T1. Introduccin a los Cultivos Celulares. Desarrollo histrico.

Tipos de Cultivos de clulas animales. Equipamiento del laboratorio de

cultivos. Biologa de las clulas en cultivo.

T2. Requerimientos de las clulas en cultivo y tcnicas de

mantenimiento.

El ambiente del cultivo. Tcnica de subcultivo. Cultivos en suspensin y

en monocapa. Congelacin y descongelacin. Deteccin de

contaminaciones.

T3. Cultivos primarios y lneas celulares. Cultivos tridimensionales.

Evolucin de los cultivos primarios. Lneas celulares: transformacin celular.

Cultivos de esferoides.

T4. Citometra de flujo y anlisis del ciclo celular. Curvas de crecimiento.

T5. Tema 5. Citotoxicidad y genotoxicidad

Ensayos de viabilidad y supervivencia. Uso de cultivos organotpicos.

Deteccin de dao en el ADN

Programa de teora de TMC Biologa celular

Culture of Animal Cells, A Manual of Basic Tecnique and

Specialized Applications, Freshney R I (2010), sixth edition.

CULTIVO DE CLULAS ANIMALES Y HUMANAS.

APLICACIONES EN MEDICINA REGENERATIVA, Pablo Gil-

Loyzaga , Vision Libros (2011).

Tcnicas en Histologa y Biologa Celular. Montuenga, L.

Esteban F.J. y Calvo, A. (2009)

Tema 1. Introduccin a los Cultivos Celulares.

Desarrollo histrico de los cultivos.

Mtodos de inicio

Tipos de Cultivos de clulas animales.

Equipamiento del laboratorio de cultivos.

Biologa de las clulas en cultivo.

Tcnicas Moleculares y Celulares

Biologa Celular

Curso 2014/15

Cultivos de clulas y tejidos

Tcnica mediante la cual se pueden mantener clulas y

fragmentos de tejidos y rganos en situacin de aislamiento

de un organismo pluricelular.

Se pueden obtener de animales y vegetales.

Los cultivos celulares se obtienen haciendo crecer in vitro clulas

dispersas en las condiciones adecuadas.

Las clulas dispersas se pueden obtener mediante disgregacin

mecnica o enzimtica.

Tambin se usa el trmino cultivo celular para designar cultivos

tridimensionales (de rganos o de tejidos)

Inicialmente se us el trmino Cultivo tisular, porque se realizaban a

partir de explantes

Implantacin en laboratorios de Ciencias Biomdicas

Tcnica adecuada para investigacin en ciencias experimentales y de la salud

Aplicaciones diagnsticas, industriales y teraputicas

Ventajas

Gran control de condiciones fsico-qumicas: permite

el estudio de comportamientos fisiolgicos en diferentes

condiciones

Homogeneidad del comportamiento celular: resultados repetitivos

Desventajas

Requerimiento instrumental y entrenamiento tcnico

Falta de estabilidad del cariotipo celular

Acontecimientos para el desarrollo de cultivos

de clulas animales

Roux (1885): mantiene clulas embrionarias de pollo vivas en solucin

salina

Harrison, 1907: cultivo explantes (mdula espinal anfibio)

Carrel, 1913: - cultiv explantes en plasma coagulado

- asepsia

- mezcla de suero, solucin salina y

extractos de embriones como medio

Matraz de Carrel

Actualmente:

Frascos de Cultivo Cabinas de flujo

1940s-1950s : Desarrollo de los cultivos celulares

- desarrollo de antibiticos

- Enders, 1949: virus polio en clulas tejidos diferentes al nervioso

humano

Cultivos primarios: preparados directamente

de organismo

Tcnicas de subcultivo o transferencia

Cultivos secundarios

Cepas celulares, lneas celulares no transformadas

o lneas celulares primarias: vida media finita en cultivo

Gey, 1952: HeLa, lnea celular

continua de carcinoma cervical

humano

Lneas celulares transformadas: cambio gentico

que les permite un crecimiento indefinido

Eagle, 1955: Primer estudio sistemtico de los requerimientos nutricionales

de las clulas en cultivo

1970-80:

Produccin de AC monoclonales a partir de hibridomas (Kholer y Milstein, 1975).

Tecnologa de ADN recombinante: produccin de molculas de inters

(en bacterias: Insulina )

en eucariotas: activador de plasmingeno

1990: aislamiento de clulas madre

Mtodos de

inicio de

cultivos

adulto

embrin

diseccin

Digestin

enzimtica Diseccin

fina

Cultivo celular Explantes

primarios Cultivo

tridimensional

Organismo

Clulas

poco

adherentes

Cultivo

en suspensin

Algunas aplicaciones de los cultivos de clulas

Investigacin de la fisiologa y bioqumica celular; anlisis gentico.

Anlisis de los efectos de compuestos en determinados tipos celulares

* metabolitos, hormonas, factores de

crecimiento

* compuestos potencialmente txicos o

mutagnicos

Terapia celular y medicina regenerativa: * cultivos de condrocitos autlogos

*produccin de tejido artificial: sustitutos

drmicos (Apligraft)

Obtencin de productos de inters

- vacunas

- protenas de uso teraputico (factores de

coagulacin VIII y IX para la hemofilia,

eritropoyetina)

- AC monoclonales de hibridomas

Cultivos de tejidos y rganos

Cultivos de clulas: disgregadas o dispersas

(de cultivo primario o de lnea celular)

Cultivo histotpico: re-agregacin de clulas y

reconstruccin tridimensional

Cultivo organotpico: similar a histotpico, con

distintos tipos celulares

Tipos de cultivos de clulas animales

Tipos celulares usados en cultivos celulares

* Epitelial

* Conjuntivo: FIBROBLASTOS

* Muscular

* Nervioso

* Sangre

* Clulas madre embrionarias

* Clulas madre adultas

https://www.youtube.com/watch?v=pqia6TZdVa4

Colecciones o bancos de clulas

The American Type Culture Collection

(ATCC)

The European Collection of Animal Cell

Culture (ECACC)

http://www.lgcstandards-atcc.org/

Fibroblastos humanos

Epiteliales

SH-SY5Y (neuroblastoma)

Esterilidad

Laboratorio de cultivos:

Equipamiento

Seguridad

La esterilidad: es condicin fundamental mantener los cultivos de clulas estriles puesto que los microorganismos crecen rpidamente.

Equipos del laboratorio de Cultivo Celular

Cabinas de flujo laminar

Incubador de CO2

Microscopio invertido

Cabina de flujo laminar

Sirven para mantener un ambiente estril Luz UV

Filtros HEPA (tamao poro 0.2 m): no permite el paso

de esporas, microorganismos, partculas de polvo, etc.

Tipos: de flujo laminar horizontal de flujo laminar vertical

Tipos de cabinas de flujo laminar (laminar flow hoods) :

Filtros HEPA ((High Efficiency Particulate Air)

Buena proteccin del personal

Mayor proteccin

estril del cultivo

Mayor proteccin

del operador

Qu tipo de cabina se deben usar para cultivos de

clulas de primates incluidas las humanas?

El riesgo biolgico del trabajo con cultivos de clulas

animales procede de

Incubadores de CO2

Temperatura: 37C

CO2: 5%

Seguimiento del cultivo: viabilidad,

multiplicacin, contaminacin.

Son microscopios pticos con la fuente de luz

situada en la parte superior y los objetivos en

la inferior.

Microscopio invertido

Biologa de las clulas en cultivo

Mayor proliferacin

Menos interacciones intercelulares

Menos interacciones con la matriz

Distintos nutrientes, hormonas y factores

de crecimiento

condiciones antagnicas a diferenciacin Energa metablica: glucolisis