97313408 Manual de Toxicologia Facultad de Quimica ORIGINAL

Laboratorio de Toxicologa 2010-I

PROGRAMADEAPOYOAPROYECTOSPARALAINNOVACINYMEJORAMIENTODELAENSEANZA

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTNOMA DE MXICO

FACULTAD DE QUMICA

DEPARTAMENTO DE FARMACIA

Manual de guiones experimentales para la enseanza y

aprendizaje del laboratorio de Toxicologa (clave 1614)

Mara Elena Bravo Gmez Jorge Cornejo Garrido Francisco Hernndez Luis Juan Francisco Palacios Espinosa Araceli Prez Vzquez Francisco Snchez Bartez

Perla Carolina Castaeda Lpez Manuel Gutirrez Aguilar Bernardo Lucas Florentino Carlos Prez Muoz Alejandra Quijano Mateos

Facultad de Qumica, UNAM Mxico, D.F. 2009



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NDICE

Pgina PRLOGO

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REGLAMENTO DE HIGIENE Y SEGURIDAD PARA LOS LABORATORIOS DE LA FACULTAD DE QUMICA

6

REGLAMENTO DE HIGIENE Y SEGURIDAD PARA LOS LABORATORIOS DEL DEPARTAMENTO DE FARMACIA

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REPORTE DE SEGURIDAD E HIGIENE 9

EXTRACCIN Y CUANTIFICACIN DE TXICOS NO VOLATILES EN UNA MUESTRA PROBLEMA

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CUANTIFICACIN DE CIANURO DE HIDRGENO, COMO TXICO VOLTIL, A PARTIR DE GLUCSIDOS CIANOGNICOS

22

PRODUCCION DE METAHEMOGLOBINA POR NITRITOS Y EFECTO PROTECTOR DEL AZUL DE METILENO IN VIVO

31

DETERMINACIN DE MALATIN RESIDUAL

39

DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE DE LA QUERCETINA Y EL CIDO NORDIHIDROGUAYARTICO

47

EVALUACIN DE LA ACTIVIDAD GENOTXICA DE LA CICLOFOSFAMIDA UTILIZANDO LA TCNICA DE MICRONCLEOS EN MDULA SEA

53

EFECTO TXICO DE PLOMO EN RATAS

63

EFECTO DEL pH EN LA LIBERACIN DE PLOMO POR UTENSILIOS DE BARRO VIDRIADO

75

DETERMINACIN DE ETANOL EN UNA MUESTRA PROBLEMA

80

IDENTIFICACIN DE ALCALOIDES Y BARBITRICOS EN MUESTRAS PROBLEMA

87



3

PROLOGO En noviembre de 2004, el H. Consejo Tcnico de la Facultad aprob las modificaciones al plan de estudios de la carrera de Qumica Farmacutico Biolgica (QFB) y en junio de 2005 fue aprobado por el Consejo Acadmico de las Ciencias Biolgicas y de la Salud (CAABYS). De tal manera, que a partir del semestre 06-I se inici la implantacin gradual del mapa curricular del plan de estudios 2005. En este nuevo mapa curricular, la asignatura terico-experimental de Toxicologa, con clave 1614, qued ubicada en el 6 semestre para la carrera de QFB. El diseo del actual contenido programtico de la asignatura, consider revisar los conocimientos bsicos de toxicologa como son citotoxicidad, bioactivacin txica, estrs oxidante, mutagnesis, carcinognesis y teratognesis, para integrarlos a las etapas de estudio sobre el riesgo de exposicin, toxocintica y toxodinamia de las reacciones adversas ocasionadas por xenobioticos frmacos, metales pesados y sustancias de abuso. A travs del aprendizaje de esta asignatura, se pretende contribuir al perfil del egresado en el diseo, evaluacin y produccin de medicamentos, produccin de reactivos para diagnstico, diagnstico de laboratorio, investigacin biomdica y conservacin del medio ambiente. En consecuencia, el grupo de profesores de toxicologa, en forma colegiada, decidi realizar la actualizacin y modificacin del curso prctico, incluyendo algunos temas de inters actual en esta asignatura, y rediseando los existentes de acuerdo a la reforma a la enseanza experimental (Hernndez y Llano, 1994). Siguiendo estos criterios, se implementaron dos nuevas prcticas con el apoyo del proyecto PE202006 a travs del Programa de Apoyo a Proyectos para la Innovacin y Mejoramiento de la Enseanza (PAPIME), lo cual permiti la adquisicin de equipos, materiales y reactivos para la enseanza experimental de esta asignatura. Con base a lo anterior, los autores presentamos el Manual de guiones experimentales para la enseanza y aprendizaje del laboratorio de Toxicologa. Este manual est constituido por diez guiones experimentales que cubren las unidades temticas del curso terico (Tabla 1) y que permiten integrar, aplicar y relacionar los conocimientos tericos adquiridos en la asignatura. As mismo, los guiones propician la integracin de algunos de los conocimientos adquiridos previamente en asignaturas como Bioqumica, Farmacologa, Qumica Analtica, y Qumica Orgnica, as como su correspondiente aplicacin a la resolucin de problemas de esta rea.



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Tabla 1. Relacin entre las unidades temticas del curso terico y los guiones experimentales.

Curso laboratorio Guin experimental

Curso terico Unidad temtica

Extraccin y cuantificacin de txicos no voltiles en una muestra problema Introduccin a la Toxicologa

Cuantificacin de cianuro de hidrgeno, como txico voltil, a partir de glucsidos

cianognicos

La biotransformacin de xenobiticos y su importancia toxicolgica.

Produccin de metahemoglobina por nitritos y efecto protector del azul de metileno in vivo

La biotransformacin de xenobiticos y su importancia toxicolgica.

Determinacin de malatin residual La biotransformacin de xenobiticos y su importancia toxicolgica Determinacin de la capacidad antioxidante

de la quercetina y el cido nordihidroguayartico.

El estrs oxidante

Cuantificacin de microncleos en eritrocitos de mdula sea como indicador de

genotoxicidad

Mutagnesis, Carcinognesis y Teratognesis

Efecto txico de plomo en ratas Toxicidad de metales pesados Efecto del pH en la liberacin de plomo por

utensilios de barro vidriado Toxicidad de metales pesados

Determinacin de etanol en una muestra problema Toxicidad de sustancias de abuso

Identificacin de alcaloides y barbitricos en muestras biolgicas Toxicidad de sustancias de abuso

Los guiones experimentales se elaboraron siguiendo los criterios establecidos por la Reforma de la Enseanza Experimental, donde la adquisicin del conocimiento se da a la luz de las evidencias observables o medibles de los fenmenos que ocurren en el laboratorio. El estudiante es enfrentado a los mismos a travs de un problema bien definido, el cual debe ser resuelto encontrando las relaciones causa-efecto de stos a travs del trabajo experimental. Cada uno de los guiones est estructurado de la siguiente manera:

OBJETIVO ACADMICO. Se establece para reforzar y enriquecer los conocimientos adquiridos en las clases tericas, as como el desarrollo de habilidades para el manejo de materiales y tcnicas analticas empleadas comnmente para determinar y/o identificar la presencia de xenobiticos.



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PROBLEMA Se plantea con la intencin de enfrentar al estudiante con fenmenos relacionados con el rea que le permita adquirir los conocimientos planteados en el OBJETIVO ACADMICO a travs del trabajo experimental; encontrando las relaciones causa-efecto y relacionando estos hallazgos con el riesgo de intoxicacin y/o el potencial toxicolgico.

DESARROLLO EXPERIMENTAL

Describe el procedimiento y tcnicas utilizadas para el desarrollo y obtencin de resultados que permitan resolver el PROBLEMA.

CUESTIONARIO Se incluye con la intencin de dirigir al estudiante hacia la resolucin del PROBLEMA, resaltando los aspectos vivenciales de la experiencia en el laboratorio y, de esta forma, reforzar el proceso cognoscitivo.

APNDICE I : CONOCIMIENTOS PREVIOS ste apndice contiene un listado de los conceptos indispensables para que el estudiante comprenda el guin y sea capaz de resolver el PROBLEMA planteado.

APNDICE II: PREPARACIN DE REACTIVOS En este apndice se indican las cantidades necesarias para la preparacin de los reactivos a emplear en el DESARROLLO EXPERIMENTAL.

APNDICE III: DISPOSICIN DE RESIDUOS Considerando que en cada sesin de laboratorio se generan un nmero importante de residuos se contempl la necesidad de indicar puntualmente cada uno de ellos as como la manera en que debern ser confinados y etiquetados para su posterior tratamiento. Los autores consideramos importante tambin incluir en el presente material el Reglamento de Higiene y Seguridad de la Facultad y del Departamento de Farmacia, para concientizar a los alumnos de la relevancia y carcter obligatorio de ambos, promoviendo de esta forma el desarrollo de actitudes apropiadas para un profesionista en el rea de las ciencias biolgicas y de la salud.

Finalmente, los autores agradecemos el apoyo brindado a travs del proyecto PAPIME No. PE202006 de la Direccin General de Asuntos del Personal Acadmico (DGAPA) de la UNAM. Hernndez Luna, M. y Llano Lomas, M. Propuesta de Reforma de la Enseanza Experimental. Revista del IMIQ, Ao XXV, vol. 07, 1994, pp. 5-7.



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Reglamento de Higiene y Seguridad para los Laboratorios de la Facultad de Qumica ARTCULO 1. El presente Reglamento es aplicable en todos aquellos de la Facultad de Qumica en donde se realice trabajo experimental, sea de docencia o de investigacin. Estos sitios, para efectos del presente Reglamento, sern denominados laboratorios. Su observancia es obligatoria para el personal acadmico alumnos y trabajadores administrativos y no excluye otra reglamentacin que resulte aplicable. ARTCULO 2. Es necesario que el personal que trabaja en cada laboratorio conozca el sistema de alertamiento, las zonas de seguridad, las rutas de evacuacin, el equipo para combatir siniestros y las medidas de seguridad establecidas en cada laboratorio. ARTCULO 3. Los laboratorios debern estar acondicionados, como mnimo con lo siguiente: a) Un control maestro para energa elctrica b) Un botiqun de primeros auxilios c) Extintores d) Un sistema de ventilacin adecuado e) Agua corriente f) Drenaje g) Un control maestro para suministro de gas h) Sealamientos de proteccin Civil ARTCULO 4. Todas las actividades que se realicen en los laboratorios debern estar supervisadas por un responsable. Los Departamentos acadmicos respectivos nombrarn a dicho responsable en sus reas correspondientes. ARTCULO 5. Al realizar actividades experimentales, nunca deber estar una persona sola en los laboratorios. El mnimo de personas deber ser, invariablemente, de 2. ARTCULO 6. Los usuarios debern abstenerse de dejar, en el lugar de trabajo, cosas de valor a la vista y cerrar las puertas de cubculos y laboratorios, as como cajones y archiveros, siempre que se ausente del laboratorio. ARTCULO 7. Para trabajar en los laboratorios es obligatorio que los estudiantes usen bata y lentes de seguridad. En el caso del personal acadmico y administrativo, el equipo de proteccin personal, lo dictaminar la Comisin Mixta de Higiene y Seguridad. Este equipo ser de uso obligatorio. El alumno que no tenga proteccin no podr permanecer en el laboratorio, siendo su responsabilidad contar con el equipo mencionado. Adems no podr trabajar ni permanecer dentro de los laboratorios, si no se encuentra su profesor o alguien responsable que los sustituya. ARTCULO 8. En los laboratorios queda prohibido: fumar, consumir alimentos o bebidas, el uso de lentes de contacto y el uso de zapatos abiertos (tipo huarache). ARTCULO 9. Para realizar trabajos con material radiactivo es obligatorio aprobar el curso de su manejo, as como la obtencin del dosmetro correspondiente. ARTCULO 10. Todas las substancias, equipos, materiales, etc., debern ser manejados con el mximo cuidado, atendiendo a las indicaciones de los manuales de uso o de los manuales de seguridad, segn el caso. ARTCULO 11. Las puertas de acceso y salidas de emergencias debern de estar siempre libres de obstculos, accesibles y en posibilidad de ser utilizadas ante cualquier eventualidad. El responsable del rea deber verificar esto, al menos una vez cada semana. ARTCULO 12. Las regaderas debern contar con el drenaje correspondiente, funcionar correctamente, estar lo ms alejadas que sea posible de instalaciones o controles elctricos y libres de todo obstculo que impida su correcto uso. El responsable del rea deber verificar esto, por lo menos una vez cada semana. ARTCULO 13. Los controles maestros de energa elctrica y suministros de gas para cada laboratorio debern estar sealados adecuadamente, de manera tal que sean identificados fcilmente. ARTCULO 14. En cada laboratorio deber existir al alcance de todas las personas que en l trabajen, un botiqun de primeros auxilios. El responsable del rea deber verificar, al menos una vez cada semana, e contenido del botiqun, para proceder a reponer los faltantes. ARTCULO 15. Los extintores de incendios debern ser de CO2, y de polvo qumico seco, segn lo determine la Subcomisin Mixta de Higiene y Seguridad y/o el Departamento de Bomberos de la Universidad; debern de recargarse cuando sea necesario, de conformidad con los resultados de la revisin o por haber sido utilizados.



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ARTCULO 16. En caso de emergencias, con incendios, derrames o personas accidentadas, dirigirse a la zona de seguridad establecida y/o activar el servicio de Emergencias 55 (red digital UNAM). Al activarlo: Identifquese: Nombre y Puesto. Ubicacin: D el mayor nmero de referencias fsicas posibles y las vas de acceso. Tipo de siniestro. Nmero de lesionados. Apoyo: Especifique si requiere apoyo adicional de vigilancia. Avisar de inmediato al encargado de la Seguridad del rea y a la Coordinacin de Seguridad. ARTCULO 17. Los sistemas de extraccin de gases debern de mantenerse siempre sin obstculos que impidan que cumplan con su funcin, debern de evaluarse al menos una vez cada mes, y debern recibir el mantenimiento preventivo o correctivo que los responsables de cada rea soliciten. ARTCULO 18. Tanto los sistemas de suministro de agua corriente como de drenaje, debern de recibir el mantenimiento preventivo o correctivo que los responsables de cada rea soliciten. ARTCULO 19. Los lugares en que se almacenen reactivos, disolventes, equipos, materiales, medios de cultivo, y todo aquello relacionado o necesario para que el trabajo en los laboratorios se lleve a cabo, estarn sujetos a este Reglamento en su totalidad. ARTCULO 20. Queda prohibido desechar sustancias al drenaje o por cualquier otro medio sin autorizacin del responsable del rea correspondiente. Los manuales de prcticas correspondientes debern incluir la forma correcta de desechar los residuos. ARTCULO 21. Para transferir lquidos con pipetas, deber utilizarse la llenadora correspondiente. Queda prohibido pipetear con la boca. ARTCULO 22. Al finalizar las actividades en el laboratorio, el responsable del rea deber verificar que queden cerradas las llaves de gas, agua, vaco, tanques de gases y aire, segn sea el caso; apagadas las bombas de vaco, circuitos elctrico, luces, etc. En caso de requerir que algn equipo trabaje de manera contina, deber dejarse en el interior y en el exterior del laboratorio correspondiente, en forma claramente visible y legible, la informacin acerca del tipo de reaccin o proceso en desarrollo, las posibilidades fuentes de problema, la manera de controlar los eventuales accidentes, y la forma de localizar al responsable del equipo. ARTCULO 23. Cuando se trabaje con sustancias txicas, deber identificarse plenamente el rea correspondiente. Nunca debern tomarse frascos por la tapa o el asa lateral, siempre debern tomarse con ambas manos, una en la base y la otra en la parte media. Adems se deber trabajar en rea con sistema de extraccin y equipo de proteccin personal (segn el manual correspondiente). ARTCULO 24. En cada laboratorio de la Facultad deber existir, de manera clara, visible y legible, la informacin acerca de los telfonos de emergencia a los cuales llamar en caso de requerirlo. ARTCULO 25. Todas aquellas cuestiones que no estn especficamente sealadas en el presente Reglamento, debern ser resueltas por la Direccin de la Facultad con la opinin de la Coordinacin de Seguridad, Prevencin de Riesgos y Proteccin Civil. ARTCULO 26. Cualquier alteracin en las condiciones de seguridad o en el cumplimiento del presente reglamento, deber ser reportado al responsable correspondiente. ARTCULO 27. Las personas a quienes se sorprenda haciendo mal uso de equipos, materiales, instalaciones, etc. propias de los laboratorios, de todo aquello mencionado en el artculo 2 del presente Reglamento, o de las sealizaciones instaladas para proteccin civil, sern sancionadas conforme a la Legislacin Universitaria, segn la gravedad de la falta cometida. ARTCULO 28. En el caso de los alumnos, las sanciones aplicables sern las que decida el H. Consejo Tcnico, conforme a las disposiciones de la Legislacin Universitaria. ARTCULO 29. Tratndose de personal acadmico y administrativo, se levantarn las actas correspondientes y se dictarn las sanciones conforme a las disposiciones de la Ley Federal del Trabajo. ARTCULO 30. Cada rea acadmica deber tener un Reglamento Interno de Higiene y Seguridad y ser de observancia obligatoria, siendo este complementario al presente Reglamento, en tanto no lo contravengan. TRANSITORIO NICO. El presente reglamento entrar en vigor el da siguiente de su publicacin en la gaceta de la propia Facultad.



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Reglamento de Higiene y Seguridad de los Laboratorios del Departamento de Farmacia ARTCULO 1. El presente Reglamento es complementario del Reglamento de Higiene y Seguridad, para Laboratorios de la Facultad de Qumica de la UNAM, aprobado por el H. Consejo Tcnico el 28 de abril de 1994. Su observancia es obligatoria para el personal acadmico, alumnos y trabajadores administrativos, y no excluye otra reglamentacin que resulte aplicable. ARTCULO 2. REGLAS DE SEGURIDAD 2.1 Seguir todas las indicaciones de seguridad que se sealan en cada equipo o reactivo, as como las sealadas en cada prctica. 2.2 Queda prohibido correr dentro del laboratorio. 2.3 Todas las lesiones sufridas dentro del laboratorio, no importa qu tan insignificantes sean, debern darse a conocer al coordinador del laboratorio. 2.4 Antes de desarmar o limpiar un aparato elctrico, debe asegurarse de que est desconectado de la corriente elctrica. Nunca opere un equipo que desconoce, pregunte primero al laboratorista o al profesor. 2.5 No debe usarse material de vidrio roto o despostillado. 2.6 Si en su rea o equipo se va a efectuar algn servicio de mantenimiento, asegrese de dar aviso oportuno a todos los involucrados y comunquelo a la Coordinacin de Seguridad. 2.7 El alumno que necesite salir por cualquier motivo, deber comunicarlo a los profesores. 2.8 El alumno que acta como supervisor de cada equipo de trabajo, deber verificar, al finalizar la prctica, el orden y la limpieza de cubculos y equipos. 2.9 Al finalizar cada sesin prctica, los alumnos entregarn al profesor responsable de la asignatura o al laboratorista en turno, los cubculos y equipos empleados, limpios y en buen estado; asimismo debern informar cualquier defecto o anomala detectada en los mismos. 2.10 Deber colocar sus artculos personales en el sitio que para tal efecto se asignar en cada laboratorio. ARTCULO 3. MANUFACTURA DE MEDICAMENTOS 3.1 Todo el personal involucrado en la manufactura de medicamentos, deber cubrir totalmente su cabello con una cofia limpia y en buen estado. 3.2 Deber usar guantes de cirujano y cubrebocas limpios, en buen estado, cuando el proceso lo indique (por ejemplo, surtido y pesado de materias primas, etc.). 3.3 De preferencia debe portar zapatos cerrados con suela antiderrapante. 3.4 Queda prohibido introducir alimentos, bebidas o golosinas, excepto cuando as se requiera (Biofarmacia). 3.6 Quedan prohibidas las visitas. 3.7 Las puertas de los cubculos deben permanecer cerradas. ARTCULO 4. DISPOSICIN DE RESIDUOS BIOLGICOS 4.1 En caso de romper o derramar material contaminado, se deber agregar fenol al 5% y dejar actuar el desinfectante por 10 minutos. 4.2 Queda estrictamente prohibido arrojar medio de cultivo, disolventes orgnicos o productos biolgicos, al sistema de drenaje, as como a los colectores de basura; estos residuos se debern incorporar a recipientes que se localizan en cada laboratorio, para ser dispuestos adecuadamente. 4.3 Los cultivos deben esterilizarse antes de ser desechados; si se encuentran en material desechable, ste debe depositarse en los recipientes que se localizan en cada laboratorio. Estos residuos sern reciclados. 4.4 Otros desechos orgnicos (alimentos, animales, muestras biolgicas) se depositarn en los recipientes etiquetados que para este propsito se encuentran en cada laboratorio. 4.5 El material de plstico se depositar en otro recipiente especial. 4.6 El material de vidrio se colectar aparte, en el recipiente indicado. 4.7 El papel limpio de desecho se depositar en otra caja para ser reciclado. ARTCULO TRANSITORIO NICO. El presente Reglamento entrar en vigor al da siguiente de su aprobacin por el H. Consejo Tcnico de la Facultad.



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REPORTE DE SEGURIDAD GRUPO:_____________ FECHA:___________________ PRACTICA:_______________________________________________________________ INTEGRANTES:___________________________________________________________ UTILIZACIN DE REACTIVOS.

REACTIVO Cantidad empleada Observaciones

VIGILANCIA DE EQUIPO

Equipo Hora de inicio Hora final Observaciones

MEDIDAS DE SEGURIDAD TRATAMIENTO DE RESIDUOS

OBSERVACIONES

Firma del responsable:________________________________________



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EXTRACCIN Y CUANTIFICACIN DE TXICOS NO VOLTILES EN UNA MUESTRA PROBLEMA

OBJETIVO ACADMICO

Que el alumno emplee mtodos de extraccin cida y bsica para obtener eficientemente

txicos no voltiles de naturaleza cida y bsica en una muestra problema y concluya que

mtodo de extraccin es el ms eficiente.

PROBLEMA

Establecer las condiciones ms adecuadas para realizar una extraccin mayor o igual al

90% de los txicos no voltiles cidos y bsicos (cido acetilsaliclico [AAS] y cafena)

presentes en una muestra problema. La muestra deber trabajarla en medio cido y medio

bsico.

REACTIVOS

cido tartrico Cafena Hidrxido de sodio (NaOH) Cloroformo (CHCl3) Nitrato frrico (Fe(NO3)3) Salicilato de sodio cido clorhdrico (HCl) Cloruro mercrico (HgCl2) Bicarbonato de sodio (NaHCO3) Sulfato de sodio anhidro (Na2SO4)

EQUIPO

Espectrofotmetro Balanza analtica Rotaevaporador Vrtex

MATERIAL

MATERIAL POR EQUIPO Gradilla 1 Piseta con agua destilada 1 Tubos de ensayo 13 x 100 4 Matraz de bola de 50 mL 2 Matraz aforado de 10 mL 2 Pipeta Pasteur 2 Matraz aforado de 25 mL 2 Probeta de 25 mL 1 Embudo de separacin de 250 mL 2 Esptula 1 Matraz Erlenmeyer de 250 mL 1 Pipeta graduada de 10 mL 2 Matraz Erlenmeyer de 50 mL 2 Pipeta graduada de 5 mL 2 Anillo metlico 2 Pipeta graduada de 1 mL 1



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MATERIAL PARA LA CURVA PATRN Gradilla 1 Matraz volumtrico de 10 mL 5 Matraz volumtrico de 25 mL 5 Tubos de ensayo 10 Vaso de precipitado de 100 mL 1 Pipeta graduada de 1 mL 1 Pipeta graduada de 10 mL 1 NOTA: El profesor proporcionar las celdas a los alumnos.


El profesor proporcionar 30 mL de muestra problema la cual deber dividirse en dos

porciones de 15 mL para realizar a una porcin la extraccin en medio cido y a la otra

porcin la extraccin en medio bsico. La cuantificacin de cido acetilsaliclico (AAS) y

cafena se determinar siguiendo los apndices correspondientes.

A) PROCESO DE EXTRACCIN EN MEDIO CIDO PARA TXICOS NO VOLTILES

1. Agregar cido tartrico hasta un pH = 2.

2. La solucin cida se extrae con 2 porciones de 15 mL de CHCl3, separando las fases

orgnicas y reunindolas en un matraz.

3. La fase acuosa se guarda, etiquetndola como fraccin A.

4. La fase orgnica se extrae con dos porciones de 10 mL de agua destilada y se renen las

fases acuosas con la fraccin A.

5. Tratamiento de la fase orgnica: sta fase se trata con 5 mL de una solucin saturada de

NaHCO3, se separan las fases. Etiquetar la fase acuosa como fraccin B. Tratar esta

fraccin como se indica en el inciso C.



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5.1. Extraer la fase orgnica con 5 mL de NaOH 0.1 N. La fase acuosa resultante,

etiquetarla como fraccin C y trabajarla como se indica en el inciso C. La fase orgnica

resultante marcar como R1.

6. Tratamiento de la fraccin A. La fase acuosa obtenida del inciso 4 se alcaliniza hasta pH

= 10 con NaOH 2.5 N.

6.1. Extraer con dos porciones de CHCl3 de 10 mL (2 x 10 mL CHCl3) y separar las fases.

Desechar la fase acuosa resultante en el contenedor etiquetado como R2.

6.2. Concentrar la fase orgnica hasta sequedad en rotaevaporador. Etiquetar como

fraccin D y tratarlo como se indica en el inciso D. El disolvente orgnico resultante que se

encuentra en el matraz de condensacin debe ser desechado en el contenedor etiquetado

como R1.

B) PROCESO DE EXTRACCIN EN MEDIO BSICO PARA TXICOS NO VOLTILES

1. La muestra se ajusta a pH = 10 con NaOH 2.5 N.

2. Realizar la extraccin con dos porciones de CHCl3 de 15 mL, separando las fases.

3. La fase orgnica se concentra hasta sequedad y el residuo se etiqueta como fraccin E y

se trata como se indica en el inciso D.

4. La fase acuosa se etiqueta como fraccin F y se trata segn el inciso C.



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C) CUANTIFICACIN DE CIDO ACETILSALICLICO

Tratamiento de la muestra (Fracciones B, C y F)

1. Colocar 1 mL de las fracciones B, C y F en tubos de forma separada y adicionar a cada

una 5 mL del reactivo para desarrollar color (apndice II), agite, espere 2 min.

2. Determinar la absorbancia a 540 nm. Si la lectura de absorbancia no cumple con la ley

de Lambert y Beer, realice las diluciones necesarias, repita el procedimiento y vuelva a

realizar la lectura.

3. Calcular la concentracin de AAS presente en su muestra, interpolando la lectura de

absorbancia en la curva patrn.

4. Despus de haber realizado la lectura y una vez obtenidos los resultados, las fracciones

B, C y F se renen y desechan en el contenedor etiquetado como R3.

Curva patrn del AAS

1. Solucin patrn de salicilato de sodio (1000 g/mL): Pesar 25 mg de salicilato de sodio y disolverlo. Llevar hasta 25 mL con agua destilada.

2. A partir de la solucin patrn de salicilato de sodio (1000 g/mL), preparar la curva patrn como se describe a continuacin (realizar dos curvas patrn por grupo).

Alicuota de la solucin patrn

(mL)

Aforo con agua destilada

Concentracin (g/mL)

0.5 10 50 1 10 100 3 10 300 5 10 500 7 10 700

En un tubo de ensaye colocar 1 mL de las soluciones recin preparadas y adicionar 5 mL

del reactivo para desarrollar color (apndice II), agitar la muestra en un vrtex durante 1



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min, esperar 2 min. y determinar la absorbancia a una longitud de onda de 540 nm,

ajustando a cero con un blanco (1 mL de agua y 5 mL del reactivo para desarrollar color).

D) CUANTIFICACIN DE CAFENA

Tratamiento de la muestra (Fracciones D y E)

1. Disolver por separado los residuos de las fracciones D y E en 5 mL de NaOH 0.1 N.

Transferirlo a un matraz volumtrico de 25 mL y aforar con NaOH 0.1 N.

2. Determinar la absorbancia de la solucin anterior a 275 nm utilizando NaOH 0.1 N

como blanco. Si la lectura de absorbancia obtenida no cumple con la ley de Lambert y

Beer, realice las diluciones necesarias con NaOH 0.1N.

3. Calcular la concentracin de cafena presente en su muestra, interpolando la lectura de

absorbancia en la curva patrn.

4. Despus de haber realizado la lectura y una vez obtenidos los resultados, las fracciones

D y E se renen y desechan en el contenedor etiquetado como R2.

Curva patrn

1. Solucin patrn de cafena (100 g/mL). Disolver 10 mg de cafena anhidra en 10 mL

de NaOH 0.1 N y afore con la misma solucin a 100 mL.

2. A partir de la solucin patrn de cafena (100 g/mL) preparar la curva patrn como se

describe a continuacin. Por grupo realizar dos curvas patrn.

Alicuota de la solucin patrn

(mL)

Aforo con NaOH 0.1 N

Concentracin (g/mL)

1 25 4 2 25 8 3 25 12 4 25 16 5 25 20

3. Determinar la absorbancia de la curva patrn a una longitud de 275 nm, ajustando a cero

con un blanco (NaOH 0.1 N).



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CUESTIONARIO

1. En el caso de emplear una muestra biolgica indique cul es el objetivo de adicionar

cido tartrico adems de ajustar el pH?

2. Una vez desarrollado el guin para una eficiente extraccin de un xenobitico qu

puntos del proceso y propiedades fisicoqumicas considera que son crticos?

3. Complete la siguiente tabla e indique los datos de la regresin lineal de cada curva.

Tabla 1. Curva Patrn

AAS

[g/mL]

Abs*

curva

1

Abs*

curva

2

cafena

[g/mL]

Abs*

curva

1

Abs*

curva

2

50 4

100 8

300 12

500 16

700 20

Pendiente (m) Pendiente (m)

Ordenada al origen (b) Ordenada al origen (b)

Coeficiente de

correlacin lineal (r)

Coeficiente de

correlacin lineal (r)

*Abs:Absorbancia

Tabla 2. Lecturas de Muestras

Equipo Absorbancia de las fracciones

B C F D E

1

2

3



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4. Interpole los datos de absorbancia de cada una de sus fracciones y calcule la

concentracin de AAS y/o cafena en su muestra indicando el procedimiento que sigui

para realizarlo.

5. Es necesario considerar el factor de dilucin para calcular la concentracin inicial de

los xenobiticos en su muestra? Justifique su respuesta.

6. Complete las siguientes tablas y de acuerdo a los resultados grupales concluya cual es el

mejor mtodo de extraccin para los xenobiticos analizados.

Tabla 3. Resultados grupales AAS

Equipo

cido acetilsaliclico

Extraccin en medio cido Extraccin en medio bsico

Concentracin

(g/mL)

Rendimiento

(%)

Concentracin

(g/mL)

Rendimiento

(%)

1

2

3

Tabla 4. Resultados grupales cafena

Equipo

cafena

Extraccin en medio cido Extraccin en medio bsico

Concentracin

(g/mL)

Rendimiento

(%)

Concentracin

(g/mL)

Rendimiento

(%)

1

2

3

7. En caso de no haber obtenido un rendimiento superior al 90% analice a que puede

atribuirse el hecho.



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REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS.

Casarett, L.J. Caffeine biotransformation. En: Casarett & Doulls Toxicology: The basic science of poisons. McGraw Hill, New York, 2001, p 1071.

Casarett, L.J. Salicylic acid, biotransformation. En: Casarett & Doulls, Toxicology: The basic science of poisons. McGraw Hill, New York, 2001, p 203.

Clarke, E.G.C. Screening Tests for Common Drugs. En: Isolation and identification of drugs in pharmaceuticals body fluids and post-mortem material. Vol. 1. Pharmaceutical Press, London, 1974, p 3-15.

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18

APNDICE I: CONOCIMIENTOS PREVIOS

1. Efectos txicos del cido acetilsaliclico (AAS) y de la cafena.

2. Relacin entre el pKa de una sustancia con el pH del medio en el que se encuentra

disuelto.

3. Estructura de la forma inica y no inica del AAS y de la cafena.

4. Reaccin de hidrlisis del AAS.

5. Valores de pKa del AAS, cido saliclico, cido tartrico, cido actico y de la cafena

6. Solubilidad de una sustancia inica en medio acuoso y disolvente orgnico.

7. Densidad de los disolventes a emplear.

8. Fundamento de una extraccin mltiple y selectiva.

9. Sustancias que pueden precipitar protenas.

10. Esquema de los procesos de separacin empleados tanto en medio cido como en

medio bsico especificando qu especies qumicas se encuentran en cada uno de las

fases.

11. Propsito de lavar la fase orgnica con dos porciones de agua destilada en la extraccin

en medio cido.

12. Propsito de juntar las facciones acuosas obtenidas de la particin con CHCl3 con la

fraccin A en el proceso de extraccin en medio cido.

13. Objetivo de adicionar NaHCO3 y NaOH 0.1N en el proceso de extraccin cida.

14. Naturaleza de los compuestos obtenidos en cada una de las fracciones.

15. Dibujo de la reaccin de identificacin y cuantificacin del AAS.

16. Rango de absorbancia en el cual se cumple la ley de Lambert y Beer.

17. Razn por la cual se determinan la cafena y el AAS a diferentes longitudes de onda.

18. Forma de obtener el rendimiento de la extraccin de una sustancia.

19. El anlisis de una muestra biolgica de 20 mL para determinar la presencia de

salicilatos y/o cafena arroj las siguientes lecturas de absorbancia:



19

Tabla 1. Absorbancia y volumen final de las fracciones B,C y D

Absorbancia a = 540 nm

Volumen (mL)

Absorbancia a = 275 nm

Volumen(mL)

fraccin B = 0.613 15 fraccin D = 0.785 6 fraccin C = 0.456 7

Para la realizacin de los clculos considere el proceso de extraccin en medio cido

descrito en el guin experimental y tome en cuenta las diluciones necesarias.

Las lecturas de absorbancia de las curvas patrn para AAS y cafena son las que se

muestran a continuacin:

Tabla 2. Curva patrn

AAS Cafena

Concentracin

[g/mL] A = 540 nm Concentracin

[g/mL] A = 275 nm

50 0.060 4 0.184

100 0.133 8 0.484

300 0.421 12 0.684

500 0.713 16 0.885

700 0.970 18 1.000

b = 5.8 x 10-3

m = 1.409 x 10-3

r= 0.999

b = 9.2 x 10-3

m = 0.0566

r =0.996

Calcule la concentracin de AAS y Cafena en la muestra inicial.



20

APNDICE II: PREPARACIN DE REACTIVOS

Reactivo para desarrollar color:

Pesar 4 g de HgCl2 y disolverlo en 12 mL de HCl 1N. Adicionar 4 g de Fe(NO3)3 y agitar

hasta su total disolucin. Diluir con agua destilada a 100 mL (considerar cantidades

adicionales para el blanco y curva patrn)

Solucin de hidrxido de sodio 2.5 N

Disolver 10 g de NaOH en 25 mL de agua destilada y aforar a 100 mL.

Solucin de hidrxido de sodio 0.1 N

Disolver 0.4 g de NaOH en 25 mL de agua destilada y aforar a 100 mL.

Solucin de cido clorhdrico 1 M

Colocar 83 mL de HCl concentrado en un matraz aforado y adicionar agua destilada hasta 1 L.

Solucin de cido tartrico al 10%

Colocar 10 g en 100 mL de agua destilada.

Solucin saturada de bicarbonato de sodio.

Colocar una cantidad aproximada de bicarbonato de sodio R.A., en 10 mL de agua

destilada, hasta que no se pueda disolver en fro.



21

APNDICE III: DISPOSICIN DE RESIDUOS

R1: Cloroformo (restos de acido acetilsaliclico y cafena)

R2: Solucin acuosa bsica de NaOH (pH = 10), tartrato de sodio y restos de cafena

ionizada, cido acetilsaliclico y cido saliclico.

R3: Solucin acuosa con HgCl2 y Fe(NO3)3.



22

CUANTIFICACIN DE CIANURO DE HIDRGENO, COMO TXICO

VOLTIL, A PARTIR DE GLUCSIDOS CIANOGNICOS

OBJETIVO ACADMICO

Que el alumno determine la cantidad de cianuro de hidrgeno liberado a partir de

glucsidos cianognicos presentes en muestras que forman parte de la dieta de humanos y

animales, y relacione la concentracin con su potencial toxicolgico.

PROBLEMA

Que el alumno cuantifique la concentracin de cianuro de hidrgeno presente en una serie

de 2 muestras de semillas o plantas, y concluya cul de estas muestras presentan riesgo de

toxicidad para el humano, en base a la cantidad de HCN que est presente en el consumo de

100 g de muestra.

REACTIVOS

Reactivo de Guignard * cido clorhdrico * (HCl)

Cianuro de potasio * (KCN) Cloroformo (CHCl3)

Carbonato de sodio (Na2CO3) cido pcrico

* VER APNDICE II

EQUIPO

Espectrofotmetro Termmetro

Estufa

MATERIAL POR EQUIPO

Tubos de ensaye 20 x150 con tapn de hule 3 Tijeras 1

Cajas Petri 1 Pinzas 1

Mortero con pistilo 1 Navaja (traer por equipo) 1



23

Tiras de papel filtro cualitativo (filtracin

rpida) de 2 x 10 cm

3

Matraz Erlenmeyer de 250 mL con

tapn de hule

3

Pipeta volumtrica de 25 mL 1 Pipeta graduada de 1 mL 1

Probeta de 50 mL 1 Embudo de cola corta 3

Vaso de precipitado de 100 mL 3 Hielo (proporcionado por

laboratorista)

MATERIAL PARA LA CURVA

Matraces Erlenmeyer de 250mL con tapn de hule 6

Matraces volumtricos de 25 mL 6

Pipeta graduada de 1 mL 1

Tubos de ensaye 20 x 150 con tapn de hule. 6

Papel filtro (tiras de 2 x 10 cm) 6

NOTA: El profesor proporcionar las celdas para las lecturas

MATERIAL DE ESTUDIO

Traer por equipo aproximadamente 1g de una de las siguientes muestras: almendra de

durazno, semillas de manzana roja, almendra de ciruela pasa, semilla de lima,

almendra de capuln, almendra de cerezas.


Cada equipo trabajar con 2 muestras problema de plantas o semillas segn la lista

mencionada, una de las cuales ser proporcionada por el profesor.

NOTA: La solucin patrn de cianuro de potasio, el cido clorhdrico 0.5N y el agua destilada deben de estar en bao de hielo antes de realizar la parte experimental. PREPARACIN DE LA TIRA REACTIVA



24

1. Cortar 2 tiras de papel filtro de 2 x 10 cm. El equipo que prepare curva patrn de HCN

deber preparar 6 tiras adicionales.

2. Sumergir las tiras de papel filtro en el reactivo de Guignard y escurrirlas, colocndolas

para su secado sobre una caja Petri.

3. Introducir las tiras en una estufa que se encuentre estable a una temperatura entre 50-

55oC, dejndolas aproximadamente 10 min cuidando que estn humedecidas.

PREPARACIN DE LAS MUESTRAS NOTA: Antes de comenzar a triturar y pesar su muestra debern tener todos los reactivos necesarios dentro del matraz, as como lista la tira reactiva, tanto para su muestra como para la curva patrn. A cada una de las muestras se le realizar el siguiente procedimiento:

1. Medir 25 mL de agua destilada con pipeta volumtrica y agregarlos a un matraz

Erlenmeyer de 250 mL, colocar el matraz en bao de hielo.

2. Adicionar al matraz del inciso anterior 1mL de solucin de HCl 0.5N y dos gotas de

CHCl3.

3. Poner con cuidado la tira reactiva de papel en el matraz como se indica en la figura 1

4. Tapar inmediatamente cada uno de los matraces Erlenmeyer con su tapn despus de

concluir este procedimiento.

5. Pesar la cantidad de cada muestra de acuerdo al siguiente cuadro y colocarla en el

mortero con la ayuda de las pinzas de diseccin y navaja cortarla y macerarla lo ms

rpido posible.

Insertar Tabla Leticia

6. Colocar rpidamente la muestra fragmentada en el matraz Erlenmeyer de 250 mL y

tapar inmediatamente.

7. Introducir simultneamente en la estufa a 40C los matraces con las muestras problema y

con los correspondientes de la curva estndar de HCN durante 1 hr.



25

FIGURA 1. Preparacin de la muestra en el matraz y colocacin de la tira

reactiva.

PREPARACIN DE LA CURVA PATRN DE CIDO CIANHDRICO

La curva patrn de HCN se prepara colocando en matraces volumtricos de 25 mL los

volmenes de la solucin patrn de KCN indicados en la siguiente tabla y llevando al aforo

con agua destilada:

Tabla 2. Curva patrn de HCN

Alcuota de la solucin

patrn de KCN (mL)

Concentracin de HCN

(g/mL) 0.0 Blanco

0.1 0.4

0.2 0.8

0.3 1.2

0.4 1.6

0.5 2

TAPON DE HULE

PAPEL FILTRO (TIRA REACTIVA)

MUESTRA



26

1. Colocar con cuidado la tira reactiva en el matraz como se indica en la figura 1 y agregar

a cada matraz 1 mL de la solucin de HCl 0.5 N y dos gotas de CHCl3, cuidando de no

mojar la tira. Tapar inmediatamente cada uno de los matraces Erlenmeyer con su

tapn despus de concluir este procedimiento.

2. Una vez preparadas las soluciones de la curva patrn, pasarlas inmediatamente a

matraces Erlenmeyer de 250 mL, debidamente etiquetados y colocarlos en bao de

hielo.

3. Introducir simultneamente en la estufa a 40C los matraces con las muestras problema y

con los correspondientes de la curva estndar de HCN durante 1 h.

TRATAMIENTO DE LAS MUESTRAS PROBLEMA, CURVA PATRN Y

BLANCO

1. Transcurrido el tiempo de incubacin, los matraces se sacan de la estufa y se dejan

enfriar. Decantar el contenido del matraz y colocar el residuo lquido en un contenedor

etiquetado como R1. El material vegetal se deja secar en la campana sobre papel

peridico para ser desechado posteriormente.

2. Introducir en un tubo de ensaye la tira reactiva positiva (procedente de muestra

problema, curva estndar blanco) adicionar al tubo 20 mL de agua destilada, tapar el

tubo y agitar vigorosamente. Filtrar la solucin con papel filtro para eliminar residuos

de la tira de papel.

3. Determinar la absorbancia de la muestra y de la curva patrn en el espectrofotmetro a

520 nm, utilizando como blanco el primer punto de la curva.

4. Despus de haber realizado la lectura y una vez obtenido resultados, la mezcla se coloca

en un contenedor etiquetado como R2.



27

CUESTIONARIO

1. Reporte en la siguiente tabla los valores de absorbancia obtenidos, e indique los valores

de la regresin lineal.

Tabla 1. Absorbancias de la curva patrn

HCN

[g/mL] Absorbancia

0.4

0.8

1.2

1.6

2

Pendiente (m)

Ordenada al origen (b)

Coeficiente de correlacin lineal (r)

2. Interpole sus valores de absorbancia en la curva y calcule la concentracin de HCN en

mg/100g de muestra, indicando el procedimiento realizado para esta determinacin.

3. Reporte los resultados obtenidos en su grupo y llene la siguiente tabla:

Tabla 2. Resultados grupales

Equipo Material

vegetal

Concentracin de HCN

(g/mL)

mg HCN/100 g de

muestra

Riesgo de

toxicidad*

1

2

3

* alto 10 mg/100g de muestra; bajo < 10 mg/100g de muestra



28

4. Indique cules muestras representan un riesgo potencial en caso de su consumo.

5. Cmo podra eliminar la presencia de glucsidos cianognicos de sus muestras?

6. Proponga un mtodo para extraer txicos voltiles a partir de una muestra.

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Vetter, J. (2000). Plant cyanogenic glycosides. Toxicon 38, 1136.



29


1. Estructura de un glucsido cianognico.

2. Hidrlisis enzimtica de un glucsido cianognico.

3. Importancia toxicolgica de los glucsidos cianognicos.

4. Reaccin de Guignard para la deteccin de HCN.

5. Importancia que tiene durante la prctica que la trituracin de la muestra se realice

rpidamente y sea colocada en bao de hielo.

6. Razn por la cual la tira reactiva no debe tocar la solucin en que se encuentra la

muestra.

7. Razn por la cual se da una reaccin positiva sin que la tira reactiva est en contacto

con la muestra.

8. Razn por la cual es necesario colocar las soluciones de cianuro de potasio y el HCl

0.5N empleadas en la preparacin de la curva patrn en bao de hielo.

9. Propsito de agregar HCl y CHCl3 a la muestra y a la curva patrn.

10. Propsito de calentar la muestra a 40C en la estufa.

APNDICE II: PREPARACIN DE SOLUCIONES

Reactivo de Guignard

Colocar 2.5 g de cido pcrico en un matraz Erlenmeyer de 250mL y disolver con 200mL

de agua destilada. Enseguida agregar 12.5 g de carbonato de sodio (Na2CO3) y agitar

cuidadosamente para disolverlo. Llevar la solucin a un volumen de 500 mL con agua

destilada.

NOTA: Manejar con cuidado el cido pcrico, ya que esta sustancia es cancergena y se absorbe fcilmente por la piel.

Solucin patrn de cianuro de potasio.(KCN)

Se pesa exactamente 12.05 mg de KCN transferir la pesada cuidadosamente a un matraz

aforado de 50mL, disolver y aforar con agua destilada.



30

NOTA: A pesar de que la concentracin utilizada de KCN en este guin es de aproximadamente 0.24 mg/mL y esta concentracin est por debajo de la DL50 en ratones, no deber descuidar las medidas de seguridad para su trabajo.

Solucin cido clorhdrico 0.5 N. (HCl)

Medir 42.5 mL de HCl concentrado (densidad: 36.46g/100mL) y vaciar a un matraz

volumtrico de 1000 mL que contiene aproximadamente 500mL de agua destilada, aforar

enseguida con agua destilada.


R1: Solucin acuosa de HCl (0.5 N), KCl, KCN.

R2: Solucin de cido pcrico, Na2CO3, restos de isopurpurina.



31

PRODUCCION DE METAHEMOGLOBINA POR NITRITOS Y EFECTO

PROTECTOR DEL AZUL DE METILENO IN VIVO

OBJETIVO ACADEMICO

Que el alumno observe la formacin de metahemoglobina (MHb) como consecuencia de la

administracin de nitrito de sodio y el efecto protector del azul de metileno.

PROBLEMA

Determinar cuantitativamente, en ratas tratadas con NaNO2, la reduccin en el porcentaje

de MHb debida a la administracin de azul de metileno.

REACTIVOS.

Heparina 1000 UI o EDTA al 10% Solucin amortiguadora de fosfatos*

Cianuro de potasio* (KCN) Ferricianuro de potasio* (K3[Fe(CN)6])

Solucin salina isotnica (SSI) Nuevo azul de metileno*

cido actico glacial (CH3COOH) Nitrito de sodio* (NaNO2)

Hidrxido de amonio (NH4OH) ter dietlico

*Ver APNDICE II

EQUIPO.

Espectrofotmetros UV-Vis

Centrfugas

Balanza para pesar animales

MATERIAL.

Jeringa de insulina (traer por equipo) 3 Jeringa de 3 mL (traer por equipo) 3

Tubos de ensaye 13x100 10 Tijeras de diseccin 1

Pinzas de diseccin 1 Tabla de diseccin 1



32

Caja de contencin 1 Rejilla 1

Pipeta graduada de 5 mL 2 Pipeta graduada de 1 mL 1

Pipeta graduada de 0.1 mL 1 Tubos de ensaye 16 x 150 3

ANIMALES DE EXPERIMENTACIN

3 Ratas Wistar macho de 200-250 g (por equipo).

PARTE EXPERIMENTAL

1. Pesar cada uno de los animales e identificarlos como I, II y III.

2. Administrar a la rata III, por va intraperitoneal (i.p.) una dosis de 2 mg/Kg de la

solucin de azul de metileno y 15 minutos despus administrar por la misma va, 50

mg/Kg de la solucin de nitrito de sodio.

3. Administrar a la rata I por va i.p. 1 mL/Kg de SSI.

4. Administrar a la rata II por va i.p., 50 mg/Kg de la solucin de nitrito de sodio.

5. Dejar transcurrir 30 min despus de la administracin.

6. Preparar 3 jeringas con 0.1mL de solucin de heparina o EDTA y 3 tubos de ensaye

con 0.3 mL del mismo anticoagulante e identificarlos de acuerdo al nmero de rata

correspondiente.

7. Anestesiar a cada rata con ter, colocarla en la tabla de diseccin y extraer de cada una,

por puncin cardiaca 1 mL de sangre.

8. Colocar la muestra sangunea en el tubo correspondiente. QUITAR LA AGUJA DE

LA JERINGA PARA EVITAR HEMOLIZAR LA MUESTRA SANGUINEA.

MEZCLAR LOS TUBOS PERFECTAMENTE POR INVERSIN PARA

EVITAR LA COAGULACIN DE LAS MUESTRAS.

9. Depositar las jeringas y las agujas en el contenedor para residuos peligrosos biolgico-

infecciosos (RPBI). Envolver los restos de los animales de experimentacin en una

hoja de papel peridico y colocarlos en la caja de contencin para su posterior

incineracin.



33

10. Determinar el contenido de metahemoglobina y hemoglobina total de cada muestra

como se indica a continuacin:

a) Colocar 4.9 mL de solucin amortiguadora de fosfatos pH 6.6 en un tubo de

ensaye.

b) Agregar 0.1 mL de sangre. Conservar el resto de la muestra hasta el final de la

determinacin y despus desactivar con hipoclorito de sodio (NaClO).

c) Mezclar y dejar reposar durante 5 minutos.

d) Centrifugar a 2500 rpm durante 10 minutos.

e) Separar el sobrenadante.

f) Medir la absorbancia del sobrenadante a 630 nm (lectura A1), contra un blanco de

solucin amortiguadora de fosfatos.

g) Pasar la solucin a un tubo limpio.

h) Agregar una gota de la solucin neutralizada de KCN al sobrenadante y al blanco.

i) Mezclar y dejar reposar 2 minutos.

j) Determinar nuevamente la absorbancia a 630 nm (lectura A2). Recuperar la

solucin en el mismo tubo.

k) Agregar una gota de NH4OH concentrado al tubo del inciso i, y mezclar.

l) Transferir 2 mL de la solucin del tubo del inciso k, a otro tubo y agregar 8 mL de

la solucin amortiguadora y 0.1 mL de la solucin de K3[Fe(CN)6] al 20% en

solucin acuosa. Desechar el sobrante de la solucin proveniente del inciso k en el

contenedor etiquetado como R1.

m) Preparar un blanco empleando 2 mL de agua destilada, 8 mL de solucin

amortiguadora y 0.1 mL de la solucin de K3[Fe(CN)6] al 20% en solucin acuosa.

n) Despus de 2 minutos agregar una gota de la solucin neutralizada de KCN a cada

tubo (blanco y problema).

o) Mezclar, esperar 10 minutos y determinar la absorbancia a 540 nm, contra su

respectivo blanco (lectura A3). Despus de haber realizado la lectura y una vez

obtenidos los clculos, desechar el contenido de la celda y el resto de la solucin

del inciso n en el contenedor etiquetado como R1.



34

NOTA: Todo material de vidrio que estuvo en contacto con muestras sanguneas deber

ser inactivado con NaClO previamente a su lavado.

11. Clculos:

Hemoglobina total (Hbt) en g/100 mL = A3 x 37.4

Metahemoglobina total (MHbt) en g/100 mL = (A1 - A2) 23.4

Porcentaje de MHb en sangre total (%MHbt) = (MHbt) x 100/Hbt



35

CUESTIONARIO

1. Reporte los resultados grupales en las siguientes tablas:

Tabla 1. Lecturas espectrofotomtricas

Equipo SSI NaNO2

Azul de metileno + NaNO2

A1 A2 A3 A1 A2 A3 A1 A2 A3 1 2 3

Tabla 2. Determinaciones de Hb y MHb totales

Eq SSI NaNO2

Azul de metileno + NaNO2

Hbt (g/100 mL)

MHbt (g/100mL)

Hbt (g/100 mL)

MHbt (g/100mL)

Hbt (g/100 mL)

MHbt (g/100mL)

1 2 3

Prom SD

%CV Tabla 3. Comparacin del porcentaje de MHb en los diferentes tratamientos

Equipo SSI NaNO2 Azul de metileno + NaNO2 %MHbt %MHbt %MHbt

1 2 3

Prom SD

%CV

2. Graficar los resultados promedio de Hbt y MHbt para cada tratamiento

3. Graficar los resultados porcentuales de MHbt para cada tratamiento

4. Qu efecto observ en el %MHbt en la rata II? A qu lo atribuye?

5. Qu efecto observ en el %MHbt en la rata III? A que lo atribuye?



36

6. Observ algn cambio en la cantidad de Hbt en funcin de los xenobiticos

administrados?, Por qu?

7. Por qu es necesario comparar la cantidad de MHbt en valores porcentuales?


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Stahr, H. M. Inorganic and other Analisis. Analitical Methods in toxicology. Ed. John Wiley and sons, inc., USA. 1991, pp 57.



37


1. Efectos txicos de una intoxicacin por nitritos.

2. Efectos txicos de una intoxicacin con azul de metileno.

3. Esquema que explique el efecto protector del azul de metileno en una intoxicacin por

nitritos.

4. Fundamento de los mtodos analticos para determinar hemoglobina total y

metahemoglobina en sangre.

5. Especies que se determinan en A1, A2 y A3.

6. Propsito de agregar la solucin amortiguadora de fosfatos pH 6.6, NH4OH en el paso

k de su tcnica, K3[Fe(CN)6] y KCN.

APNDICE II: PREPARACIN DE SOLUCIONES

a) Solucin amortiguadora de fosfatos pH = 6.6.

Realizar una primera solucin amortiguadora de fosfatos, disolviendo 3.8 g de fosfato

disdico anhdro (Na2PO4) y 5.44 g de fosfato monopotsico anhdro (KHPO4) en 1000

mL de agua destilada. Mezclar una parte de la solucin anterior con tres partes de agua

destilada y ajustar el pH a 6.6.

b) Solucin de cianuro de potasio neutralizada.(KCN)

Mezclar una parte de una solucin de cianuro al 10% y otra parte de cido actico glacial al

12% (v/v).

NOTA: Tanto el cianuro de hidrgeno como los cianuros slidos o en disolucin son txicos por absorcin por la piel, ingestin e inhalacin.

c) Solucin de ferricianuro de potasio al 20%. (K3[Fe(CN)6])

Preparar 10 mL de sta solucin.



38

d) Solucin Salina Isotnica (SSI)

Preparar 50 mL de sta solucin o comprar una presentacin comercial.

e) EDTA al 10%. (Preparar slo en caso de no haber heparina, consultar con el

laboratorista o el profesor)

Pesar 1 g de EDTA y disolver en agua destilada, aforar a 10 mL.

f) Solucin de nuevo azul de metileno en SSI (4 mg/mL)

Preparar 10 mL de sta solucin, pesando 40 mg de nuevo azul de metileno y disolviendo

en 10 mL de SSI.

g) Solucin de nitrito de sodio (NaNO2) en SSI (100 mg/mL)

Preparar 10 mL de sta solucin, pesando 1 g de NaNO2 y disolvindolos en 10 mL de

solucin salina isotnica.


R1: Solucin amortiguadora de fosfatos pH 6.6, KCN, NH4OH, K3[Fe(CN)6] y residuos de sangre.



39

DETERMINACION DE MALATION RESIDUAL

OBJETIVO ACADMICO

Que el alumno sea capaz de extraer y cuantificar un xenobitico empleando sus

propiedades cido-base y reacciones de degradacin.

PROBLEMA

Cuantificar malatin residual en la superficie de vegetales comestibles y reportar un

porcentaje de recuperacin mayor o igual al 75% en la muestra control. Relacionar la

cantidad de insecticida presente en ambas muestras con el riesgo toxicolgico de su

consumo.

MATERIAL VEGETAL

Traer por equipo 50 g de cscara de limn, calabaza chayote; o bien 50 g de hojas

externas de col o coliflor.

MATERIAL POR EQUIPO

Frasco de vidrio de boca ancha con

tapa (traer por equipo)

2

Probeta graduada de 25 mL

1

Pipeta volumtrica de 10 mL 1 Tubo de ensaye de 16 x 150 2

Pipeta graduada de 1 mL 3 Vasos de precipitado de 100 mL 2

Pipeta graduada de 5 mL 2 Propipeta 1

Pipeta graduada de 10 mL 2 Soporte universal con anillos de fierro 2

Embudo de filtracin rpida 2 Embudo de separacin de 125 mL 2

Probeta graduada de 50 mL 1 Papel filtro



40

MATERIAL PARA LA CURVA

Embudo de separacin de 125 mL 3 Pipeta graduada de 5 mL 1

Tubo de ensaye de 16 x 150 3 Vasos de precipitado de 100 mL 3

Embudo de filtracin rpida 3

REACTIVOS

Sulfato de sodio* (NaSO4) Malatin al 50%

Hidrxido de sodio* (NaOH) Fenoftalena*

Cloruro frrico* (FeCl3) Etanol (EtOH)

Sulfato cprico* (CuSO4) Tetracloruro de carbono (CCl4)

Acetona Disulfuro de carbono (CS2)

* Ver APNDICE II


1. Colocar 25 g del material de estudio (nicamente la cscara o superficie del vegetal) en

un frasco de vidrio de boca ancha y aadir 30 mL de CCl4, tapar y agitar

vigorosamente durante 5 minutos.

2. Filtrar y recolectar cuando menos 20 mL. (Medir el volumen exacto con una probeta).

3. Desechar el material vegetal tratado con CCl4 colocndolo sobre un papel peridico,

identificar como R1 y colocar en la campana. Al finalizar la sesin los responsables de

seguridad e higiene debern colocar R1 en una bolsa de plstico y cerrarla.

4. Preparar un tubo problema con 10 mL del extracto filtrado midiendo con pipeta

volumtrica. Adicionar a cada tubo 0.2 mL de solucin de CS2 al 0.5% y 5 mL de

etanol. Pasar esta mezcla a un embudo de separacin y agitar suavemente.

5. Adicionar 15 mL de solucin cida de Na2SO4 al 9% y agitar cuidadosamente el

embudo por 1 minuto.



41

6. Colectar la fase orgnica en un vaso de precipitado y filtrarla transfirindola

nuevamente al embudo de separacin enjuagado previamente con acetona. Etiquetar la

fase acuosa como R2.

7. Aadir 5 mL de etanol, agitar y aadir 0.2 mL de NaOH 6N. Agitar nuevamente por 5

minutos, dejar reposar durante 1 minuto y adicionar 15 mL de solucin de Na2SO4 al

9%. Mezclar, separar las fases, recolectar la fase acuosa y desechar la fase orgnica

etiquetndola etiquetar como R3.

8. Aadir 5 mL de CCl4 a la fase acuosa y una gota de indicador fenoftalena al 1%.

Neutralizar gota a gota con HCl 6N con agitacin continua hasta la desaparicin del

color azul violeta.

9. Aadir 0.2 mL de solucin de FeCl3, agitar y desechar la fase orgnica en el recipiente

etiquetado como R3.

10. Aadir a la fase acuosa 5 mL de CCl4 y 0.3 mL de solucin de CuSO4 al 3.5% y agitar.

Colectar la fase orgnica y desechar la fase acuosa etiquetndola como R4.

11. Leer la fase orgnica en el espectrofotmetro a 416 nm, ajustando previamente a 100%

de transmitancia con CCl4.

12. Una vez que se obtengan los resultados finales desechar la fase orgnica etiquetndola

como R5.

PROCEDIMIENTO PARA LA CURVA PATRN

Preparar la curva patrn de la siguiente forma:

Tabla 1. Procedimiento para la curva patrn de malatin

Tubo Reactivos Concentracin

1 1 mL de solucin patrn de malatin + 4 mL de etanol 8 g/mL 2 2.5 mL de solucin patrn de malatin + 2.5 mL de etanol 20 g/mL 3 5.0 mL de solucin patrn de malatin 40 g/mL



42

Colocar el contenido de cada tubo en un embudo de separacin. Adicionar 10 mL de CCl4 y

0.2 mL de solucin de CS2 al 0.5%. Agitar suavemente y continuar el procedimiento como

en la muestra a partir del inciso 5.


Adrien. A. Selective Toxicity: the physicochemical basis of therapy. Ed. Chapman and Hall (6a ed.), London, 1979, pp 455463.

CremLyn, C. Pesticides and mode of action, John Wiley & Sons, New York, 1978. Katzung. B. Farmacologa Bsica y Clnica. Ed. El Manual Moderno (7 ed.), Mxico.

1999, pp 119121. Klassen, C. D., Watkins, J.B. Casarette & Doull, Manual de Toxicologa. Ed. McGraw-Hill

Interamericana, Mxico, 2001, pp 615618, 624-634, 937. Morifusa. E. Organophosphorus pesticides: Organic and Biological Chemistry. CRC

Press, Cleveland, 1979, pp 6277, 103, 196199. Negherban, O.W. Handbook of toxicology: Insecticides. W. B. Saunders Comp., E.U.A.,

1959, pp 451464. Norris, M.V., Voil, W.A., Averall, P.R. (1954). Colorimetric estimation of malation

residues. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 2, pp 570. Robertson, W.O., Dreishbad, R.H. Manual de Toxicologa Clnica. Prevencin,

Diagnstico y Tratamiento. El Manual Moderno (6 ed.), Mxico, 1987, pp 95104. White-Stevens, R. Pesticides in the Enviroment Part I and II, Marcel Dekker, Inc., New

York, 1971.



43

CUESTIONARIO

1. Reporte sus resultados en la siguiente tabla:

Tabla 1. Resultados Malatin (g/mL) %Transmitancia Absorbancia

8 20 40

Muestra 1 Muestra 2

Pendiente (m) Ordenada al origen (b)

Coeficiente de correlacin lineal (r)

2. Explique por qu se determinan las lecturas en transmitancia.

3. Indique el procedimiento que sigui para realizar los clculos de concentracin de

malatin en sus muestras.

4. Reporte los resultados grupales en la siguiente tabla:

Tabla 2. Resultados grupales Equipo Material

vegetal Malatin (g/mL)

Rendimiento Malatin en la muestra (ppm)

Riesgo txico*

1 ---

2 ---

3 ---

* Alto 8 ppm; bajo < 8 ppm

5. De acuerdo a los resultados obtenidos concluya si existe un riesgo toxicolgico por el

consumo del material vegetal analizado.

6. En caso de encontrar una baja concentracin en alguna de las muestras. Comente como

influira cada uno de estos factores en el resultado del anlisis: A) estabilidad del



44

compuesto, B) el desarrollo experimental realizado, C) cumplimiento de las normas de

aplicacin del pesticida en cuestin.


1. Usos y propiedades biolgicas del malatin.

2. Ventajas que presentan los pesticidas organofosforados con relacin a los

organoclorados.

3. Mecanismo de toxicidad del malatin en el insecto.

4. Mecanismo de potenciacin del efecto txico del malatin en insectos.

5. Enzimas involucradas en la destoxificacin del malatin en insectos y en mamferos.

6. Comparacin de los valores de DL50 para mamferos y para insectos.

7. Propsito de adicionar los siguientes reactivos: CCl4, CS2, EtOH, solucin cida Na2SO4

al 9% , NaOH, solucin Na2SO4 9%, fenoftalena, HCl, FeCl3 y CuSO4.

8. Dibuje la reaccin que se lleva a cabo con el malatin en medio bsico y presencia de

etanol .

9. Estructura del compuesto de coordinacin que se forma durante la prctica con los

productos de la reaccin anterior y el catin Cu2+, Relacin matemtica entre

absorbancia y transmitancia.

10. Lmites permitidos de acuerdo a la NOM vigente para el malatin.


Solucin patrn de malatin 40 g/mL Medir 0.1 mL de malatin al 50% y aforar con etanol a 100 mL. De esta solucin medir 8

mL y aforar a 100 mL con etanol.

Nota: El malatin es inhibidor de la colinesterasa y se absorbe fcilmente por piel y vias respiratorias, se debe extremar cuidado con su contacto directo. Sus efectos agudos incluyen convulsiones, coma y fallo respiratorio.



45

Disulfuro de carbono al 0.5% (CS2)

Para preparar 100 mL, medir 0.5 mL de CS2 y aforar a 100 mL con CCl4.

Nota: El CS2 es altamente txico, se absorbe por piel y vas respiratorias. Sus efectos txicos incluyen irritacin de membranas, nausea, vmito, prdida de conocimiento y convulsiones.

Sulfato de sodio al 9% (Na2SO4)

Para preparar 100 mL, pesar 9 g de Na2SO4 y aforar a 100 mL con agua destilada.

Solucin cida de sulfato de sodio

A 100 mL de solucin de Na2SO4 al 9% adicionar 3 mL de HCl concentrado.

Hidrxido de sodio 6N (NaOH)

Para preparar 100 mL, pesar 24 g de NaOH y aforar a 100 mL con agua destilada.

cido clorhdrico 6N (HCl)

Para preparar 100 mL, medir 48.5 mL de HCl concentrado y aforar a 100 mL con agua

destilada.

Cloruro frrico al 5% (FeCl3)

Para preparar 100 mL, pesar 5 g de FeCl3 y disolver en 1 mL de HCl 6N, aforar a 100 mL

con agua destilada.

Sulfato cprico al 3.5% (CuSO4)

Para preparar 100 mL, pesar 3.5 g de CuSO4 y aforar a 100 mL con agua destilada.

Fenolftalena al 1%

Para preparar 100 mL, pesar 1 g y aforar a 100 mL con EtOH.



46


R1: Material vegetal con CCl4

R2: Solucin cida de Na2SO4 al 9% y EtOH

R3: CCl4 y subproductos orgnicos de hidrlisis cida

R4: CuSO4, FeCl3, Na2SO4, fenoftalena, H2O

R5: CCl4 y compuesto de coordinacin de cobre



47

DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE DE LA QUERCETINA Y EL CIDO NORDIHIDROGUAYARTICO

OBJETIVO ACADMICO

Que el alumno sea capaz de determinar la capacidad antioxidante de sustancias qumicas.

PROBLEMA

Determinar la capacidad antioxidante de la quercetina y el cido nordihidroguayartico

mediante la reduccin en la produccin de anin superxido utilizando el sistema xantina-

xantina oxidasa-nitroazul de tetrazolio.

REACTIVOS

Xantina (Xan) Carbonato de sodio (Na2CO3)

Xantina oxidasa (XO) Bicarbonato de sodio (NaHCO3)

Nitroazul de tetrazolio (NAT) EDTA

Quercetina Nitrato de cobre (Cu(NO3)2)

cido nordihidroguayartico (ANDG)

EQUIPO

Balanza analtica Potencimetro

Espectrofotmetro

MATERIAL POR EQUIPO

4 Tubos Eppendorf 1.5 mL 1 gradilla

1 micropipeta de 100-1000 l 1 esptula de cromo nquel 1 micropipeta de 10-100 l 1 nave de pesado 1 celda 2 matraces de 250 mL



48


1. Todo el material de vidrio deber ser enjuagado previamente con EDTA. 2. Marcar 4 tubos Eppendorf como control positivo (C+), control negativo (C-), quercetina

y ANDG.

3. Preparar los tubos de acuerdo a la siguiente tabla, siguiendo el orden de adicin indicado en la columna reactivo.

Tabla 1. Preparacin de los tubos problema y control

Tubo Reactivo

Control positivo

(L) Control negativo

(L) Antioxidante 0.25 M

quercetina (L) ANDG (L) a. Xantina 100 100 100 100 b. EDTA 100 100 100 100 c. Solucin

amortiguadora 300 600 200 200

d. NBT 300 300 300 300 e. Antioxidante - - 100 100 f. XO* 300 - 300 300 g. Agitar e Incubar ** 1h 1h 1h 1h h. Cu(NO3)2 200 200 200 200

* Una vez adicionada, se empieza a contar el tiempo.** Cerrar el tubo, agitar la mezcla por inversin e incubar a 24-30C

4. Transcurrido el tiempo de incubacin leer las diferentes muestras a 560 nm empleando como blanco una solucin amortiguadora de carbonatos pH 10.2.

5. Interpretar los resultados obtenidos considerando que el control positivo representa el 100% de formazn en el sistema Xan-XO-NAT de acuerdo a la siguiente frmula.

% atrapamiento= 100 - [(AM) x100/A C+] En donde: AM= absorbancia de la quercetina y/o ANDG A C+= absorbancia del control positivo

6. Una vez obtenidos los resultados desechar el contenido de los tubos en un frasco etiquetado como R1.

7. Depositar las puntas y los tubos Eppendorf en un contenedor proporcionado por el profesor.



49

CUESTIONARIO

1. Reporte sus resultados en la siguiente tabla:

Tabla 1. Resultados por equipo

Control positivo

(C+)

quercetina ANDG

Absorbancia

% Atrapamiento 0 %

2. Cul de los dos antioxidantes muestra una mayor capacidad atrapadora del radical O2-

3. Considera que el consumo habitual de estos antioxidantes contribuira a disminuir el

estrs oxidante?. Justifique su respuesta.

4. Reporte los resultados grupales en la siguiente tabla:

Tabla 2. Resultados grupales

Equipo % de Atrapamiento

quercetina ANDG

1

2

3

4

promedio

desviacin estndar

4. En caso de que los resultados grupales muestren una elevada variabilidad discutan a que

factores se podra atribuir ese comportamiento.



50

BIBLIOGRAFA

Cadenas, E. Packer L. Handbook of Antioxidants. Marcel Dekker, Inc., New York, 2002. Klaassen, C.D., Watkins, J.B. Manual de Toxicologa de Casarett & Doull: la ciencia

bsica de los txicos. (5 ed.) McGraw-Hill, Mxico, 2001. Klassen, C.D. Casarett and Doulls Toxicologia. La ciencia de los venenos. (6a ed.). Ed.

Mc Graw Hill, Interamericana 2001. Martnez-Flrez, S., Gonzlez-Gallego, J., Culebras, J. M., y Tun, M. J. (2002). Los

flavonoides: propiedades y acciones antioxidantes. Nutricin Hospitalaria. XVII, 271278.

Owena, P.L., Johns, T. (1999). Xanthine oxidase inhibitory activity of northeastern north American plant remedies used for gout. Journal of Ethnopharmacology 64, 149160.

Tsutomu, K., Susumu, T., Hidetaka, N., et al. (2003). A novel and potent biological antioxidant, kinobeon A, from cell culture off sunflower. Life Sciences 74, 8797.

Wardman, P., (2007). Fluorescent and luminescent probes for measurement of oxidative and nitrosactive species in cells and tissues: Progress, pitfalls, and prospects. Free Radical Biology & Medicine 43, 9951022.

World Health Organization monographs on selected medicinal plants. Volume 1. 1999, Geneva. Pp 16-32.



51


1. Definicin del proceso de estrs oxidante.

2. Reaccin catalizada por la XO.

3. Concepto de radical libre y especies reactivas.

4. Concepto de antioxidante.

5. Reaccin de Fenton.

6. Propsito de la adicin secuencial de: xantina, EDTA, solucin amortiguadora de

carbonatos pH 10.2, nitroazul de tetrazolio, XO y Cu(NO3)2.

7. Completar los productos en el siguiente diagrama.

+

8. Especie qumica que absorbe a 560 nm.


1. Xantina 1.5 mM

Pesar 22.7 mg de xantina, agregar Na2CO3 0.4 M hasta solubilizar y aforar a 50 mL con

solucin amortiguadora de carbonatos.

2. Solucin amortiguadora de bicarbonato de sodio-carbonato de sodio 84 mM, pH 10.2

Pesar 970 mg de NaHCO3 y 1.01 g de Na2CO3, disolverlos con agua destilada. Ajustar pH a

10.2 y aforar a 250 mL.



52

3. Nitroazul de tetrazolio 0.1 M

Pesar 41 mg de nitroazul de tetrazolio y aforar a 50 mL con agua destilada. Guardar la

solucin en un frasco mbar en el refrigerador.

4. EDTA 0.1 mM

Pesar 33.6 mg de EDTA, disolver con agua destilada, aforar a 1L.

5. Xantina oxidasa

La enzima se preparar durante la sesin de laboratorio de acuerdo a la indicacin de los

profesores.

6. Nitrato de cobre 0.2 mM (Cu(NO3)2)

Pesar 4 mg de Cu(NO3)2 y aforar a 100 mL con agua destilada.

7. Quercetina 0.25 M Pesar 1.4 mg de quercetina y aforar a 250 mL con solucin amortiguadora de carbonatos

pH 10.2 (solucin stock).

8. ANDG 0.25 M Pesar 1.3 mg de ANDG y aforar a 250 mL con solucin amortiguadora de carbonatos pH

10.2 (solucin stock)


R1: xantina, xantina oxidasa, EDTA, solucin amortiguadora de carbonatos pH 10.2,

nitroazul de tetrazolio, quercetina, cido nordihidroguayartico, Cu(NO3)2, formazn, cido

rico, H2O2.



53

EVALUACIN DE LA ACTIVIDAD GENOTXICA DE LA CICLOFOSFAMIDA

UTILIZANDO LA TCNICA DE MICRONCLEOS EN MDULA SEA

OBJETIVO ACADMICO

Que el alumno sea capaz de determinar la actividad genotxica de un xenobitico

empleando la tcnica de cuantificacin de microncleos en mdula sea de ratn.

PROBLEMA

Identificar la presencia de microncleos, inducidos por ciclofosfamida, en eritrocitos

policromticos de mdula sea murina.

ANIMALES DE EXPERIMENTACIN

1 ratn ICR por equipo administrado 24 horas antes con ciclofosfamida con una dosis de 40

mg/Kg i.p. o un ratn ICR control negativo no tratado.

MATERIAL POR EQUIPO

Tijeras de diseccin 2 Portaobjetos 6

Pinzas de diseccin 2 Pipeta Pasteur 4

Bulbo para Pipeta Pasteur 4 Contador de clulas 1

Microscopio de Contraste 2

REACTIVOS

Solucin salina isotnica (SSI) Colorante de giemsa 2 %

Aceite de inmersin. Etanol (EtOH)

Solucin amortiguadora de fosfatos pH=6.8



54


NOTA: El siguiente protocolo requiere que no pasen ms de 30 minutos entre los pasos 1 y 9. 1. Sacrificar al ratn por dislocacin cervical.

2. Una vez muerto el animal de experimentacin fijarlo a la mesa de trabajo.

3. Dislocar la articulacin del fmur con la cadera, estirando las patas traseras del animal.

4. Diseccionar y extraer el fmur cortando por arriba de la cresta iliaca (en la cadera) y por

debajo de la rodilla.



55

5. Limpiar cuidadosamente cada fmur con papel hasta eliminar totalmente todo el tejido

muscular. Para facilitar la eliminacin del tejido muscular, tomar la parte que queda

debajo de la rodilla y rotarla al lado contrario del movimiento natural de la articulacin

de la rodilla y el femur.

6. Una vez limpio, cortar cuidadosamente ambas epfisis y lavar el interior del fmur con 3

mL de SSI empleando una jeringa de 3 mL con aguja del nmero 21. Recolectar y reunir

en un mismo tubo de 13 x 100, la mdula de cada fmur.

7. Envolver los restos del animal de experimentacin en una hoja de papel peridico,

colocarlos en la caja de contencin para su posterior incineracin.

8. Centrifugar a 3000 rpm durante 5 min el tubo que contiene la mdula (tubo del inciso 6),

extraer el sobrenadante cuidadosamente con una pipeta Pasteur y resuspender el botn

en una gota de SSI. Depositar el sobrenadante en una solucin de hipoclorito de sodio.



56

9. Realizar 4 extendidos de la siguiente manera: colocar en la orilla de un portaobjetos una

gota de la suspensin de mdula sea y un segundo portaobjetos justo atrs de la gota en

ngulo de 45. Dejar que la muestra se distribuya por capilaridad y deslizar suavemente

para formar una delgada capa de clulas.

10. Secar completamente los extendidos al aire.

11. Adicionar por goteo EtOH a las laminillas hasta cubrir la superficie y secar al aire.

Repetir esta operacin durante 5 minutos.

12. A cada laminilla adicionar dos o tres gotas de colorante giemsa 2% y cubrir con un

cubreobjetos, dejar reposar durante 10 minutos.

13. Retirar cuidadosamente el cubreobjetos, y enjuagar la laminilla con agua destilada.



57

14. Cubrir la laminilla con solucin amortiguadora de fosfatos pH 6.8 durante 5 minutos.

15. Enjuagar la laminilla una vez ms con agua destilada y secar al aire.

16. Observar al microscopio con aceite de inmersin, y registrar los siguientes datos:

El nmero de eritrocitos pol

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