados en diferentes hbitats. Una de estas divisiones es la bacteriologa y micologa mdica que

estudia aquellas bacterias, levaduras y hongos que afectan la salud del hombre y de los animales,

especialmente por su capacidad patgena. De tal manera que la bacteriologa y micologa son

ramas de la microbiologa que estudian a las bacterias, levaduras y hongos.

La importancia de los microorganismos en la vida de los humanos y animales, as como la relacin

con el medio ambiente no fue reconoci inmediatamente, pero en 1893 Theobald Smith dijo: En el

estudio de las formas microscpicas conocidas como bacterias, tenemos lo que puede llamarse

justamente el punto focal de varias ramas de la ciencia biolgica. El desarrollo de la bacteriologa

y micologa mdica en los aos subsecuentes ha probado esta veracidad. Lo que ha permitido la

interaccin de las bacterias y hongos en la historia natural de la enfermedad, puesto que el

concepto de enfermedad infecciosa, su prevencin y tratamiento se mantienen actualizados hasta

la fecha.

El desarrollo de la microbiologa se ha debido a la curiosidad cientfica y al inters de

investigadores y cientficos, auxiliados muchas veces por su firmeza en sostener lo que saban que

era cierto, en contra de las refutaciones aparentes y el desdeo de sus compaeros. La historia de

la bacteriologa y micologa mdica, es la evolucin del conocimiento de las causas del proceso

salud-enfermedad.

Este manual de prcticas de bacteriologa y micologa, abarca aquellas especies bacterianas y

micticas de importancia en salud animal, para lo cual se considera sus caractersticas

morfolgicas, fisiolgicas y patognicas. Se realiza una descripcin bsica de los agentes

patgenos que afectan tanto al hombre como a los animales. La ntima relacin existente entre el

hombre y los animales y el consumo de productos de origen animal exigen que toda la gente

involucrada en la microbiologa mdica veterinaria se familiarice con los agentes infecciosos de los

animales si desean comprender las enfermedades que producen.

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II. BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO

La mayora de los accidentes que ocurren en un laboratorio de prcticas, son ocasionados

principalmente por dos razones: la falta de conocimiento acerca de los procedimientos que se

realiza en el laboratorio y la negligencia para seguir las reglas de seguridad. Es transcendental

tener en cuenta que las normas de seguridad, no son la nica base en que los laboratorios

efectan las actividades de docencia, extensin, diagnstico e investigacin, pero es muy

importante que esas medidas sean aplicadas al ingresar al laboratorio de prcticas.

Al realizar cualquier procedimiento en un laboratorio, involucra el exponerse a diferentes agentes

bacterianos o micoticos infecciosos de manera directa al momento de manipular la muestra o

material contaminado, para disminuir este riesgo se debe aplicar la bioseguridad.

La bioseguridad involucra en lograr actitudes y conductas que disminuyan el riesgo del usuario en

el laboratorio, de tal manera que salvaguarde su salud o integridad. El conocimiento previo de

normas y la aplicacin adecuada de buenas prcticas de trabajo en el laboratorio es un deber de

cada discente. Estas normas son la base de un buen control de calidad del trabajo que se est

llevando en la realizacin de cada prctica para cubrir los objetivos planteados.

Recomendaciones generales para aplicar las buenas prcticas en el laboratorio:

1. Ingresar al laboratorio con bata blanca limpia. 2. Antes de realizar cualquier procedimiento retirarse anillos, pulseras, o cualquier otro accesorio

que pueda entrar en contacto con las muestras o medios que se utilizan en el laboratorio; colocar sus pertenencias en un lugar apropiado retirado del sitio de trabajo.

3. Evitar pipetear con la boca. 4. Manejo de cualquier muestra con equipo de proteccin personal (bata, guantes, mascarilla,

careta facial y goggles). 5. Restringir el uso a alumnos sin previa capacitacin de agujas, jeringas, y otros objetos

punzocortantes a fin de evitar el riesgo de inoculacin. 6. Limpiar y desinfectar con alcohol al 70 % o benzal al 5 % las superficies de trabajo antes, y

despus de realizar cualquier procedimiento. Se sugiere realizar una segunda desinfeccin con hipoclorito de sodio al 0.5 %

7. Lavado de manos antes y despus de cada sesin de trabajo con jabn y agua, esto incluye tambin el colocarse los guantes.

8. Manejo, tratamiento y disposicin adecuada de los Residuos Peligrosos Biolgicos Infecciosos (RPBI), con base a la Norma Oficial Mexicana NOM-087-ECOL-SSA1-2002, Proteccin ambiental- Salud ambiental- Residuos Peligrosos Biolgicos Infecciosos- Clasificacin y especificaciones de manejo.

9. Todos los qumicos debern manejarse con equipo de proteccin y dentro de una campana de extraccin.

10. En caso de un derrame de muestras biolgicas deber agregarse hipoclorito de sodio al 1.0 % y dejar actuar por 30 min y posteriormente limpiar.

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Normas disciplinarias: 1. Leer el reglamento interno del laboratorio de prcticas 2. No se permitir el ingreso al laboratorio, despus de 15 minutos del horario estipulado de

inicio de la prctica. 3. El acceso al laboratorio es exclusivamente con bata blanca y limpia, por lo que no se permitir

la permanencia en la sesin prctica de los discentes que no porten su bata. 4. Se prohbe fumar, comer, beber o realizar cualquier otra actividad que no est relacionada con

la prctica correspondiente. 5. Se prohbe el uso de celulares y otros medios electrnicos de comunicacin durante la

realizacin de las prcticas y uso de los laboratorios. 6. Ningn discente podr salir o entrar sin previa autorizacin del docente. 7. Las comunicaciones verbales sern de manera ordenada, en voz baja y solo con la mesa que

integra el equipo. 8. Evitar lo ms posible el estar circulando entre mesas del laboratorio durante la sesin prctica 9. En caso de accidentes (quemadura, salpicadura y heridas) avisar inmediatamente al docente

encargado de la prctica. 10. Colocar los desechos en el contenedor correspondiente. 11. No verter sustancias en la superficie de la mesa, suelo o tarjas.

Manejo adecuado de residuos peligrosos biolgico infecciosos:

Sangre y material orgnico: Cogulos, aplicadores de madera e hisopos, se sumergirn en una

solucin de hipoclorito de sodio al 1.0%, posteriormente sern colocados en bolsas de plstico

rojas (sangre) y amarillas (desechos patolgicos) para su eliminacin e incineracin.

Materia fecal: Al trmino de la prctica se colocar en una solucin de hipoclorito de sodio al

1.0%, posteriormente sern colocados en bolsas de plstico amarillas (desechos patolgicos) para

su eliminacin e incineracin.

Material de vidrio: tubos, portaobjetos, cubreobjetos, varillas de vidrio, cajas de Petri, matraces y

frascos de diferentes capacidades, sern depositados en contenedores con agua jabonosa

adicionada con hipoclorito al 1.0%, en esta solucin permanecern por tres horas antes de su

lavado y secado.

Nota: Material como papel, aplicadores de madera, algodn y similares que hayan estado en

contacto con material infeccioso, debern ser rociados con hipoclorito al 1.0 %, y posteriormente

colocarlos en bolsas de plstico amarillas (desechos patolgicos) para ser incinerados.

Desinfectantes Es importante conocer las diferentes soluciones desinfectantes, como el cloro, que se utiliza para

mantener limpio y desinfectado el laboratorio, materiales, equipos, as como su preparacin en las

concentraciones que se necesiten.

Al inicio y al final de cada prctica el discente debe lavarse las manos y colocarse alcohol al 70 %

o benzal al 5 %.

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Las superficies de trabajo deben ser limpiadas y suministrar con un pao una solucin de

hipoclorito de sodio al 0.5 % esperar 3 minutos e iniciar a trabajar.

ADVERTENCIA: No usar fenol, debido a que es una solucin custica, no se recomienda su

empleo sobre la piel, por su efecto irritativo y acumulativo en la piel.

Preparacin de soluciones: Solucin de alcohol al 70 %

Alcohol al 96.. 73 mL

Agua bidestilada o desionizada 27 mL

Hipoclorito de sodio al 0.5 % (reas sin presencia de material orgnico) Hipoclorito de sodio (5.0 % presentacin comercial)... 100 mL

Agua bidestilada o desionizada.... 900 mL

Hipoclorito de sodio al 1.0 % (reas con presencia de material orgnico) Hipoclorito de sodio (5.0 % presentacin comercial)... 200 mL

Agua bidestilada o desionizada.... 800 mL

Cuestionario.

1. Qu es la bioseguridad? 2. Cul es el objetivo de la bioseguridad? 3. Cules son los tipos de riesgos que existen en un laboratorio? 4. En que se basa la clasificacin de los agentes biolgicos? 5. Menciona cuales son las vas de entrada de los agentes biolgicos al cuerpo? 6. Mtodos para disminuir los riesgos biolgicos? 7. Menciona 5 recomendaciones para buenas prcticas de trabajo? 8. Menciona 5 normas disciplinarias de un laboratorio? 9. Qu desinfectantes se pueden usar en la piel? 10. Qu causa el fenol en el organismo?

Glosario de trminos:

Accidente: suceso eventual o accin de que involuntariamente resulta dao para las personas o

las cosas.

Desinfectante: sustancia que destruye los microorganismos presentes, a excepcin de las

esporas bacterianas

Precaucin: accin para evitar o prevenir los inconvenientes, dificultades o daos que pueden

temerse durante el procedimiento.

Investigacin: actividad que tiene por fin ampliar el conocimiento, sin perseguir, en principio,

ninguna aplicacin prctica.

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III. PRCTICAS 1. Procedimientos de rutina para identificar bacterias y hongos

Unidad de Competencia 1: Conocer e identificar la morfologa bacteriana y fungal, as como sus

principios metablicos, genticos y taxonmicos.

Introduccin:

En el diagnstico microbiolgico, la visualizacin del agente patgeno o su efecto en el material

biolgico remitido al laboratorio de diagnstico constituye el primer paso hacia su identificacin.

Esto puede realizarse mediante el examen directo de una preparacin hmeda o bien de un frotis

fijo teido con colorantes especficos.

La observacin de microorganismos vivos con o sin motilidad utilizando preparaciones hmedas es

fcil de realizar y requieren de un mnimo de material.

En una preparacin hmeda se pueden observar diferentes tipos de movimiento, como son:

El movimiento browiniano de partculas pequeas debido al bombardeo por molculas del medio lquido.

El movimiento de microcorrientes debido frecuentemente al calor generado por el foco microscpico.

Movimiento flagelar o real de las bacterias cuyas caractersticas pueden variar en los diversos microorganismos.

Para los estudios bacteriolgicos y micolgicos adems se han ensayado y propuesto gran

variedad de mtodos de tincin, los que apoyan en proporcionar contraste entre el microorganismo

y el medio que la rodea, permitiendo llevar a cabo la diferenciacin entre los distintos tipos

morfolgicos; adems permite el estudio de estructuras u organelos propios de la clula bacteriana

y mictica. Dentro de las tinciones importantes para bacterias y hongos son las siguientes:

Tincin de Gram:

En 1884 un mdico Dans, Christian Gram, desarroll un mtodo de tincin de gran utilidad en el

laboratorio de bacteriologa. Est tincin revela detalles referentes a la forma y agrupacin

bacteriana y permite clasificar a las bacterias en dos grandes grupos: Gram positivas y Gram

negativas.

Durante el proceso de tincin, tanto las bacterias Gram positivas como las Gram negativas retienen el colorante primario. Sin embargo al aplicar el agente decolorante, la pared de las bacterias Gram positivas sufre una deshidratacin que impide la salida de colorante. En el caso de las bacterias Gram negativas, el agente decolorante destruye la integridad de la membrana externa, incrementando as su permeabilidad, lo cual permite la salida del colorante primario.

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Al aplicar el colorante de contraste, este no puede penetrar fcilmente en las bacterias Gram

positivas debido a la deshidratacin de su pared; adems de que estas bacterias quedaron

previamente teidas con el colorante primario. Por el contrario, las bacterias Gram negativas se

tien fcilmente con el colorante de contraste. El resultado final es que las bacterias Gram

positivas se tien de violeta o azul y las Gram negativas de rojo.

La tincin de Gram es aplicada en forma universal como primer paso en la identificacin de las

bacterias. Desafortunadamente existen algunos grupos bacterianos en los cuales la tincin de

Gram no es de utilidad taxonmica; como son: espiroquetas, micoplasmas, micobacterias,

clamidias y rickettsias.

Tincin para Bacterias Acido-Alcohol Resistentes:

Este mtodo de tincin la penetracin del colorante primario se facilita debido a que ste se

encuentra disuelto en fenol y a que es aplicado en presencia de calor. El mtodo para demostrar la

cido-alcohol resistencia es la tincin de Ziehl-Neelsen.

Una vez que el colorante penetra a la clula bacteriana, este se combina con las mismas

estructuras con las que se combina en cualquier otra bacteria y adems reacciona con cidos

miclicos libres, lo cual hace que la pared celular se vuelva an ms hidrofbica.

Con la tincin de Ziehl-Neelsen tanto las bacterias cido-alcohol resistentes, como las bacterias no

cido-alcohol resistente se tien con el colorante primario. Sin embargo, al aplicar el agente

decolorante, compuesto por una mezcla de alcohol-cido, este no solubiliza los lpidos de la pared

de las bacterias cido-alcohol resistentes, y por lo tanto no se decoloran. Las bacterias no cido-

alcohol resistentes se decoloran fcilmente, por lo que se vuelve a teir al aplicar el colorante de

contraste.

El grupo de bacterias cido-alcohol resistentes, est representado principalmente por el gnero

Mycobacterium.

Tincin para Endoesporas:

La endoespora bacteriana es una estructura altamente deshidratada y rgida, que es formada por

algunos bacilos Gram positivos. Los gneros bacterianos de inters en medicina veterinaria que

son capaces de formar endoesporas son Bacillus y Clostridium. Estos responden de manera

diferente a las condiciones ambientales que inducen la formacin de la espora.

Las endoesporas son estructuras ovales o esfricas que pueden encontrarse tanto

intracelularmente, como fuera de la bacteria (clula vegetativa). Por su localizacin dentro de la

clula pueden ser centrales, subterminales o terminales, y presentan adems variacin en su

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tamao. Estas caractersticas son de utilidad taxonmica para la identificacin de algunas especies

de los gneros capaces de esporular.

Se preparan 2 frotis fijos a partir del cultivo, uno de los frotis ser teido con la tincin de Gram y el

otro con la tincin de Schaeffer y Fulton.

En la tincin de Gram las esporas se observan como cuerpos refringentes sin teir, mientras que

con la tincin de Schaeffer y Fulton las esporas se observan de color verde y las formas

vegetativas rojas.

Tincin Lactofenol Azul de Algodn:

Este es un mtodo utilizado rutinariamente para la realizacin de preparaciones microscpicas de

hongos filamentosos con el fin de determinar sus estructuras morfolgicas y por lo consiguiente su

identificacin. Cada uno de los constituyentes del colorante lactofenol azul de algodn cumple una

funcin determinada.

El fenol sirve como fungicida, la glicerina permite tener una preparacin semipermanente, el azul

de algodn tie el exterior de la pared de los hongos y el cido-alcohol lctico acta como agente

aclarante.

Objetivo: El discente realizar las tinciones de rutina en el laboratorio de Bacteriologa y Micologa

para la identificacin de estructuras bacterianas y micticas, y comprender su utilidad.

Competencias:

1. Describir la diferencia entre una preparacin hmeda y un frotis fijo, as como su utilidad diagnstica.

2. Aplicar los principios y procedimientos de las tinciones para la observacin de bacterias y hongos.

3. Emplear la tincin de Gram y lactofenol azul de algodn, para observar la morfologa, tamao, agrupacin y afinidad tintorial de bacterias y hongos.

Lugar de Realizacin:

Laboratorio de prcticas de la FMVZ-UAEM.

Tiempo Destinado a la Prctica:

2 Horas

Material de laboratorio:

Portaobjetos, cubreobjetos, lpiz graso, asas bacteriolgicas graduadas, papel secante, aceite de

inmersin, mechero, tren de tincin de Gram, tincin de lactofenol azul de algodn, solucin

desinfectante, KOH al 3%, Microscopio ptico binocular de campo claro (con objetivos de 4X, 10X,

40X, 100X), vaselina o plastilina

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Material biolgico:

Cultivo en agar de Escherichia coli

Cultivo en agar de Staphylococcus spp.

Cultivo en agar de una levadura

Cultivo en agar de Aspergillus spp.

Metodologa:

Preparaciones Hmedas:

1. Depositar una capa delgada de vaselina alrededor del borde del cubreobjetos o un pedazo

pequeo de plastilina en las 4 esquinas del cubreobjetos, SIN TOCAR las caras del cubreobjetos

con los dedos.

2. En el centro del cubreobjetos preparado con vaselina plastilina, coloque con el asa

microbiolgica varias gotas del cultivo bacteriano (un cubreobjetos por muestra)

3. Tome una laminilla y colquela sobre el cubreobjetos, presionando suavemente.

4. Invierta la preparacin y obsrvala al microscopio con los objetivos de 40X y 100X si se utiliz

vaselina, o con el de 10X en el caso de haberse utilizado plastilina.

Preparacin de Frotis Fijos para Tinciones:

a) Realizar un frotis fijo de cada uno de los cultivos proporcionados. b) Utilizar laminillas limpias y marcadas para su identificacin, con el lpiz graso marcar el rea

donde se va a colocar la muestra. c) La metodologa para realizar el frotis bacteriano depender si el cultivo se encuentra en medio

slido o lquido. a) Cultivo en lquido: con un asa bacteriolgica previamente flameada y fra, se introduce

en el cultivo bacteriano se coloca en el portaobjetos y se difunde en el rea marcada y se fija al calor.

b) Cultivo en medio slido: se coloca una gota de agua destilada estril en el portaobjetos, se recolecta una colonia de medio solido y se mezcla, realizando un extendido uniforme.

d) Se debe extender la gota sobre el portaobjetos de forma que el resultado sea una capa fina. Debe evitarse preparar un frotis demasiado grueso.

e) Dejar secar las preparaciones (frotis) a temperatura ambiente. f) Cuando se haya secado el frotis pasar el portaobjetos por la llama del mechero con la capa del

frotis hacia arriba, no aplicar calor en forma excesiva ya que estropeara la morfologa normal y la estructura de los microorganismos que se van a teir.

Procedimiento para la tincin de Gram:

1. Preparar frotis fijos a partir de cada uno de los cultivos bacterianos 2. Agregar sobre la preparacin cristal violeta durante 30 segundos. 3. Lavar con agua destilada 4. Aadir lugol durante 30 segundos. 5. Lavar con agua destilada

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6. Decolorar con alcohol-cetona por 5 a 10 segundos. 7. Lavar con agua destilada 8. Agregar safranina durante 30 segundos. 9. Lavar, secar y observar al microscopio con aceite de inmersin y con el objetivo de 100X

Procedimiento para la prueba de KOH al 3 %:

El objetivo de realizar la prueba de KOH al 3% es para ratificar los resultados de la tincin de

Gram. Esta prueba consiste en colocar sobre una laminilla una gota de KOH al 3 %, despus con

el asa calibrada se recolecta muestra de las colonias bacterianas en estudio, se mezcla con la gota

de KOH, con movimientos giratorios durante 1 a 3 minutos.

Interpretacin: Si al separar el asa de la mezcla se forma una hebra viscosa, la prueba es positiva

e indica que se trata de bacterias Gram negativas. Si al separar el asa no se forma hebra, la

prueba es negativa, e indica que las bacterias son Gram positivas

Procedimiento de Tincin de Lactofenol Azul de Algodn:

Este procedimiento se usa para identificar las formas fungales

1. Sobre un portaobjetos limpio se coloca una gota de lactofenol azul de algodn. 2. Con el asa en forma de L recolectar una pequea cantidad de la colonia y se deposita sobre

la gota del colorante. 3. Se coloca un cubreobjetos sobre la preparacin, la cual puede ser ligeramente calentada (esto

ayuda a extender el hongo en toda la preparacin y a remover las burbujas) 4. La preparacin se observa al microscopio con los objetivos 5X, 10X y 40 X.

Resultados:

El discente realizara dibujos o fotografas de las formas bacterianas y fngicas, as como una

investigacin bibliogrfica para conocer de acuerdo a la morfologa colonial macroscpica y

microscpica de las bacterias, as como las estructuras celulares de los hongos para identificarlos,

y realizar un reporte escrito de la prctica.

Evaluacin:

El docente establecer los criterios de evaluacin para otorgar una calificacin durante la prctica

y del reporte de prcticas, con la finalidad de medir el grado de adquisicin de conocimientos,

habilidades, aptitudes/valores de las unidades de competencia que se relacionen con la prctica.

Cuestionario:

1. De qu color se tien las bacterias Gram positivas y por qu? 2. De qu color se tien las bacterias Gram negativas y por qu? 3. Qu es un frotis? 4. Con que finalidad se fija la muestra de microorganismos en el porta objetos? 5. Cul es la razn de teir las muestras bacterianas? 6. Por qu es necesario emplear aceite de inmersin para la observacin de los

microorganismos?

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7. Qu funcin tiene el yodo en la tincin de Gram? 8. Menciona tres bacterias que tien Gram positivas y escribe la enfermedad que causa cada una

de ellas 9. Menciona tres bacterias que tien Gram negativas y escribe la enfermedad que causa cada

una de ellas. 10. Para qu sirve la tincin de Ziehl-Neelsen?

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2. Mtodos de inoculacin y siembra de bacterias en medios de cultivo

UNIDAD DE COMPETENCIA 1: Conocer e identificar la morfologa bacteriana y fungal, as como

sus principios metablicos, genticos y taxonmicos.

Introduccin:

Para realizar el estudio de las bacterias es necesario recuperarlas del hbitat natural donde se

encuentran y hacer que proliferen en medios artificiales, que les proporcionen sus requerimientos

nutricionales. Este procedimiento se le conoce como cultivo bacteriano in vitro.

Las bacterias para su metabolismo necesitan donadores y aceptores de hidrgeno, fuentes de carbono, fuentes de nitrgeno y minerales. Adems del uso de un medio nutritivo adecuado para el cultivo bacteriano, es necesario considerar factores ambientales tales como la temperatura, pH, humedad relativa y atmsfera de incubacin. Los mtodos de siembra de bacterias en medios de cultivo estn directamente relacionados con la

consistencia de los mismos. Estos pueden ser lquidos (pruebas bioqumicas y medios de

enriquecimiento), semislidos (pruebas de motilidad de cepas), slidos (pruebas bioqumicas,

conservacin de cepas, pruebas de susceptibilidad a quimio-teraputicos o realizar aislamientos

en cultivo puro).

Medios Slidos para Conservacin de Cepas: el medio es envasado en tubos y se permite su

solidificacin de manera inclinada de tal manera que se logre una superficie (Fig. 1). El uso de

tubos con tapn de baquelita disminuye la deshidratacin del medio.

Fig. 1. Medio de cultivo envasado

en tubo y salificado de manera

inclinada para realizar la siembra

del cultivo bacteriano a conservar.

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Medios Slidos para Pruebas de Susceptibilidad a Quimioteraputicos: el medio es envasado

en cajas de Petr y la inoculacin se hace por medio de estras continuas en toda la superficie por

medio del asa o por medio de un hisopo (Fig. 2).

Medios Slidos para el Aislamiento en Cultivo Puro: el medio para cultivo bacteriano se envasa

en cajas de Petr, con el objetivo es obtener un crecimiento uniforme de colonias bacterianas, es

decir, colonias puras, libres de otros grmenes contaminantes, con el fin de estudiar e identificar

la especie bacteriana. La inoculacin se realiza con el asa graduada (Fig. 3).

Fig. 2. (a). Medio de cultivo solido en caja Petr, la superficie debe ser lisa y el nivel de llenado

debe estar parejo, (b). Inoculacin de la cepa bacteriana para realizar la prueba de

sensibilidad.

a b

Fig. 3. (a) Distribucin del medio de cultivo en cuadrantes envasado en caja Petr para el

aislamiento bacteriolgico (b) modo de sembrado con el asa bacteriolgica y el sentido de la

dilucin.

a

b

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El estudio de la morfologa de las colonias es de gran importancia debido a que gracias a sta

puede iniciarse una identificacin preliminar de los microorganismos aislados. Las colonias

bacterianas presentan caractersticas morfolgicas muy variadas, mismas que son constantes para

cada especie de bacterias en idnticas condiciones de cultivo. Estas caractersticas pueden

modificarse cuando factores tales como la humedad relativa, medio de cultivo, temperatura,

atmsfera de incubacin varan.

La descripcin de las colonias bacterianas debe realizarse cuando stas se encuentran separadas unas de otras en el medio de cultivo, tomando en cuenta las siguientes caractersticas: tamao, color, superficie, borde, opacidad, elevacin, estructura interna. Las caractersticas de la superficie, borde, opacidad, elevacin y estructura interna, estn sujetas a la interpretacin del observador. Para describirlas es necesario el uso de un microscopio estereoscpico, por lo que su valor descriptivo es menos relevante (ver Anexo 3). De acuerdo a estos criterios, las colonias pueden clasificarse de la siguiente forma:

Superficie: lisas, rugosas.

Estructura interna: mucoide, granular, filamentosa.

Opacidad: translcidas, opacas, brillantes.

Borde: enteras, onduladas, lobuladas, erizadas, filamentosas.

Elevacin: umbilicales, difusas, planas, convexas.

Otro dato til en la identificacin preliminar de colonias bacterianas es la produccin de

hemolisinas. Estas se ponen de manifiesto en medios de cultivo adicionados con sangre, tales

como el agar sangre y el caldo sangre. En el agar sangre la produccin de hemolisinas conduce a

la formacin de un halo de lisis de eritrocitos alrededor de las colonias. Si dicho halo es

transparente se interpreta como hemlisis completa (hemolisis ) mientras que si el halo es de

color gris verdoso se trata entonces de hemlisis incompleta (hemolisis ).

Al hacer la identificacin de las colonias bacterianas aisladas no siempre ser necesario detallar

todas las caractersticas morfolgicas mencionadas; generalmente se toman en cuenta aquellas

que son relevantes.

Objetivo: El alumno analizar las diferentes tcnicas de siembra para el cultivo de bacterias y

hongos in vitro, utilizando medio de cultivo segn su utilidad y describir la morfologa colonial.

Competencias:

1. Describir la importancia del cultivo de bacterias y hongos in vitro. 2. Identificar las condiciones necesarias para el cultivo in vitro de las bacterias y hongos. 3. Clasificar los medios de cultivo bsico, de enriquecimiento, diferenciales, selectivos y de

transporte. 4. Realizar las tcnicas de siembra en medios de cultivo lquidos semislidos y slidos. 5. Explicar las reacciones metablicas de bacterias y hongos en algunos medios diferenciales.

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6. Analizar la utilidad diagnstica de la morfologa colonial bacteriana y fungal, y categorizar con base en las siguientes caractersticas: tamao, color de la colonia, pigmentacin de medio, estructura interna, borde y hemlisis.


Laboratorio de prcticas de la FMVZ-UAEM, bajo el apoyo del Departamento de Prcticas de la

Facultad


4 Horas (dos sesiones)

Material:

General: Asas bacteriolgicas graduadas, asas bacteriolgicas rectas, papel secante, solucin

desinfectante, marcador permanente, mechero, estufa bacteriolgica a 37 C (temperatura

constante).

Seccin:

1 cultivo en agar de Escherichia coli 1 cultivo en agar de Staphylococcus spp. 1 cultivo en agar de una levadura 1 cultivo en agar de Aspergillus spp. Medio Agar sangre Medio MacConkey Medio Verde Brillante Medio Agar Sal y manitol Medio Agar Sabouraud Medio TSI Medio SIM Caldo Rojo de Fenol Caldo nutritivo

Metodologa:

Proceso de Inoculacin y Siembra en Placa:

Primer Da (Sesin Uno)

1. Desinfectar la mesa de trabajo. 2. Seleccionar una colonia del medio que contiene un cultivo puro, sosteniendo la placa a una

distancia no mayor de 20 cm. del mechero. 3. Esterilizar el asa y dejarla enfriar en el agar. 4. Tomar nicamente la colonia seleccionada 5. Descargar el asa en uno de los extremos de la placa (ver Anexo 1). 6. Realizar la siembra con la misma asa. 7. Esterilizar el asa y dejarla enfriar,

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8. Cerrar la caja y rotularla con el nmero o nombre de muestra, nmero de equipo y fecha. 9. Incubar placas a 37 C por 24 horas. Segundo Da (Sesin Dos) 1. Desinfectar la mesa de trabajo y encender el mechero. 2. Analizar cuidadosamente el crecimiento en las cajas de Petr, sin abrirlas. 3. Observar las colonias obtenidas y describirlas teniendo en cuenta las siguientes

caractersticas: tamao, color de la colonia, pigmentacin de medio, estructura interna, borde y hemlisis.

4. Interpretar las formas y caractersticas de las colonias (ver Anexo 3). 5. Guarda las cajas en el refrigerador, hasta la prxima clase (OPCIONAL). Proceso de Inoculacin y Siembra en Tubo (Medio Slido): Primer Da (Sesin Uno) 1. Destapar el tubo y flamear la parte superior. 2. Esterilizar el asa recta y enfriarla. 3. Tomar una colonia del medio que contiene el cultivo puro con el asa recta estril. 4. Siembre en los tubos con agar inclinado de acuerdo al mtodo que se utilice de siembra, a una

distancia aproximada de 20 cm. del mechero (ver Fig. 1). 5. Rotular los tubos de la misma manera que las placas. 6. Incubar placas a 37 C por 24 horas. Segundo Da (Sesin Dos) 1. Analizar y observar cuidadosamente el crecimiento en los tubos, sin abrirlos, y anotar lo

interpretado. 2. Guarda las cajas en el refrigerador, hasta la prxima clase. Proceso de Inoculacin en Tubo (Medio Lquido): Primer Da (Sesin Uno) 1. Seleccionar una colonia del medio a una distancia aproximada de 20 cm. del mechero 2. Esterilizar el asa recta y enfriarla 3. Destapar el tubo y flamear la parte superior. 4. Introducir el asa con el inocul a sembrar, agitar el asa hasta que la muestra sea homognea

(ver Anexo 2). 5. Esterilizar el asa y dejarla enfriar 6. Flamear el tubo y taparlo. 7. Rotular los tubos de la misma manera que las placas. 8. Desinfectar la mesa de trabajo 9. Incubar tubos a 37 C por 24 horas.

Segundo Da (Sesin Dos)

1. Analizar y observar cuidadosamente el crecimiento en los tubos, sin abrirlos, y anota lo observado.

2. Guarda los tubos en el refrigerador, hasta la prxima clase (OPCIONAL).

18/52



Resultados:

Con la informacin obtenida durante la prctica y la posterior investigacin que tendr que realizar

el alumno, entregar un reporte de prctica tal como lo solicite el docente.

Evaluacin (Criterios):

Cada docente establecer los criterios de evaluacin para otorgar una calificacin durante la

prctica y del reporte de prcticas, con la finalidad de medir el grado de adquisicin de

conocimientos, habilidades, aptitudes/valores de las unidades de competencia que se relacionen

con la prctica.

CUESTIONARIO:

1. Por qu se debe trabajar cerca del mechero? 2. Qu es un cultivo puro? 3. Qu estudios se realizan aislando un microorganismo? 4. Qu sucede si se recolecta una colonia bacteriana con el asa caliente?

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Anexos:

Anexo 1. Tcnicas de Siembra en Placa y Tubo

Anexo 2. Tcnica de sembrado en tubo

Anexo 1. (a) Inicio de la inoculacin y distribucin de la muestra con asa bacteriolgica, (b) y (c)

distribucin de los cuadrantes 2 y 3 se toca una o dos estras del cuadrante anterior (d) el cuarto

cuadrante se toca una o dos estras del tercer cuadrante y se hace la distribucin con estras

separadas con la finalidad de obtener colonias aisladas. Terminada la distribucin en cada cuadrante

se flamea el asa. Ntese que el procedimiento es en sentido a las manecillas del reloj.

Anexo 2. (a) Se flamea el asa bacteriolgica. (b) Se enfra y se recolecta la muestra. (c) Se introduce

en el tubo con medio lquido y se gira el asa para que se desprenda la muestra. (d) Se cierra el tubo y

se flamea el asa. El proceso se realiza cerca de la flama del mechero.

(a) (b) (c) (d)

(a) (b) (c) (d)

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Anexo 3. Morfologa de las colonias bacterianas

Anexo 3. Caractersticas morfologa de las colonias bacterianas en cultivos primarios (Stanchi N. O., et

al 2007)

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3. Toma, conservacin y envi de muestras para anlisis bacteriolgico y miclogico

UNIDAD DE COMPETENCIA III: Explicar la importancia del control de las bacterias y hongos en

las diversas reas de la medicina veterinaria en las que se ven relacionados, as como la

coleccin, envo y procesamiento de muestras para diagnstico

Introduccin:

La bacteriologa y micologa diagnstica es el estudio de las muestras tomadas a partir de

pacientes de los cuales se sospecha de una infeccin que involucre a estos agentes. El laboratorio

puede apoyar al clnico de la siguiente manera:

Confirmando el diagnstico presuntivo.

Sugiriendo la quimioterapia de la enfermedad.

Colaborando en el conocimiento epidemiolgico de las enfermedades.

Permitiendo la elaboracin de autobacterinas.

Los resultados del examen bacteriolgico y micolgico, as con la rapidez con que stos sean

obtenidos, no dependen slo de los mtodos de laboratorio empleados, sino tambin de la forma

en que sean colectadas y enviadas las muestras clnicas. Dichos resultados pueden verse

influenciados por la presencia de microorganismos que son parte de la microflora normal, por la

migracin bacteriana pos-mortem o por la aplicacin de antimicrobianos antes del envo de la

muestra. El clnico debe tener en mente estos factores para realizar la interpretacin de los

resultados emitidos por el laboratorio.

1. Coleccin y Envi de Muestras: A continuacin se mencionan algunas normas generales:

Tomar la muestra del sitio ms representativo del problema, de preferencia en la etapa aguda de la enfermedad.

Las muestras obtenidas a partir de animales muertos debern tomarse dentro de las primeras 3 horas de ocurrida la muerte o el sacrificio.

Las muestras deben colectarse bajo estrictas condiciones de antisepsia. Tanto el material de coleccin como el recipiente en el que la muestra sea transportada debern ser estriles. Este ltimo preferentemente debe tener un tapn de rosca.

Las muestras colectadas no deben entrar en contacto con desinfectantes.

Las muestras deben identificarse con los siguientes datos: especie, raza, edad, sexo, arete o nombre del animal, as como direccin telfono y nombre del propietario del animal (etiqueta de identificacin).

Una vez colectadas las muestras deben enviarse dentro de las siguientes 24 horas al laboratorio en condiciones de refrigeracin.

Cuando sea necesario el uso de hisopos para la coleccin de las muestras hay peligro de desecacin, por ello deben enviarse en medios de transporte (Stuart, Carry-Blair, etc.) que ayudan a la preservacin de la bacteria pero no a la multiplicacin.

Debe anexarse una historia clnica pertinente que incluya la hora de la muerte del animal, nmero de animales afectados, si el animal del que proviene la muestra fue tratado con

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antimicrobianos, cules y durante cunto tiempo; as como un diagnstico presuntivo con base en signos clnicos y epidemiolgicos.

Es importante hacer notar que el manejo de las muestras clnicas deben realizarse con precaucin debido a que algunos agentes involucrados en las enfermedades infecciosas de animales constituyen un riesgo de zoonosis para la salud del clnico y del bacterilogo.

Los problemas ms frecuentes para la identificacin bacteriana y micolgica en el laboratorio son:

Envi de muestras no representativas de la lesin en cuestin.

Toma de muestras sin antisepsia.

Envi de muestras en condiciones inadecuadas.

Falta de historia clnica completa y de un diagnstico presuntivo.

Por lo anterior, es indispensable que el clnico tenga un conocimiento sobre la correcta obtencin y

envo de muestras al laboratorio (ver Anexo 4).

Objetivo: El alumno utilizar los procedimientos generales para la coleccin, conservacin y envo

de muestras clnicas al laboratorio para el diagnstico bacteriolgico y micolgico.

Competencias:

Describir el material necesario para colectar muestras o especmenes sospechosos de microorganismos aerobios y anaerobios

Identificar las condiciones ambientales adecuadas para tomar una muestra representativa de un proceso infeccioso, as como de agua y alimento

Describir como se conservan y se envan las muestras al laboratorio Indicar los datos importantes para realizar una historia clnica pertinente, orientada al

diagnstico bacteriolgico y micolgico Demostrar a partir de una muestra clnica, los conocimientos de coleccin y envi de muestras

para laboratorio



Facultad, siempre y cuando se decida trabajar con animales de laboratorio.

OPCIONAL: Se puede optar por ir a una explotacin animal y a nivel de campo realizar el ejercicio

de toma y envi de muestras


2 Horas (una sesin)

Material:

Grupo:

Una nevera con refrigerantes Torundas con alcohol al 70 % Torundas con yodo al 2 %

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Por Equipo:

Material para sujecin del animal Medio de transporte Stuart Hisopos estriles Frascos tipo Gerber estriles Bolsa de plstico nuevas Estuche de disecciones

Por Discente:

Equipo de proteccin personal (dependiendo si se decide realizar en laboratorio o explotacin pecuaria)

Metodologa:

Obtener muestras de exudado, leche, sangre, heces, orina, rgano y pelos de animales que presenten problemas clnicos, as como de agua y alimento si amerita.

Recopilar los datos ms importantes para realizar la historia clnica Conservar y enviar las muestras al laboratorio de diagnstico para su anlisis bacteriolgico o

micolgico.

Resultados:


el alumno, entregara un reporte de prctica tal como lo solicite el docente.





con la prctica.

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Anexos:

Anexo 4. Recomendaciones para la Toma y Envi de Muestras de Acuerdo a Condiciones

Patolgicas Especficas.

Condicin

Patolgica

Tipo de Muestra y Cantidad

Recomendada

Forma de

Coleccin y

Envo

Observaciones

Abortos Feto Completo o Contenido Abomasal (1 mL)

Pulmn, Bazo, Hgado, Rin Fetal (6 cm por lado)

Placenta y Placentomas.

Secrecin Vaginal (1 mL)

Leche (15 mL)

Alimento (100 g.)

Frascos,

Bolsas de

Plstico,

Hisopos,

Jeringas.

El feto y los rganos

pueden enviarse en

congelacin, cuando se

sospecha de candidiasis

enviar hgado en medio de

transporte especial.

Alimento en caso de

aflatoxicosis.

Abscesos,

Granuloms y

Exudados

Exudado Purulento (1 mL)

Absceso Completo

Biopsia

Jeringa,

Hisopo,

Frasco, Bolsa

de Plstico.

En caso de granulomas

sospechosos de

tuberculosis deben

extremarse precauciones.

Artritis Lquido Sinovial (1 mL)

Articulacin Completa

Jeringa,

Hisopo, Bolsa

de Plstico.

Desinfectarse piel antes de

la artrocentesis.

Clostridiasis

Invasivas (Miositis

Necrticas,

Hepatitis

Necrtica)

Msculo Necrtico (6 cm. por lado)

Tejido Subcutneo Edematoso (6 cm. por lado)

Hgado (6 cm. por lado)

Frasco, Bolsa

de Plstico

Enviar rpidamente al

laboratorio en atmsfera

anaerobia, en este caso no

es recomendable

refrigeracin.

Enterotoxemia Intestino y rganos Afectados Segmento

Ligado de

Intestino en

Frasco.

Enviar en refrigeracin.

Dermatomicosis Pelos y Escamas Frascos,

Sobres de

Papel Nuevos,

Portaobjetos

No es necesario que los

recipientes estn estriles.

Las muestras deben

tomarse de la periferia de la

lesin.

Diarreas Intestino

Heces (1 g.)

Nodulos Linfaticos Mesentericos, Vescula Biliar.

Alimento (100 g.)

Agua (100 mL)

Segmento

Ligado del

Intestino en

Frasco.

Guantes de

Palpacin.

Frascos,

Bolsas,

En grandes especies tomar

las heces directamente del

recto y en pequeas

especies con hisopos. En

caso sospechoso de

paratuberculosis enviar

raspado y mucosa

intestinal.

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Hisopos.

Infecciones

Genitales

Exudados (1 mL)

Lavados Prepuciales o Vaginales (10 mL)

rganos: Testculos, Epididimo, tero. (Completos o 6 cm. por lado)

Hisopos,

Jeringas,

Frascos o

Bolsas de

Plstico.

Si se sospecha de

Campylobacter, Leptospira

o mycoplasma, las

muestras deben enviarse

dentro de las siguientes 3

horas de su coleccin en

refrigeracin.

Infecciones

Urinarias

Orina (6 mL)

Rin (6 cm. por lado)

Cateter,

Jeringa,

Frasco, Bolsa

de Plstico.

Las muestras deben

enviarse dentro de las

siguientes 2 horas de su

coleccin.

Mastitis Leche (15 mL)

Glndula Mamaria (6 cm. por lado)

Frascos,

Bolsas de

Plstico

Lavar y desinfectar el

pezn previo a la obtencin

de la muestra, cuidar de no

tocar la piel con el frasco,

slo el chorro de leche

tendr contacto con el

frasco.

Neumonas Lavado Traqueobronquial (5 mL)

Pulmn (6 cm. por lado)

Ndulos Linfaticos Mediastinicos

Jeringas,

Frascos,

Bolsas de

Plstico

Si se sospeche de

micoplasmosis o

clamidiasis, las muestras

deben enviarse dentro de

las siguientes 4 horas a su

coleccin.

Otitis Media Aguda

o Crnica

Exudado (1 mL) Hisopos,

Jeringas

Limpiar el canal externo

con un antisptico y tomar

la muestra en el odo

medio.

Problemas

Nerviosos

Encfalo (Completo o 6 cm. por lado)

Exudados (1 mL)

Lquidos Cefalorraquideo (2 mL)

Bolsas de

Plstico,

Frascos,

Jeringa,

Hisopos.

El liquido cefalorraqudeo

debe ser procesado de

inmediatos

Septicemias Sangre (10 mL)

Bazo, Hgado, Pulmn, Nodulos Linfaticos

Riones, Cerebro (6 cm. por lado)

Mdula sea (Una Costilla)

Jeringas,

Frascos,

Bolsas de

Plstico

Si el animal tiene ms de 3

horas de muerto debe

enviarse mdula sea.

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4. Aislamiento e identificacin de enterobacterias UNIDAD DE COMPETENCIA IV: Identificar los principales agentes bacterianos Gram negativos de importancia veterinaria. Introduccin: Dentro de la familia Enterobacteriaceae, muchos gneros de este grupo son habitantes naturales

del tracto gastrointestinal. Antes del advenimiento de los antibiticos, quimioteraputicos e

inmunodepresores, estos gneros bacterianos estaban limitados a causar enfermedades del tracto

gastrointestinal y urinario. Hoy las enterobacterias (como lo es la E. coli) se pueden aislar en

infecciones septicmicas y en otros rganos diferentes al sistema digestivo y urinario.

Las enterobacterias tienen como va de salida las heces y contaminan el medio ambiente, donde

pueden permanecer viables por mucho tiempo en condiciones favorables, por lo cual estos

agentes bacterianos son indicadores del grado de contaminacin fecal de los alimentos y agua.

Algunos microorganismos intestinales como E. coli son parte de la flora normal, producen

enfermedades de manera accidental; en tanto otros gneros como Salmonella cuentan con

serovares que son patgenos para el hombre (tiphymurium) y en los animales domsticos

(chorelaisuis, dublin, entre otros).

Todas las enterobacterias son bacilos Gram negativos, sin agrupacin definida. Ninguna

enterobacteria forma esporas. Son aerobias o anaerobias facultativas. Este grupo es amplio y

frecuentemente de publican cambios en su clasificacin taxonmica.

E. coli causa diarrea y enteritis en distintas especies animales, adems puede actuar como un

patgeno oportunista de procesos miscelneos como mastitis, onfalitis, infecciones de vas

urinarias y respiratorias. Adems existen serotipos enteropatgenos que se asocian a la

produccin de diarreas en cerdos, bovinos, caprinos y equinos; y serotipos asociados a septicemia

en bovinos y aves.

Citrobacter freundii es un patgeno oportunista que se asocia a infecciones miscelneas como las

descritas para E. coli. Se puede aislar de mamferos, aves, reptiles y anfibios.

Salmonella enteritidis causa diarreas, septicemia y aborto en distintas especies animales.

Salmonella cholerasuis causa septicemia y neumona en cerdos. Salmonella gallinarum causa la

tifoidea aviar.

Proteus mirabilis y Proteus vulgaris son patgenos oportunistas ampliamente distribuidos en la

naturaleza.

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Enterobacter aerogenes se asocia a mastitis bovina, se comporta como patgenos oportunista.

Serratia marcescens causa mastitis en bovinos. Klebsiella pneumoniae acta como oportunista en

vas respiratorias y en tracto genital principalmente; es causa comn de mastitis aguda en bovinos

y metritis, cervicitis y abortos en yeguas.

Objetivo:

El alumno describir las caractersticas de cultivo, morfolgicas y bioqumicas ms relevantes de

las enterobacterias de mayor importancia en Medicina Veterinaria.

Competencias:

1. Realizar la tincin de Gram en las diferentes cepas de trabajo para conocer su morfologa microscpica, afinidad tintorial y agrupacin.

2. Utilizar los medios de cultivo in vitro para el aislamiento de enterobacterias, as como sus requerimientos atmosfricos.

3. Identificar las principales especies de cada gnero bacteriano perteneciente a las enterobacterias.

4. Realizar las pruebas bioqumicas mnimas necesarias para la identificacin de las enterobacterias.

5. Utilizar las tablas de identificacin para confirmar el gnero y la especie de cada microorganismo.

6. Describir los principales procesos patolgicos en los que se presentan las enterobacterias.



Facultad



Material:

GENERAL: Asas bacteriolgicas graduadas, asas bacteriolgicas rectas, portaobjetos, papel

secante, solucin desinfectante, marcador permanente, Mechero, Estufa Bacteriolgica a 37 C

(temperatura constante). Microscopio ptico binocular de campo claro (con objetivos de 4X, 10X,

40X, 100X), tiras de papel filtro.

Seccin:

1 cultivo en agar de Escherichia coli 1 cultivo en agar de Salmonella tiphymurium 1 cultivo en agar de Enterobacter cloacae 1 cultivo en agar de Citrobacter freundii 1 cultivo en agar de Proteus vulgaris o Proteus mirabilis 1 cultivo en agar de Pseudomona aeroginosa

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Por Equipo:

Agar Sangre Agares selectivos diferenciales: MacConkey, Verde Brillante, XLD, Salmonella-Shigella,

Bismuto sulfito. Agar de Triple Hierro y Azcar (TSI) Medio SIM Citrato de Simmons Urea Lisina Descarboxilasa Agar de Fenilalanina Base de rojo de Fenol con Lactosa, glucosa, manitol y maltosa. Medio MIO. Reactivo de Cloruro ferrico al 10 %. Reactivo de Oxidasa Reactivo de Indol Tren de tincin de Gram Reactivo de KOH al 3 %

Metodologa:


1. Limpie y desinfecte la mesa de trabajo. 2. Inocule y siembre en cada medio de cultivo asignado, la cepa bacteriana establecida a cada

equipo. 3. Realice la tincin de Gram y compruebe con la prueba de KOH al 3 % 4. Realice la prueba de Oxidasa, utilizando el papel filtro 5. Siembre las pruebas bioqumicas con la cepa bacteriana establecida a cada equipo 6. Incube los medios de cultivo y las pruebas bioqumicas a 37 C por 24 horas 7. Limpie y desinfecte la mesa de trabajo. 8. Anote las observaciones obtenidos de las pruebas realizadas.


1. Limpie y desinfecte la mesa de trabajo. 2. Realice la tincin de Gram, prueba de KOH al 3% y prueba de Oxidasa. 3. Realice la interpretacin de las pruebas bioqumicas. 4. Observe la morfologa colonial y las reacciones que se observan en cada medio de cultivo. 5. Concluya la identificacin del microorganismo con base a los resultados de las pruebas

bioqumicas. 6. Limpie y desinfecte la mesa de trabajo.

Resultados:



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con la prctica.

CUESTIONARIO:

1. Menciona las principales enterobacterias de importancia en Medicina Veterinaria? 2. Cules son las enfermedades que producen y que especies afectan las enterobacterias que

mencionaste anteriormente? 3. Qu medios de cultivo y pruebas complementarias necesitaras para confirmar el gnero y

especie de las enterobacterias antes mencionadas?

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5. Aislamiento e identificacin de bacterias no entricas

(Bacterias que afectan el tracto respiratorio: Pasteurella, Mannheimia, Bordetella)

UNIDAD DE COMPETENCIA IV: Identificar los principales agentes bacterianos Gram negativos de

importancia veterinaria.

Introduccin:

Las pasteurelas son bacterias facultativas, inmviles y poseen cpsula. No forman esporas. Son

oxidasa positiva. Habitantes normales de las mucosas de las vas respiratorias altas y del tracto

digestivo de animales y hombre. Generalmente se presentan como invasores secundarios

produciendo infecciones del tracto respiratorio, mastitis y ocasionalmente septicmicas.

Pasteurella multocida y Mannheimia haemolytica se asocian al proceso multietiolgico denominado

fiebre de embarque de los bovinos. Pasteurella multocida se asocia a procesos neumnicos en

bovinos y cerdos. Es uno de los agentes etiolgicos de la rinitis atrfica del cerdo (junto con B.

bronchiseptica) y el agente etiolgico del clera aviar.

Mannheimia haemolytica se asocia a procesos neumnicos en ovinos y caprinos, a septicemias en

corderos y a problemas de mastitis en ovinos.

Pasteurella pneumotropica es causa de neumonas y abscesos en cuyos, ratas y hmsters.

Pasteurella gallinarum es parte de la microflora normal de la cavidad nasal de pollos y pavos y se

comporta como oportunista en problemas respiratorios.

Bordetella bronchiseptica son microorganismos aerobios estrictos, pueden presentar motilidad y

generalmente producen cpsulas. No forman esporas. Es una bacteria del epitelio ciliado del tracto

respiratorio de diferentes especies animales. Ocasiona la rinitis atrfica del cerdo en asociacin

con P. multocida. Tambin se ha aislado a partir de neumonas en roedores, gatos, equinos y

perros.

Objetivo: El alumno describir las caractersticas de cultivo, morfolgicas y bioqumicas ms

relevantes de los gneros Pasteurella, Mannheimia y Bordetella de mayor importancia en Medicina

Veterinaria.

Competencias:

Aplicar la tincin de Gram en las diferentes cepas de trabajo para conocer su morfologa microscpica, afinidad tintorial y agrupacin.

Utilizar los medios de cultivo in vitro para el aislamiento de los gneros Pasteurella, Mannheimia y Bordetella, as como sus requerimientos atmosfricos.

Identificar las principales especies de los gneros Pasteurella, Mannhemia y Bordetella.

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Realizar las pruebas bioqumicas mnimas necesarias para la identificacin del gnero y especie de las bacterias estudiadas.

Utilizar las tablas de identificacin para confirmar el gnero y la especie de cada microorganismo.

Describir los principales procesos patolgicos en los que se presentan los gneros Pasteurella, Mannheimia y Bordetella.



Facultad



Material:

General: Asas bacteriolgicas graduadas, asas bacteriolgicas rectas, portaobjetos, papel



40X, 100X), tiras de papel filtro.

Seccin:

1 cultivo en agar de Pasteurella multocida 1 cultivo en agar de Mannheimia haemolytica 1 cultivo en agar de Bordetella Bronchiseptica

Por Equipo:

Agar sangre Agar MacConkey. Agar de Triple Hierro y Azcar (TSI) Medio SIM Urea Base de rojo de Fenol con Lactosa, glucosa, manitol y maltosa. Medio MIO. Reactivo de Oxidasa Reactivo de Indol Tren de tincin de Gram Reactivo de KOH al 3 %

Metodologa:



equipo.

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3. Realice la tincin de Gram y compruebe con la prueba de KOH al 3 % 4. Realice la prueba de Oxidasa, utilizando el papel filtro 5. Siembre las pruebas bioqumicas con la cepa bacteriana establecida a cada equipo 6. Incube los medios de cultivo a 37 C por 24 h en microaerobiosis 7. Incube las pruebas bioqumicas a 37 C por 24 h 8. Limpie y desinfecte la mesa de trabajo. 9. Anote las observaciones obtenidos de las pruebas realizadas.


1. Limpie y desinfecte la mesa de trabajo. 2. Realice la tincin de Gram, prueba de KOH al 3% y prueba de Oxidasa. 3. Realice la interpretacin de las pruebas bioqumicas. 4. Observe la morfologa colonial y las reacciones que se observan en cada medio de cultivo. 5. Concluya la identificacin del microorganismo con base a los resultados de las pruebas


Resultados:


el alumno, entregar un reporte de prctica tal como lo solicite el docente.





con la prctica.

Cuestionario:

1. Menciona las principales diferencias morfolgicas de entre las enterobacterias y bacterias Gram negativas que afectan el tracto respiratorio?

2. Qu medios de cultivo y pruebas complementarias necesitaras para confirmar el gnero y especie de los agentes bacterianos antes mencionados?

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6. Aislamiento e identificacin de bacterias Gram positivas

(Cocos pigenos)

UNIDAD DE COMPETENCIA V: Identificar los principales agentes bacterianos Gram positivos de

importancia veterinaria.

Introduccin:

Los estafilococos son microorganismos facultativos, inmviles, generalmente no poseen cpsula y

no forman esporas. Algunas cepas producen pigmento cuando se cultivan a 37C en medios

enriquecidos. Son catalasa positiva. Los estafilococos son microorganismos ubicuos que con

frecuencia pueden ser comensales de la piel y mucosas de los animales. Son organismos

esfricos que se agrupan en racimos, aunque algunas clulas pueden encontrarse solas, en pares

o en cadenas muy cortas. Son fuertemente Gram positivos.

Staphylococcus aureus produce una gran variedad de infecciones supurativas en heridas,

endometritis, cistitis, piodermas en corderos, perros, gatos y en aves se produce tambin en

abscesos. Staphylococcus hycus, se asocia a la entidad clnica especfica del cerdo conocido

como epidermitis exudativa. Staphylococcus intermedius se asocia a piodermas, otitis,

conjuntivitis, osteomielitis y rara vez mastitis en perros. Staphylococccus saprophyticus es un

patgeno oportunista.

Los estreptococos son microorganismos facultativos, generalmente inmviles, algunas especies

poseen cpsula y no forman esporas. Con excepcin de algunas especies de los grupos B y D, no

producen pigmento. Son catalasa negativo. Los estreptococos son parsitos de las mucosas de los

animales y el hombre. Dadas las condiciones apropiadas, pueden convertirse en grmenes

oportunistas, asocindose a una gran variedad de procesos pigenos.

Las colonias de los estreptococos a las 24 h de incubacin a 37 C en aerobiosis son de 1 a 2 mm

de dimetro, circulares convexas, grisceas o translucidas en forma de gotas de roco. La mayora

de las cepas patgenas producen hemlisis o , lo cual se ve incrementado cuando se cultivan

en atmsfera con 10% de CO2. Son organismos esfricos u ovoides que se agrupan en cadenas

cuando son cultivados en medios lquidos.

Streptococcus zooepidemicus y Str. equisimilis producen cervicitis, metritis, abortos, poliartritis y

mastitis en equinos; tambin producen procesos pigenos en bovinos y cerdos. Streptococcus

zooepidemicus y Str. equi producen la gurma o papera de los potros. Streptococcus

zooepidemicus, Str. faecalis y Str. faecium se involucran en diferentes procesos patolgicos de las

aves. Streptococcus agalactiae, Str. disgalactiae y Str. uberis son importantes agentes etiolgicos

de mastitis bovina. Streptococcus canis es agente etiolgico de diferentes procesos purulentos en

perros. Streptococcus suis es el agente etiolgico de la linfadenitis estreptococcica del cerdo.

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Objetivo: El alumno describir las caractersticas de cultivo, morfolgicas y bioqumicas ms

relevantes de las especies de Staphylococcus spp y Streptococcus spp de mayor importancia en

Medicina Veterinaria.

Competencias:

Realizar la tincin de Gram en las diferentes cepas de trabajo para conocer su morfologa microscpica, afinidad tintorial y agrupacin.

Utilizar los medios de cultivo in vitro para el aislamiento de los gneros Staphylococcus spp y Streptococcus spp, as como sus requerimientos atmosfricos.

Identificar las principales especies de los gneros Staphylococcus spp y Streptococcus spp. Realizar las pruebas bioqumicas mnimas necesarias para la identificacin del gnero y

especie de las bacterias estudiadas. Utilizar las tablas de identificacin para confirmar el gnero y la especie de cada

microorganismo. Describir los principales procesos patolgicos en los que se presentan los gneros

Staphylococcus spp y Streptococcus spp.



Facultad



Material:

General: Asas bacteriolgicas graduadas, asas bacteriolgicas rectas, portaobjetos, papel



40X, 100X).

Seccin:

1 cultivo en agar de Staphylococcus aureus 1 cultivo en agar de Staphylococcus epidermidis 1 cultivo en agar de Streptococcus agalactiae 1 cultivo en agar de Streptococcus disgalactiae 1 cultivo en agar de Steptococcus hemoltico 1 cultivo en agar de Enterococcus faecalis

Por Equipo:

1. Plasma de Conejo. 2. Agar sangre.

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3. Medio selectivo (Staphylococcus): Agar sal y manitol, Agar staphylococcus 110 Agar Chapman stone.

4. Agar sangre con azida de sodio 5. Agar MacConkey 6. Agua Oxigenada (reactivo de catalasa). 7. Agar de Triple Hierro y Azcar (TSI) 8. Urea 9. Base de rojo de fenol con lactosa, glucosa, manitol, trehalosa, sorbitol y maltosa. 10. Medio MR-VP. 11. Tren de tincin de Gram 12. Reactivo de KOH al 3 %

Metodologa:



equipo. 3. Realice la tincin de Gram y compruebe con la prueba de KOH al 3 % 4. Realice la prueba de catalasa, y efectu la prueba de coagulasa en portaobjetos 5. Siembre las pruebas bioqumicas con la cepa bacteriana establecida a cada equipo 6. Incube los medios de cultivo y pruebas bioqumicas a 37 C por 24 h 7. Limpie y desinfecte la mesa de trabajo. 8. Anote las observaciones obtenidos de las pruebas realizadas.


1. Limpie y desinfecte la mesa de trabajo. 2. Realice la tincin de Gram, prueba de KOH al 3% y prueba de catalasa. 3. Realice la interpretacin de las pruebas bioqumicas. 4. Observe la morfologa colonial y las reacciones que se observan en cada medio de cultivo. 5. Concluya la identificacin del microorganismo con base a los resultados de las pruebas


Resultados:







con la prctica.

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Cuestionario:

1. Menciona las principales diferencias morfolgicas de entre las bacterias Gram positivas y bacterias Gram negativas?

2. Cules son las diferencias entre Staphylococcus y Streptococcus? 3. Qu medios de cultivo y pruebas complementarias necesitaras para confirmar el gnero y

especie de los agentes bacterianos antes mencionados?

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7. Aislamiento e identificacin de agentes micticos

UNIDAD DE COMPETENCIA VII: Identificar los principales agentes micticos de importancia

veterinaria.

Introduccin:

Los dermatofitos forman un grupo de hongos relacionados taxonmicamente, que muestran

afinidad por tejidos queratinizados tales como piel, pelo, plumas, uas, y cuernos. Dentro de este

grupo de hongos se incluyen tres gneros: Epidermophyton, Microsporum y Trichophyton, de los

cuales nicamente los dos ltimos tienen importancia en Medicina Veterinaria.

La mayora de los dermatofitos son habitantes del suelo. Algunas especies que se han adaptado al

husped son parsitos de los animales. Las infecciones por dermatofitos se conocen como

dermatofitosis y se caracterizan por producir lesiones superficiales. En los animales domsticos no

existe diferencia clnica notoria en cuanto a tipo y forma de las lesiones. Estas son generalmente

circulares, con descamacin, alopecia y prurito, con o sin formacin de costras.

Objetivo: El alumno describir las caractersticas de cultivo y morfolgicas ms relevantes de las

micosis ms importantes del grupo de los dermatofitos de mayor importancia en Medicina

Veterinaria.

Competencias:

Realizar la tincin de lactofenol azul de Algodn en las diferentes muestras de trabajo para conocer su morfologa microscpica.

Utilizar los medios de cultivo in vitro para el aislamiento de dermatofitos, as como sus requerimientos atmosfricos.

Identificar las principales especies de cada gnero mictico de importancia Medicina Veterinaria.

Utilizar las tablas de identificacin para confirmar el gnero y la especie de cada microorganismo.

Describir los principales procesos patolgicos en los que se presentan los gneros pertenecientes al grupo de los dermatofitos.



Facultad


4 Horas (dos sesiones, separadas por una semana una de otra)

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Material:

General: Asas bacteriolgicas graduadas, asas bacteriolgicas rectas, portaobjetos, cubreobjetos,

papel secante, solucin desinfectante, marcador permanente, Mechero, Estufa Bacteriolgica entre

24 y 28 C (temperatura constante). Microscopio ptico binocular de campo claro (con objetivos de

4X, 10X, 40X, 100X), Hojas y mangos de Bistur, pinzas sin dientes de uso clnico.

Por Equipo:

Agar sangre. Medio selectivo: Agar Sabouraud, agar para seleccin de hongos (agar micobitico) o agar

tripticasa de soya. Agar MacConkey Base de rojo de fenol con lactosa, glucosa, manitol, trehalosa, sorbitol y maltosa. Tren de tincin lactofenol azul de algodn

Metodologa:


Preparacin y Acondicionamiento de la Muestra:

La muestra ha utilizar para el aislamiento e identificacin micolgica debe ser caracterstica, y debe ser tomada bajo las debidas medidas de bioseguridad exigidas para este gnero y del tamao adecuado, y procesarse inmediatamente. Procedimiento:

1. Con un hisopo estril se toma la muestra y se siembra en una caja de agar Sabouraud o agar micobitico, agar sangre y agar Mc Conkey, e inocular bajo el procedimiento de aislamiento en cultivo puro incubando a 30 C por 24 a 72 h.

2. Sembrado en el microcultivo: a. Dentro de una caja petr estril agregar entre 2 a 4 mL de agua bidestilada estril. b. Colocar un soporte y poner un portaobjetos con un cuadro de Agar Sabouraud o

Agar para hongos de aproximadamente 1 cm2. c. Con el asa tomar la muestra y sembrar por picadura en cada lado del agar,

posteriormente colocar el cubreobjetos, tapar la caja e incubar de 24 a 28 C de entre 24 a 120 h aprox.

d. Una vez observado crecimiento se procede a la realizacin del frotis, previa inactivacin del cultivo.

3. Preparacin del frotis. a. Introduce un algodn impregnado con formol al 10 % en la caja y djalo actuar

durante 30 minutos con el fin de inactivar al hongo. b. En un portaobjetos coloca dos gotas separadas de lactofenol azul de algodn. Con

las pinzas toma cada uno de los cubreobjetos y colcalos sobre cada una de las gotas del colorante.

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c. Obsrvese las preparaciones en el microscopio de campo claro con los objetivos 10 X y 40 X

d. Observa las estructuras fungales y sus caractersticas morfolgicas.


Interpretacin de Resultados:

La identificacin se lleva a cabo mediante la observacin de las colonias fungales y la preparacin

de frotis hmedos a partir de estas o a partir de microcultivos con el fin de determinar la morfologa

microscpica (ver Anexo 5).

1. Identificacin en medio de cultivo: las cajas de estos medios deben ser revisadas

peridicamente hasta por 190-200 h a 24 a 28 C y observar la textura, tamao y pigmento de la

superficie y base de las colonias desarrolladas. La mayora de los dermatofitos producen colonias

con micelio de aspecto algodonoso o polvoso.

2. Tincin de Azul de Algdon: los dermatofitos producen dos tipos de aleuriosporas; las

macroaleuriosporas (multicelulares, septadas) y las microaleuriosporas (unicelulares, no septadas)

la morfologa caracterstica de dichas estructuras permite la identificacin de cada una de las

especies.

Epidermophyton produce abundantes macroaleuriosporas de pared gruesa y lisas, en forma de

raqueta y no produce microaleuriosporas.

Trichophyton produce pocas macroaleuriosporas con forma alargada (forma de basto), de pared

lisa y delgada, y produce abundantes microaleuriosporas.

Microsporum produce abundantes macroaleuriosporas en forma de huso, con pared gruesa y

spera (a menudo descritas como ornamentadas) y produce pocas microaleuriosporas. Otras

estructuras microscpicas que ocasionalmente son tiles para la identificacin de los dermatofitos

son la presencia de hifas espirales o en forma de peine (hifas pectinadas); la presencia de

clamidosporas terminales; de artrosporas.

Resultados:







con la prctica.

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Cuestionario:

1. Menciona las principales diferencias morfolgicas entre las bacterias y los hongos microscpicos?

2. Qu diferencia hay entre la tincin de Gram y la tincin Lactofenol azul de algodn? 3. Qu medidas de bioseguridad utilizaras para manipular y procesar muestras de

enfermedades micticas?

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ANEXOS:

Anexo 5: Principales agentes micoticos de importancia en medicina veterinaria (Hungerford, et al.,

1998)

a) Microsporum canis b) Microsporum gypseum

c) Conidiobolus coronatus d) Sporothrix schenckii

e) Aspergillus flavus f) Blastomyces dermatitidis

g) Malassezia pachydermatis h) Trichophyton mentagrophytes

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8. Determinacin de la susceptibilidad in vitro a los antimicrobianos

UNIDAD DE COMPETENCIA VIII: Identificar los mecanismos de accin y resistencia de los antimicrobianos utilizados en medicina veterinaria Introduccin: En la actualidad se encuentra una gran cantidad de antibiticos en el mercado, algunos solamente

son especficos para determinadas bacterias, otros nicamente las inhiben y otros actan solo

sobre las Gram positivas.

Debido al abuso de los antibiticos, las bacterias han adquirido resistencia a ellos, de ah que

cuando se presenta un paciente en el que no surten efectos los antibiticos, se debe considerar

que el microorganismo que lo est infectando se ha hecho resistente.

En la seleccin del antibitico ms adecuado para el tratamiento de una infeccin bacteriana se

deben tomar en cuenta diversos factores que dependen tanto del tipo de antibitico elegido y de su

efecto sobre el agente causal que se aslo del proceso infeccioso.

Se han propuesto diversos mtodos para medir in vitro la susceptibilidad bacteriana a los

antibiticos, de los cuales el ms popular es el mtodo de difusin en agar, prueba cualitativa en la

que se utilizan discos de papel filtro impregnado con concentraciones conocidas de los diferentes

antibiticos. Estos discos se colocan sobre la superficie del agar Muller-Hinton previamente

inoculado con la cepa problema (ver Anexo 6).

Despus de la incubacin se observan halos de inhibicin de desarrollo bacteriano alrededor de

los discos con antibiticos a los cuales el microorganismo es susceptible. Por el contrario, si la

bacteria es resistente hay crecimiento alrededor del disco (ver Anexo 6).

Objetivo: El alumno determinar la susceptibilidad a los antimicrobianos empleados para Gram

positivos y Gram negativos mediante el mtodo de difusin en agar.

Competencias:

Realizar el mtodo de difusin en agar como prueba de susceptibilidad in vitro a los antimicrobianos.

Identificar los principales antimicrobianos empleados para agentes bacterianos Gram positivos y Gram negativos.

Analizar los resultados de la prueba de susceptibilidad in vitro para clasificara los agentes bacterianos en susceptibles, susceptibilidad intermedia y resistentes a los antimicrobianos a los que fueron desafiados.

Describir los principales mecanismos de accin de los antimicrobianos en los principales gneros bacterianos de importancia Medicina Veterinaria.

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Facultad

Tiempo Destinado A La Prctica:


Material:

General: Asas bacteriolgicas graduadas, pinzas de diseccin sin dientes de uso clnico, Comps

de calibracin, Vernier, regla o platilla diseada para este propsito, hisopos estriles, papel


(temperatura constante).

Seccin:

1 cultivo en agar de E. coli 1 cultivo en agar de Staphylococcus spp Medio Agar Muller-Hinton Caldo Muller-Hinton Multidiscos de 12 antibiticos para bacterias Gram positivos (Sanofi Diagnostics Pasteur, S. A.) Multidiscos de 12 antibiticos para bacterias Gram negativos (Sanofi Diagnostic Pasteur, S. A.)

Metodologa:


Preparacin y Acondicionamiento de la Muestra:

Preparar el medio de agar Mueller-Hinton de acuerdo a las instrucciones del fabricante, el pH final

a temperatura ambiente deber estar entre 7.2 y 7.4, este medio favorece el crecimiento de casi

todos los microorganismos para los que son ms importantes las pruebas de susceptibilidad.

Tomar con una asa bacteriolgica de 4 a 5 colonias aisladas del mismo tipo morfolgico e inocular

en 4 mL de caldo Mueller-Hinton, se incuba a 35 C hasta que aparece una turbidez ligera

(generalmente 2 a 5 horas), la turbidez se ajusta con solucin salina estril o caldo estril hasta

tener una densidad de 0.5 de MacFarland, comparable con un estndar de sulfato de bario [El

estndar se prepara mezclando 0.5 mL de BaCl2 0.048 M (1.175 % peso/volumen de BaCl2H20)

con 99.5 mL de H2SO4 al 1% v/v (0.36N)].

La suspensin ajustada del inoculo no debe permanecer ms de 15 a 20 minutos antes de

proceder a inocular en la caja de Petr.

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Procedimiento:

1. Para inocular el agar se utiliza un hisopo estril de algodn, el cual se humedece con la suspensin, se quita el exceso de caldo presionado y girando el hisopo sobre la pared interna del tubo, por arriba del nivel del caldo, se estra el medio en tres direcciones sobre la totalidad de la superficie de agar, para obtener un inculo uniforme, se efecta un ltimo barrido del hisopo sobre el reborde de la caja de Petr y el agar. Cuando el inculo se haya secado (de 3 a 5 minutos) se procede a colocar los discos.

2. Los discos se toman con pinza estril y se colocan en el medio en un tiempo menor de 15 minutos despus de haber inoculado la placa, los discos debern presionarse ligeramente para asegurar un contacto con la superficie, deber prevenirse una sobreposicin de las zonas de inhibicin con la distribucin adecuada de los discos y con un lmite no menor de 15 mm de los bordes de la placa.

3. Despus de 15 minutos de haber colocado los discos, invertir la caja de Petr e incubar a 35 C. El tiempo de incubacin es de 18 a 24 horas.

Interpretacin:


La medicin de los halos de inhibicin se hace con comps de calibracin, Vernier, regla o platilla diseada para este propsito, por el fondo de la caja la cual se ilumina con luz reflejada. El punto final de todos los sistemas de lectura ser hasta la completa inhibicin del crecimiento determinada visualmente, ignorando colonias tenues o muy pequeas que pueden ser observadas con minuciosidad (ver Anexos 6 y 7).

Resultados:







con la prctica.

Cuestionario:

1. Que otros medios de cultivo se pueden utilizar para preparar el inoculo? 2. Cmo sabremos que el tubo con el inoculo ya est listo para ser inoculado? 3. Que otros medios de cultivo se pueden utilizar en lugar del agar Mueller-Hinton?

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Anexos: Anexo 6: Visualizacin de los diferentes resultados obtenidos en la prueba de susceptibilidad in vitro, por el mtodo de difusin en Agar (Kirby-Bauer).

Anexo 7: Clasificacin de la susceptibilidad antimicrobiana con base al dimetro de los halos de

inhibicin en bacterias Gram positivas y Gram negativas. ANTIBITICO CONCENTRACIN

(MICROGRAMOS/mL)

DIMETRO DEL HALO DE INHIBICIN

EN mm (***)

Resistente

()

Intermedio Susceptible

()

AMIKACINA 30 14 15-16 17

AMPICILINA

Enterobacteriaceae

Staphylococcus spp.

Enterococcus spp.

Estreptococcus spp.

10

11

28

16

21

12-13

22-29

14

29

17

30

CARBENICILINA

Enterobacteriaceae

Pseudomona aeruginosa

100

17

13

18-22

14-16

23

17

CEFALOTINA 30 14 15-17

607_970_MP Bacteriología y Micología

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