Responsable Proyectos Organismo

Begoña de la Roza Delgado SERIDA

Equipo Investigador

Adela Martínez Fernández SERIDAAna Soldado Cabezuelo “Fernando Vicente Mainar “Ana Garrido Varo Univ. de CórdobaAugusto Gómez Cabrera “Emiliano de Pedro Sanz “José Emilio Guerrero Ginel “Mª Dolores Pérez Marín “

Equipo Técnico

Sagrario Modroño Lozano SERIDAÁngeles Méndez García “Ovidio Fernández García “Alfonso Carballal Samalea “

Asesores

Pablo Presa Martínez Universidad de VigoMontserrat Pérez Rodríguez “Félix Mª Goyache Goñi SERIDA

Objetivos

�Establecer las bases metodológicas para latrazabilidad (cuantitativa y cualitativa) de dife-rentes ingredientes de origen animal median-te microscopía clásica.

�Definir las bases metodológicas para la traza-bilidad (cuantitativa y cualitativa) de diferen-tes ingredientes de origen animal, medianteFT-NIR (Espectroscopia en el infrarrojo cerca-no por transformada de Fourier).

�Establecer las bases metodológicas para latrazabilidad (cuantitativa y cualitativa) de di-ferentes ingredientes de origen animal, me-diante PCR (Reacción en cadena de la poli-merasa).

Resultados

Optimización de la

identificación de

ingredientes de origen

animal por microscopía.

Detección de factores que

alteran la cuantificación de

los mismos

Preparación de la muestra

La microscopía óptica, aunque adolece delimitaciones, sigue siendo la metodología oficialpara el caso particular de la declaración deingredientes en piensos. En el caso de aquéllosde origen animal permite, tras una separaciónpor densidades de las distintas fracciones poruna técnica de flotación diferencial, identificar

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Área de Nutrición, Pastos y Forrajes

CAL02-018-C2-1. Nuevas tecnologías para la

trazabilidad de ingredientes de origen animal y de

piensos compuestos, para su incorporación en

programas de calidad y seguridad alimentaria

AGL2002-03131. Detección y cuantificación de

proteínas animales en piensos por micrografía y

reflectancia en el infrarrojo cercano más inteligencia

artificial. Diferenciación de especies por polimerasas

la presencia de harinas de carne, harinas depescado, sangre y/o huesos y otras proteínaselaboradas de origen animal. Por tanto, es vitalutilizar una muestra representativa del materiala utilizar, siendo determinante la fase de prepa-ración en los resultados finales obtenidos.

Con el fin de optimizar el tratamiento previode la muestra, se evaluaron tres formas de pre-paración de ésta: 1. utilizando un mortero, co-mo recomienda la técnica oficial y 2. moliendola muestra con dos pasos de luz diferente 1 y 2mm.

El análisis estadístico mostró que en la de-tección de harinas de carne no existen diferen-cias significativas según el modo de prepara-ción de muestras (P<0,05). Para las harinas depescado, no existen diferencias entre 2 mm ymortero, pero sí se detectaron con 1 mm.

Las ventajas e inconvenientes de las dife-rentes formas de preparación de muestras seenumeran en el cuadro 1.

Muestras experimentales de referencia

y Banco de muestras

Se recogieron 358 muestras (harinas cárni-cas y producto terminado) de referencia en las

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Investigación y Desarrollo Agroalimentario - 2003

Mortero

• Según el tipo de ingre-diente del pienso, puedenquedar partículas que difi-cultan la extracción en elembudo de decantación.

• Las preparaciones quedanlimpias y los sedimentosse recogen bien.

• No se pierde material enla fracción <0,125 mm.

1 mm

• Resulta muy costosa laextracción en el embudo dedecantación.

• Las preparaciones no quedanlimpias y resulta difícil identifi-car los diferentes huesos.

• El sedimento queda demasia-do pulverulento y al tamizarse pierde la fracción <0,125mm.

2 mm

• Este tamaño de partículapermite realizar la extrac-ción con comodidad.

• Las preparaciones quedanlimpias y los sedimentos serecogen bien y se puedenleer con facilidad.

• El sedimento no queda pul-verulento y no se pierdematerial en la fracción<0,125 mm.

diferentes empresas y entidades colaborado-ras. En las harinas cárnicas se dispuso de infor-mación de las plantas de procesado en lo refe-rente a los porcentajes de presencia de cadaespecie (bovino, ovino, ave, cerdo.....) y, en losproductos terminados, se manejaron los datosde % de contaminación. Estas muestras, entra-ron a formar parte del banco de muestras y delbanco de datos del SERIDA.

Además, se construyó una población demuestras experimentales a partir de piensoscomerciales de vacuno en producción y cebo,que fueron contaminados con diferentes por-centajes de harinas de carne, sangre y pesca-do, de acuerdo con el esquema que se mues-tra en la tabla 1.

Establecimiento de una base de

imágenes micrográficas de

ingredientes de origen animal

Se está generando una base de imágenesmicrográficas, que se captan de forma simultá-nea al análisis de cuantificación de ingredientespor microscopía de las muestras.

Actualmente, la colección contiene 200 imá-genes clasificadas como: producto entero

Cuadro 1.–Ventajas e inconvenientes de las diferentes formas de preparación de muestras

(piensos y mezclas), ingredientes de origenvegetal (maíz, cebada, semilla de algodón,pulpa de remolacha,...) e ingredientes de origenanimal. Estos últimos, a su vez, se clasificaroncomo componentes aislados en las diferentesfracciones de extracción (pesada, media y lige-ra) y dentro de cada fracción, se agruparon enfunción de la estructura y tipo de constituyente:

sangre, sangre en spray, glóbulos rojos, huesosde pescado, espinas, escamas, huesos demamíferos, huesos de ave, pelos, plumas, mús-culos, etc.

Esta colección se seguirá ampliando duran-te el desarrollo del proyecto, para finalmentequedar implantada en la web del SERIDA:www.serida.org para consulta.

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Área de Nutrición, Pastos y Forrajes

Tabla 1.–Muestras de piensos compuestos experimentales con diferentes nivelesde contaminación en proteínas animales elaboradas

CONTAMINANTEPIENSO % de contaminación

HC HS HP1 HP2 HP3 HP4

0

0,100

0,125

PIENSO 0,200 12 muestras negativas

VACAS 0,500 14 muestras contaminadas con harina de carne

1,000 14 muestras contaminadas con harina de sangre

1,500 56 muestras contaminadas con harina de pescado

3,000

0

0,100 Total= 96 muestras experimentales

0,125

PIENSO 0,200

CEBO 0,500

1,000

1,500

3,000

HC: Harina de carne; HS: Harina de sangre; HPi: Diferentes harinas de pescado

Aplicación de la tecnología

FT-NIR para el análisis de

ingredientes de origen animal

en piensos en su estado natural

y sus materias primas.

Desarrollo y evaluación de

ecuaciones de calibración

Forma de interacción

radiación-muestra

Con el fin de optimizar la información es-pectral, se estudiaron diferentes formas de inte-racción de la radiación con la muestra: reflec-tancia vs. transmitancia; distintas resoluciones;diversos tipos de cápsula, etc. De acuerdo conel trabajo previo, los parámetros espectralesseleccionados fueron los siguientes:

Rango de trabajo: 1000-2500 nm (10000-4000 cm-1).

Resolución: 4 cm-1.

Número de barridos espectrales promedia-dos en cada espectro: 30

Modo: Reflectancia (las muestras son muyopacas como para permitir la transmisiónde luz), e Interleaved (Medida de la RelaciónSeñal/ Fondo continua).

Análisis FT-NIR cuantitativo.

Obtención de ecuaciones de

calibración

Se procedió a la toma de espectros deabsorción en espectroscopía por transformadade Fourier (equipo FT-NIR, modo reflectancia),con las condiciones descritas en el subaparta-do anterior, realizando dos cargas por muestra(se almacena el espectro promedio de 30 lec-turas por duplicado de cada carga), utilizandouna cápsula grande (placa Petri de 11 cm dediámetro en esfera integradora módulo NIRA).

Fueron desarrollados algunos modelos pre-liminares para evaluar la posibilidad de cuanti-ficación de ingredientes de origen animal en lapoblación de muestras experimentales. Paraello, se empleó el software quimiométricoQuant + ver. 4.51.02.

Aunque los resultados obtenidos en estadisciplina son menos exactos y precisos quelos ya conocidos por la tecnología NIRS tradi-cional, cabe esperar mejoras significativas unavez que se profundice en los pretratamientosespectrales y modelos de regresión. No obs-tante, puede observarse claramente que losestadísticos obtenidos para la cuantificacióndel % en harina de sangre, resultaron excelen-tes (Tabla 2).

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Investigación y Desarrollo Agroalimentario - 2003

Tabla 2.–Estadísticos de calibración obtenidos por FT-NIR sobre las muestrasexperimentales (n= 96) por regresión de componentes principales

CONTAMINANTE R2 ETC ETP CPs

% Harina de carne 67,10 0,58 0,62 3

% Harina de pescado 72,75 0,52 0,53 6

% Harina de sangre 97,69 0,17 0,21 8

R2: Coeficiente de determinación para la calibración.ETC y ETP: Errores estándar de calibración y predicción, respectivamente.CPs: nº de componentes principales utilizadas en la regresión.

Análisis FT-NIR cualitativo: Obtención

de modelos de clasificación y/o

autentificación

Se desarrollaron modelos quimiométricospara clasificar las muestras en función del tipode ingredientes de origen animal. Para ello, seutilizó un modelo por componentes principa-les incluido en el software Quant + ver.4.51.02.

En la figura 1 se puede apreciar, cómo elmodelo desarrollado permite, mediante la dis-tribución bidimensional en función de las dosprimeras componentes principales elegidas(PC1 y PC2), las cuales explican el 97,23 % dela variabilidad poblacional, realizar una clasifi-cación y diferenciación de las muestras depiensos contaminados con harinas animales endiferentes porcentajes (desde tres a 0,1 %). Engeneral, las muestras contaminadas con hari-nas de carne se sitúan en la parte positiva deleje PC2, mientras que las que en su composi-

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Área de Nutrición, Pastos y Forrajes

PC1 (% Varianza, 92,26)

Figura 1.–Análisis de clasificación por componentes principales. PC1: primera componenteprincipal; PC2: segunda componente principal

Aplicación de la Microscopía

FT-NIR (MNIR) a la trazabilidad de

ingredientes de origen animal

Esta tecnología consiste en el análisis NIRpor transformada de Fourier de las partículasintegrantes de un pienso compuesto; siendoello posible por la conexión de un microscopioAutoIMAGE a un equipo FT-NIR, que permite lacolección de espectros NIR de partículas (Figu-ra 2) extremadamente pequeñas (< 5 micras).Las partículas pueden ser identificadas comoproteínas de origen animal, harinas de carne,pescado y sangre, etc., una vez puesto a puntoun sistema de reconocimiento por compara-ción con librerías espectrales. Posteriormente,

ción llevan harina de pescado o sangre quedansituadas en la parte negativa. A su vez, los pien-sos con harina de sangre están en la partenegativa de PC1 y con harina de pescado en lapositiva.

PC2

(%

Var

ianz

a, 4

,97

)

es posible, mediante la toma de espectrosautomática de una porción o área definida,cuantificar el porcentaje de los componentes a

través de la proporción del área de la imagenocupada por las partículas del ingrediente oingredientes considerados (Figura 3).

120

Investigación y Desarrollo Agroalimentario - 2003

Figura 2.–Espectros MNIR de huesos procedentes de una contaminacióncon harina de carne de un pienso compuesto

Figura 3.–Área delimitada para mapeo por superficie y posterior cuantificación de ingredientes

Optimización del análisis

cualitativo y cuantitativo de

ingredientes de origen animal

en piensos compuestos y sus

materias primas por la reacción

en cadena de la polimerasa (PCR)

Se realizó un rastreo genético en basesgenómicas mediante una caracterización delos genes mitocondriales con los promotoresFASTA y BLASTA y un diseño y ensayo de ceba-dores del gen citocromo b para la diagnosis deingredientes de origen animal en piensos y sus

materias primas de acuerdo a las secuenciasde bases por especie: rumiante (vacuno, ovinoy caprino), no rumiante (aviar y porcino) ypeces.

El logigrama establecido para el análisiscualitativo implica: 1- una primera PCR paraconfirmar si los constituyentes del pienso son100 % de origen vegetal o contienen algúnotro ingrediente orgánico. 2- segunda PCR queconfirma si los restos anteriores no vegetalesson de origen marino o terrestre. 3- terceraPCR que confirma si los restos terrestres perte-necen a una especie concreta de rumiante.

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Área de Nutrición, Pastos y Forrajes

060000-2003-19. Trazabilidad de ingredientes y

estrategias a seguir para incrementar la seguridad

alimentaria en la producción animal

Responsables Proyecto Organismo

Rafael Peláez Valle CICABegoña de la Roza Delgado SERIDA

Equipo Investigador

Alejandro Argamentería Gutiérrez SERIDAAdela Martínez Fernández “Ana Belén Soldado Cabezuelo “

Equipo Técnico

Ovidio Fernández García SERIDAMª Antonia Cueto Ardavín “

Objetivos

�Determinar el contenido en principios nutriti-vos por métodos de referencia y toma deespectros NIRS.

�Desarrollar calibraciones NIRS para la predic-ción de la composición química.

Resultados

Análisis de principios nutritivos

Se obtuvieron los datos de referencia delos parámetros que se consideraron idóneospara establecer la trazabilidad y control de ca-lidad en materias primas y productos finales,lo que permitió conocer la variabilidad intrín-seca de estos alimentos en su composiciónnutritiva.

1. Materias primas: maíz (humedad, proteína,extracto etéreo, almidón y cenizas), cebada(humedad, proteína, fibra, almidón y ceni-zas), harina de soja (humedad, proteína,fibra y cenizas), pulpa de remolacha (hume-dad y cenizas), alfalfa deshidratada [hume-dad, proteína, fibra (fibra bruta –FB- fibraneutro detergente –FND- y fibra ácidodetergente –FAD-), digestibilidad enzimáticade la materia orgánica y cenizas] y heno dealfalfa [humedad, proteína, fibra (fibra bruta