Articulo 1 - Biote

7/21/2019 Articulo 1 - Biote

1/14

LA EXPRESIN DE FACTOR DE CRECIMIENTO EPIDRMICO HUMANO

RECOMBINANTE EN ESCHERICHIA COLI Y CARACTERIZACIN DE SU

ACTIVIDAD BIOLGICA

Introduccin

El sistema de expresin de Escherichia coli es conocido por ser el ms fcil, yuna tcnica ms rpida, de bajo costo usado para expresar cantidades tiles deprotena recombinante. Estas caractersticas, junto con el conocimiento previoacerca de E. coli y los muchos aos de experiencia con la expresin de !enesforneos, han establecido E. coli como el or!anismo lder de aco!ida para lamayora de aplicaciones cient"cas en la expresin de protenas #$%.

&actor de crecimiento epidrmico 'E(&) es un polipptido de cadena simple *ueconsta de + aminocidos con un peso molecular de aproximadamente -.//0a. 1os seis residuos de cistena en la secuencia de hE(& forman tres enlacesdisulfuro, *ue son necesarios para el E(& humano 'hE(&) para serbiol!icamente activos #%. E(& fue aislado de las !lndulas submaxilares de

ratones machos adultos #% y descubri en la orina humana como un inhibidorde la secrecin de cido !strico #2%. 3s tarde, se demostr *ue el E(& caustanto la proliferacin de las clulas epiteliales y la inhibicin de la secrecin decido !strico.

4hora, hE(& se ha convertido en uno de los factores de crecimiento mspopulares estudiadas en ciencias de la vida, as como los campos de labiotecnolo!a. hE(& es un potente estimulador de clulas epiteliales, clulasendoteliales, y la proliferacin de "broblastos tanto in vitro como in vivo, lo *ueresulta en su potencial como un a!ente curativo prometedor para eltratamiento de diversas piel y heridas corneales #+%. 5ambin es un buencandidato para el tratamiento de lceras !stricas debido a *ue inhibe lasecrecin de cido !strico y re!enera la capa de la mucosa !strica #2%.

67u es hE(& y *ue diferencia hay con E(&8

El hE(& es un potente estimulador de clulas epiteliales, clulas endoteliales, yla proliferacin de "broblastos tanto in vitro como in vivo, lo *ue resulta en supotencial como un a!ente curativo prometedor para el tratamiento de diversasafecciones de la piel, adems es un buen candidato para el tratamiento delceras !stricas debido a *ue inhibe la secrecin de cido !strico y re!enerala capa de la mucosa !strica. El E(& 'factores de crecimiento) corresponden aun conjunto de molculas de naturale9a proteica y:o pptidos biorre!uladorescuya funcionalidad fundamental radica en el control del ciclo celular. 140I&E;E140A; 0E 14@ 14@ B E1A5;A


2/14

periplsmico o el crecimiento celular. Curi"cacin entonces sera ms sencillopara una protena intracelular como el producto no se contamine concomponentes citoplasmticos #D%.

4dems, la formacin de cuerpos de inclusin se evita, y se reducira posiblesefectos txicos del producto polipeptdico hE(& en la clula husped #%. Cararesolver estos problemas, se utili9 un ampicilina '4mp) resistentes a la cepade E. coli 0?+a para producir la protena secretada hE(&. >n !en sinttico parahE(& se fusiona con la protena de membrana externa 4 'Amp4) pptido seal*ue estaba contenida en la expresin p&14(F45@ vectorial '@i!ma 4ldrich,EE.>>.). 1a secuencia seal de Amp4 es responsable de la secrecin de Amp4,una protena abundante en E. coli desde el espacio citoplasmtico en elespacio periplsmico *ue considera libre de cuerpos de inclusin y no hayposibles efectos txicos en la clula husped. 1as protenas excretadasconocidas como protenas de fusin son !eneralmente estables, no de!radasi!ni"cativamente, y tienen bajos niveles de actividad de la proteasaextracelular. &inalmente, el estudio sobre la actividad biol!ica del hE(&expres en E. coli debe llevarse a cabo, ya *ue es muy importante paraveri"car *ue el hE(& sinteti9ado fue bioactivo y completamente idntica a laprotena ori!inal y hE(& estndar.

345E;I41E@ B 3G5A0A@

Expresin y 4islamiento de hE(&

>n plsmido recombinante, p&14(F45@ 'hE(&) se construy y se transform en

la cepa de E. coli, 0?+a #H%. >na colonia individual fue reco!ido de 1uriaertani '1) placa de a!ar y se inocul en + ml de medio 1 *ue contiene +/m! : ml 4mp y /,2J de !lucosa y despus se incub en el a!itador orbitaldurante la noche a D K


3/14

Curi"cacin de hE(& con 4=5IF&14( 3 4Onity (el

?E(& recombinante se puri"c usando el Pit de la protena de fusin &14(inmunoprecipitacin '@i!ma 4ldrich, EE.>>.). Este Pit ofrece unainmunoprecipitacin rpida y e"ciente y la elucin de una protena de labandera de eti*uetado activo. El procedimiento incluye varias etapas de

centrifu!acin y eliminacin de sobrenadante. 1a resina de !el de a"nidad antiF&14( 3 se suspendi con solucin salina tampn 5ris #+/ m3 5risF?>.). 1a e"ciencia de elucin est muy altoutili9ando este mtodo. 4 $//Fl Q &14( tampn de elucin '@i!ma 4ldrich,EE.>>.) se aadi a la resina en el tubo de ensayo y se incub con a!itacin

suave durante / min a 2 K


4/14

1a concentracin de protena hE(& se cuanti"c usando E(&, hE(&, io4ssayU E1I@4 Vit 'Estados >nidos iol!ica, EE.>>.) de acuerdo con larecomendacin. @e prepararon diluciones en serie de estndar de E(& en elran!o de $, a $/// p! : ml, y la cantidad de protena hE(& en las muestrasse midi a 2+/ nm usando un ensayo de inmunoabsorcin li!ado a en9imas'E1I@4) lector '@unrise, 5ecan, 4ustria) . 5odas las mediciones se reali9aron porduplicado, y los resultados se calculan como un promedio de dos lecturas'recomendacin Pit).

El anlisis por inmunotransferencia de la protena hE(&

1a protena hE(& se resolvi primero en un $+J 5risF!licina dodecil sulfato desodio '@0@) F !el de poliacrilamida, despus se trans"ri a una membrana dediWuoruro de polivinilideno '3illipore, EE.>>.) y posteriormente se hacereaccionar con un ratn antiFhE(& anticuerpo monoclonal '4bcam, EE.>>. ).3onoclonal antiFhE(& ',/ m! : ml) con $L $./// diluciones se utili9 comoanticuerpo primario e I!( antiFratn marcado por peroxidasa de rbano picante'$L $./// diluciones) como anticuerpo secundario. 1a unin del anticuerposecundario fue desarrollado utili9ando sustrato 04 '>.) losreactivos de color.

?umanos "broblastos drmicos

?umanos normales "broblastos drmicos '?0&) de


5/14

Corcentaje de >.M &i!. $).

5ambin reaccion fuertemente con el anticuerpo monoclonal antiFhE(&, *uevisuali9a como una banda !ruesa distinta en la membrana de diWuoruro depolivinilideno 'carril ) en comparacin con el hE(& estndar 'carril ) en la &i!.

.


6/14


7/14

hE(& periplsmico en ?0& se extendi a 2 h de incubacin '&i!. 2). En laconcentracin de $/ n! : ml, no se encontr una diferencia si!ni"cativa delefecto proliferativo en comparacin con la concentracin de / n! : ml con unaumento de $,+ veces, $ n! : ml con aumento de $, veces, /,$ n! : ml conaumento de $, veces, /,/$ n! : ml con aumento de $,- veces, y /.//$ n! :ml con aumento de $, veces. @e observ una diferencia si!ni"cativa de laproliferacin celular en $/ y $ n! : ml en comparacin con /,/$ y /,//$concentraciones hE(& periplsmicas n! : ml. @e observaron halla9!os similaresa los *ue en 2 y 2 h de incubacin, incluso cuando el perodo de incubacinse extendi a D h '&i!. +). El efecto proliferativo de hE(& periplsmico seencontr *ue era si!ni"cativamente diferente a una concentracin de $/ n! :ml en comparacin con la concentracin de / n! : ml con el aumento de $,-$veces, lo *ue aumenta an ms a $ n! : ml con $,- veces y, "nalmente, dejen /,$ n! : ml con $,+H veces, /,/$ n! : ml con $,+D veces, y /.//$ n! : ml con$,+ veces. 0iferencia si!ni"cativa de la proliferacin celular tambin se observa las $/, $, /,$, y /,/$ n! : ml en comparacin con /,//$Fn! : ml deconcentracin hE(& periplsmico.


8/14

se encontr a una concentracin de $/ n! : ml hE(& con $-,+J de 2 h deincubacin, +J de 2 h de incubacin, y -2,J de D h de incubacin. Elresultado mostr *ue el porcentaje de crecimiento se incrementproporcionalmente con el aumento de las concentraciones de factor decrecimiento. 4dems, existe una dosis e"ca9 'E


9/14

0I@@IY=

En el presente estudio, hE(& recombinante se expres en el espacioperiplsmico de E. coli utili9ando un vector de expresin aminoFterminal. Estevector contiene la seal de secrecin Amp4 para la secrecin de protenas defusin &14( en el espacio periplsmico de E. coli. El interfern alfa y - sesecretan a travs de la membrana citoplsmica en el espacio periplsmico deE. coli cuando la protena madura se fusion con el pptido seal de Amp4,

una importante protena de la membrana exterior de E. coli #$/, $$%. 0el mismomodo, el hE(& expresado podra ser secretada en el medio de manera rpida ye"ciente, debido a su menor peso molecular #$%.

4 travs de los aos, la tecnolo!a de protena de fusin se ha convertido enuna herramienta para la solucin de problemas conectado a la produccin deprotena recombinante. >n nmero de sistemas de fusin de !enes se han


10/14

desarrollado para bene"ciarse de las interacciones moleculares derivados de latecnolo!a de fusin !nica. Estos sistemas incluyen varias extensiones de laprotena diana, *ue conducen a un aumento en la solubilidad y el rendimientode la protena a ser expresada. Cor otra parte, las propiedades de la eti*uetaadicional facilitar la identi"cacin y proporcionan un procedimiento depuri"cacin de una etapa de la protena haciendo pasar extractos celulares osobrenadantes a travs de columnas de una matri9 apropiada, por ejemplo,a"nidad. 0ebido a varios factores, tales como la posibilidad de un efectoadverso de la fusin en funcin de las protenas, se re*uiere la eliminacin dela eti*ueta a travs de consideracin. Cor otro lado, la eti*ueta &14( Umuestra todas las ventajas y desventajas de puri"cacin por inmunoa"nidad.4un*ue altamente selectiva, la capacidad de unin fue baja, por lo *ue ampliarla escala de una empresa costosa. 4dems del costo y baja capacidad,cromato!rafa de inmunoa"nidad a !ran escala aplicada a la produccin deprotenas teraputicas tiene varias desventajasL las fu!as li!ando, lainestabilidad y la necesidad de la validacin de la produccin de anticuerpos.1a estabilidad de la columna de cromato!rafa de a"nidad depende de la

naturale9a y fuente de los extractos crudos.

4dems, la eti*ueta &14( U, diseado para ser inmuno!nico, se debe *uitarde las protenas teraputicas. En la mayora de los casos, esto se puede lo!rarcon entero*uinasa. 4 pesar de estos inconvenientes, la protena de fusin &14(era til en la investi!acin y el desarrollo, *ue se puede puri"car y ensayadapor E1I@4 o cual*uier otro mtodo de deteccin inmuno*umica, a!ili9ando asla elevacin de antisueros frente a una protena deseada y estudios decaracteri9acin #$% fcilmente.

En este estudio, la expresin se reali9 en pe*ueo volumen para el estudiopreliminar de la protena recombinante hE(& de produccin usando el sistema

de expresin p&14(F45@ en E. coli. Este halla9!o permitira optimi9ar yproceder a la produccin a !ran escala con "nes comerciales utili9ando elsistema de biorreactores. Esto se debe a *ue en la actualidad, no existe unestudio reali9ado utili9ando el sistema de expresin p&14(F45@ para "nescomerciales, y la protena sinteti9ada fue demostrado ser bioactivo. En !eneral,un rendimiento mximo hE(& de +/ m! : l se obtuvo por BadTad et al. #$2% enfermentadores de laboratorio p? controlado *ue contienen medio 31.

>n ensayo biol!ico es un procedimiento de prueba biol!ica para estimar laconcentracin de una sustancia activa farmacutica en un producto formulado

o material a !ranel. En contraste con los mtodos fsicos o *umicos comunes,se consi!ue informacin detallada sobre la actividad biol!ica de unasustancia. 0urante la ltima dcada, los ensayos biol!icos se han vuelto msimportantes para un pro!rama de control de calidad e"ca9 en el desarrollo yfabricacin biofarmacutica. El enfo*ue !eneral de la mayora de ensayosbiol!icos es reali9ar un ensayo de dilucin, *ue mide las respuestas biol!icasen varias dosis #$+%. >n supuesto clave de un ensayo de dilucin es *ue elcomponente activo si!ue el mismo principio de la actividad en la preparacin


11/14

estndar y la muestra. En tales casos, la preparacin desconocido puede, enteora, ser derivada diluyndola con componentes inertes o mediante laconcentracin de la solucin a !ranel. Este concepto se puede comprobar conla ayuda de un modelo de lnea paralela adecuado para el anlisis de losresultados obtenidos por varios ensayos biol!icos #$-%. En el presente estudio,355 ensayo de proliferacin celular en ?0& se haba utili9ado para determinarla actividad biol!ica del hE(& expres en E. coli. @eleccin de lasconcentraciones de factor de crecimiento para dcuples dilucin se extrapol apartir in vitro y en protocolos de investi!acin estudios in vivo.

El estudio se llev a cabo en cultivos de ?0& para determinar la actividadbiol!ica del hE(& sinteti9ada en E. coli mediante el uso de ensayo deproliferacin celular 355. En este estudio, la incubacin de ?0& con diferentesconcentraciones hE(& se llev a cabo. Esto es para estudiar el efecto dediferentes concentraciones de hE(& en la estimulacin de la proliferacincelular. En el presente estudio, 355 ensayo de proliferacin celular de 2 h deincubacin mostr un aumento si!ni"cativo de la proliferacin celular, *ue se

produjo incluso a la mayor concentracin de $/ n! : ml.


12/14

Atro halla9!o interesante fue *ue la incubacin a D h se encontr *ue erae"ca9 perodo en la produccin el nmero ms alto de la proliferacin celular,as como el porcentaje de crecimiento. 4 su ve9, la dosis e"ca9 'E


13/14

Atro punto importante es *ue los resultados de este estudio mostraron *ue nohaba diferencia si!ni"cativa para el porcentaje de crecimiento en lacomparacin entre hE(& comercial y hE(& periplsmico en ?0&. &ueronreali9ados y comunicados por En!ler et al conclusiones similares. #%. Elpresente estudio demostr *ue el hE(& secretado a partir de E. coli fuecomparable en su actividad biol!ica en ?0& a hE(& comercial producida en E.coli. Este halla9!o est de acuerdo con EbrahimiF; et al. #$%. Ellos encontraron*ue la bioactividad de hE(& secretado fue consistente con la protena autntica*ue indica la conformacin nativa de la protena con los tres puentes disulfuro.

En este estudio, hE(& periplsmico se utili9 en lu!ar de hE(& citoplsmicapara determinar la actividad biol!ica del hE(& expres en E. coli. Esto fuedebido a estudios previos *ue su!eran *ue el hE(& periplsmico erabiol!icamente activo en comparacin con hE(& citoplasmtica. Atros estudiosse incluyen en EbrahimiF; et al. #$% *uienes encontraron *ue la bioactividadde E(& soluble en la expresin citoplasmtica se midi como slo el $DJsimilar cuando se compara con la actividad biol!ica estndar E(&. Ensayo de

unin receptorFcompetitiva *ue utili9a marcado con $+I E(& de ratn mostr*ue no haba actividad observada en la me9cla de fracciones citoplsmica y demembrana de clulas de E. coli #2%. El hE(& periplsmico fue comparable ensu actividad biol!ica a uro!astrona humana y E(& en comparacin con hE(&citoplsmica #+%.

En la actualidad, este estudio promueve el uso de sistema de expresin p&14(,*ue es capa9 de secretar la forma biol!icamente activa de hE(&, con cistenas*ue participan en el ple!amiento apropiado mediante el uso de sistema deexpresin periplsmico. Este sistema tambin fue capa9 de trasladar con xitomadura, procesada correctamente, y se cru9 de hE(& *ue indujo respuestasproliferativas de clulas ?0&. 1os enlaces disulfuro en hE(& !enerado por los

bucles *ue presentan residuos importantes para la unin, por tanto, los efectosproliferativos de hE(& es el resultado de ple!ado derecha y puentes disulfurocorrectos hE(&Freceptor.

En resumen, este estudio su!iere las ventajas de utili9ar la expresin p&14(F45@sistema en la produccin de la protena recombinante hE(& comercial, porlas si!uientes ra9onesL '$) la protena expresada es para ser acumulado en elespacio periplsmico, ') los residuos aminoterminales del pptido secretadoeran idnticas al pptido natural, ') Crocedimiento de osmoticshocP era unmtodo simple para la obtencin de la protena deseada desde el espacioperiplsmico, '2) la puri"cacin de la protena desde el lavado de a!ua fra es

fcil, y la recuperacin es alta por*ue las protenas periplsmicas comprendenslo el 2J de las protenas totales de E. coli # -%. 4dems, hay caractersticasy aplicaciones de sistema de expresin p&14(F45@ *ue lo hacen til para lapuri"cacin por a"nidad y la deteccin inmunol!ica de protenas de fusin&14( tal como se describe por Einhauer y Sun!bauer #$%L '$) la e"ciencia, '),'versatilidades ) un efecto mnimo sobre la funcin de protenas, '2) lafacilidad de deteccin, '+) la puri"cacin suave, '-) la facilidad de eliminacin,y 'D) varias aplicaciones, *ue son tiles para el estudio adicional de protenaF


14/14

protena, interacciones 40=Fprotena , la vi!ilancia de la protena, yultraestructura.

Articulo 1 - Biote

Documents

Transcript of Articulo 1 - Biote