CANCIONEIRO DE CABANA DE BERGANTIÑOS_Pablo Díaz e Olga Kirk
Barrera & Díaz 2013
93
EVALUACIÓN DE LA CAPACIDAD FIJADORA DE NITRÓGENO DE CEPAS NATIVAS DE Bacillus sp. PROCEDENTES DEL CEPARIO DE LA UNIVERSIDAD COLEGIO MAYOR DE CUNDINAMARCA BARRERA PARADA ANA PAOLA DIAZ MORALES ADRIANA PATRICIA UNIVERSIDAD COLEGIO MAYOR DE CUNDINAMARCA FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD PROGRAMA DE BACTERIOLOGÍA 1
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EVALUACIÓN DE LA CAPACIDAD FIJADORA DE NITRÓGENO DE
CEPAS NATIVAS DE Bacillus sp. PROCEDENTES DEL CEPARIO DE LA
UNIVERSIDAD COLEGIO MAYOR DE CUNDINAMARCA
BARRERA PARADA ANA PAOLA
DIAZ MORALES ADRIANA PATRICIA
UNIVERSIDAD COLEGIO MAYOR DE CUNDINAMARCA
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
PROGRAMA DE BACTERIOLOGÍA
TRABAJO DE GRADO
BOGOTA D.C. NOVIEMBRE 2013
1
EVALUACIÓN DE LA CAPACIDAD FIJADORA DE NITRÓGENO DE
CEPAS NATIVAS DE Bacillus sp. PROCEDENTES DEL CEPARIO DE LA
UNIVERSIDAD COLEGIO MAYOR DE CUNDINAMARCA
BARRERA PARADA ANA PAOLA
DIAZ MORALES ADRIANA PATRICIA
Asesor temático:
Ligia Consuelo Sánchez Leal
Bacterióloga y Laboratorista Clínico
Ms. Biología Aplicada con énfasis en fitoprotección
UNIVERSIDAD COLEGIO MAYOR DE CUNDINAMARCA
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
PROGRAMA DE BACTERIOLOGÍA
TRABAJO DE GRADO
BOGOTA D.C. NOVIEMBRE 2013
2
EVALUACIÓN DE LA CAPACIDAD FIJADORA DE NITRÓGENO DE
CEPAS NATIVAS DE Bacillus sp. PROCEDENTES DEL CEPARIO DE LA
UNIVERSIDAD COLEGIO MAYOR DE CUNDINAMARCA
APROBADA ______________
JURADOS _________________
_________________
_________________
ASESOR ______________
UNIVERSIDAD COLEGIO MAYOR DE CUNDINAMARCA
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
PROGRAMA DE BACTERIOLOGÍA
TRABAJO DE GRADO
BOGOTA D.C NOVIEMBRE 2013
3
CONTENIDO
INDICE DE FIGURAS......................................................................................8
INDICE DE TABLAS.......................................................................................9
RESUMEN.....................................................................................................10
1. INTRODUCCIÓN.......................................................................................12
2. OBJETIVOS..............................................................................................15
2.1 Objetivo general.................................................................................15
2.2 Objetivos específicos........................................................................15
3. MARCO TEÓRICO....................................................................................19
3.1 NITROGENO....................................................................................19
3.1.1. CICLO BIOGEOQUIMICO DEL NITROGENO.............................20
3.1.2 FIJACIÓN BIOLOGICA DEL NITROGENO.........................................27
3.1.3 BACTERIAS FIJADORAS DE NITROGENO.......................................27
3.1.4.1 Bacillus......................................................................................31
3.1.5 GENES FIJADORES DE NITROGENO...............................................32
3.1.6 FERTILIZANTES NITROGENADOS.............................................35
4. DISEÑO METODOLOGICO......................................................................38
4.1 Hipotesis:................................................................................................38
4.3 Universo.............................................................................................38
4.4 Población............................................................................................38
4.5 Muestra...............................................................................................38
4.5.1 Tipo de muestreo.........................................................................38
4.6 Variables..........................................................................................39
5. TECNICAS Y PROCEDIMIENTOS............................................................39
6. RESULTADOS..........................................................................................44
4
7. DISCUSION...............................................................................................52
8. CONCLUSIONES......................................................................................56
BIBLIOGRAFIA.............................................................................................57
5
DEDICATORIA
Agradezco a Dios por darme a fortaleza necesaria para culminar este ciclo
de mi vida, a mis padres y a mi novio quienes con su apoyo y amor me han
guiado en el trascurso de este proceso.
Ana Paola Barrera P.
Dedico éste proyecto a mi mamá y a mi hermana por su apoyo incondicional,
por confiar en mí, por su paciencia y por alentarme en los momentos difíciles
de éste camino, a Josué por acompañarme, darme fortaleza durante todo
éste tiempo y simplemente por existir, a ti, mi mejor herencia, mi mayor
orgullo, y a todos aquellos que creyeron en mí.
Adriana Díaz
6
AGRADECIMIENTOS
A la profesora Ligia Consuelo Sánchez por brindarnos la oportunidad de
trabajar junto a ella, por su colaboración, paciencia y comprensión.
A la doctora Ruth Bonilla por su ayuda para el desarrollo de este trabajo.
A Mauricio Camelo por su colaboración y orientación para concluir con éxito
este trabajo.
Al Centro de Investigación Tibaitatá – Corpoica por la dotación de medios de
cultivo y por permitir parte de la realización de este trabajo en sus
instalaciones.
7
INDICE DE FIGURAS
Figura 1. Distribución de nitrógeno (N) en la Tierra
Figura 2. Ciclo redox del nitrógeno
Figura 3. Pasos intermedios en las reacciones de denitrificación
Figura 4. Asimilación de amonio
Figura 5. Formas del nitrógeno en el suelo
Figura 6. Familia Bacillaceae
Figura 7. Mapa de genes Nif.
Figura 8. Agar Ashby con agarosa
Figura 9. Agar Ashby simple
Figura 10. Agar Sangre BIO9, BIO10, BIO12, Bio7b
Figura 11. Agar Sangre BIO15, BIO6A2, CH8, BIO5
Figura 12. Agar McConkey 12: U3
Figura 13. Agar Sangre CH5, U2, BIO 8, U1
Figura 14. Esporas en la coloración de Schaeffer Fulton
Figura 15. Crecimiento fiola1
Figura 16. Crecimiento fiola 2
Figura 17. U1, U2, U3 (CP, control positivo), U4
Figura 18. CH8, CH5, CN (control negativo, E. coli)
Figura 19. BIO15, BIO9, BIO10, BIO12
Figura 20. BIO6A2, BIO7b, BIO8, BIO5
Figura 21. BIO10, BIO9, BIO15, BIO12
Figura 22. BIO5, BIO8, BIO7b, BIO6A2
Figura 23. CH8, CH5, CN (control negativo, E. coli)
Figura 24. U1, U2, U3 (CP, control positivo), U4
Figura 25. Crecimiento en medio LGI
8
INDICE DE TABLAS
Tabla 1. Microorganismos fijadores de nitrógeno de forma asimbiótica
Tabla 2. Funciones del gen Nif
Tabla 3. Acidez del suelo producida por fertilizantes nitrogenados
Tabla 4. Codificación cepas y nombre microorganismo.
Tabla 5. Características de los Bacillus analizados
9
UNIVERSIDAD COLEGIO MAYOR DE CUNDINAMARCA
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
PROGRAMA DE BACTERIOLOGÍA.
EVALUACIÓN DE LA CAPACIDAD FIJADORA DE NITRÓGENO DE
CEPAS NATIVAS DE Bacillus sp. PROCEDENTES DEL CEPARIO DE LA
UNIVERSIDAD COLEGIO MAYOR DE CUNDINAMARCA
RESUMEN
Una de las asociaciones simbióticas que está relacionada con el ambiente es
la fijación del nitrógeno, éste proceso es dirigido por las plantas en
asociación con microorganismos, con el fin de mantener el flujo de nitrógeno
para todos los seres vivos. Azospirillum, Azotobacter, bacterias endófitas y
Klebsiella pneumoniae de vida libre, son los microorganismos más
reportados con este potencial fijador; el género Bacillus también ha sido
reportado con menor frecuencia cumpliendo esta función. El objetivo de este
estudio fue establecer el potencial fijador de nitrógeno de Bacillus subtilis,
B.circulans, B.brevis, B.coagulans y B.licheniformis, para lo cual la
metodología empleada incluyó el crecimiento del microorganismo en medio
Ashby libre de nitrógeno, además del medio Ashby modificado y el medio LGI
facilitados por Corpoica - Tibaitatá. Los resultados permitieron evidenciar que
las cepas de Bacillus subtilis, B.circulans, B.brevis, B.coagulans y
10
B.licheniformis son potencialmente fijadoras de nitrógeno. Se espera en
futuro próximo hacer pruebas de reducción de acetileno para la
determinación de la presencia de la enzima nitrogenasa por cromatografía de
gases y buscar el gen Nif en los microorganismos que presentaron
crecimiento en los medios selectivos.
PALABRAS CLAVE: Nif, nitrogenasa, Bacillus sp., Ashby.
Estudiantes: Ana Paola Barrera Parada, Adriana Patricia Díaz Morales
Docente: Ligia Consuelo Sánchez Leal
Fecha: Noviembre de 2013.
11
1. INTRODUCCIÓN
El interés por el análisis de los diferentes ciclos del ambiente ha llevado al
hombre a profundizar en esta temática para su comprensión y proyección de
estudios que permitan el desarrollo de nuevas biotecnologías. El ciclo del
nitrógeno es esencial en el equilibrio del medio ambiente al igual que el del
agua, estos pueden ser factores limitantes para la vida, sin embargo, el
crecimiento de las plantas(1) y la supervivencia de la mayoría de los seres
vivos dependen de este elemento para vivir, pero no son capaces de usar el
nitrógeno para su beneficio en la forma natural en que se encuentra en la
atmósfera (N2) en un 80% y debe ser fijado por algunos microorganismos
procariotas autótrofos que poseen esta capacidad.
El Nitrógeno es esencial en el crecimiento de todos los organismos, pues es
vital en la composición de ácidos nucleicos y proteínas (2). Este elemento está
en la atmósfera en forma molecular, pero son pocos los seres vivos que
logran convertirlo en compuestos útiles. La mayoría de los microorganismos
(bacterias), plantas mayores y menores (algas) y actinomicetos, entre otras,
dependen del nitrógeno en forma inorgánica, ya que debe primero ser
reducido y luego fijado como iones de nitrato o amonio, entre otros. A
diferencia de los animales que requieren este elemento en forma orgánica
proveniente de las plantas.
En la actualidad la agricultura usa plantas que tengan cada vez un mayor
potencial productivo, lo cual requiere de una elevada fijación de nitrógeno;
debido a esto son cada vez más usados los fertilizantes nitrogenados(3), no
obstante, lograrlo implica un aumento en los costos de la producción
agrícola. Desafortunadamente, el uso indiscriminado de fertilizantes
nitrogenados puede llevar a que no se fije la totalidad de ese nitrógeno, se
12
pierda y termine en el ambiente contaminando las reservas de agua con
nitratos y la atmósfera con emisiones de amoniaco, óxido nítrico y óxido
nitroso (4).
Estas emisiones tienen efectos nocivos sobre el ambiente ya que pueden
eutrofizar las aguas, lo cual indica un aumento en los nutrientes produciendo
mucha vegetación, agotando el oxígeno presente y dejando el agua no apta
para el consumo de seres vivos (5); por otra parte, la producción de ozono
troposférico, disminuye el ozono estratosférico y aumenta el calentamiento
global de la atmósfera (4). Estudios realizados en la Pontificia Universidad
Católica de Chile han demostrado que del 100% del nitrógeno aplicado en
los cultivos solo del 10 al 50% es absorbido por las plantas mientras que del
50 al 90% terminan en las aguas subterráneas y superficiales (6).
Para el beneficio del medio ambiente y de los agricultores existe otra forma
de suministrar nitrógeno a la planta, ésta es mediante la fijación biológica de
nitrógeno (FBN) o fijación simbiótica de nitrógeno. En esta vía se emplean
bacterias fijadoras de nitrógeno como Bacillus sp, Pseudomonas sp y
Stenotrophomonas sp.
Con relación a este tema, en un estudio realizado en el año 2011 por Layton
C. y colaboradores (7) se evidenció la utilidad de la investigación en este
campo para facilitar la producción de inoculantes de bajo costo y por
supuesto bajo impacto ambiental, lo que abre las puertas a nuevas
investigaciones y así llegar al desarrollo de tecnologías que permitan avanzar
en el conocimiento de fijación de nitrógeno de microorganismos nativos y
conocer de esta manera de forma más precisa las características
metabólicas de los microorganismos que cumplen esta función y su papel en
los ciclos biogeoquímicos.
13
Debido a la importancia que tiene la fijación del Nitrógeno de vida libre, se
consideró la posibilidad de comprobar si las cepas de Bacillus existentes en
el Banco de cepas del Programa de Bacteriología son capaces de desarrollar
este proceso, para así disminuir la contaminación y el costo de producción de
fertilizantes.
En el presente trabajo, se planteó la siguiente pregunta: ¿Tiene Bacillus
licheniformis, B. subtilis, B. brevis, B. circulans y B. coagulans depositados en
el Banco de cepas del Programa de Bacteriología de la Universidad Colegio
Mayor de Cundinamarca la capacidad de fijar de nitrógeno y así ser
propuesto como una alternativa biofertilizante?
En consecuencia con lo anterior, surge la necesidad de identificar el
potencial fijador de nitrógeno de vida libre de cepas nativas del género
Bacillus, como Bacillus licheniformis, B. subtilis, B. brevis, B. circulans y B.
coagulans procedentes de ambientes naturales y artificiales, como una
herramienta biotecnológica. Por eso, con este trabajo, se espera generar
información sobre la genética de microorganismos del género Bacillus
relacionada con la fijación de nitrógeno. En consecuencia con lo anterior se
deja abierta la posibilidad de en el futuro contribuir al mejoramiento del
estado del medio ambiente reduciendo la eutrofización de las aguas, la
cantidad de ozono troposférico, ozono estratosférico y el calentamiento
global de la atmósfera, todo esto mediante la fijación biológica del nitrógeno,
a través de microorganismos como Bacillus licheniformis, B. subtilis, B.
brevis, B. circulans y B. coagulans para así minimizar la muerte de la biota
del suelo y los desequilibrios que debido a esto se generan en los procesos
biogeoquímicos que afectan de forma económica, social y ambiental.
14
2. OBJETIVOS
2.1 Objetivo general
Evaluar la capacidad fijadora de nitrógeno de las cepas nativas Bacillus
licheniformis, B. subtilis, B. brevis, B. circulans y B. coagulans utilizando
pruebas funcionales.
2.2 Objetivos específicos
Establecer la calidad de las cepas nativas seleccionadas para el estudio
mediante la evaluación de la viabilidad, pureza y autenticidad.
Determinar la capacidad de fijación de nitrógeno de las cepas
seleccionadas utilizando Agar Ashby.
Confirmar la capacidad de fijación de nitrógeno de las cepas
seleccionadas con medios selectivos especiales utilizados para
Azotobacter y Azospirillum.
15
ANTECEDENTES
La fijación del nitrógeno fue descubierta en 1901 por Beijerinck y ha sido
estudiada desde hace más de 100 años, reportándose microorganismos
procariotas tales como Azospirillum que fija por asociación,
Azotobacter, Bacillus, Clostridium y Klebsiella los cuales son fijadores de vida
libre y algunos forman simbiosis como Rhizobium y Bradyrhizobium (8). En
1907 S F, Ashby realizó estudios con Azotobacter en un medio libre de
nitrógeno (9), el cual es conocido como medio Ashby, este es un medio
selectivo para bacterias fijadoras de nitrógeno, sin embargo, también
permite el crecimiento de cualquier bacteria que presente un potencial
fijador de nitrógeno; el desarrollo de dicho mecanismo de fijación
mencionado por Ashby llegaría 6 años más tarde a partir de un proceso
conocido como la síntesis de Haber-Bosch en 1913 que fue utilizado para la
producción de amoniaco por medio del uso de altas temperaturas y alta
presión para combinar el hidrógeno con el nitrógeno fijado del aire, para la
fabricación de abonos químicos (10). En 1920 un artículo de Jones referencia
el agar Ashby como medio de cultivo para experimentos con Azotobacter
desde aproximadamente 1914 (11), la cual es una de las bacterias más
estudiadas en este campo. En 1935 Smith realizó estudios con Azotobacter y
medio Ashby (12), pero modificando dicho medio, lo que muestra un punto de
partida para los medio Ashby modificados. En los 20 años siguientes, los
estudios realizados se enfocaron en el crecimiento de bacterias tales como
Azotobacter y Azospirillum en este medio selectivo y aunque en estudios
tales como el planteado por Harris en 1953, mencionaba a Bacillus cereus y
B. subtilis (13), no se reportaban como fijadores de nitrógeno y no eran
estudiado su crecimiento en este medio.
16
Desde el año 1960, este proceso de fijación de nitrógeno da un giro diferente
pues se inicia el desarrollo de técnicas diferentes para determinar la
capacidad fijadora de nitrógeno de las bacterias; Rubenchik en ese año citó
el agar Ashby como el medio de elección (14) y se habló por primera vez de la
presencia de la enzima nitrogenasa como responsable de la capacidad de
fijación (15). Hardy en 1968, para determinar la presencia de dicha enzima (16)
presentó la metodología para el ensayo de reducción del acetileno que se
hace por medio de cromatografía gaseosa el cual es usado hasta la
actualidad para la determinación de la presencia de la enzima nitrogenasa.
En 1984 Bacillus azotofixans y Bacillus polimyxa, fueron citados por Seldin y
colaboradores como fijadores de nitrógeno (17) y en 1985 Halsall y Gibson
evidenciaron por medio de la medición de etileno la fijación de nitrógeno en
Bacillus macerans pero asociado a cepas de Azospirillum. El investigador
propuso que Bacillus realizaba una descomposición celulolítica para que los
microorganismos fijadores de nitrógeno proporcionaran los requisitos de
nitrógeno óptimos (18).
En 1994 Bacillus polymixa fue clasificado como Paenibacillus polymixa (19), y
en 1995 Bacillus macerans y Bacillus azotofixans fueron nombrados como
Paenibacillus (20). Esto cambio el rumbo de las investigaciones ya que los
Bacillus que se creían fijadores de nitrógeno habían cambiado de
nomenclatura y era necesario realizar nuevos experimentos con otros
subgéneros para verificar la capacidad de fijación de nitrógeno del género.
En 1995, Merrick nombró los genes Nif, la forma de asimilación de nitrógeno
y el sistema que controla estos genes (21), esto abrió un campo en la
realización de métodos moleculares para la identificación de dichos genes
los cuales codifican para la nitrogenasa y determinarían de manera concreta
17
la capacidad fijadora de nitrógeno. En 1998 Xie G. realizó experimentos de
reducción de acetileno y nombró como fijadores de nitrógeno a Bacillus
licheniformis, B. subitlis, B. cereus, B. pumilus, B. brevis y B. firmus, dicho
estudio lo realizó con endosporas producidas por las cepas (22).
En 1999 Susan Fisher realizó una revisión de la regulación del metabolismo
del nitrógeno en B. subtilis nombrando el sistema Ntr, el cual regula los
genes Nif (23), lo cual se convirtió en el tema de investigación, ya que desde
los años 2000 hasta la actualidad el estudio de este sistema y el gen Nif es
primordial en los mecanismos evolutivos de la fijación del nitrógeno. En 2001
Mel Nikova (24), realizó un estudio con Azotobacter el cual fue incubado en
agar Ashby y con Bacillus megaterium y B. subtilis incubados en agar
Menkina, lo cual demuestra que Bacillus no era considerado como un
potencial fijador. En 2006, el IBUN (Instituto de Biotecnología de la
Universidad Nacional de Colombia) realizó un estudio con Bacillus
licheniformis donde se observó una reducción de acetileno positiva por
medio de cromatografía de gases por parte de este microorganismo (25). En el
año 2009 Menezes A, nombro a Bacillus como un microorganismo fijador de
nitrógeno endófito y rizosférico, haciendo énfasis en la importancia de
conocer el mecanismo de acción para realizar dicho proceso (26). En 2010, un
estudio de la Pontificia Universidad Javeriana mostró el posible potencial
fijador de nitrógeno de cepas de Bacillus subtilis, Bacillus sphaericus y
Bacillus firmus, basándose en el crecimiento de estos microorganismo en
medio NFB, un medio selectivo para bacterias fijadoras de nitrógeno, los
resultados encontrados en este estudio permitieron evidenciar que estos
géneros de Bacillus presentan un posible potencial como bacterias fijadoras
de nitrógeno (27).
18
3. MARCO TEÓRICO
3.1 NITROGENO
El nitrógeno junto con el carbono, oxígeno e hidrógeno son los elementos
más abundantes en la naturaleza, y constituyen las moléculas de la vida
pues forman parte de los ácidos nucléicos y de las proteínas.
Figura. 1. Distribución de nitrógeno (N) en la Tierra, expresada en millones de Tm. A: corteza (NO3-) ;
B: biosfera (N2); C: atmosférico (N2); D: combinado (NO); E: orgánico; F: inorgánico (NH4+) (NO3); G:
orgánico terrestre; H: o. acuático CO(NH2)2; I: en materia orgánica muerta (NH4+); J: en biomasa (NO3
-)
(NH4+); K: en plantas (NO3
-) (NH4+); L: en microbios (NO3
-) (NH4+); M: en animales (NO3
-) (NH4+).
Modificado de: Rosswall, T. (1979). (28)
Se calcula que en el planeta tierra hay más de 60.000 billones de toneladas
de nitrógeno (N), de los cuales aproximadamente el 94% está ubicado en la
corteza terrestre. Del 6.0% restante, se estima que el 99,86% se halla en la
atmósfera como nitrógeno molecular (N2), y que el 0,04% se encuentra en los
seres vivos, suelos y aguas, en forma de compuestos orgánicos e
inorgánicos (fig.1) (29).
19
El nitrógeno que se encuentra en forma molecular en la atmósfera (N2) solo
es útil para algunos microorganismos, ya que los animales, plantas y la
mayoría de los microorganismos usan el nitrógeno solo si están formando
compuestos. La mayoría de los microorganismos y las plantas son
dependientes de este elemento en forma inorgánica, como lo son nitratos
(NO3-), amonio (NH4
+), y otras moléculas sencillas; por el contrario, los
animales necesitan del nitrógeno orgánico, que es obtenido de forma directa
o indirecta de las plantas (29).
3.1.1. CICLO BIOGEOQUIMICO DEL NITROGENO
El ciclo biogeoquímico del nitrógeno consiste en los cambios cíclicos que
sufre este elemento, para que pueda ser utilizado y recuperado, esto ocurre
cuando un átomo de nitrógeno cambia del estado orgánico en el que se
encuentra a estado inorgánico o viceversa (29). Pero este ciclo solo simboliza
una parte del ciclo total de este elemento en la naturaleza.
La concentración de Nitrógeno en el suelo está regulada por varios factores,
la temperatura, humedad, plantas, microorganismos y el hombre. Un estudio
realizado en Canadá y Estados Unidos reveló que la temperatura es inversa
al contenido de nitrógeno y materia orgánica en el suelo, es decir, al
incrementar el grado de temperatura disminuye la cantidad de nitrógeno
presente en el suelo; de otra forma, al incrementar la pluviosidad aumenta la
vegetación y así mismo la concentración de nitrógeno. Con relación al tipo de
suelo, este influye en la cantidad de nitrógeno, en los suelos arcillosos este
elemento se encuentra en mayor cantidad que los suelos arenosos y limosos
(30).
El ciclo del nitrógeno está compuesto por 5 procesos los cuales se definen
como mineralización, nitrificación, desnitrificación, inmovilización o
20
asimilación, y fijación del nitrógeno en el cual se basará este proyecto de
investigación en particular.
El nitrógeno molecular (N2) está presente en la atmósfera en un 80% y es
considerada una molécula casi inerte debido al triple enlace que presenta
entre sus dos átomos de nitrógeno, debido a esto no puede ser asimilada por
las plantas directamente y necesita ser fijada previamente (31). Solo cuando
los microorganismos que la fijan se lisan, es que estos compuestos
orgánicos nitrogenados son liberados transformados en amonio o nitrato que
puede ser captado por la planta (32).
Figura 2. Ciclo redox del nitrógeno. NUTRIENTES Y GASES: NITROGENO – UPRM (33)
21
MINERALIZACIÓN O AMONIFICACIÓN
Es uno de los procesos más complejos de todo el ciclo. Este proceso
consiste en despolimerizar mediante las enzimas proteolíticas de peptonas y
polipéptidos las macromoléculas de las proteínas, ácidos nucleícos, en
aminoácidos y nucleótidos. Entre los aminoácidos alifáticos se encuentran:
valina, arginina, ácido aspártico, leucina, alanina, lisina y glicina. En esta fase
interactúan algunas bacterias, entre estas, Bacillus subtilis, B. cereus, B.
mesentericus, B. megaterium, Pseudomonas sp., Clostridium putrificum, C.
sporogenis y C. tetani y algunos hongos como Cephalotecium roseum,
Trichoderma koningii, Aspergillius sp. y Penicillium sp. Dichos aminoácidos
pueden ser metabolizados por algunos microorganismos, formar complejos
organominerales, ser usados por plantas y ser mineralizados hasta llegar a
amonio, en esta fase interactúan bacterias como Bacillus sp, Clostridium sp,
Pseudomonas sp, Escherichia sp y Streptococcus sp. (34).
NITRIFICACIÓN
La nitrificación se lleva a cabo por bacterias aerobias autótrofas y se realiza
en dos etapas, la primera es mediante la oxidación a nitrito NO3- y la segunda
mediante la oxidación a nitrato NO2-. Después de que el amoniaco pasa a
forma amoniacal las bacterias nitrificantes como Nitrosomonas o
Nitrocomonas son las encargas de oxidar al amoniaco. Posteriormente, se
oxida el nitrito a nitrato, todo esto en presencia de oxígeno, esta oxidación la
realizan Nitrobacter o Nitroccus, entre otros (30).
22
DENITRIFICACIÓN
Esta fase ocurre en ambiente anóxico y se divide en denitrificación biológica
y no biológica
BIOLOGICA
Esta etapa la realizan microorganismos heterotróficos, según la literatura hay
23 géneros de bacterias encargadas de esta fase, entre ellas se pueden
mencionar Pseudomonas sp, Bacillus sp, algunos microorganismos
autótrofos como Micrococcus denitrificans y Thiobacillus denitrificans.
Figura 3. Pasos intermedios en las reacciones de denitrificación. Química de suelos con énfasis en Suelos de América Latina. Fassbender H, Bornemisza E. (30)
En esta etapa se presenta la interacción de dos enzimas, en la primera parte
de la reacción actúa la Nitroreductasa, que es una flavoproteína con un peso
molecular en el rango de 20 kDa a 60 kDa, que requiere NADH ó NAD, la
cual reduce los grupos nitrato de los compuestos nitroaromáticos, para
obtener nitrógeno utilizado en el crecimiento celular y la hiponitroreductasa.
La velocidad de denitrificación depende de las condiciones del suelo, esta
ocurre cuando la concentración de oxígeno es limitante y la humedad es alta;
otras condiciones como el pH, entre de 8.0 y 8.6, además de la temperatura
y la concentración de nitratos influyen en la denitrificación biológica (36).
23
NO BIOLOGICA
También conocida como volatización del amonio, es el resultado de
reacciones químicas entre los componentes nitrogenados inorgánicos del
suelo y los usados como fertilizantes. El aprovechamiento del amonio es casi
nula, esto indica una pérdida considerable de Nitrógeno en el uso de
fertilizantes (36).
INMOVILIZACIÓN O ASIMILACIÓN
Varias bacterias y hongos asimilan el nitrógeno inorgánico en forma de NO3,
mediante la reductasa asimilatoria se reduce a NO2, posteriormente gracias a
la acción de la misma enzima se reduce a NH4, este se asimila por la acción
de las enzimas glutamina sintetasa (GS) y glutamato sintasa (GOGAT),
conocida como ruta GS/GOGAT (37, 38). La inmovilización y la
mineralización suceden de modo simultáneo ya que el nitrógeno orgánico
y el amonio (NH4) cambian constantemente. Este proceso es de gran
importancia puesto que la presencia de una forma inadecuada de nitrógeno
en el suelo podría perjudicar el crecimiento de la flora.
Figura 4. Asimilación de amonio. GS (glutamina sintetasa), GOGAT (glutamato sintasa), CN (compuestos nitrogenados), C (fuentes de carbono), N (fuentes de nitrógeno), (38).
FIJACIÓN SIMBIOTICA
24
Las plantas asimilan el nitrógeno principalmente de dos formas, la nítrica y la
amoniacal, sin embargo no son suficientes para cubrir las necesidades de la
vegetación de la corteza terrestre. Existe una forma alternativa de fijar
nitrógeno, la cual se da principalmente en la rizósfera, aunque también se
puede dar en la tallosfera y/o filosfera. Esta función se hace mediante
microorganismos simbióticos como Rhizobium leguminosarum, que se
desarrollan con leguminosas como Phaselous, Glycine, Leucaena,
Stylosanthes, Trifolium, Melilothus, Medicago, Pisum, Crotalaria, entre otras.
Las bacterias se ubican en el parénquima radical, allí se produce su división
celular acelerada produciendo así los nódulos radiculares en las plantas.
Inicialmente usan el nitrógeno fijado para su metabolismo y posteriormente,
al aumentar la producción empiezan a ceder nitrógeno a la planta. Aun no es
totalmente clara la forma de fijación del nitrógeno pero se sabe que primero
las bacterias oxidan el nitrógeno y producen un producto intermedio, la
hidroxilamina, esta se reduce a NH3 en presencia de una enzima ferrosa. En
esta forma de fijación también influyen factores como el pH, el cual es optimo
entre 5.0 y 6.0, temperatura, humedad, aireación, nutrientes del suelo (30).
FIJACION ASIMBIOTICA
Los microorganismos que fijan nitrógeno de esta forma requieren de varios
factores que se encuentran en el suelo para desarrollar esta actividad como
la celulosa o almidón, carbohidratos. Estos microorganismos se pueden
clasificar de la siguiente forma:
Tabla 1. Microorganismos fijadores de nitrógeno de forma asimbiótica
25
FUENTE: Formas del nitrógeno en el suelo. Fassbender H, Bornemisza E. (30)
Bacterias heterotróficas aeróbicasAchromobacter, Azotobacter,
Aerobacter, Azotomonas, Beijerinckia, Pseudomonas, Derxia
Bacterias heterotróficas anaeróbicas Desulfovibrio, ClostridiumBacterias heterotróficas facultativas
anaeróbicasBacillus, Klebsiella
Bacterias quimo autotróficas Methanobacillus omelianskii
Algas azules-verdesAnabaena, Anabaenopsis, Aulosira, Colotrix, Cylindrospermuns, Nostoc,
Tolypothrix
Bacterias fotosintéticasChlorobium, Chromatium,
Rhodomicrobium, Rhodopseudomonas, Rhodospirillum
El contenido de Nitrógeno en los primeros decímetros del suelo se debe a la
actividad biológica, debido al proceso de la humificación, ya que se producen
componentes nitrogenados que son unidos al suelo por la acción de
microorganismos, así mismo los restos vegetales tales como raíces,
hojarascas, etc. se humifican uniendo el nitrógeno al suelo (30).
Las diferentes formas del nitrógeno presente en el suelo podrían
representarse así:
Figura 5. Formas del nitrógeno en el suelo. Fassbender H, Bornemisza E. (30)
3.1.2 FIJACIÓN BIOLOGICA DEL NITROGENO
NITROGENASA
26
Todos estos procesos se deben a la acción del complejo enzimático
nitrogenasa que es un sistema enzimático constituido por dos proteínas
diferentes, la dinitrogenasa (también referida como proteína MoFe o proteína
I) es una proteína que tiene por función unir y reducir el nitrógeno (N2) u otros
sustratos; y la dinitrogenasa reductasa (también referida como proteína Fe o
proteína II) y tiene el rol específico de pasar electrones, uno a la vez, a la
nitrogenasa. Fuertes reductores no reducirán la dinitrogenasa directamente,
la mayor parte de la función se hace vía dinitrogenasa reductasa, además,
de presentarse una dependencia del sistema al ATP (39).
3.1.3 BACTERIAS FIJADORAS DE NITROGENO
En Colombia, las publicaciones acerca del proceso de fijación de nitrógeno
por parte de bacterias diferentes a Azospirillum y Azotobacter son escasas,
ya que se estima que aproximadamente solo el 5.0 % de la población
bacteriana realiza este proceso; por esta razón, es primordial el aislamiento,
clasificación y análisis de diferentes bacterias tales como Bacillus sp,
Pseudomonas sp y Stenotrophomonas sp, que presentan características de
bacterias promotoras de crecimiento vegetal además de presentar dentro de
sus diferentes géneros el metabolismo necesario para realizar la fijación de
nitrógeno atmosférico (40). Todo esto lleva a mostrar sus características
generales, viendo así sus diferencias morfológicas y su potencial fijador de
nitrógeno.
El género Pseudomonas pertenece a la familia Pseudomonaceae, estas son
bacterias Gram negativas, aerobias, móviles y que no presentan esporas, en
27
cuanto a un género específico de bacterias fijadoras de nitrógeno un ejemplo
que ha sido estudiado recientemente es Pseudomonas stutzeri (41).
En cuanto a los Bacillus estos pertenecen a la familia Bacillaceae, este
género se conoce por el potencial que presenta para el uso biotecnológico en
la agricultura, tienen la capacidad de producir metabolitos antimicrobianos
para el control de patógenos, presentan una alta velocidad de crecimiento,
forman endoesporas resistentes a la desecación, el calor y las radiaciones
ultravioletas y sobreviven en diversas condiciones, presentan endoesporas
las cuales les confieren resistencia, otra de sus habilidades es degradar
biopolímeros como almidón y proteínas (42), además, este género presenta la
habilidad de fijar nitrógeno biológico de manera asimbiótica lo cual es
sumamente importante y esencial para el equilibrio del medio ambiente
debido a su papel dentro del ciclo del nitrógeno que beneficia a plantas,
animales y humanos que obtienen este elemento de dichos procesos, dos
especies capaces de realizar este proceso de fijación son B. macerans y P.
polymyxa (43).
Uno de los puntos a estudiar en los últimos años han sido las aglutininas y
lectinas como proteínas polifuncionales de algunas bacterias del suelo que
desempeñan un papel importante en la formación de asociaciones
simbióticas (44) y que así mismo poseen función hemaglutinante y
enzimática. De igual forma, gracias a la presencia de enzimas hidrolíticas de
las células de Rhizobium y Azospirillum estos microorganismos logran
penetrar las raíces de las plantas, pero no se ha confirmado aún la presencia
de las mismas en células de P. polymyxa; por otra parte se ha encontrado
que las lectinas de este último microorganismo generan la unión de las
células bacterianas a las raíces de las plantas desarrollando el papel de
las adhesinas (45).
28
Por otra parte, al contacto entre los carbohidratos de las plantas y los
receptores bacterianos se produce mucina, la cual contiene residuos
como hidratos de carbono, ácido glucurónico, galactosamina y
glucosamina específicos para P. polymyxa, de igual modo estos
residuos funcionan como receptores de lectinas bacterianas lo cual
aumenta el potencial proteolítico de las enzimas y así incrementa la
penetración de la bacteria en la raíz de la planta (44, 45).
El género Stenotrophomonas es una bacteria muy común en el medio
ambiente (46), y S. maltophilia, es usualmente referida como un
microorganismo causante de infecciones nosocomiales, que representa un
agente patógeno oportunista para los humanos, además, es un promotor de
crecimiento vegetal que tiene la capacidad de fijar nitrógeno esto se mostró
debido a la presencia del gen Nif H, que codifica para la enzima nitrogenasa
este proceso lo realiza por medio de la acumulación de altas cantidades de
amonio en medios con glucosa lo cual sugiere que los procesos de fijación,
son mediados por la presencia de azúcares en el medio (47).
Son varios los medios de cultivo usados para el crecimiento de bacterias
fijadoras de nitrógeno, ente ellos están el medio Ashby, LG, NFb, LGI, entre
otros (48). El medio Ashby es altamente selectivo ya que no contiene nitrógeno
y reduce la posibilidad de contaminación con otras bacterias, por otra parte
como desventaja tiene que el crecimiento de microorganismos es lento,
alrededor de 3 a 5 días (49). Al ser un medio libre de nitrógeno hace fácil
identificar cepas capaces de suplir sus necesidades metabólicas de este
elemento utilizando el nitrógeno presente en la atmósfera de la caja de petri
(50).
3.1.4 FAMILIA BACILLACEAE
29
Esta familia de bacterias es formadora de esporas. Se distinguen dos
géneros: Bacillus: bacterias aerobias y anaerobias facultativas oxidasa y
catalasa positiva; Clostridium: bacterias anaerobias oxidasa y catalasa
negativa. El Bacillus muestra una fuerte actividad amilolitica y el Clostridium
actividad celulolitica y proteolítica (51).
Figura 6. Familia BacillaceaeFuente: Whole-genome phylogenies of the family Bacillaceae and expansion of the sigma factor gene
family in the Bacillus cereus species-group Timothy R Schmidt, Edgar J Scott and David W Dyer. 2011 (52)
30
3.1.4.1 Bacillus
El género Bacillus pertenece a la familia Bacillaceae, y presenta una alta
distribución en diferentes ambientes tales como suelo y agua (53), además
tienen la capacidad de solubilizar fosfatos (54) y producir auxinas (55), se
caracterizan por ser bacilos aerobios y anaerobios facultativos Gram
positivos, con capacidad de producir esporas como mecanismo de
resistencia, además pueden presentar flagelos, son organismos catalasa
positiva, con crecimiento en pH de 5.5 a 8.5. (56)
Bacillus circulans es un microorganismo Gram positivo, aerobio, catalasa
positivo, móvil, formador de esporas, solubilizador de fosfatos, productor de
ácido indolacético, con sideróforos, inhibidor del crecimiento de hongos (57).
Bacillus coagulans es un microorganismo Gram positivo, móvil, ácido
tolerante y resistente al calor, es además una bacteria anaerobia facultativa,
son biocatalizadores para la fermentación de la biomasa lignocelulósica en
combustibles y productos químicos y son metabólicamente versátiles,
además utilizan carbono como fuente de energía (58).
Bacillus licheniformis es una bacteria Gram positiva, formadora de esporas
es un organismo saprofito, anaerobio facultativo, este microorganismo ha
sido utilizado como productor de enzimas industriales tales como proteasas,
α-amilasa y varias enzimas pectoliticas. Las enzimas de B. licheniformis son
usadas en la industria de los detergentes y del cuero. Además en el ámbito
clínico son utilizadas para la creación de antibióticos peptídicos como la
bacitracina (59).
31
Bacillus subtilis es un microorganismo Gram positivo, aerobio, que se
encuentra ampliamente distribuido en suelo, formador de esporas, es móvil,
produce enzimas hidrolíticas extracelulares, crece a diferentes temperaturas
(15 a 55°C), crece en concentraciones de hasta 7.0 % de NaCl, es catalasa y
Voges Proskauer postitivo (60).
3.1.5 GENES FIJADORES DE NITROGENO
El gen involucrado en la fijación del nitrógeno se denomina gen Nif (nitrogen
fixation) que tiene la función de codificar para la enzima nitrogenasa
mediante sus tres genes estructurales Nif KDH los cuales se encuentran en
todos los microorganismos fijadores de nitrógeno. Los mecanismos de este
gen son múltiples incluyendo activadores y reguladores tales como un (Ntr)
que es un regulador general del nitrógeno siendo éste un sistema de control
de expresión de muchos genes incluyendo el gen de la fijación de nitrógeno.
Dentro de los complejos sistemas de este gen la transcripción se muestra por
medio del operon NifLA que requiere una DNA girasa, otra proteína que
interviene es NifA que es una activadora especifica de la expresión de genes
nif promotores por interacción con un SigN (factor Sigma) que contiene una
RNA polimerasa, esta reconoce las secuencia consenso de dinucleotidos GG
y GC en las posiciones -12 y -24 con respecto al sitio de comienzo de la
transcripción (61). La figura 7 muestra los diferentes genes Nif envueltos en el
proceso de fijación.
32
Figura.7. Mapa de genes Nif. Fuente: http://www.eez.csic.es/~olivares/ciencia/fijacion/figura3.html (62).
33
Tabla 2. Funciones del gen NifGen (Nif) Función
Q Incorporación de molibdeno en la nitrogenasa (Imperial et al., 1984)
B Síntesis de co-factor Fe_Mo (Curatti et al., 2006)
A Regulacion positiva (Lee et al., 1993; Eydmann et al., 1995; Schmitz et al., 2002)
F Transporte de electrones:flavodoxinas(Arnold et al., 1988; Taylor et al., 1990)
M Procesa la nitrogenasa reductasa (Roberts et al., 1978;Arnold et al.,1988)
Z Maduración y activación de la proteína Fe-Mo (Paul y Merrick, 1989)
W Maduración y activación; protección al oxígeno de la proteína Fe-Mo (Paul y Merrick, 1989)
V Síntesis del cofactor Fe-Mo: homocitrato-sintasa (Zheng et al., 1997; Allen et al., 1994)
S Desulfurase de cisteína homodimerica, activación de S en la sintesis del grupo metallo
U Procesa la proteína Fe-Mo (Harris et al., 1990 : Fu et al., 1994)
X Síntesis del cofactor Fe-Mo. Regulación negativa(Lee et al., 2000)
E Síntesis e inserción de Fe-Mo dentro de la proteína dinitrogenasa (Orme-Johnson, 1985; Arnold et al., 1988)
Y Transformación de la proteína Fe-Mo (Homer et al., 1993)
T Maduración de la nitrogenasa (Simon et al., 1996)
K Subunidad β Beta de la proteína Fe-Mo (Arnold et al., 1988; Kim and Rees, 1994)
D Subunidad α Alfa de la proteína Fe-Mo (Arnold et al., 1988; Kim and Rees, 1994)
H Subunidad Fe de la proteína (Arnold et al., 1988; Kim and Rees, 1994)
J Transferencia de electrones: oxidoreductasa flavodoxina-piruvato (Schmitz et al., 2001)
L Regulacion negativa (Lee et al., 1993; Eydmann et al., 1995; Schmitz et al., 2002)
Fuente: Modificado de: YAM HOK CHAI, 2007 (61)
34
3.1.6 FERTILIZANTES NITROGENADOS
Según su origen los fertilizantes nitrogenados pueden ser orgánicos o
inorgánicos:
Fertilizantes nitrogenados orgánicos: actualmente son los más
utilizados en la agricultura orgánica, su contenido de nitrógeno varía
del 1.0% al 3.0%, lo cual equivale a dosis más altas en la aplicación
para lograr un aporte de nitrógeno significativo, el nitrógeno de estos
fertilizantes no es soluble en agua, por lo que se libera por
mineralización (63).
Fertilizantes nitrogenados inorgánicos: este tipo de fertilizantes
sintéticos se comenzaron a producir en la segunda guerra mundial por
medio de la producción de nitratos, es de destacar que la mayoría de
fertilizantes nitrogenados inorgánicos se derivan del amoniaco,
aunque también hay fuentes nítricas (63).
Es importante destacar que los fertilizantes amoniacales generan acidez en
el suelo ya que al nitrificarse liberan H+ de acuerdo con la siguiente reacción:
NH4+ + 2 O2 = NO3
- + H20 + 2 H+
Tabla 3: Acidez del suelo producida por fertilizantes nitrogenados
35
Valor adoptado por la Asociación Oficial de Químicos Analíticos (Pierre 1934)FUENTE: Adams Soil Acidityand Liming n° 12 p. 234. Madison, Wisc: ASA 1984.
Extraído de Tisdale et al, 1995, (64)
Efecto del Nitrógeno en la planta
La deficiencia de este elemento en la planta genera hojas pequeñas, tallos
finos y rectos, además de ramificaciones escasas, esta falta produce una
competencia interna para transferir el Nitrógeno de las partes más viejas a
las más jóvenes, es por esto que los síntomas se ven en las hojas más
longevas (63).
36
Efectos ambientales del Nitrógeno
Uno de los efectos más comúnmente observados se trata de toxicidad por la
ingesta de agua con dióxido de nitrógeno (NO2-) que es la forma reducida del
nitrato (NO3-) el cual en el estómago de animales y humanos genera variados
síntomas clínicos desde molestias estomacales, cefaleas y en casos
extremos la muerte.
Un efecto ambiental es la afectación de la capa de ozono por la emisión de
N2O el cual se transforma a monóxido de nitrógeno (NO) que es capaz de
destruir la capa de ozono (63)
37
4. DISEÑO METODOLOGICO
4.1 Hipótesis:
Las cepas nativas de Bacillus licheniformis, B. subtilis, B. brevis, B. circulans
y B. coagulans tienen un posible potencial fijador de nitrógeno y se evidencia
mediante pruebas funcionales.
4.2 Tipo de investigación: La presente investigación es de tipo Descriptivo
cualitativo transversal.
4.3 Universo: Microorganismos aislados del ambiente
4.4 Población: Cepas nativas del género Bacillus provenientes de diferentes
ambientes, las cuales se encuentran congeladas en el Banco de cepas de la
Universidad Colegio Mayor de Cundinamarca
4.5 Muestra: La muestra analizar son los microorganismos con capacidad
fijadora de nitrógeno.
4.5.1 Tipo de muestreo: Selectivo.
38
4.6 Variables
Variables Dependientes Indicadores
Nutrientes y condiciones físicas de
los ensayos in vitro, de fijación de
nitrógeno que se van a realizar en
el laboratorio
Concentración de nutrientes que se
utilizaran en los medios de cultivos
pH de los medios y temperatura de
incubación de los cultivos.
Variables independientes Indicadores
Capacidad fijadora de nitrógeno de
los microorganismos nativos
Número de cepas aisladas que
presenten capacidad fijadora de
nitrógeno. Crecimiento en agar
Ashby y agar semisólido LGI
5. TECNICAS Y PROCEDIMIENTOS
FASE1: EVALUACION DE LA CALIDAD DE LAS CEPAS NATIVAS
De las 31 cepas existentes aisladas de anteriores trabajos del grupo
CEPARIUM (Anexo 1) se seleccionaron 14 y se codificaron según el lugar
de donde provenían:
CH: Proyecto de Chimeneas negras
BIO: Proyecto de Biocontroladores
U: Proyecto de Physalis peruviana (Uchuva)
39
Tabla 4: Codificación cepas y nombre microorganismo.Fuente autor.
CEPA MICROORGANISMO
BIO9, BIO10, BIO12, BIO15,
CH5, U2, U4 Bacillus subtilis
BIO 6A2 Bacillus circulans
BIO5, CH8 Bacillus brevis
BIO7b Bacillus coagulans
BIO8, U1 Bacillus licheniformis
U3 Stenotrophomona maltophilia
Se realizó la activación utilizando el protocolo de Sánchez y Corrales (65). Se
seleccionaron los viales congelados a -70ºC, estos se sembraron en caldo
infusión cerebro corazón BHI, para permitir el crecimiento de los
microorganismos, esto se incubo a 37°C por 24h. Las cepas fueron
sembradas en Agar Sangre y Agar McConkey, donde la glucosa es la fuente
de carbohidratos que los microorganismos utilizan mediante fermentación.
Se utilizó fosfato disódico (Na2HPO4) como tampón en el medio (66).
Posterior al crecimiento se realizó la coloración de Gram, la cual permitió
determinar la pureza de las cepas y la posterior selección de las cepas de
interés que presentaron la morfología de bacilo Gram positivo.
La identificación de las cepas se realizó por medio de pruebas bioquímicas
en tubo y pruebas de identificación rápida BBL Crystal™ el cual es un
método de identificación en miniatura (67); donde se correlacionaron los
resultados con el Manual de Bergey´s.
40
Evaluación de la viabilidad
Tiene como objetivo observar que el cultivo de interés sea viable, para así
tomar acciones específicas en caso que este se vea disminuido o afectado
en algún momento. Este chequeo se realiza antes de la preservación,
inmediatamente después y durante el almacenamiento (68).
Evaluación de la pureza
La pureza se determina mediante la demostración de la presencia de
contaminantes bacterianos y fúngicos. La pureza microbiológica es un valor
relativo a la sensibilidad de los métodos que se utilizan por lo que es
importante descartar contaminantes de especies relacionadas que pueden
encontrarse en una baja concentración (69). Así mismo se realizó la tinción de
Schaeffer Foulton, con la cual se buscaba la presencia de esporas, ya que el
género identificado, Bacillus, tiene como una de sus características la
presencia de estas.
Evaluación de la autenticidad
Se realiza para comprobar que el cultivo mantiene las características de la
cepa original. Es importante demostrar que las características y funciones
propias de los microorganismos no están alteradas. (70).
41
FASE 2. EVALUACIÓN DE LA CAPACIDAD DE FIJACION DE
NITROGENO ATMÓSFERICO
Fijación de nitrógeno con medio Ashby
Las bacterias identificadas como Bacillus fueron sembradas en medio Ashby
modificado (anexo 2) dejando incubar a 40°C de 24 a 48 horas, se esperaba
crecimiento, lo cual indicaría fijación de nitrógeno por parte de éstas. Se
escogió éste medio porque permite obtener un aislamiento altamente puro,
libre de trazas de nitrógeno que pudiesen haberse adquirido mediante los
cultivos anteriores o por contaminación (71).
FASE 3: CONFIRMACIÓN DEL POSIBLE POTENCIAL FIJADOR DE
NITRÓGENO DE LAS CEPAS SELECCIONADAS
Posteriormente se realizó el mismo procedimiento en colaboración con
Corpoica Tibaitatá - Mosquera, quienes brindaron los componentes para la
preparación de 2 medios de cultivo altamente puros y libres de nitrógeno, con
el fin de confirmar los resultados que se obtuvieran. La composición de estos
medios es la misma (Manitol, Fosfato monobásico, Sulfato de magnesio,
Cloruro de sodio, Sulfato de calcio, Carbonato de calcio) con la variación en
el agar solidificante, en uno se emplea agar agar Merck y en el otro Agarosa
Merck (anexo 3 y 4), con lo cual se garantiza que no contenga alguna traza
de nitrogeno. Se prepararon 200ml para 8 cajas de petri, sirviendo por caja
20ml; 100ml se sirvieron en la fiola para agar agar y 100ml para la fiola de
agarosa. Se mezclaron los componentes, excepto el agar y la agarosa, ya
que se debió medir el pH antes de agregarlos, el pH se midió en el
potenciómetro, arrojando un pH inicial de 6.5, se agregó NaOH para
alcalinizar el pH hasta llevarlo a 7.2, posteriormente se agregó el agar y la
agarosa, respectivamente, se autoclavó a una temperatura de 121ºC por 40
42
minutos, pasado éste tiempo se sirvió el agar, se dejó gelificar y se realizó la
siembra.
La siembra se realizó por duplicado en el medio con agar y en el medio con
agarosa, esto con el fin de observar posibles diferencias en el resultado
debido a la composición de los medios, pues la agarosa es altamente pura.
Fig. 8
agar Ashby con agarosa Fig. 9 agar Ashby simple
Posteriormente para garantizar su reproducibilidad las cepas se sembraron
por triplicado en medio LGI semisólido sin ninguna fuente de nitrógeno
(anexo 5), en tubo de ensayo tapa rosca de 25ml y se sirvieron 5ml de medio
semisólido LGI, posteriormente se realizó la siembra a superficie de las
muestras en el medio y se llevaron a incubación por 10 días a 30°C.
43
6. RESULTADOS
Los resultados de la coloración del Gram mostraron la morfología de las
cepas de Bacillus, lo que permitió confirmar que todos los bacilos
seleccionados eran bacilos Gram positivos.
FASE 1: SELECCIÓN Los microorganismos Bacilos Gram positivos presentaron crecimiento y
hemolisis beta en agar sangre y la Stenotrophomonas maltophilia en agar
MacConkey presentó crecimiento, lactosa negativa.
El género de las cepas se comprobó con pruebas BBL crystal para confirmar
si correspondían a los géneros con que habían sido codificados previamente.
Tabla 5. Características de los Bacillus analizadosFuente: Autor
BacillusCaracterísticas Macroscópicas
GRAMSchaeffer
FultonHEMOLISI
S
Pruebas rápidas de Identificación y porcentaje de
confiabilidadBacillus brevis
BIO5, CH8Colonias pequeñas de 2.0-3.0 mm de diámetro aproximadamente de forma circular, con bordes irregulares de aspecto granular, consistencia cremosa brillante (fig. 12)
Bacilos Gram
positivo
Endoesporas esféricas y centrales que deforman el bacilo.
Beta hemolisis
BBL crystal99.94% y 99.57% respectivamente
Bacillus circulansBIO 6A2
Colonias de 2.0 -4.0 mm de diámetro aproximadamente de forma
Bacilos Gram
positivo
Endoesporas esféricas y centrales que deforman el
Beta hemolisis
BBL cyistal99.99%
44
convexa, con bordes uniformes, de aspecto liso, consistencia cremosa, puntiformes brillantes, color crema a gris. (fig 12).
bacilo.
Bacillus coagulans
BIO7b
Colonias medianas de 2.0 -4.0 mm de diámetro aproximadamente de forma circular, con bordes irregulares, consistencia cremosa y dura, color gris claro (fig. 11)
Bacilos Gram
positivo
Endoesporas esféricas y centrales que deforman el bacilo.
Beta hemolisis
BBL crystal86.41%
Bacillus licheniformis
BIO8, U1
Colonias grandes de 4.0-5.0 mm de diámetro aproximadamente de forma circular, puntiformes con bordes irregulares, consistencia cremosa brillante, color grisaseo (fig. 14).
Bacilos Gram
positivo
Endoesporas esféricas y centrales que no deforman el bacilo.
Beta hemolisis
BBL crystal95.68% y 99.99% respectivamente
Bacillus subtilis BIO9, BIO10,
BIO12, BIO15, CH5, U2, U4
Colonias medianas de 2.0 -4.0 mm de diámetro aproximadamente de forma redonda, de aspecto rugoso, consistencia blanda, color gris claro. (fig 11) (fig 12) (fig. 14)
Bacilos Gram
positivo
Endoesporas esféricas y centrales que no deforman el bacilo
Beta hemolisis
BBL crystal99.93%, 99.99%, 96.47%, 94.66%, 95.67%, 94.66%
y 66.27% respectivamente
Stenotrophomona maltophilia
U3
En agar MacConkey presenta colonias rugosas de 3.0 a 5.0 mm de diámetro, color amarillo
Bacilos Gram
negativos
No aplica No aplica BBL cristal98.99%
45
(lactosa negativo) (fig. 13) (fig. 14).
Fig. 10: Agar Sangre BIO9, BIO10, BIO12, Bio7b Fig. 11: Agar Sangre BIO15, BIO6A2, CH8, BIO5
Fig. 12 Agar McConkey 12: U3 Fig. 13: Agar Sangre CH5, U2, BIO 8, U1
Fig. 14 Esporas en la coloración de Schaeffer Fulton
46
Bio9 Bio10
Bio12
Bio15
Bio7b
Bio6A2
CH8 Bio5
BIO8
U1
CH5
U2
Fase 2: crecimiento en medio ASHBY
Al realizar la lectura de la siembra realizada a partir del medio preparado en
la Fiola 1 (Sacarosa + Sales sin hierro) se observó que el crecimiento de las
cepas fue nulo debido a que el medio Ashby al no tener nitrógeno posee
hierro, el cual es elemental para la formación de las proteínas del complejo
nitrogenasa. Fig. 17, (14). En cambio en la Fiola 2 (Sacarosa + Sales con FeSO4)
hubo crecimiento ya que éste medio suministra los elementos necesarios
para el desarrollo de bacterias fijadoras de nitrógeno. (Anexo 2)
Fig. 15 Crecimiento fiola1
Fig. 16 Crecimiento fiola 2
Fase 3. Confirmación del posible potencial fijador de nitrógeno de las
cepas seleccionadas
47
Éste resultado fue confirmado mediante la siembra y crecimiento en los
agares Ashby altamente purificados y en el medio semisólido LGI
suministrados por Corpoica – Tibaitatá (anexo 5), la lectura del medio Ashby
se realizó desde el tercer día hasta el quinto día a partir del día de la
siembra. En el tercer y cuarto día se observó un crecimiento tenue, en el
quinto día hubo mayor presencia de crecimiento. Tanto en el medio
preparado con agar (fig. 17 - fig. 20) y en el preparado con agarosa (fig. 21 -
fig. 24) se presentó el mismo crecimiento.
fig. 17 U1, U2, U3 (CP, control positivo), U4
fig. 18 CH8, CH5, CN (control negativo, E. coli)
48
fig. 19 BIO15, BIO9, BIO10, BIO12
fig. 20 BIO6A2, BIO7b, BIO8, BIO5
Fig. 21 BIO10, BIO9, BIO15, BIO12 Fig. 22 BIO5, BIO8, BIO7b, BIO6A2
49
fig. 23 CH8, CH5, CN (control negativo, E. coli)
fig. 24 U1, U2, U3 (CP, control positivo), U4
Después de 10 días se realizó la lectura del medio semisólido LGI, el cual
presentó crecimiento positivo, esto permite inferir que los microorganismos
sembrados en éste medio presuntivamente tienen potencial como fijadores
de nitrógeno.
50
fig
25. Crecimiento en medio LGI
7. DISCUSIÓN
Se aislaron bacterias de proyectos anteriores sobre microorganismos
biocontroladores procedentes de chimeneas negras y cultivos de uchuva.
Mediante BBL Crystal, un método rápido de identificación bacteriana y
medios de cultivo, permitieron identificar cepas de Bacillus subtilis, B.
circulans, B. brevis, B. coagulans y B. licheniformis
Las poblaciones bacterianas presentes en cultivos de uchuva, en zonas de
chimeneas negras y como biocontroladores, concuerdan con estudios
realizados, en el caso de cultivos de uchuva se ha reportado la presencia del
genero Bacillus como bacteria promotora de crecimiento (72). Corrales, L y
colaboradores en 2011 referenciaron la presencia de cepas de Bacillus
liqueniformis, Bacillus subtilis, Bacillus megaterium y Bacillus brevis, que
cumplían con esta característica de controladores biológicos (64), así mismo
Logan. N en el año 2000 reportó la presencia de Bacillus aerobios
formadores de endoesporas en las chimeneas o fumarolas negras (73).
51
Referente a la evaluación de la calidad de las cepas se puede determinar
que se conservó su pureza ya que se preservaron las mismas características
macroscópicas en todas las colonias. La viabilidad se estableció mediante la
observación de crecimiento de microorganismos en el agar sangre. De igual
manera la autenticidad de las cepas se confirmó a través de pruebas
bioquímicas (BBL crystal). Esto es fundamental ya que es importante
establecer el adecuado uso de las cepas y así garantizar que sus
características funcionales permanezcan constantes (74).
El crecimiento de Bacillus liqueniformis, Bacillus subtilis, Bacillus megaterium
y Bacillus brevis en los medios de cultivo específicos para microorganismos
fijadores de nitrógeno como son el medio Ashby y LGI permite inferir que son
bacterias con posible potencial fijador de nitrógeno, ya que para desarrollar
su crecimiento toman este gas presente en la atmósfera del medio
reduciéndolo para luego ser asimilado en forma de iones amonio (NH4+) o
nitrato (NO3-) (75).
Se realizaron siembras de los microorganismos en medio Ashby modificado
con sacarosa como fuente de energía, con sales sin hierro y con hierro, esto
con el fin de observar en cual medio había presencia de crecimiento. Se
estableció que solamente en el medio con sales de hierro los
microorganismos presentaron crecimiento, debido a que este metal es
fundamental para la formación de las proteínas del complejo nitrogenasa (76)
lo cual determina que estos microorganismos son potencialmente fijadores
de nitrógeno.
Además de esto, se sembraron en medio Ashby modificado con manitol
como fuente de energía, uno con agar y el otro con agarosa como gelificante,
debido a que la agarosa es altamente pura, lo cual reduciría la posibilidad de
presentar contaminación con trazas de nitrógeno en el medio. Se observó
que el crecimiento de los microorganismos en ambos medios fue óptimo,
presentando igualdad en la calidad de las colonias.
52
Cuando se habla de fijación de nitrógeno es importante mencionar los
microorganismos tanto endófitos como de vida libre pertinentes para este
trabajo. En el caso de los endófitos como Rhizobium leguminosarum,
Burkholderia sp., Citrobacter sp, Enterobacter spp, Klebsiella sp,
Pseudomonas putida, Bacillus spp, Clostridium sp., estos presentan la
cualidad de tener una alta disponibilidad de nutrientes, ya que al estar
presentes dentro de la planta su competencia con otros microorganismos
disminuye, (77) por otra parte los microorganismos que fijan nitrógeno por vida
libre a pesar de que compiten por los nutrientes de la planta presentan mayor
resistencia a diferentes factores ambientales presentes en la rizosfera,
además de no necesitar la asociación con ningún tipo de planta para realizar
su proceso de fijación (78). En el caso específico de este estudio, Bacillus
además de presentar un posible potencial fijador de nitrógeno fue reportado
por Rosenblueth en 2006 como un microorganismo endófito de cítricos (79),
lo cual es significativo ya que esto le da a Bacillus la característica de posible
fijador tanto de vida libre como endófito y debido a la presencia de esporas
su resistencia es vital para proteger dicho proceso de fijación por cualquiera
de las vías. Estas características primordiales hacen de Bacillus un
microorganismo que muestra alternativas diversas para su aislamiento y
posterior producción de biofertilizantes que generen mayor productividad a
nivel agrícola
La presencia de Bacillus subtilis, B. circulans, B. brevis, B. coagulans y B.
licheniformis que se consideren como microorganismos con potencial de
bacterias fijadoras de nitrógeno se presenta como un hecho innovador,
debido a que solo recientemente se ha comenzado a estudiar a Bacillus
como un fijador ya que no hay estudios de carácter experimental con
características moleculares que respalden dichos resultados. De los
53
aislamientos realizados en este trabajo el crecimiento de las cepas de
Bacillus en medio Ashby y LGI da un gran avance a nivel de fijación de
nitrógeno debido a que comienzan a observarse nuevas alternativas de
conocimiento acerca de las múltiples capacidades que tienen las bacterias y
de su papel primordial en el desarrollo de nuevos procesos a nivel agrícola.
Debido a que se comprobó que los bacilos demostraron fijación de nitrógeno
en las pruebas funcionales, se están realizando pruebas adicionales como la
determinación de la presencia de la enzima nitrogenasa y la prueba de
reducción de acetileno.
De ser positiva la capacidad de reducción de acetileno por parte de Bacillus
se abren nuevos campos para utilizarlos como bioabonos, no solo como
solubilizadores de fosfato que es la función que ha sido siempre establecida,
sino como fijadores de nitrógeno, en plantas que no hacen simbiosis en sus
raíces con Azotobacter y Azospirillum, ya que estas bacterias son las más
estudiadas en cuanto a fijación del nitrógeno.
Igualmente las cepas de Bacillus que demuestren esta capacidad de
reducción de acetileno, serán caracterizadas molecularmente para abrir
nuevos campos de estudio con estos microorganismos.
54
De la presente investigación surgen las siguientes recomendaciones:
Ahondar más en el tema de Bacillus como fijador de nitrógeno,
realizando estudios de caracterización molecular que complementen
el estudio que hemos realizado, mostrando así cual es el mecanismo
genético que interviene en este microorganismo.
Realizar la prueba de reducción del acetileno mediante la
cromatografía de gases, identificando de ésta forma la presencia de la
enzima Nitrogenasa.
55
8. CONCLUSIONES
La calidad de las cepas es óptima debido a que el método de
conservación y viabilidad permitió activar y recuperar cepas aisladas
anteriormente y luego de la tinción de Gram se concluyó que los
microorganismos no tenían ningún tipo de contaminación, además
El medio Ashby y Ashby modificado con agarosa son una buena
alternativa para garantizar que la bacteria está realmente fijando el
nitrógeno por su alto grado de pureza. En el caso específico de
Bacillus puede decirse con un alto grado de seguridad que las cepas
de Bacillus subtilis, B. circulans, B. brevis, B. coagulans y B.
licheniformis son potencialmente fijadores de nitrógeno
Comprobar que los Bacillus son fijadores de nitrógeno es un resultado
innovador por cuanto la información de este género como fijador de
nitrógeno es prácticamente nula. Será necesario verificar con pruebas
específicas de tipo químico y molecular para garantizar los resultados
obtenidos en este trabajo.
56
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66
Anexos
Anexo 1: Lista de microorganismos
CEPA IDENTIFICACIONU3 Stenotrophomona maltophiliaU1 Bacillus licheniformisU2 Bacillus subtilisU4 Bacillus subtilisBIO3 Staphylococcus aureusBIO 5 Bacillus brevisBIO 8 Bacillus licheniformisBIO 9 Bacillus subtilisBIO 10 Bacillus subtilisBIO 12 Bacillus subtilisBIO 15 Bacillus subtilisBIO 6b Staphylococcus intermediusBIO 6s Staphylococcus intermediusBIO 6A1 Bacillus circulansBIO 6A2 Bacillus circulansBIO 7a Enterococcus faeciumBIO 7b Bacillus coagulansBIO 7c Streptococcus uberisBIO 7s Staphylococcus aureusBIO 7sab Staphylococcus aureusCH1 Micrococcus luteusCH2 Micrococcus luteusCH3 Micrococcus luteusCH4a Bacillus licheniformisCH4b Bacillus licheniformisCH5 Bacillus subtilisCH6 Staphylococcus xylosusCH7b Corynebacterium aquaticumCH7c Corynebacterium aquaticumCH8 Bacillus brevis
67
CH9 Yersinia sp
Anexo 2: Medio de cultivo Ashby modificado
Medio de cultivo Ashby con sulfato ferroso FeSO4
Cantidad
Sacarosa (C12H22O11) 1.5g
Sulfato de magnesio heptahidratado
(MgSO4 + 7H2O)
0.02g
Cloruro de sodio (NaCl) 0.02g
Fosfato monoácido de potasio (K2HPO4) 0.02g
Sulfato ferroso (CaSO4) 0.01g
Carbonato de calcio (CaCO3) 0.5g
Agar 14g
Completar el volumen con agua destilada a 1000 ml y ajustar el pH a 7.2.
Medio de cultivo Ashby con sulfato ferroso FeSO4
Cantidad
Sacarosa (C12H22O11) 1.5g
Sulfato de magnesio heptahidratado
(MgSO4 + 7H2O)
0.02g
Cloruro de sodio (NaCl) 0.02g
Fosfato monoácido de potasio (K2HPO4) 0.02g
Carbonato de calcio (CaCO3) 0.5g
Agar 14g
Completar el volumen con agua destilada a 1000 ml y ajustar el pH a 7.2.
68
Anexo 3: Medio de cultivo Ashby modificado con AGAROSA
Manitol (C6H14O6) 1 gr
Fosfato monobásico de potasio (KH2PO4) 0,02 gr
Sulfato de magnesio (MgSO4) 0,02 gr
Cloruro de sodio (NaCl) 0,02 gr
Sulfato de calcio (CaSO4) 0,02 gr
Carbonato de calcio (CaCO3) 0,5 gr
Agarosa Merck 1,4 gr
Completar el volumen a 100 ml con agua destilada y ajustar el pH a 7.2
Anexo 4: Medio de cultivo Ashby
Manitol (C6H14O6) 1 gr
Fosfato monobásico de potasio (KH2PO4) 0,02 gr
Sulfato de magnesio (MgSO4) 0,02 gr
Cloruro de sodio (NaCl) 0,02 gr
Sulfato de calcio (CaSO4) 0,02 gr
Carbonato de calcio (CaCO3) 0,5 gr
Agar-Agar Merck 1,5 gr
Completar el volumen a 100 ml con agua destilada y ajustar el pH a 7,2
69
Anexo 5. Medio de cultivo LGI
Azúcar cristal 5.0 g
Fosfato monoácido de potasio (K2HPO4) 0.2 g
Fosfato diácido de potasio (KH2PO4) 0.6 g
Sulfato de magnesio dihidratado (MgSO4 + 7H2O) 0.2 g
Cloruro de calcio dihidratado
(CaCl2 + 2H2O)
0.02 g
Molibdato de sodio dihidratado (Na2MoO4 + 2 H2O) 0.002 g
Azul de bromotimol (0.5% en etanol)
C27H28Br2O5S
5 ml
Hierro EDTA (solución 1.64%) 4 ml
Solución de vitaminas 1 ml
Completar el volumen a 1000 ml con agua destilada y ajustar el pH 6.0 y 6.2
con H2SO4. Para el medio semisólido se debe agregar entre 1.75 y 1.8 g/l de
agar-agar y para el medio solido 15 g/l de agar-agar.
70
