9. Enzimas

8/16/2019 9. Enzimas

1/230

8/16/2019 9. Enzimas

2/230

¿Cuándo tiene lugar una reacción química? (1)

- Las reacciones que tienen lugar espontáneamente suelen serexotérmicas, esto es, con desprendimiento de calor.

- El calor que se desprende o absorbe en una reacción a presiónconstante recibe el nombre de Entalpía (DH). Las reacciones enlas que se desprende calor son exotérmicas y por convención, laentalpía se supone negativa: DH < 0

ΔH = ΔH productos- ΔH sustratos

- Sin embargo, hay reacciones endotérmicas que cursan espontá-neamente, DH > 0; por ejemplo, la disolución de sulfato amónicoen agua.

8/16/2019 9. Enzimas

3/230


- La disolución de sulfato amónico en agua es un proceso porel cual se pasa de un sistema altamente ordenado, cual es elestado cristalino, a otro de mucho mayor desorden molecular.

- La función termodinámica que mide el desorden de un sistemarecibe el nombre de Entropía (DS). Puede observarse que muchasreacciones que cursan espontáneamente lo hacen con incremento

positivo de entropía: DS > 0.

- Sin embargo, hay procesos espontáneos que cursan con dismi-nución de entropía, p.e.: la solidificación del agua a 0ºC.

8/16/2019 9. Enzimas

4/230


- Ni la entropía ni la entalpía valen como criterio único paradefinir la espontaneidad de una reacción.- Existe otra función termodinámica de estado que agrupa alas dos en procesos a presión constante, la Energía Libre deGibbs, que se define así:

DG = DH - TDS

- La energía libre de Gibbs es un criterio válido para verificarla espontaneidad de una reacción. Pueden cursar espontánea-mente aquellos procesos en los que se desprende energía libre,exergónicos, (DG < 0). No pueden hacerlo, sin embargo,aquellos procesos en los que se absorbe energía libre,endergónicos (DG > 0)

8/16/2019 9. Enzimas

5/230

Sea un sistema

A BLa reacción cursará de izquierda a derecha cuando las concentra-ciones de A y B sean tales que la energía libre del sistema seanegativa. La energía libre del sistema viene dada por:

DG = DG0 + RT ln[A] [B]

Donde DG0

es la Energía Libre Standard de la reacción: la energíalibre del sistema con los reactivos a concentración unidad, en condi-ciones STP. Hay tablas que nos dan la DG0 para toda reacción. A

partir de las mismas podemos calcular si un proceso puede tenerlugar espontáneamente o no en unas determinadas condiciones.

8/16/2019 9. Enzimas

6/230

Ejemplo:

Calcular la energía libre del proceso de descomposición del

éster Glucosa-6-fosfato a Glucosa y fosfato inorgánico en lascondiciones intracelulares, que son:

Temperatura: 37 ºC, equivalentes a 310 ºK[Glucosa-6-fosfato], 1 mM[Glucosa], 0.01 mM[fosfato], 10 mM

La reacción es:

G6P + H2O G + Pi

La Energía Libre Standard de la reacción es de -3250 cal/mol

8/16/2019 9. Enzimas

7/230

La expresión que nos da la Energía Libre es:

DG = DG0 + RT ln[Glucosa] [Fosfato]

[Glucosa-6-fosfato]

(No se tiene en cuenta el agua porque su concentración seconsidera constante)

Sustituyendo, obtenemos:

DG = -3250 + 1.98*310*2.303* log 10-5*10-3

10-2= -8900 cal/mol

Por lo tanto, en las condiciones intracelulares el proceso puede tener lugar espontáneamente.

8/16/2019 9. Enzimas

8/230

8/16/2019 9. Enzimas

9/230

La expresión que nos da la energía libre de un proceso tieneotra importante derivación. Para la reacción

DG = DG0 + RT ln

[A]

[B]

A BEsta expresión es:

En el equilibrio, DG = 0; por tanto,

0 = DG0 + RT ln[Aeq]

[Beq]

Pero[Aeq] [Beq] = K eq Por tanto, DG0 = -RT ln K eq

8/16/2019 9. Enzimas

10/230

8/16/2019 9. Enzimas

11/230

En general, podemos decir:

Reacciones catabólicas: DG < 0

Reacciones anabólicas: DG > 0

Supongamos una reacción anabólica mediante la cual se formaun enlace químico entre A y B; esquemáticamente,

A + B A-B ( DG > 0)

La reacción no puede tener lugar espontáneamente. ¿Cómo puede entonces tener lugar en el metabolismo?

8/16/2019 9. Enzimas

12/230

Lo que ocurre en el metabolismo es que las reaccionesendergónicas (DG > 0) se acoplan a reacciones exergónicas(DG < 0) de manera que :

1. La energía desprendida en una de las reacciones es absorbida por la otra.

2. La suma total de energías libres de una y otra reacción da unaDG < 0, por lo que el proceso en conjunto tiene lugar espontánea-

mente.

8/16/2019 9. Enzimas

13/230

8/16/2019 9. Enzimas

14/230

8/16/2019 9. Enzimas

15/230

El polifosfato mayoritario en las reacciones de acoplamiento

energético es el ATP, 5’-Adenosina trifosfato:

OCH2 N

N

N

N

NH2

OHOH

OPOPOP-O

O O O

O-O-O-

8/16/2019 9. Enzimas

16/230

De esta manera, los procesos catabólicos productores de energíageneran ATP, que se empleará en todas aquellas reacciones ender-

gónicas en las que sea requerido.En general, el ATP se produce de dos maneras:

1. Por fosforilación a nivel de substrato(procesos anaeróbicos, fermentativos)Por ejemplo: La Glicolisis

2. Por fosforilación oxidativa

(procesos aeróbicos, oxidativos)Por ejemplo: Ciclo de Krebs, - b oxidación, etc.

8/16/2019 9. Enzimas

17/230

Los dos enlaces anhídrido del polifosfato del ATP son el ejemplode configuraciones de alta energía de hidrólisis:

OPOPOP-O

O O O

O-O-O-

R

Existen otras configuraciones de alta energía, por ejemplo:

Fosfoenolpiruvato

O-PO

O

O-

C

CH2

COO-

O-P

O

O-

NHC

NH

N

CH3

CH2

C

O

-O

Fosfocreatina

8/16/2019 9. Enzimas

18/230

O-P

O

O-OC

O

H2N

Carbamilfosfato

R C

O

S CoA

Tioésteres de Coenzima A

Otras configuraciones de alta energía de hidrólisis

8/16/2019 9. Enzimas

19/230

Consideremos ahora la reacción de degradación aeróbica de la glucosa:

C6H12O6 + 6O2 6CO2 + 6H2O DG0’ = -684 kcal/mol

Según lo hasta ahora expuesto, esta reacción es fuertementeexergónica, por lo que debería cursar espontáneamente.

Sin embargo, la glucosa en presencia de oxígeno es perfectamenteestable y no entra espontáneamente en combustión.

8/16/2019 9. Enzimas

20/230

Ello es debido a que los reactivos han de superar una barreraenergética, la Energía de Activación:

Energía

Coordenadade reacción

Ea G + O2

CO2 + H2ODG0

8/16/2019 9. Enzimas

21/230

La barrera energética que separa al papel del CO2 es de 451ºF o 233ºC. A

esta temperatura todas las moléculasdel papel se transformanespontáneamente a producto.A temperatura ambiente existe unaamplia distribución de energía en lasmoléculas de papel y sólo algunas deellas alcanzan a romper la barreraenergética lo que hace que el papel sevaya destruyendo a muy bajavelocidad pero en forma constante.(Todos los papeles con el tiempo se

tornan amarillos, luego se convertiránen polvo).Un catalizador como el ácidosulfúrico hará que la reacción seainmediata.

8/16/2019 9. Enzimas

22/230

Introducción a la Enzimología

8/16/2019 9. Enzimas

23/230

DG

Ea

DG

Ea’

Reacciónno catalizada

Reaccióncatalizada

Catálisis

8/16/2019 9. Enzimas

24/230

Enzima: Proteína dotada de actividad catalítica

- Enzimas proteolíticas- Desnaturalización de enzimas- Purificación de enzimas

- Síntesis completa de una enzima

A partir de 1982, se sabe que no todas las enzimas son

proteínas; existen moléculas de RNA con actividad cata-lítica, las llamadas ribozimas

8/16/2019 9. Enzimas

25/230

8/16/2019 9. Enzimas

26/230

En la catálisis química se distingue entre:

- Catálisis homogénea, cuando catalizador y reactivosestán en la misma fase físicoquímica: Por ejemplo, lahidrólisis ácida de la sacarosa.

- Catálisis heterogénea, cuando catalizador y reactivosestán en distinta fase físicoquímica: por ejemplo, lareacción en fase gaseosa entre N2 y H2 para formar amoníaco(proceso Haber), que es catalizada por metales (sólidos)

La catálisis enzimática tiene características de ambas

8/16/2019 9. Enzimas

27/230

Los siguientes hechos:

- Especificidad de la reacción enzimática- Carácter heterogéneo de la catálisis enzimática

Nos llevan a postular la existencia de un Centro Activo enla molécula de enzima, capaz de:

- Fijar específicamente al substrato

- Transformarlo catalíticamente.

8/16/2019 9. Enzimas

28/230

Lisozima y susubstrato

8/16/2019 9. Enzimas

29/230

Substrato: molécula(s) sobre la(s) que actúa la enzima

Actividad enzimática: velocidad a la que cursa la reacciónenzimática

Velocidad: variación de la concentración en la unidadde tiempo

Unidades:katal: moles.s-1 U.I.: mmoles.min-1 (a 25ºC)

La velocidad es directamente proporcional de la concentraciónde enzima; por tanto, la velocidad es una medida de la concen-tración de enzima en una preparación.

8/16/2019 9. Enzimas

30/230

8/16/2019 9. Enzimas

31/230

Cofactor (Coenzima):

Átomo, ion o molécula que participa en el procesocatalítico sin ser enzima ni substrato.

Los cofactores participan de dos maneras distintas:

1. A través de una fijación muy fuerte a la proteína y salensin ser modificados del ciclo catalítico

2. Como un segundo substrato; salen modificados del ciclocatalítico y por lo general requieren otra enzima para volveral estado original.

8/16/2019 9. Enzimas

32/230

R CH

NH3+

COO- + O2 + H2O R CO COO- + H2O2 + NH4

+

Aminoácido CetoácidoLAO

LAO: L-aminoácido oxidasa: es una flavoproteína

Las flavoproteínas tienen un grupo prostético flavínico,que interviene en el proceso catalítico sin salir modificadodel mismo

NH

N NH

N O

H3C

H3C

O

8/16/2019 9. Enzimas

33/230

COO-

C O

CH3

COO-

CHO H

CH3

NADH + H+ NAD+

Piruvato L-Lactato

LDH

LDH: Lactato deshidrogenasa

Utiliza como cofactor NADH, el cual sale de la reacción

oxidado a NAD+. La regeneración a NADH requeriría otraenzima.

8/16/2019 9. Enzimas

34/230

Los cofactores que están unidos a la enzima en forma covalentereciben el nombre de grupo prostético.

Las enzimas unidas al su grupo prostético se conocen comoHOLOENZIMAS, poseen actividad.

Las enzimas carentes de su grupo prostético se conocen como

APOENZIMAS, y no presentan actividad.

8/16/2019 9. Enzimas

35/230

Isoenzimas: formas moleculares distintas de una enzima dentro

del mismo organismo

Hexokinasa: Presenta, al menos, cuatro formas distintas

- Hepática- Cerebral- Muscular- Eritrocitaria

Las isoenzimas representan formas que tienen que ver conla diferenciación celular, presentando distintas característicasfuncionales.

8/16/2019 9. Enzimas

36/230

Especificidad de las enzimas, 1

Especificidad absoluta:

Enzima:

Fumarato hidratasa

Específica para elisómero trans- porun lado y para elL- por otro.

COO-

CHCH

COO-

H2O COO-

CHCH2

COO-

HO

Fumarato(trans-) L-Malato

8/16/2019 9. Enzimas

37/230

Especificidad de las enzimas, 2

Especificidad de grupo:

R CO O R' + H2O R COOH + HO R'

Esterasa

Las carboxilesterasas hidrolizan todo tipo de ésteres, independien-temente de la naturaleza de R o R’

8/16/2019 9. Enzimas

38/230

Otras características de la acción enzimática

Eficiencia catalítica

En ocasiones llega a ser enorme; con números de recambiodel orden de 108 s-1

Las enzimas que han llegado a este límite reciben el nombrede Enzimas plenamente evolucionadas, ya que un incrementoen la actividad no tendría sentido al superar la velocidad dedifusión de los substratos.

8/16/2019 9. Enzimas

39/230

Teorías de la acción enzimática, 1

Modelo de Llave y Cerradura (Emil Fischer)

Substrato y enzima se acoplan de forma estereospecífica,de la misma manera que una llave se ajusta a su cerradura.

Modelo aceptado durante mucho tiempo; hoy se considera

insuficiente al no explicar algunos fenómenos de la inhibi-ción enzimática, por ejemplo

8/16/2019 9. Enzimas

40/230


Modelo de Ajuste Inducido (Koshland)

Tanto la enzima como el substrato sufren una alteración

en su estructura por el hecho físico de la unión.

Está mucho más de acuerdo con todos los datos experimen-tales conocidos hasta el momento.

8/16/2019 9. Enzimas

41/230


La teoría del Ajuste Inducido se amplía en la actualidaddefiniendo la acción enzimática como

Estabilización del Estado de Transición

Según lo cual, el Centro Activo enzimático es en realidadcomplementario no al substrato o al producto, sino al

estado de transición entre ambos.

8/16/2019 9. Enzimas

42/230

R C

O

O R' Substrato: un éster

R C O R'

O-

O-

Estado de transición:

intermediario tetraédrico,inestable

R C

O

O- HO R' Productos

8/16/2019 9. Enzimas

43/230

R P O

O-

O-R'

Análogo de Estado de Transición

Derivado fosforilado, que no es substratode la reacción, pero que por su analogíaestructural ocupa el centro activo de laenzima e inhibe fuertemente a la reacción

8/16/2019 9. Enzimas

44/230

Clasificación y nomenclatura de enzimasReacciones enzimáticas

8/16/2019 9. Enzimas

45/230

ATP: hexosa fosfotransferasa

Nombre sistemático:

Donador Aceptor

Grupo transferido

EC 2.7.1.1

Número sistemático

EnzymeComission

Grupo Subgrupo

Sub-subgrupo Enzima

Nombre común: Hexokinasa

8/16/2019 9. Enzimas

46/230

1. Oxidorreductasas

2. Transferasas

3. Hidrolasas

4. Liasas

5. Isomerasas

6. Ligasas

Clasificación de enzimas:Grupos

8/16/2019 9. Enzimas

47/230

Cinética de las reacciones enzimáticas

C d l id d i i i l

8/16/2019 9. Enzimas

48/230

t

s

p [ ]

Concepto de velocidad inicial

d[ ]dtv = , t -> 0

8/16/2019 9. Enzimas

49/230

Variables que influyen en la velocidad de unareacción enzimática

1. Concentración de enzima

2. Concentración de substrato

3. pH

4. Temperatura

5. Efectores (Activadores e Inhibidores)

8/16/2019 9. Enzimas

50/230

S

8/16/2019 9. Enzimas

51/230

S

EES

P

EP

Ciclo catalíticode una enzima

Una cinética lineal implicaun proceso regenerativo,

cíclico

8/16/2019 9. Enzimas

52/230

v

[s]

Efecto de la concentración de substrato

.

.

. . . . ..

8/16/2019 9. Enzimas

53/230

E + S ES E + Pk +1

k -1

k +2

Una cinética hiperbólica implica un proceso saturante:

Hay un número limitado de sitios en la enzima para fijar substrato; una vez que están ocupadostodos, por mucho que aumente la concentración

de substrato, la velocidad permanecerá constantetendiendo a un valor asintótico

8/16/2019 9. Enzimas

54/230

E + S ES E + Pk +1

k -1

k +2

s = [S]x = [ES]

e = [E]e0 = [ES] + [E] = x + e

ds/dt = - k +1es + k -1xde/dt = - k +1es + (k -1 + k +2) x

dx/dt = k +1es - (k -1 + k +2) xdp/dt = k +2 xe0 = e + x

Descripción dinámica de la catálisis enzimática

8/16/2019 9. Enzimas

55/230

El sistema de ecuaciones diferenciales que describe la dinámicadel sistema

E + S ES E + Pk +1

k -1

k +2

No admite solución analítica. Para describirlo recurrimos a:

- Simulaciones numéricas

- Hipótesis que lo simplifiquen

Simulación numérica del sistema

8/16/2019 9. Enzimas

56/230

Simulación numérica del sistema

E + S ES E + Pk +1

k -1

k +2

8/16/2019 9. Enzimas

57/230

8/16/2019 9. Enzimas

58/230

8/16/2019 9. Enzimas

59/230

Hipótesis de estado estacionario

Según veíamos en la simulación numérica, hay un tiemporelativamente prolongado en el curso de la reacción en elque la variación de complejo [ES] es prácticamente iguala cero:

dx/dt = k +1es - (k -1 + k +2) x = 0

A partir de esta expresión podemos llegar a obtener una

expresión que nos da la velocidad para la concentraciónde substrato

d

8/16/2019 9. Enzimas

60/230

dx

dt k es k k x

0 1 1 2

k es k e x s k k x 1 1 0 1 2

xe s

k k

k s

e s

K sm

0

1 2

1

0

v V s K sm

max

v k x 2 k e V 2 0 max

Hipótesis deestado estacionario

8/16/2019 9. Enzimas

61/230

Tanto con las suposiciones de Michaelis-Menten como conLas de estado estacionario, llegamos a la ecuación

v =Vmaxs

K m + s

La única diferencia radica en el significado de K m:

K m = k -1/k +1 en mecanismo de M.M.

K m = (k -1 + k +2)/k +1 en mecanismo de E.E.

Significado de la constante K

8/16/2019 9. Enzimas

62/230

Significado de la constante K m

1. Constante de equilibrio de disociación del complejo ES(en condiciones de equilibrio rápido)

2. Medida inversa de la afinidad de la enzima por el substrato(en condiciones de equilibrio rápido)

3. Mide la función de fijación (en cond.de equilibrio rápido)

4. Concentración de substrato para la que la velocidad se hace

igual a la mitad de la máxima (s0.5)

5. Se define para una pareja enzima-substrato

6. Se mide en unidades de concentración

Significado de la constante V = k e

8/16/2019 9. Enzimas

63/230

Significado de la constante Vmax = k +2 e0

1. Velocidad asintótica para s

2. Directamente proporcional a la concentración de enzima

(hoy se prefiere caracterizar a la enzima por k +2)

3. Mide función de transformación catalítica

4. Se expresa en unidades de velocidad

8/16/2019 9. Enzimas

64/230

Representación directa

s

0 20 40 60 80 100

v

0

20

40

60

80

100

Km

Vmax

vV s

K smx

m

Representación recíproca doble

8/16/2019 9. Enzimas

65/230

Representación recíproca doble(Lineweaver - Burk)

1/s

-0.4 -0.2 0.0 0.2 0.4 0.6

1/v

0.00

0.01

0.02

0.03

0.04

1 1 1

v

K

V s V m

mx mx

-1/K m

1/Vmax

8/16/2019 9. Enzimas

66/230

Efecto del pH

pH

v

8/16/2019 9. Enzimas

67/230

1. Sobre la fijación del substrato al centro activo:- Grupos disociables de la enzima- Grupos disociables del substrato

2. Sobre la transformación catalítica del substrato

3. Sobre la estructura de la proteína enzimática

Efecto del pH

NH A

8/16/2019 9. Enzimas

68/230

Succinato ycentro activo de SDH

pH 7

COO-

CH2

CH2

COO-

+H3NC

NH

NH

CH

+H3N

CH

Arg

Lys

8/16/2019 9. Enzimas

69/230

Succinato ycentro activo de SDH,

pH 2

COOHCH2

CH2

COOH

+H3NC

NH

NH

CH

+H3N

CH

NH

8/16/2019 9. Enzimas

70/230

COO-

CH2

CH2

COO

-

H2N

C

NH

NH

CH

H2N

CH

Succinato ycentro activo de SDH,

pH 13

8/16/2019 9. Enzimas

71/230

Efecto de la temperatura

v

T

8/16/2019 9. Enzimas

72/230

En el efecto de la temperatura hay dos componentes:

1. Aceleración de la reacción según la ecuaciónde Arrhenius

k = A exp (-Ea/RT)

2. Desnaturalización térmica de la proteína

8/16/2019 9. Enzimas

73/230

Inhibición enzimática

8/16/2019 9. Enzimas

74/230

Inhibidor:

Efector que hace disminuir la actividad enzimática, a través deinteracciones con el centro activo u otros centros específicos(alostéricos).

Esta definición excluye todos aquellos agentes que inactivan ala enzima a través de desnaturalización de la molécula enzimática

De esta forma, habrá dos tipos de inhibidores:

I. Isostéricos: ejercen su acción sobre el centro activoII. Alostéricos: ejercen su acción sobre otra parte de la

molécula, causando un cambio conformacional conrepercusión negativa en la actividad enzimática.

8/16/2019 9. Enzimas

75/230

Los inhibidores isostéricos pueden ser de dos tipos:

1. Inhibidor reversible: establece un equilibrio con la enzima libre,con el complejo enzima-substrato o con ambos:

E + I EI

2. Inhibidor irreversible: modifica químicamente a la enzima:E + I E’

ES + I ESI

Inhibición reversible

8/16/2019 9. Enzimas

76/230

Inhibición reversible

(a) El inhibidor se fija al centro activo de la enzima libre,impidiendo la fijación del substrato: Inhibición Competitiva

(b) El inhibidor se fija a la enzima independientemente de que lo

haga o no el substrato; el inhibidor, por tanto, no impide lafijación del substrato a la enzima, pero sí impide la accióncatalítica: Inhibición No Competitiva

(c) El inhibidor se fija únicamente al complejo enzima-substrato

una vez formado, impidiendo la acción catalítica; este tipose conoce como Inhibición Anticompetitiva

8/16/2019 9. Enzimas

77/230

E ES

EI

I

S

E + PInhibición

Competitiva

Las fijaciones de substrato e inhibidor sonmutuamente exclusivas; el complejo EI no es productivo

8/16/2019 9. Enzimas

78/230

E ES

EI

I

S

E + PI

ESI

SInhibición

No Competitiva

El inhibidor se fija indistintamente a la enzima libre Ey al complejo enzima-substrato ES; ni el complejo EIni el complejo ESI son productivos

8/16/2019 9. Enzimas

79/230

E ES

S

E + PI

ESI

Inhibición

Acompetitiva

El inhibidor sólo puede fijarse al complejo ES;el complejo ESI no es productivo

Inhibición Competitiva

8/16/2019 9. Enzimas

80/230

E ES

EI

I

S

E + P

Características:- Las fijaciones de substrato e inhibidor son mutuamente exclusivas

- A muy altas concentraciones de substrato desaparece la inhibición- Por lo general, el inhibidor competitivo es un análogo químico del

substrato.- El inhibidor es tan específico como el substrato

Se define una constante deequilibrio de disociación delinhibidor: K i =

[E] [I]

[EI]

Inhibición Competitiva

E di i d ilib i á id ll d l ió

8/16/2019 9. Enzimas

81/230

En condiciones de equilibrio rápido, llamando y a la concentracióndel complejo EI, para la inhibición competitiva obtenemos el siste-ma de ecuaciones

vV s

K i

K s

mx

m

i

1

K e x y s

x

K e x y i y

m

i

( )

( )

0

0

Que resuelto para x nos da

xe s

K i

K sm

i

0

1

De donde

8/16/2019 9. Enzimas

82/230

Por tanto, en la inhibición competitiva,

1. El efecto cinético del inhibidor es el aumento aparente de laK m, que aparece multiplicada por el factor (1 + i/K i)

2. La Vmax no aparece modificada; para concentraciones muyaltas del substrato, v = Vmax, igual que en ausencia de inhibidor

3. Cuanto más pequeño sea el valor de K i mayor será la potenciadel inhibidor competitivo.

8/16/2019 9. Enzimas

83/230

Representación directaInhibición competitiva

s

0 20 40 60 80 100 120

v

0

20

40

60

80

100

120

Inhibición competitiva - Representación recíproca doble

8/16/2019 9. Enzimas

84/230

1/s-0.3 -0.2 -0.1 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6

1/v

0.00

0.01

0.02

0.03

0.04

0.05

0.06

0.07

-1/K m

-1/(K m

(1 + i/K i))

1/Vmax

Inhibidores

8/16/2019 9. Enzimas

85/230

COO-

CH2

CH2

COO-

FAD FADH2 COO

-

CH

CH

COO-

Succinato Fumarato

SDH

Succinato deshidrogenasa COO-

CH2

COO-

Malonato

COO-

C O

CH2

COO-

Oxalacetato

competitivos

8/16/2019 9. Enzimas

86/230

COO-

CH2

CH2

COO-

Succinato

COO-

C O

CH2

COO-

Oxalacetato

Inhibidores competitivos

como ánalogos estructuralesdel substrato

OO

8/16/2019 9. Enzimas

87/230

H2N S

O

NH2H2N C

O-

4-aminobencenosulfonamida

4-aminobenzoato

N NH2NH

8/16/2019 9. Enzimas

88/230

N

N

N

N

H2N

N

C NH

O

C H

COO-

CH2CH2

CO OH

CH3

n

Ác. Fólico

Methotrexate

NN

OH

N

C NH

O

C H

COO-

CH2

CH2

CO OH

H

n

8/16/2019 9. Enzimas

89/230

NH

HN

O

O

CH3

NH

HN

O

O

Br

Timina

5-Bromouracilo

Análogos de base

NH

8/16/2019 9. Enzimas

90/230

OHOCH2

OH

N

O

NH2

OH

OHOCH2

OH

N

O

NH2

OH

Citidina

Citosinaarabinósido

Análogos denucleósido

8/16/2019 9. Enzimas

91/230

Un paso más allá en el desarrollo de inhibidores potentes

es el concepto de Análogo de Estado de Transición (AET)

- El inhibidor no es estrictamente análogo del substrato,

sino del Estado de Transición de la reacción.

- La afinidad de las enzimas por los AET es enorme, delorden nM o pM, con lo que la fijación es tan fuerte que

puede considerarse irreversible

C

O

N+H3C

CH S bt t

8/16/2019 9. Enzimas

92/230

O2N OC

ON CH3

CH3

O2N OP

ON+

H3C

CH3

CH3

-O O-

Susbtrato

O2N OC

ON+

H3C

CH3

CH3

-O O-

Estado de transición

O2N OH + ON+

H3C

CH3

CH3

C

O

HO Productos

Análogo deestado de transición

8/16/2019 9. Enzimas

93/230

Substrato

Estado detransición

Análogo deestado de transición

Aspartato

8/16/2019 9. Enzimas

94/230

COO-

H2CNH

-OOCO

NH2

O-

PO O-

O-

PO O-

O-

CH2

COO-

H2C

NH-OOC

O

transcarbamilasa

Estado detransición

Análogo deestado de transición:

N-fosfonoacetil L-aspartato(PALA)

Angiotensinógeno

8/16/2019 9. Enzimas

95/230

Angiotensina IDRVYIHPFHL

Angiotensina IIDRVYIHPF

HL

Renina

Enzima convertidora

de Angiotensina, ECA

Hipotensión,

hipovolemia,

ortostatismo

Aumento de la presión arterial

Análogos de Estado de Transición: Captopril

8/16/2019 9. Enzimas

96/230

C O

HNCH COO-

R

C HR'NH

C-O C

HO

+

Zn2+

+

Zn2+

C O

NCH COO

-

CH3C H

CH-S

H

Estado de transiciónde la ECA

CaptoprilEnalapril

Ramipril

Inhibición Irreversible

8/16/2019 9. Enzimas

97/230

- Los inhibidores irreversibles reaccionan con un grupo

químico de la enzima, modificándola covalentemente

- Su acción no se describe por una constante de equilibrio K i,sino por una constante de velocidad k i:

E + I E’

- A diferencia de la inhibición reversible, el efecto de losinhibidores irreversibles depende del tiempo de actuación

del inhibidor.

- Los inhibidores irreversibles son, por lo general, altamentetóxicos.

Algunos tipos de inhibidores irreversibles

8/16/2019 9. Enzimas

98/230

Algunos tipos de inhibidores irreversibles

1. Reactivos de grupos -SH

2. Organofosfóricos

3. Ligandos de metales

4. Metales pesados

Reactivos de grupos -SH, 1

8/16/2019 9. Enzimas

99/230

(a) Agentes alquilantes

E SH E S CH2 COO-

ICH2 COO- IHYodoacetato

(b) Compuestos insaturados

N CH2 CH3

O

O

E SHE S

N CH2 CH3

O

O

N-Etil maleimida (NEM )

Reactivos de grupos -SH, 2

8/16/2019 9. Enzimas

100/230

g p

(c) Formadores de mercáptidos

HOHg COO-

E SH E S Hg COO-

p-Hidroximercuribenzoato

(d) Oxidantes

Promueven la oxidación de dos tioles a un disulfuro

Organofosfóricos

8/16/2019 9. Enzimas

101/230

CH CH2 OHSer

PF O

CH

CH

H3C CH3

CH3H3C

CH CH2 O P O

CH

CH

H3C CH

3

CH3H3C

Ser

DFP:

diisopropil

fluorofosfato

- Actúan sobre enzimas serínicas

- Únicamente sobre la Ser activa- Insecticidas: Parathion, Malathion- Inhibidores de la Acetilcolinesterasa- Neurogases

Ligandos de coordinación de metales

8/16/2019 9. Enzimas

102/230

Ligandos de coordinación de metales

Es el caso del ion cianuro, CN-

Se fija con gran afinidad a la sexta posición de coordinacióndel Fe hemínico, impidiendo toda modificación posterior.

Por ello actúa sobre sistemas de Fe hemínico con la sexta posición de coordinación libre, como la citocromo oxidasa,de lo que deriva su elevadísima toxicidad

Substratos suicidas

8/16/2019 9. Enzimas

103/230

Substratos suicidas

(Inhibidores activados enzimáticamente)

- Se trata de moléculas que se unen al centro activo de maneraespecífica, igual que el substrato o los inhibidores competitivos

- Una vez unidos al centro activo, la enzima transforma lamolécula en una especie química muy reactiva que modificacovalentemente a la enzima, inactivándola

- Tienen por tanto (a) la especificidad del inhibidor competitivoy (b) la potencia de los inhibidores irreversibles

Modo de acción de los inhibidores suicidas

8/16/2019 9. Enzimas

104/230

E + I EI EI* E’ + I*

Modo de acción de los inhibidores suicidas

1 2 3

1. El inhibidor se fija a la enzima igual que el substrato o uninhibidor competitivo convencional

2. La acción catalítica de la enzima convierte al inhibidor I

en una especie altamente reactiva I*

3. I* modifica covalentemente a la enzima, inactivándolade forma definitiva al igual que un inhibidor irreversible.

Ejemplos de inhibidores suicidas, 1

8/16/2019 9. Enzimas

105/230

- Sistema de la b-lactamasa bacteriana

La utilización masiva de antibióticos b-lactámicos (penicilinas,sus derivados semisintéticos y cefalosporinas) ha conducido ala aparición de resistencias a los mismos.

Los microorganismos resistentes a estos antibióticos lo son por producir una enzima, la b-lactamasa, que inactiva a los antibió-ticos b-lactámicos.

S

Penicilina (activa)

8/16/2019 9. Enzimas

106/230

R CO NH S

N

O

CH3

CH3

COO-

R CO NH S

HN

CH3

CH3

COO-

CO

O-

-Lactamasa

Ác.peniciloico (inactivo)

Muy a menudo los preparados de penicilinas o penicilinassemisintéticas se formulan añadiendo un inhibidor suicida

8/16/2019 9. Enzimas

107/230

semisintéticas se formulan añadiendo un inhibidor suicidade la b-lactamasa, el ácido clavulánico

O

N

OCOO-

C

CH2OH

H -Lactamasa

O

HN

COO-

C

CH2OH

H

C

O

O-

O

HN

COO-

C CH2OH

H

C

O

OCH2CH

Ser

Esta moléculareacciona con la

serina activa de la

b-lactamasa, produciendo suinactivación

Ác.clavulánico

Ejemplos de inhibidores suicidas, 2

8/16/2019 9. Enzimas

108/230

j p

- Sistema de la monoamino oxidasa (MAO) cerebral

Los estados depresivos, en general, están relacionados con undescenso en la concentración de neurotransmisores adrenérgicos(dopamina, noradrenalina, etc.) en determinadas regiones del

cerebro.

Una de las enzimas encargadas de la degradación de estosneurotransmisores es la monoamino oxidasa (EC 1.4.3.4).

Por tanto, la inhibición de la monoamino oxidasa se emplea comoterapéutica de los estados depresivos. Se han desarrollado muchosinhibidores suicidas de la MAO

HO

Noradrenalina

8/16/2019 9. Enzimas

109/230

HO CHOH CH2 NH2

O2 + H2O

NH3 + H2O2

HO

HO

CHOH CHO

Dihidroxifenilglicol

Monoamino

oxidasa

La MAO es una flavoproteína:tiene un grupo prostéticoflavínico (FAD) fundamental

para la catálisis. Los inhibidoressuicidas de la MAO inactivanal cofactor FAD.

NH3C

O N,N’ dimetil

8/16/2019 9. Enzimas

110/230

HC C CH N+CH3

CH3

N

NNH

N

H3C

H2C OSE

R

N

NNH

NH

H3C

H2C

O

OSE

R

CH

CHCHN+

H3C

H3C

Flavina

Flavina modificada

propargilamina(pargilina)

Inhibición suicida de laMAO mediante Pargilina

Selegilina

(antiparkinsoniano

y antidepresivo)

8/16/2019 9. Enzimas

111/230

Cofactores enzimáticos (Coenzimas)


8/16/2019 9. Enzimas

112/230


Átomo, ion o molécula que participa en el procesocatalítico sin ser enzima ni substrato.

Los cofactores participan de dos maneras distintas:

1. A través de una fijación muy fuerte a la proteína y salensin ser modificados del ciclo catalítico

2. Como un segundo substrato; salen modificados del ciclocatalítico y por lo general requieren otra enzima para volveral estado original.

8/16/2019 9. Enzimas

113/230

Los cofactores enzimáticos suelen ser moléculas complejas,que nuestro organismo no puede sintetizar, por lo general.

Por esa razón muchos cofactores enzimáticos deben ser, en

todo en parte, ingresados con la dieta; muchos de ellos son, porlo tanto, vitaminas.

Ni todos los cofactores son vitamínicos ni todas las vitaminasson cofactores enzimáticos

Cofactores de naturaleza vitamínica; ejemplos

8/16/2019 9. Enzimas

114/230

1. Hidrosolubles

Tiamina Tiamina pirofosfato B1 Riboflavina Flavinas: FAD, FMN B2 Piridoxal Piridoxal fosfato B6 Cobalamina Coenzimas cobamídicos B12 Ác.Ascórbico Ac. Ascórbico C

Nicotinamida NAD+, NADP+ PPÁc.Lipoico LipoamidaÁc.Fólico Coenzimas folínicosÁc.Pantoténico Panteteínas (CoA, p.e.)

2. Liposolubles Naftoquinonas g-Carboxilación K

8/16/2019 9. Enzimas

115/230

Cofactores de naturaleza no vitamínica: ejemplos

Hemo Hemoenzimas, citocromosComplejos Fe-S Ferredoxinas

Quinonas Tr.electrónico mitocondrial y fotosintéticoGlutatión Redox; transporte de aminoácidosATP Transf.de fosfato y/o de energíaUTP Transf.de grupos glicosídicosPAPS Transf.de grupos sulfato

S-AM Transf.de grupos metiloCarnitina Transportador de grupos acil-

8/16/2019 9. Enzimas

116/230

Vitaminas que no forman parte de cofactores enzimáticos

Liposolubles

Retinoides vit. ACalciferoles vit. DTocoferoles vit. E

Cofactores redox

8/16/2019 9. Enzimas

117/230

Cofactores redox

Operan en procesos de transferencia electrónica, a vecescomo aceptores, a veces como donadores.

- Cofactores piridínicos (NAD+, NADP+)

- Cofactores flavínicos- Cofactores hemínicos- Ferredoxinas- Quinonas

- Ác. Ascórbico- Ác. Lipoico- Glutatión

OON

N

NH2

N

CONH2

+

8/16/2019 9. Enzimas

118/230

O

O

H

H

OH

H

OH

CH2

H

OP

O-

OP

O-

OCH2 NN

NOH OH

N

O

O

H

H

O

H

OH

CH2

H

OP

O

O-

OP

O

O-

OCH2 N

N

N

N

NH2

OH OH

N

CONH2

P O-O

O-

+

Nicotinamida - Ribosa - P - P - Ribosa - Adenina

NAD+

NADP+

NAD+, NADP+ NADH, NADPH

8/16/2019 9. Enzimas

119/230

N

CONH2

N

H HCONH2

AH2 A + H+

(Formas oxidadas) (Formas reducidas)

AH2 + NAD(P)+ A + NAD(P)H + H+

8/16/2019 9. Enzimas

120/230

NH C

O

8/16/2019 9. Enzimas

121/230

O

H

H

OH

H

OH

CH2

H

OP

O

O-

OP

O

O-

O N

N

N

N

NH2

CH2

C

C

C

CH2

OHH

OHH

OHH

N

NNH

N

H3C

H3C O

FAD: Flavin Adenin Dinucleótido

NNH

H3C

O

8/16/2019 9. Enzimas

122/230

N

NH

N

3

H3C O

N

NNH

NH

H3C

H3C

O

O

N

NH

NH

NH

H3C

H3C

O

O

Forma oxidada

Semiquinona

(Radical libre)

Forma reducida

CH2

8/16/2019 9. Enzimas

123/230

NN Fe++

H3C

CH2

CH3

CH CH2CH2-

OOC N

CH3H2C

CH2

COO-

N

H3C CH

Citocromos

8/16/2019 9. Enzimas

124/230

Son proteínas de tamaño pequeño, que operan como

transportadores monoelectrónicos debido a una transición

Fe2+ Fe3+

Se distinguen tres tipos:

1. Citocromos A: Alto potencial redox (transportadores terminales)2. Citocromos B: Bajo potencial redox

3. Citocromos C: Potencial redox intermedio

(Se distinguen por su espectro característico de absorción)

8/16/2019 9. Enzimas

125/230

Citocromo c

8/16/2019 9. Enzimas

126/230

Cofactores quinónicos

8/16/2019 9. Enzimas

127/230

O

O

OH

OH

AH2 A

QuinonaHidroquinona

8/16/2019 9. Enzimas

128/230

O

O

CH3O

OCH3

CH3

CH3 n

Ubiquinona (Coenzima Q)

8/16/2019 9. Enzimas

129/230

OO

OHHO

CH2C

HO

HOH OO

OO

CH2C

HO

HOH

Ácido Ascórbico(vit. C)

A AH2

S S

COOH

Á

8/16/2019 9. Enzimas

130/230

S S

S S

CONH

CH Lys

CO NH CH

SH SH

Lys

AH2

A

Lipoamida

Dihidrolipoamida

Ác. Lipoico

Glutatión: g-Glu-Cys-Gly(forma reducida, GSH)

g-Glu-Cys-Gly

8/16/2019 9. Enzimas

131/230

COO-

C+H3N H

CH2

CH2

CO NH CH

CH2

SH

CO NH CH2 COOH

COO-

CH3N H

CH2

CH2

CO NH CH CO NH CH2 COO-

CH2

S

COO-

C+H3N H

CH2

CH2

CO NH CH

CH2S

CO NH CH2 COO-

S

Sg-Glu-Cys-Gly

Glutatión:forma oxidada, GSSG

2GSH + A GSSG + AH2

H3C

CH2 CH2OH

8/16/2019 9. Enzimas

132/230

N

N

H3C

CH2 N+ S

H3C

CH2 CH2 O P O P O-

O-O-

O O

Tiamina pirofosfato, TPP

N

N

H3C

CH2 N+

S

H3C

Tiamina (vit. B1)

CHO

8/16/2019 9. Enzimas

133/230

N

OH

CH3

HOH2C

N CH3

HOH2C

CHO

O P

O

O-

O-

Piridoxal (vit. B6)

Piridoxal fosfato

8/16/2019 9. Enzimas

134/230

N CH3

HOH2C

CHO

O P

O

O-

O

-

N CH3

HOH2C

CH2NH2

O P

O

O-

O-

Piridoxal fosfato Piridoxamina fosfato

Pteridina

8/16/2019 9. Enzimas

135/230

N

N

N

N

OH

H2N

N

C NH

O

C H

COO-

CH2

CH2

CO OH

H

n

Ác. Fólico

4-amino benzoico

Poliglutamato

N

N

N

N

H2N

NCO OH

H

8/16/2019 9. Enzimas

136/230

OH

C NH

O

C H

COO-

CH2

CH2

n

N

N

N

NH

OH

H2N

N

C NH

O

C H

COO-

CH2

CH2

CO OH

H

n

N

N

NH

NH

OH

H2N

N

C NH

O

C H

COO-

CH2

CH2

CO OH

H

n

Folato

reductasa

DHF Reductasa

Ác. Fólico

Ác.Dihidrofólico, DHF

Ác.Tetrahidrofólico, THFMethotrexate

N

N

NH

N

H2N

8/16/2019 9. Enzimas

137/230

N

OH H2C N

C NH

O

C H

COO-

CH2

CH2

CO OH

n

N

N

NH

N

OH

H2N

N

C NH

O

C H

COO-

CH2

CH2

CO

H

OH

COH

n

N5,N10 Metilen THF

N5 Formil THF

HH3C

CH3

CH2CONH2H

CH2CH2CONH2

8/16/2019 9. Enzimas

138/230

Cobalamina(vit. B12)

NH2COCH2CH2

HH

H CH2OHOH

H

CH3

CH3

H3C CH

CH2

NH

CO

CH2

CH2

NC

H3C

H

HCH3NH2COCH2

H3C

NH2COCH2

CH3

H

CH2CH2CONH2

CH3

CH3

CH2CH2CONH2

NN

NN

N

O

O

OP

O

O

N

Co+

NHHN Biotina

8/16/2019 9. Enzimas

139/230

NHHN

S COOH

NHN

S COOH

C

O

HO

CO2

Biotina

Carboxibiotina

8/16/2019 9. Enzimas

140/230

NHHN

S CONH

CH

CO

HNCH

OC

R

NHOC

CH

HN

R'Biotinil- proteína

Lys

Ác. Pantoico b-Alanina

8/16/2019 9. Enzimas

141/230

CH2OH C

CH3

CH3CHOH CO NH CH2 CH2 COOH

CH2OH C

CH3

CH3

CHOH CO NH CH2 CH2 CO NH CH2 CH2 SH

Ác. Pantoténico

Ác. Pantoténico Cisteamina

Panteteína

ADPPanteteína

8/16/2019 9. Enzimas

142/230

O

H

H

OH

H

OH

CH2

H

N

NN

N

NH2

OP

O

O-

OP

O

O-

O

H3C CH3

HO H

CN

CN

HS

O

H

O

H

ADP

Coenzima A

ON

N

NH2

O

8/16/2019 9. Enzimas

143/230

O

HH

OH

H

O

CH2

H

OP

O-

O NN

N

S

O

-O

P O

O-

-O

3’- Fosfoadenil 5’- Fosfosulfato

(PAPS)

CH3

8/16/2019 9. Enzimas

144/230

CH3 N

C 3

CH3

CH2 CHOH CH2 COOH

Carnitina

NH2

8/16/2019 9. Enzimas

145/230

O

H

H

OH

H

OH

CH2

H

OP

O

O-

OP

O

O-

O N

N

N

N

NH2

P

O

-O

O-

5’- Adenosina trifosfato (ATP)

8/16/2019 9. Enzimas

146/230

El Centro Activo Enzimático

- La evidencia cinética lleva a concluir que las enzimas

8/16/2019 9. Enzimas

147/230

funcionan a través de la formación de un complejo ES

- El complejo ES es estequiométrico: existe una relaciónentera entre número de moléculas de enzima y número demoléculas de substrato (1:1, 1:2, etc)

-La fijación de S a E es estereoquímicamente específica, y S puede ser desplazado de su fijación por análogos estructurales(inhibidores competitivos)

-De todo lo cual se deduce que el substrato se fija a una regiónespecífica de la molécula enzimática, llamada Centro Activo

Pruebas experimentales de la existencia del Centro Activo, 1

8/16/2019 9. Enzimas

148/230

1. Formación de complejo ES evidenciable cinéticamente

2. Presencia de grupos prostéticos que participan en la catálisis

3. Fenómeno de la inhibición competitiva y efecto de los análogosde estado de transición

4. Efecto de inhibidores irreversibles:

- Organofosfóricos sólo reaccionan con Serina “activa” - Clorometilcetonas sólo reaccionan con Histidina “activa”

Pruebas experimentales de la existencia del Centro Activo, 2

8/16/2019 9. Enzimas

149/230

5. Estudios filogenéticos en secuencias de aminoácidos en enzimas

Tripsina CQGDSGGPV

Quimotripsina CMGDSGGPLElastasa CQGDSGGPL

Trombina CEGDSGGPF

Plasmina CQGDSGGSW

Pr. Sorangium GRGDSGGST

Pr. St.griseus CQGDSGGPV

8/16/2019 9. Enzimas

150/230

8/16/2019 9. Enzimas

151/230

8/16/2019 9. Enzimas

152/230

Número de centros activos

1. Estudios de fijación de ligandos2. Número de grupos prostéticos3. Reactivos específicos de centro activo (Organofosfóricos)4. Titulación directa del centros activos

E t di d fij ió d li d

8/16/2019 9. Enzimas

153/230

Estudio de fijación de ligandos

Consisten en incubar la enzima con un análogo del substratodebidamente marcado (radioactivo, fluorescente, etc.), a dife-Rentes concentraciones de ligando.

Ligando libre y ligando unido pueden separarse por:

- Diálisis de equilibrio- Ultrafiltración- Cromatografía de exclusión en gel.

Aminoácidos presentes en el centro activo de enzimas

8/16/2019 9. Enzimas

154/230

- Serina: enzimas inhibidas por organofosfóricos- Histidina: enzimas inhibidas por clorometilcetonas- Cisteína: enzimas inhibidas por reactivos – SH

- Lisina: enzimas que forman bases de Schiff- Aspartato y Glutamato: dependencia de pH

Mecanismos de acción enzimática, 1

8/16/2019 9. Enzimas

155/230

1. Efectos de proximidad y orientación

Las enzimas logran en su centro activo una concentraciónlocal de reactivos mucho mayor que cuando éstos están

en solución (efecto de proximidad)

Además, la fijación al centro activo se hace en la orienta-ción correcta (efecto de orientación)

Colisionesno productivas

8/16/2019 9. Enzimas

156/230

Colisión productiva

En la superficie de la enzima,los reactivos se encuentranen la orientación correcta y auna concentración local muchomayor que en solución

Mecanismos de acción enzimática 2

8/16/2019 9. Enzimas

157/230

Mecanismos de acción enzimática, 2

2. Catálisis general ácido-base

3. Formación de intermediarios covalentes

4. Otros efectos (efectos cuánticos, por ejemplo)

Mecanismo de la ribonucleasa pancreática, 1

8/16/2019 9. Enzimas

158/230

O

O

PO CH2

O

O

P

O CH2

O

O

P

O CH2

OH

OH

OH

B

Py

B

O

O

O

O-

O-

O-

HN NH+

:N NHNH3

+

His 12

His 119

Lys 41

O

O

O

O

P

O CH2

OH

O

B

PyO

O-

PO

O

O

O

PO CH2

CH2

OH

B

O

O-

H

HN N:

HN NHNH3

+

His 12

His 119

Lys 41+

Mecanismo de la ribonucleasa pancreática, 2

8/16/2019 9. Enzimas

159/230

O

O

O

P

O CH2

OH

B

PyO

O-

O OP

-O O

HN N:

HN NHNH3

+

His 12

His 119

Lys 41

O

O

PO CH2

HOCH2

OH

B

O

O-

+

H

OH

O

O

O

PO CH2

OH

B

PyO

O-

HO O

P O-

O

O-

HN NH+

:N NHNH3

+

His 12

His 119

Lys 41

O

O

PO CH2

HOCH2

OH

B

O

O-

Mecanismo de las serinproteinasas

8/16/2019 9. Enzimas

160/230

CH2

OH

CH

Ser

:N NH

CH2

CH His

C-O O

CH

R C NH R'

O

Asp

CH2

O-

CH

Ser

HN NH

CH2

CH His

C

-O O

CH

R C NH R'

O

+

Asp

1 2


8/16/2019 9. Enzimas

161/230

Ser

HN NH

CH2

CH His

C

-O O

CH

R C NH R'

CH2

O

CH

O-

+

Asp

Ser

:N NH

CH2

CH His

C

-O O

CH

CH2

O

CH

C

O

R NH2 R'

Asp

3 4


8/16/2019 9. Enzimas

162/230

Ser

:N NH

CH2

CH His

C

-

O O

CH

CH2

O

CH

C

O

R

Asp

OHH

Ser

HN NH

CH2

CH His

C-O O

CH

CH2

O

CH

C

O

R

Asp

H

-

O

+

65


8/16/2019 9. Enzimas

163/230

Ser

HN NH

CH2

CH His

C

-

O O

CH

CH2

O-

CH

Asp

+

R C

O

OH

Ser

:N NH

CH2

CH His

C

-

O O

CH

CH2

OH

CH

Asp

87

8/16/2019 9. Enzimas

164/230

His 57Asp 102

Ser 195

Configuración en el centroactivo de la Quimotripsina,con un inhibidor

8/16/2019 9. Enzimas

165/230

Regulación de la actividad enzimática, 1

Regulación de la actividad enzimática

8/16/2019 9. Enzimas

166/230

v =k +2e0 s

K m + s

I. Sobre e0: Regulación de la concentración enzimática

II. Sobre K m y k +2: Regulación de la actividad intrínsecade la enzima

1. Regulación alostérica2. Regulación por modificación covalente

=Vmax s

K m + s

Regulación alostérica

8/16/2019 9. Enzimas

167/230

Procesos a nivel celular; regulación de ajuste finode la actividad enzimática, a través de efectos deretroalimentación (negativa o positiva)

Regulación por modificación covalente

Procesos a nivel supracelular (orgánico); regulacióna gran escala de actividades enzimáticas, a través demodificación covalente de enzimas, provocadas porseñales (transducción de señales)

Retroalimentación negativa en vías metabólicas, 1

8/16/2019 9. Enzimas

168/230

Thr a-cetobutirato IleTreonina

desaminasa

Síntesis de Isoleucina

El producto final de la ruta, Isoleucina, inhibe a la primeraenzima de la misma, Treonina desaminasa

Retroalimentación negativa en vías metabólicas

Síntesis de pirimidinas

8/16/2019 9. Enzimas

169/230

Asp + CP Carbamil aspartato CTP

Síntesis de pirimidinas

ATCasa

El producto final de la vía, CTP (citidin trifosfato) inhibe a la

primera enzima de la ruta metabólica, Aspartato transcarbamilasa

Al mismo tiempo, dicha enzima puede ser activada por ATP

ATP+

Rutas metabólicas controladas por retroalimentación

8/16/2019 9. Enzimas

170/230

Glicolisis Fosfofructokinasa ATP Neoglucogénesis FBP fosfatasa AMP

Bios. Ács. Grasos AcetilCoA carboxilasa AcilCoABios. Colesterol HMGCoA reductasa ColesterolBios. Purinas PRPP sintetasa AMP,GMP,IMP

Ruta Enzima Inhibidor

En el estudio de las enzimas controladas por realimentaciónnegativa, se comprobaron una serie de regularidades en las mismas:

8/16/2019 9. Enzimas

171/230

negativa, se comprobaron una serie de regularidades en las mismas:

1. Primer paso de una ruta metabólica o punto de ramificación2. Enzimas de naturaleza compleja: subunidades; la enzima puede

desensibilizarse a sus inhibidores por diversos métodos.3. Los inhibidores se comportan como competitivos (elevan el valor

de la K m aparente, pero sin embargo no son análogos estructuralesdel substrato

Estas últimas características lleva al concepto de alosterismo:

Una acción sobre la actividad enzimática que se desarrollafuera del Centro Activo (Jacob y Monod, 1960)

8/16/2019 9. Enzimas

172/230

Otra característica importante de las enzimas alostéricast i éti ó l l t

8/16/2019 9. Enzimas

173/230

es que presentan cinéticas anómalas, normalmente

cinéticas sigmoides:

v

s

La presencia de unasigmoide implicala existencia decooperatividad en la

fijación del substrato

La cooperatividad (positiva) consiste en que la fijación de unamolécula de substrato favorece la fijación del siguiente y así

8/16/2019 9. Enzimas

174/230

molécula de substrato favorece la fijación del siguiente, y así

hasta ocuparse toda la molécula

s s s ss s

s

s

s s

+ + +

1 2 3

En términos de Km veríamos que K m1 > K m2 > K m3

Existe también cooperatividad negativa, cuando la fijación deuna molécula de substrato dificulta la fijación del siguiente.

El comportamiento cooperativo implica:

8/16/2019 9. Enzimas

175/230

1. Que hay más de un sitio de fijación de substrato por molécula de enzima (estr.cuaternaria)

2. Que hay interacciones entre los sitios de fijación

Un sistema alostérico clásico es la Hemoglobina:

8/16/2019 9. Enzimas

176/230

1. La fijación de su “substrato”, O2, es de tipo sigmoide

2. La fijación del “substrato” puede inhibirse por efectores (H+, CO2, 2,3-BPG) que no actúan sobre el “Centro Ac-

tivo” (grupo hemo)

3. Las subunidades, por separado, presentan cinéticamichaeliana en la fijación de O2

Cinéticas michaeliana y sigmoide:Mioglobina y Hemoglobina

1.0

8/16/2019 9. Enzimas

177/230

s

0 2 4 6 8 10 12

Y

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8 Mioglobina

Hemoglobina

Efecto del pH sobre la saturación de la hemoglobina

100

(Efecto Bohr)

8/16/2019 9. Enzimas

178/230

PO2, mmHg

0 20 40 60 80 100

SaturacióndeO2,%

0

20

40

60

80

100

pH 7.4 pH 7.0

pH 6.6

Efecto del 2,3-bisfosfoglicerato (2,3-BPG)sobre la saturación de la hemoglobina

8/16/2019 9. Enzimas

179/230

PO2, mmHg

0 20 40 60 80 100

Saturación

deO2,%

0

20

40

60

80

100

0 0.1 mM

1 mM

Inhibidores y activadoresalostéricos

1 0

8/16/2019 9. Enzimas

180/230

s

0 2 4 6 8 10 12

Y

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

(+ Inhibidor)

(+ Activador)

(sin efectores)

V+

V0

V-

Los efectores alostéricos operan sobre el grado dei id d d l i

8/16/2019 9. Enzimas

181/230

cooperatividad del sistema:

- Los inhibidores alostéricos aumentan el grado decooperatividad

- Los activadores alostéricos disminuyen el grado decooperatividad; a concentraciones elevadas de activador,la cinética pasa a ser michaeliana, y deja de ser sigmoide.

Ecuación de Hill

h > 1 cooperatividad positiva

8/16/2019 9. Enzimas

182/230

y Ks Ks

h

h

_

1

Obsérvese que para h=1, esta ecuación se reduce a una formanormalizada de la ecuación de Michaelis-Menten:

h > 1, cooperatividad positiva

h = 1, no hay cooperatividad

h < 1, cooperatividad negativa

yv

V

k x

k e

s

K s

K s

K s

K s

K smx m

m

m

a

a

_

2

2 0

1

1 1 1

Forma RModelo MWC

8/16/2019 9. Enzimas

183/230

ss s s s ss s ss

L

ii i i i i

i i i

i

Forma T

n _

a a 11

8/16/2019 9. Enzimas

184/230

y

Ln

a 1

: Concentración normalizada de substrato, s/K m

L: Constante alostérica: a mayor valor de L, mayorgrado de cooperatividad (positiva)

n: Número de sitios de fijación de substrato

8/16/2019 9. Enzimas

185/230

Regulación de la actividad enzimática, 2

8/16/2019 9. Enzimas

186/230

Suele haber fenómenos de modificación covalente deenzimas en la respuesta celular a señales químicas:

1. Neurotransmisores2. Hormonas

3. Factores de crecimiento4. Estímulos morfogenéticos y de diferenciación5. Muerte celular programada (apoptosis)6. Estímulos antigénicos

7. Luz y otros agentes físico-químicos

Formas de modificación covalente, 1

Fosforilación: Protein kinasas

8/16/2019 9. Enzimas

187/230

Sobre residuos de Ser, Thr y Tyr

Ser

ATP ADP

Ser

C

N

C

CN

C

C

N

CH2OH

O

H

R

H

O

R'

H

H

H

H

C

N

C

CN

C

C

N

CH2O

O

H

R

H

O

R'

H

P O

-

O

O-

H

H

H


Defosforilación: Protein fosfatasas

8/16/2019 9. Enzimas

188/230

Sobre residuos previamente fosforilados: Ser-P, Thr-P, Tyr-P

Ser Ser

C

N

C

CN

C

C

N

CH2OH

O

H

R

H

O

R'

H

H

H

H

C

N

C

CN

C

C

N

CH2O

O

H

R

H

O

R'

H

P O-

O

O-

H

H

H

H2O Pi


Adenilación: Sistema de la Glutamina sintetasa

8/16/2019 9. Enzimas

189/230

Tyr O

OH OH

N

N N

N

H2NC

N

C

C

N

C

C

N

O

H

R

H

O

R'

H

CH2 O P

O

O-O CH2

H

H

H

8/16/2019 9. Enzimas

190/230


8/16/2019 9. Enzimas

191/230

Rotura proteolítica:

Proteinasaespecífica

+

N C

N N CC

Zimógeno

Enzima activada

La mayoría de las señales químicas operan sobre un

Concepto de Segundo Mensajero

8/16/2019 9. Enzimas

192/230

receptor situado en la parte externa de la membrana.Al operar sobre este receptor determinan la aparición en elinterior celular de un segundo mensajero, que desencadenala respuesta celular a la señal.

Algunos segundos mensajeros:

- Nucleótidos cíclicos: cAMP, cGMP

- Ca++- Diacilglicerol- Inositolfosfatos- Óxido nítrico, etc.

E II E

8/16/2019 9. Enzimas

193/230

R R

Efector

E I

X

P

I E

OH

HOH

HH

CH2OH

OHO

OH

HOH

HH

CH2OH

O

OH

HOH

HH

CH2OH

O ....

Glucógeno (n)

8/16/2019 9. Enzimas

194/230

OHH

O

OHH

O

OHH

O

+

OH

H

OH

OH

H

HH

CH2OH

HO O P

O

O-

O-

OH

H

OH

OH

H

HH

CH2OH

OOH

OH

H

OH

OH

H

HH

CH2OH

O ....

Pi

Glucógeno (n-1)Glucosa-1-fosfato

Glucógeno fosforilasa

8/16/2019 9. Enzimas

195/230

Subunidad de la glucógeno fosforilasa

8/16/2019 9. Enzimas

196/230

OCH2 N

N

N

N

NH2

OPOPOP-O

O O O

OOO

8/16/2019 9. Enzimas

197/230

OHOH

O-O-O-

O N

N

N

N

NH2

OHO

P O

O

-O

ATP

cAMP

Adenilato

ciclasa

Formación de cAMPa partir de ATP

+Proteínas G

8/16/2019 9. Enzimas

198/230

8/16/2019 9. Enzimas

199/230

RL Ga AC cAMP PKA FK F

N

NN

NH2

8/16/2019 9. Enzimas

200/230

O N N

OH

O

P O

O

-O

OCH2 N

N

N

N

NH2

OHOH

OP-O

O

O-

cAMP

fosfodiesterasa

Metilxantinas(p.e. cafeína)

-

cAMP

8/16/2019 9. Enzimas

201/230

Protein kinasa A

GlucógenoFosforilasa

Proteinfosfatasas

cAMP

fosfodiesterasa

Glucógenosintetasa

- +

+ -

-

Protein kinasas

8/16/2019 9. Enzimas

202/230

1. Protein kinasas A (Activadas por cAMP)

2. Protein kinasas G (Activadas por cGMP)

3. Protein kinasas A (Activadas por DAG)

4. Protein kinasas dependientes de Ca++-Calmodulina

5. Protein tirosin kinasas (Factores de crecimiento, etc.)

8/16/2019 9. Enzimas

203/230

Activaciones proteolíticas

N

C

Pepsinógeno

8/16/2019 9. Enzimas

204/230

C

N pH < 5

Pepsina

Activación del

pepsinógeno

Protrombina (II)

Precursores,vía intrínseca

8/16/2019 9. Enzimas

205/230

Fibrinógeno (I)Monómero

de fibrina (Ia)Polímerode fibrina

Trombina (IIa)

Protrombinasa

Precursores,vía extrínseca

Fase 1Fase 2

Fase 3

Vía extrínseca

8/16/2019 9. Enzimas

206/230

VII VIIa

X Xa

V VaCa++

Complejo

protrombinasa

XII XII

8/16/2019 9. Enzimas

207/230

XII XIIa

XI XIa

IX IXa

VIII VIIIa

X Xa

V Va

Complejo

protrombinasa

Vía intrínseca

Ca++

Ca++Trombina

+

S

S

VaXa

Ca++Complejo

protrombinasa

Protrombina

8/16/2019 9. Enzimas

208/230

S

PLP

protrombinasa

S

S H

L

Trombina

8/16/2019 9. Enzimas

209/230

8/16/2019 9. Enzimas

210/230

- + - Monómero de fibrina

8/16/2019 9. Enzimas

211/230

- + -+ -

- + -

- +- + -- + -- + -- + - - ++ -

-

-

- + -+ -

- + -- +

- + -- + -

- + -

- + - - ++ - -

-

Fibrina (Unión no covalente)

CHNH2

HOOCCHLys

Glu

8/16/2019 9. Enzimas

212/230

NH2 Glu

CH NH

OC

CHLys

Glu

Factor XIII

(estabilizadorde la fibrina)

Formación deenlaces covalentesen la fibrina

8/16/2019 9. Enzimas

213/230

Enzimas en Medicina

Biotecnología enzimática

Enzimas en el diagnóstico clínico

8/16/2019 9. Enzimas

214/230

Existe en el suero sanguíneo una gran cantidad deactividades enzimáticas. De la relación

Vmax = k +2 e0

Se deduce que la medida en suero de la actividadenzimática es una medida directa de la concentraciónde enzima en dicho medio.

Alteraciones de la concentración enzimática en suero, 1

8/16/2019 9. Enzimas

215/230

1. Aumentos de la actividad enzimática

(a). Incremento patológico de la permeabilidad de membrana

(b). Muerte y destrucción celular

(c). Inducción enzimática

(d). Proliferación celular

Alteraciones de la concentración enzimática en suero, 2

8/16/2019 9. Enzimas

216/230

2. Disminuciones de la actividad enzimática

(a). Intoxicaciones

(b). Enfermedades crónicas

(c). Alteraciones del estado nutritivo

Algunas enzimas con interés diagnóstico

8/16/2019 9. Enzimas

217/230

1. Aminotransferasas2. Creatin kinasa3. Fosfatasa alcalina4. a-Amilasa5. Fosfatasa ácida6. Lactato deshidrogenasa7. g-Glutamil transferasa8. Seudocolinesterasa

Aminotransferasas (Transaminasas)

Catalizan la interconversión reversible de aminoácidosy cetoácidos Utilizan piridoxal fosfato como cofactor

8/16/2019 9. Enzimas

218/230

COOH

CHH2N

R1

+

COOH

C O

R2

COOH

CHH2N

R2

COOH

C O

R1

+

y cetoácidos. Utilizan piridoxal fosfato como cofactor

Su papel es importantísimo en el metabolismo deaminoácidos. En clínica se determinan las siguientes:

EC 2.6.1.1, Aspartato aminotransferasa (AST, GOT)EC 2.6.1.2, Alanina aminotransferasa (ALT, GPT)

COO- COO-

Aspartato aminotransferasa, EC 2.6.1.1 (AST, GOT)

8/16/2019 9. Enzimas

219/230

COO-

CH+H3N

CH2

COO-

+

COO

C O

CH2

CH2

COO-

COO-

C

CH2

COO-

O

COO

CH

CH2

CH2

COO

-

+H3N

+

Aspartato a-Cetoglutarato Oxalacetato Glutamato

Aparece en citosol y mitocondrias de tejidos metabólicamentemuy activos. Su nivel se eleva en el suero ante afeccioneshepáticas y miocárdicas.

8/16/2019 9. Enzimas

220/230

Creatin kinasa, EC 2.7.3.2 (CK, CPK)

8/16/2019 9. Enzimas

221/230

CH3N CH2 COOH

CHNNH2

ATP ADP CH3

N CH2 COCHN

NH2

O P O-

O-

O

CreatinaCreatin fosfato

Creatin fosfato es una forma de almacenamiento de enlacesricos en energía en el tejido muscular. Es el prototipo de los

compuestos conocidos como fosfágenos.

8/16/2019 9. Enzimas

222/230

Fosfatasa alcalina, EC 3.1.3.1

8/16/2019 9. Enzimas

223/230

R O P

O

O-

O-

+ H2O R OH + HO P O-

O

O-

Hidroliza con baja especificidad fosfomonoésteres, a un pHalto (de ahí el nombre). No se conoce con certeza cuál essu función metabólica. Aparece en gran cantidad de tejidos.

La fosfatasa alcalina presenta varias isoenzimas:

- Ósea

8/16/2019 9. Enzimas

224/230

- Hepática- Intestinal- Placentaria

Las más importantes son las dos primeras. Se pueden distinguir por su termoestabilidad, siendo la ósea más termolábil.

Ósea: Propia del tejido óseo en crecimiento y de enfermedadesque cursan con neoformación ósea

Hepática: Propia de las células del árbol biliar: se eleva en lascolestasis (obstrucciones biliares) asociada a partículasde elevado peso molecular

g-Glutamil transferasa, EC 2.3.2.2 (GGT)

GSH + aa g-Glu-aa + Cys-Gly

8/16/2019 9. Enzimas

225/230

g Cys Gly

Tiene un importante papel en el transporte de aminoácidosa través de membranas. Aparece, como la fosfatasa alcalina,

en obstrucciones biliares asociada a fracciones de alto pesoçmolecular.

Es una enzima inducible, y su concentración en suero aumenta

con xenobióticos (alcohol, drogas, etc.)

a-Amilasa, EC 3.2.1.1

8/16/2019 9. Enzimas

226/230

Es una enzima producida por las glándulas salivales y el páncreas.

Es un marcador muy importante de afecciones pancreáticas

agudas (pancreatitis). Puede incluso aparecer en la orina, debidoa su bajo peso molecular (amilasuria)

Fosfatasa ácida, EC 3.1.3.2

8/16/2019 9. Enzimas

227/230

R O P

O

O-

O-

+ H2O R OH + HO P O-

O

O-

Hidroliza fosfomonoésteres con baja especificidad. Presentavarias isoenzimas, una de las cuales (Fosfatasa ácida prostática)es un marcador muy fiable del cáncer de próstata y que se emplea

en el diagnóstico precoz del mismo.

Adagen (adenosine deaminase) Enzon, Inc.

Enzimas en Terapéutica: producidas por recombinación

8/16/2019 9. Enzimas

228/230

g ( ) ,

Autorizado su uso pediátrico en inmunodeficienciascongénitas.

Ceredase (alglucerase) Genzyme Corp.Autorizado su empleo en enfermedad de Gaucher tipo 1

Cerezyme (imiglucerase) Genzyme Corp.Autorizado su empleo en enfermedad de Gaucher tipo 1

Pulmozyme (Dnase) Genentech, Inc.Autorizado su empleo en fibrosis quística

Activase (recombinant alteplase) Genentech, Inc.Autorizado en infarto de miocardio y embolia pulmonar

8/16/2019 9. Enzimas

229/230

Biosensores

8/16/2019 9. Enzimas

230/230

Producto Membrana semipermeable

Memb rana de Teflon

Cáto do

Anodo

Esquema de un biosensor de glucosa

9. Enzimas

Documents

Transcript of 9. Enzimas