Applicaciones de los Applicaciones de los Applicaciones de los aCGH al diagnóstico Applicaciones de los aCGH al diagnóstico aCGH al diagnóstico

prenatalaCGH al diagnóstico

prenatalprenatalprenatalA. PlajaA. Plaja

Programa de Medicina MolecularHospital Vall d’Hebron

Programa de Medicina MolecularHospital Vall d’Hebronpp

aCGH y DPaCGH y DP

• ¿De donde venimos?

• ¿Dónde estamos?

• ¿A dónde vamos?¿A dónde vamos?

aCGH y DPaCGH y DP

• ¿De donde venimos?

• ¿Dónde estamos?

• ¿A dónde vamos?¿A dónde vamos?

Defecto congénitoDefecto congénito

• Anomalías del desarrollo • Anomalías del desarrollo morfológico, estructural, funcional o molecular, funcional o molecular, presentes al nacer (OMS).

• Pueden manifestarse después del nacimiento.

• Afectan a un 2%-3% de los recién nacidoslos recién nacidos.

Defecto congénitoDefecto congénito

Monogénicos Infecciones 2%T ó 2%

Cromosómicos

Monogénicos7% Teratógenos 2%

Otros 1%Cromosómicos7%

DesconocidosPoligénico-multifactoriales20 25 % 50-60%20-25 %

¿Qué es una anomalía cromosómica?¿Qué es una anomalía cromosómica?

Anomalía cromosómica: mutación >5 Mb,(visible al M. O.)

Afectan al 0.92% RN(0,4% desequilibrada)( , q )

del(2)(q37.3)J Med Genet 1992 29: 103-108.

Cariotipo convencionalCariotipo convencional

Colcemid

CultivoMedio de cultivo

Tripsina

15-21

Fijador Choque hipotónico

Estudio al microscopio

15 21dias

ExtensiónBandeo

aCGH y DPaCGH y DP

• ¿De donde venimos?

• ¿Dónde estamos?

• ¿A dónde vamos?¿A dónde vamos?

DP cromosómicoDP cromosómico

Economia

SensibilidadSensibilidad

Rapidez

Citogenética molecularCitogenética molecular

Cariotipo FISHCariotipo FISH

MLPAQF-PCR Array CGH

Técnicas rápidas (12-24 h.)Técnicas rápidas (12-24 h.)

Detección del 80-90%? de las anomalías en 12-24 horas.Gestantes 35 años a.

estruct= 2x a. numéricas.

F H

Gestantes 37 años a. estruct= a. numéricas.

FISH

QF-PCR

Estrategias de cribadoEstrategias de cribado

Cribado d d

1er trimestre 90% d ó por edad90% detección

2o trimestre

Cribado

2o trimestre 60% detección

bioquímico¿5% FP?

Cribado ecográfico

Mutaciones genómicas recurrentesMutaciones genómicas recurrentes

La arquitectura del DNA provoca deleciones o duplicaciones recurrentes de

pequeño tamaño (< 5Mb)

Mutaciones genómicas clásicasMutaciones genómicas clásicas

Mutaciones genómicas clásicasMutaciones genómicas clásicas

S WilliamsS. Williams

Nuevas mutaciones genómicasNuevas mutaciones genómicasSíndrome Características

Deleción 1q21.1 Pacientes normales, con retraso mental, cardiopatía , hipotonía, convulsiones y cataratas.

óDeleción 1q21.1 Trombocitopenia-agenesia/hipoplasia de radio (TAR)

Deleción 8p23.1 Cardiopatía congénita, hernia diafragmática, retraso mental, criptorquidia.

Deleción Pacientes normales, retraso mental, convulsiones, alteraciones de D c ón 15q13.3

ac nt s norma s, r traso m nta , con u s on s, a t rac on s conducta, cardiopatía, esquizofrenia.

Deleción 15q24 Retaso mental moderado,, microcefalia, anomalías digitales, hipospadias, tejido conectivo flácido.

Deleción Trastorno del espectro autista (1% de autistas) Retraso mentalDeleción 16p11.2

Trastorno del espectro autista (1% de autistas), Retraso mental

Deleción 16p13.11

Locus de susceptibilidad a retraso mental /malformaciones.

D l ió P bl d li t ió hi t í ( i áti ) b j l Deleción 17q21.3

Problemas de alimentación, hipotonía (no-miopática), peso bajo al nacer (< 3%), retraso mental, epilepsia, cardiopatía, anomalías renales

Deleción 22q11.2

Prematuridad, retraso de crecimiento pre y posnatal, anomalías esqueléticas, cardiopatía, paladar hendido.

Mutaciones genómicas recurrentesMutaciones genómicas recurrentes

Las nuevas técnicas permiten evaluar un ú d l gran número de loci:

diagnóstico de síndromes •diagnóstico de síndromes sin fenotipo característico

•diagnóstico cuando no es posible examen detallado posible examen detallado del paciente (DP).

MLPAMLPA

Desnaturalización

MLPA (MRC Holland) subtelomérico: DesnaturalizaciónDetección de aneuploidias + deleciones/

Hibridización

deleciones/ duplicaciones terminales.

Diana A Diana BLigación

MLPA t. recurrentes18 síndromes

Ligasa termoestable

Ligación

Amplificación

18 síndromes

Diana A Diana B

Array CGHArray CGH

il pacientecontrol

Array CGHArray CGH

Las CNV (Copy Number Variations) Las CNV (Copy Number Variations) ( py m )son muy frecuentes

( py m )son muy frecuentes

Array CGHArray CGH

qChip PreqChip Pre

1. ~2000 BACs (x4plex)

2. Evita los CNVs conocidos

3. Cobertura: • Regiones teloméricasg• Regiones pericentroméricas• Síndromes genómicos (>200)

Proyecto evaluación tecnologias DPProyecto evaluación tecnologias DPEvaluar las técnicas disponibles de DP citogenético en un

contexto real (900 gestaciones referidas a HUVH & HULP)HULP)

Cariotipo FISHCariotipo FISH

MLPAQF-PCR Array CGH

Counseling / Informed consentMetodologiaMetodologiaExtracción DNA

(células no cultivadas)

4 L

LA (81%)mínimo 16 mL

>4mL

C l i

VC (18%)

FC (1%) Cultivos12mL

FC (1%)

½ cariotipos

½DNA

~45% poca calidad

>1μg55% aceptable

670ng

ComparativaComparativa• Muy baja tasa de no resultados• Muy rápido T. respuesta 6-24h

D t ió b j 80 85% i tiQF-PCR

• Detección baja 80-85% cariotipo• Baja tasa de no resultados• Lento T respuesta: 12-21 díasCariotipo

MLPA • Elevado tasa de no resultados falsos +

Lento T. respuesta: 12 21 días• Buena tasa detección

Cariotipo

MLPA kits no DP • T. respuesta rápido/lento: 7/25* días

• Buena tasa detección• Muy baja tasa de no resultados• Muy baja tasa de no resultados• T. respuesta rápido/lento: 3-8/25* días• Detección muy elevada

*: tiempo de respusta si se requiere cultivo celular

ComparativaComparativa

Coste Cariotipo 142,50 €QF-PCR 40 €MLPA 70,42 * 2= 140,84 €aCGH 242,04 €,

Array CGH: resolución elevadaArray CGH: resolución elevada

Biopsia corial en gestante de 34 años con 3 Biopsia corial en gestante de 34 años con 3 abortos previos y riesgo cribado de 1/54Cariotipo pareja normal

Dup ~5Mb 8q24-qterD p M q q

Del ~7Mb 13q33-qter

Array CGH: resolución elevadaArray CGH: resolución elevada

1 2 3 4 5

6 7 8 9 10 11 12

13 14 15 16 17 18

19 20 21 22 X

Array CGH: resolución elevadaArray CGH: resolución elevada

Array CGH: significado inciertoArray CGH: significado inciertoDel / Dup pericentromericas / subtelomericas sin genes

relevantes Probablemente CNVs poco frecuentesProbablemente CNVs poco frecuentes

Dup 1,5 Mb feto XX

Dup 1.5Mb 19q11 heredada de la madre (no información)

Difficult ManagementrearrangementsRESULTS: aCGHArray CGH: resultado inciertoArray CGH: resultado incierto

Penetrancia incompleta

Dup ~2Mb 1q21 1 (incluye TAR)Fallot Eco normal

Dup ~2Mb 1q21.1 (incluye TAR)

Herencia paterna

Padre: normal Feto anterior: no hay muestrayFeto actual: ECO normal

ILE

aCGH y DPaCGH y DP

• ¿De donde venimos?

• ¿Dónde estamos?

• ¿A dónde vamos?¿A dónde vamos?

DP molecular v citogenético DP molecular v citogenético

Citogenética molecularC togenét ca molecular

Citogenética lá iclásica

¿Desplazarán las nuevas técnicas a la citogenética clásica?

Asesoramiento genético + complejoAsesoramiento genético + complejo

La nueva tecnología d ó ll diagnóstica lleva a un asesoramiento genético

complejo p j

Estrategias de cribadoEstrategias de cribado

1. ¿Funciona el cribado bi í i / áfi l bioquímico/ecográfico con las reorganizaciones submicroscópicas?

2. El cribado de 1er trimestre favorece la obtención de VC y yLA >16s

AgradecimientosAgradecimientos

Valle Hebrón

Luís Perez JuradoValle Hebrón

(C i tip Valle Hebrón

(asesoramiento)Valle Hebrón

UDP

(Cariotipo,MLPA, QF-PCR, DNA)

Cristina PreciadoClara SerraAna Cueto

Teresa Vendrell

Mª Angeles SánchezJuan Sagalá

Cristina PreciadoCarmen Mediano

Leonor Espí Matilde Jallas

Q-Genomics (arrays)

Miguel del Campo

CRG

Matilde JallasAsunción Fernández Valle Hebrón

UMF

Lluis ArmengolManel Garcia

Olaya VillaBenja Rodríguez

Elena CarrerasElisa Llurba

Teresa Higueras