TEMA 6

ADN I BIOTECNOLOGIA 1.- ADNs i ARNs: estructura, funcionament i tipuss. 1.1.- Estructura de l’ADNs. 1.2.- Tipus d’ADNs. 1.3.- Estructura i tipus d’ARNs. 2.- Enginyeria genètica

3.- Biotecnologia i salut 3.1.- La fabricació de fàrmacs 3.2.- Els animals transgènics 3.3.- Prevenció i diagnòstic de malalties hereditàries 3.4.- Teràpia gènica 3.5.- Aplicacions en agricultura i alimentació 3.6.- Conservació del medi ambient

1.- ADN i ARN: estructura, funcionament i tipus. 1.1.- Estructura de l’ADNs

L’ADN és la molècula encarregada d’emmagatzemar la informació genètica de totes les cèl·lules i, per extensió, de tot l’organisme portador.

Algunes proves d’aquest fet eren:

L'ADN era quantitativament constant en les cèl·lules dels individus d’una determinada espècie. La quantitat d'ADN dels gàmetes era meitat de la que tenien les cèl·lules somàtiques. Tret d'algunes excepcions, com més complexitat hi havia en un organisme més quantitat d'ADN tenia. La llum ultraviolada de 360 nm és fortament absorbida per l'ADN, la qual provoca mutacions y aquest fet provoca malalties o disfuncions.

L’ADN està format per moltíssimes unitats repetides anomenades nucleòtids. Cada nucleòtid està format, a la vegada, per: àcid fosfòric, base nitrogenada i un monosacàrid (glúcid format per una sola unitat). Àcid fosfòric és: H3PO4. Base nitrogenada: poden ser quatre: adenina (A), timina (T), citosina (C) i guanina (G). La seva estructura és bastant complexa. En general, l’ADN s’estructura de forma molt complexa.

• Estructura primària Ve determinada per la seqüència de nucleòtids. Aquests s’uneixen entre ells mitjançant un enllaç que té un únic sentit: 5→3. Aquest fet té una gran repercussió a l’hora de com es duplica l’ADN. Mitjançant anàlisis clíniques s’ha comprovat que la quantitat d’adenines (A) és igual que el de timines (T) i que les citosines (C) = Guanines (G).

GTCA +=+

En cada ésser viu es pot establir aquesta relació: AC

TG

=

Dos organismes seran filogenèticament més pròxims com més semblant tinguin aquesta proporció. Entre l’home i el ximpanzé només hi ha una diferència de mil·lèsimes. La seqüència de bases és el que determina els caràcters dels éssers vius: ... AATGACTGGC .... • Estructura secundària Va ser descoberta per Watson i Crick al 1953. Varen utilitzar la difracció de raig X i a partir de la igualtat numèrica de bases (A = T i C = G). L’ADN està format per: dues cadenes de polinucleòtids formant una doble cadena en forma d’hèlix al voltant d’un eix imaginari. − l’enrotllament és sempre dextrogir en sentit cap a munt. − té 10 parelles de bases (o nucleòtids) per volta i cada volta té 340 nm. els nucleòtids es disposen segons un pla perpendicular a l’eix. les diferents bases s’atrauen per ponts d’hidrogen. L’aparellament de bases es fa SEMPRE entre una base purina i una púrica: La unió C − G es fa mitjançant tres enllaços (ponts d'H) La unió A − T es fa mitjançant dos enllaços (ponts d'H). Aquest fet fa que la parella de bases timina-adenina sigui més vulnerable a canvis, com per exemple per irradiació solar.

les dues cadenes de polinucleòtids estan orientades en sentit contrari. les dues cadenes són complementàries; és a dir, quan en una cadena hi ha una TIMINA → en la mateixa posició, però en la cadena homòloga hi ha d’haver una ADENINA.

5A T TGCCTAGGTTTAC 3 3T A ACGGATCCAAATG5

NOTA: Hi ha altres conformacions, no tan habituals com la conformació B de l'ADN. S’han descobert petites desviacions d’aquesta estructura: les formes A i Z.

H

OH

H H

O

H

OH C2

BASE

5’

3’

P O

O

HO

H

OH

H H

O

H

OH C2

BASE

5’

3’

P O

O

HO

H

OH

H H

O

H

OH C2

BASE

5’

3’

H

OH

HH

O

H

OH2

BASE

5’

3’

PO

O

HO

H

OH

HH

O

H

OH C2

BASE

5’

3’

PO

O

HO

H

OH

HH

O

H

OH C2

BASE

5’

3’

1.2.- Tipus d’ADNs Existeixen cadenes d'ADN tant lineals com circulars. Algunes tipus d’ADN diferents al nostre poden ser: A 1.− ADN de virus: Poden tenir una sola cadena d'ADN molt curta o dues cadenes formant una doble hèlix. 2.− Alguns virus no tenen ADN: llavors la informació la transmet una cadena senzilla d'ARN. 3.− L'ADN de bacteris i procariotes: Alguns bacteris tenen una sola molècula d’ADN de doble cadena amb estructura d'hèlix. Alguns bacteris la cadena és circular. 4.- En els mitocondris i cloroplasts (orgànuls cel·lulars): Tenen una molècula d’ADN diferent a l'ADN del nucli. L'ADN mitocondrial és de doble cadena i circular. Aquest ADN permet a aquests orgànuls dividir-se independentment del nucli. ADN mitocondrial

5. − L'ADN en eucariotes: L’ADN s’empaqueta en unitats anomenades cromosomes. Hi ha una gran diversitat en el nombre de cromosomes que hi ha en una determinada cèl·lula. Cada cromosoma conté una sola molècula d'ADN, això si molt gran. La molècula d’ADN d’un cromosoma d'una cèl·lula de mamífer pot arribar a fer uns 2 metres de longitud.

Aquests cromosomes es troben concentrats en els nuclis cel·lulars. L’empaquetament de la molècula d’ADN en forma de cromosomes es pot fer gràcies a un conjunt de

proteïnes, anomenades histones. Les histones tenen un caràcter fortament bàsic, fet indispensable per poder contrarestar les càrregues negatives dels grups fosfats de la molècula d’ADN. Així doncs:

Cromatina = ADN (50%) + histones (50%)

1.3.- Estructura i tipus d’ARNs. És un polinucleòtid format per: • les bases nitrogenades A, G, C i U. • un glúcid: ribosa • l'àcid fosfòric L’estructura de l'ARN també té dues estructures: Estructura primària: Està formada per la seqüència dels nucleòtids A, C, G i U. La unió es per també té el sentit 5→3. Estructura secundària: En general és té una sola cadena. Només, en alguns casos, pot replegar-se per formar la doble hèlix, com és el cas de l’ARNt. Classes d'ARNs • ARN missatger (ARNm) Té un pes molecular superior (200.000 − 1.000.000 D) → equival a 3.000 − 5.000 nucleòtids. La seva importància radica en què transporta la informació des del nucli on es troba l'ADN fins el citoplasma on té lloc la síntesi de proteïnes (en els ribosomes). Té una vida mitjana curta; no sobrepassa les 12 hores de vida. Equival al 5% de l'ARN total d'un cèl·lula. L’ARMm es troba dividit, funcionalment, en triplets de bases nitrogenades, les quals formen els codons. Cada codó té una correspondència amb un aa, mitjançant l’ARNt. En eucariotes: En general, només té estructura primària, tot i que pot presentar doble hèlix en algunes zones. Sol estar associat a proteïnes. Com que és un ARNm de cadena simple i que es desplaça per la cèl·lula ha d’estar correctament marcat perquè no sigui destruït i perquè a l’arribar al ribosoma pugui fer la seva funció. El marcatge consisteix en:

• tenir una G metilada en l’extrem 5’ per tal d’evitar que l’ARN no sigui destruït. Després d’aquesta G-metilada hi ha tres bases que anomenat codó d’inici.

• a l’extrem 3’ hi ha una cua amb moltes A, fet que provoca una major estabilitat a la molècula. En procariotes: L’ARNm procariota no té caputxa ni cua. • ARN de transferència (ARNt) Té un pes molecular baix (10.000 − 30.000 D) → 70 − 100 nucleòtids. Hi ha uns 50 ARNt diferents. La seva importància radica en què cada ARNt es pot unir de manera reversible a un aa específic i introduir-lo en el ribosoma. Es troba lliure en el citoplasma. Equival al 10% de l'ARN total d'un cèl·lula.

Té quatre regions amb bases aparellades i 3 amb bases desaparellades formant uns bucles. → La forma global recorda un trèvol. lòbul I o D: reconeix a la sintetasa específica que unirà l'ARNt amb l'aa. següent. lòbul II o anticodó: està format per tres bases i forma un anticodó, aquest s'unirà per complementarietat en les bases al triplet (tres bases) de l'ARNm. Hi ha un anticodó diferent per cada aa. lòbul III o T: s'encarrega d'unir-se al ribosoma. lòbul IV: l’extrem 3’ comença sempre amb el triplet CCA; lloc on s'uneix l'aa corresponent, mitjançant una sintetasa. L’extrem 5’ es troba sempre fosforilat.

• ARN ribosòmic (ARNr) Equival al 80% de l'ARN total d'un cèl·lula. Té un pes molecular superior (200.000 − 15.000.000 D) → equival a 3.000 − 5.000 nucleòtids. Forma part dels ribosomes. (Els ribosomes són ARNr + proteïnes). Ribosomes: Es troben en el citoplasma o enganxats a la membrana del reticle endoplasmàtic.

Estan implicats en la síntesi de proteïnes. Estan constituïts per dues subunitats de diferent grandària. locus A (aminoacil): Centre on se situa l’ARNt unit a l’aa específic que transporta. Locus P (peptídic): Centre on se situa l’ARNt unit a la cadena peptídica en formació. Locus PT : lloc on se situa l’enzim peptidiltransferasa, que és l’enzim que transfereix els aa del locus P al locus A, catalitzant la formació de l’enllaç peptídic. La fenedura M: és la cavitat que serà ocupada per l’ARNm i per on avançarà a mesura que es vagi llegint.

IMATGES: TRANSCRIPCIÓ: ADN → ARN m. • RNA polimerasa fent la transcripció; és a dir, passant un fragment d’ADN (que es troba al nucli) a ARN missatger. El de l’esquerra és l’ADN que, a dins de la polimerasa, se separa i quan surt de l’enzim es torna a refer la seva estructura secundària (cadena part superor). A la dreta és veu la cadena simple d’ADN missatger.

• Imatge de múltiples ADN plolimerases transcrivint l’ADN; és a dir, passant l’ADN a ARN missatger.

Cadena doble d’ADN entrant

Cadena doble d’ADN sortint

Cadena simple d’ADN missatger

• Imatge real de la transcripció de l’ADN d’un cromosoma de tritó tenyit amb anticossos fluorescents: els de color verd s’han unit a l’ADN i el vermell a l’ARN missatger.

TRADUCCIÓ: ARNm → Proteïna.

2.- Enginyeria genètica

L’enginyeria genètica consisteix en la manipulació i modificació de la informació genètica d’un organisme. Aquesta manipulació es fa sobre l’ADN mitjançant la introducció de gens. Aquests gens poden provenir de la mateixa espècie o bé d’una altra relativament pròxima. Això suposa una veritable reprogramació de l’ésser viu, almenys en aquell aspecte referent al gen. Per poder fer aquestes manipulacions a tant petita escala varen ser necessaris molts descobriments. El primer es va produir als anys 70; quan es va descobrir que uns enzims dels microorganismes tenien la funció de destruir l’ADN estrany; eren els anomenats enzims de restricció. Més tard es van descobrir els plasmidis: eren unes estructures, també pròpies dels microorganismes, que permetien el pas d’ADN d’una cèl·lula a l’altra.

Conjuntament també es va descobrir que els retrovirus eren capaços de convertir l’ARN en ADN i que aquest últim eren capaços d’introduir-lo en l’ADN d’una cèl·lula.

Tant el plasmidis com els retrovirus són anomenats vectors. Són els responsables de transportar un

fragment d’ADN i introduir-lo en l’ADN principal. Amb això, l’enginyeria genètica pot seguir una sèrie d’operacions:

Obtenir fragments d’ADN que es volen manipular. Es poden manipular gens sencers, parts o grups de gens.

Unir fragments d’ADN en llocs escollits prèviament per tal de formar l’ADN recombinant. L’ADN

que s’introdueix pot provenir del mateix individu a d’altres de diferents. Per tal de separar i unir els diferents fragments s’utilitzen els enzims de restricció. Cada enzim de

restricció talla i uneix el fragment d’ADN per uns llocs específics de cada enzim. Els enzims de restricció reconeixen una determinada seqüència d’ADN (de 4 a 6 parells de

nucleòtids). L’enzim talla aquesta seqüència per un lloc determinat en una cadena i en el mateix lloc en la

cadena complementària. Per ex, Eco RI (un dels enzims de restricció més utilitzats) talla així: 5’ ... GAATTC ... 3’ → 5’ ... G AATTC ... 3’ 5’ ... CTTAAG ... 3’ → 5’ ... CTTAA G ... 3’ A la dreta s’observa per on ha tallat l’enzim. Amb altres enzims es pot unir nous fragments entre aquests o després d’haver-ne eliminat algun. S’introdueix l’ADN dintre d’una cèl·lula mitjançant els vectors, per tal que la nova cèl·lula amb

l’ADN recombinant pugui portar a terme les funcions que li ha conferit el nou fragment d’ADN introduït. A més de fer servir els vectors (plasmidis i virus) es pot introduir l’ADN mitjançant microinjeccions,

però només si les cèl·lules són de mida gran.

En els ratolins, la freqüència d’integració del material genètic dintre de les cèl·lules és d’un 25%. Si s’ha introduït amb èxit es crea un organisme transgènic.

organisme transgènic: és aquell organisme al qual se li ha introduït un fragment d’ADN no propi de forma artificial.

L’ADN introduït ha de funcionar correctament i ha de ser funcional; és a dir s’ha de poder replicar.

Tot això està molt bé però abans d’introduir un fragment d’ADN és necessari localitzar-lo en l’ADN original, i això ja és més que difícil. Per això es fa servir la tècnica PCR (reacció en cadena de la polimerasa). Una vegada localitzat aproximadament el fragment se’n una enorme quantitat de còpies; així s’obtenen moltes còpies del gen que volem aïllar; i evidentment, així és més fàcil de localitzar-lo.

3.- Biotecnologia i salut

La biotecnologia és una branca de la biologia que estudia totes aquelles aplicacions que els éssers vius poden oferir a l’espècie humana des del punt de vista sanitari, com econòmic, etc.

Aquestes aplicacions ja en són moltes, i a mesura que passa el temps, se n’estan formant de noves. Algunes de les més importants són: 3.1.- La fabricació de fàrmacs

L’Enginyeria genètica ha permès fer grans avenços gràcies a la inserció de gens en microorganismes per tal de poder produir determinades substàncies de manera intensiva, que d’altre manera seia molt costós o perillós. Alguns casos actuals són: la insulina pel tractament de la diabetis

l’hormona del creixement que provoca el nanisme. Abans s’extreia dels cadàvers. El factor VII de coagulació sanguínia que produeix l’hemofília, s’obté d’animals transgènics, els quals tenen un gen inserit que codifica per aquesta proteïna. 3.2.- Els animals transgènics

Els animals transgènics són aquells en els quals se’ls ha introduït algun gen d’una altra espècie o propi, però modificat. Són importants en diversos camps: Per poder estudiar determinades malalties de la nostra espècie (com ara el càncer). S’introdueix (en un ratolí, un primat, etc.) el gen que es vol estudiar i que se sap que produeix la malaltia que es vol estudiar. Més tard s’experimenta amb nous fàrmacs i es fan els assaigs clínics necessaris. Els xenotransplantaments. Es tracta d’obtenir animals transgènics dotats d’òrgans compatibles estructuralment i fisiològicament amb els dels humans. Una de les espècies més estudiades és el porc. S’ha practicat amb òrgans com el cor, el fetge, els ronyons, la medul·la òssia, etc. Amb aquesta tècnica desapareix completament la manca de disponibilitat d’òrgans i els problemes de rebuig. L’únic problema és de tipus ètic. El problema és sempre el mateix: els animals estan a la nostra completa disposició o també mereixen no ser tractats com a simples recanvis. 3.3.- Prevenció i diagnòstic de malalties hereditàries

Gràcies al projecte humà es coneixeran més de 100.000 gens i el seu emplaçament exacta dins de cada cromosoma.

Fins ara només se’n coneixen uns 4000 que produeixen malalties; és a dir, gens que tenen alguna mutació i que codifiquen per a proteïnes defectuoses. Conèixer la seqüència d’aquest gen defectuós ens permetrà diagnosticar la malaltia de manera precoç i poder aplicar els tractaments preventius de manera eficaç. Avui en dia ja existeixen algunes tècniques d’aquest tipus que s’han mostrat molt eficients. 3.4.- Teràpia gènica

El pas següent i natural del diagnòstic precoç de malalties és la teràpia gènica. Aquesta consisteix en guarir de certes malalties mitjançant l’enginyeria genètica.

Els vectors que hem vist en capítols anteriors s’utilitzen per a introduir en l’ADN de les cèl·lules humanes. Generalment s’utilitzen retrovirus (ARN → ADN) ja que tenen una gran facilitat per introduir els seu codi genètic dins del de les cèl·lules que infecten.

Les primeres tractades són les patologies que afecten a la síntesi de l’hemoglobina (proteïna encarregada de transportar gasos per la sang). El gen implicat en la síntesi d’aquesta proteïna es troba en les cèl·lules anomenades eritroblasts. Si s’extreuen aquestes cèl·lules del cos humà, se’ls introdueix el gen funcional; es cultiven en el laboratori i es retornen tan intactes com sigui possible al pacient. Si es fa correcte es pot arribar a donar per guarida la malaltia.

Actualment s’estan fent grans estudis per aplicar l’enginyeria genètica coma a teràpia generalitzada; però hi ha grans riscos que es desconeixen o que no es controlen: - Els retrovirus utilitzats com a vectors poden tenir algun efecte desconegut? - Els canvis en l’estructura de l’ADN no repercutiran en la descendència o en el propi individu al cap del temps? - etc. 3.5.- Aplicacions en agricultura i alimentació

Els vegetals tenen una gran versatilitat cel·lular la qual cosa facilita molt la tasca de l’enginyeria genètica. Molts vegetals són capaços de regenerar-se a partir de qualsevol cèl·lula. Això implica que tota la nova planta que s’ha format tindrà la característica que s’ha introduït per primera vegada en la cèl·lula inicial. Però també vol dir que els òrgans reproductors i les seves cèl·lules també tindran aquests nou gen y per tant s’heretarà a la descendència. Al principi, el fet que els vegetals tinguessin parets vegetals va dificultar la tasca d’introduir ADN. Però el descobriment que els plasmidis d’Agrobacterium tumefaciens s’introduïen en les cèl·lules d’altres vegetals i podien inserir fragments d’ADN, va permetre iniciar l’enginyeria genètica en vegetals. L’únic que feia falta era eliminar els gens del plasmidi d’A. tumefaciens que provocaven els tumors. Un altra mètode efectiu és la introducció de gens en les cèl·lules mitjançant les microprojectils, són unes petites esfèrules microscòpiques que porten l’ADN que es vol introduir. Els dos principals objectius de la biotecnologia és: pretendre aconseguir plantes i cultius amb un millor renidment: creixement més ràpid, més nutritius, major control sobre els processos biològics (floració, maduració, caiguda del fruit, etc.), resistencia a les plagues, etc. Per una altra part, es pretén que les plantes produeixen substàncies terapèutiques: medicaments, hormones, etc.

Les plantes a les quals se’ls ha inoculat algun estrany se les anomena plantes transgèniques. Les seves avantatges són enormes, però la seva aplicació a gran escala no està exempta de problemàtica. Alguns aspectes inquietants són: → l’efecte d’aquests aliments manipulats sobre les persones que els consumeixen. → la possibilitat que aquests gens (mitjançant hibridació) passin a les plantes autòctones i als ecosistemes. → la pèrdua de la biodiversistat en el món de l’agricultura és molt important. → s’haurien de distingir aquests productes mitjançant etiquetes dels que són “naturals” o no transgènics? Alguns dels aliments transgènics ja comercialitzats són el Blat de moro. Els EUA van ser els primers en comercialitzar una varietat de blat de moro resistent als herbicides i tòxic per ala majoria d’insectes. En el camp de la ramaderia, la manipulació genètica està encarada a aconseguir: - un creixement més ràpid - un increment de la producció Els primers animals transgènics se’ls va transferir un a colla de gens que codificaven per l’hormona del creixement; la qual cosa els permetia produir carns més magres i sense greixos. Els porcs transgènics patien úlceres gàstriques, dermatitis (inflamacions de la pell) i problemes renals. → Falta molt de camí per arribar a manipular els gens a voluntat sense problemes. 3.6.- Conservació del medi ambient

Algunes de les aplicacions de la biotecnologia enfocades a la conservació del medi ambient són: Neutralització de metalls pesants: Els metalls com ara el plom, el cadmi, el mercuri, etc. són molt perillosos perquè s’acumulen en els organismes en les xarxes tròfiques. S’ha dissenyat bacteris dotats d’unes proteïnes que s’uneixen i capten els metalls pesants. Degradació de combustibles fòssils: S’han dissenyat bacteris dotats de dues característiques: porten una membrana que els protegeix contra moltes substàncies tòxiques. porten uns gens que els fan capaços de degradar els hidrocarburs (petroli i altres crus). Tractament de residus i obtenció de biogàs: Les aigües residuals que provenen de les indústries, agricultura o domèstic es poden tractar amb bacteris. Si les condicions es mantenen sense oxigen, els bacteris anaeròbics degraden els residus i generen metà; un gas que després es pot utilitzar coma a combustible.