Cap 4 Pruebas Bioquímicas 2014

8/18/2019 Cap 4 Pruebas Bioquímicas 2014

1/14

MANUAL PRÁCTICO DE MICROBIOLOGÍA - Tomo II: Microbiología Ambiental IIManacorda A. M., Álvarez A. S, Pezzullo S. D. & Cuadros D. P. Año 2014

1

Capítulo 4

PRUEBAS BIOQUÍMICAS:DIFERENCIACIÓN E IDENTIFICACIÓN DE ENTEROBACTERIAS

Objetivos

Conocer el fundamento de la realización de las diferentes pruebas bioquímicas. Identificar las bacterias coliformes presentes en aguas contaminadas.

Introducción

Las bacterias son capaces de modificar el ambiente que las rodea captando sustancias necesariaspara su multiplicación y excretando productos resultantes de su metabolismo de desecho, como serenzimas, toxinas, metabolitos, entre otros. A su vez, las interacciones que establecen con el entornoson características para cada tipo de bacteria. Esta especificidad depende del genotipo y se expresaen un determinado grupo enzimático. Por ello, la caracterización de dichas enzimas es unaherramienta útil para la identificación y clasificación de bacterias.

Durante el estudio de las bacterias coliformes fecales, aquel grupo de bacterias que indicador decontaminación fecal por su existencia en las heces humanas y/o animales de sangre caliente, esnecesario recurrir a la identificación de las bacterias presentes para establecer el riesgo relacionadoa la presencia de las mismas en el ambiente. El significado de los distintos tipos de coliformes queexisten en ecosistemas acuáticos o en el suelo ha sido y es objeto de amplios estudios.

Para este fin se utilizan pruebas diferenciales, sabiendo que existen variaciones entre las cepastaxonómicamente asignadas al grupo de los coliformes. Las bacterias consideradas comocoliformes pertenecen a la familia de Enterobacteriaceae, las cuales son gram negativas, bacilos ococobacilos, oxidasa negativo, anaerobias facultativas, capaces de reducir nitratos a nitrito, ymuchos géneros poseen flagelos, los que le otorgan la posibilidad de desplazarse. Esta familia debacterias posee una estructura antigénica compleja, produce diversas toxinas y otros factores de

virulencia. Los géneros que se incluyen en esta familia son: Escherichia, Shigella, Salmonella,Enterobacter, Klebsiella, Citrobacter, Serratia y Proteus, entre otros.

Se debe considerar que los bacilos gram negativos no fermentadores de lactosa, son bacterias nopertenecen a la familia de las enterobacterias (como ser Pseudomonadaceae o Vibrionaceae) queen muchas ocasiones comparten el ambiente y que poseen algunas características morfológicas yfisiológicas similares a estas. Por lo cual, las pruebas bioquímicas debe ir dirigidas en primer lugar adeterminar las características principales de la familia, en segundo lugar a descartar la posiblepresencia de generos de otras familias con características similares, y por último, diferenciar entrelos géneros de la familia de interés.

Las pruebas bioquímicas consisten en evaluar la reacción que tiene la cepa en estudio frente a undeterminado sustrato. Es importante destacar que la cepa provenga de un cultivo joven y puro, o

sea, que no esté contaminado con microorganismos y que se encuentre en una fase de desarrolloque presente el metabolismo activo para poder obtener resultados confiables. Para corroborar lapresencia de enterobacterias y confirmar características generales de la familia se deberán realizarpruebas como: coloración de gram, oxidasa, catalasa y fermentación de azúcares. Luego, secontinúa con la identificación de enterobacterias en las que se utiliza comúnmente un conjunto depruebas, denominadas IMViC, que contribuyen a distinguir entre los principales géneros quecomponen esta familia. Para una identificación total se puede recurrir a pruebas bioquímicasadicionales como la prueba de la oxidasa, motilidad, catalasa, entre otras. En la tabla 4.1 sepresentan las pruebas bioquímicas usadas para identificar algunos de los géneros principales deenterobacterias.

Tabla 4.1: Pruebas bioquímicas usadas para la identificar algunos de los géneros

principales de enterobacterias (Díaz, 1999)


2/14


2

Prueba o Sustrato

E s c h e r i c h i a

S a l m o n e l l a

S h i g e l l a

K l e b s i e l l a

E n t e r o b c t e r

S e r r a n t í a

P r o t e u s

Y e r s i n i a

Rojo Metilo + + + + o - - - + +Voges-Proskauer - - - + o - + + o - + o - -

Citrato - + - + o - + + + o - -

Beta- lactosidasa + + o - + o - + + + - +

Motilidad + o - + - - + + + -

Indol + - - - - - + o - + o -

CNK (crecimiento en) - + o - - + + + + -

SH2 (sobre TSI) - + - - - - + o - + o -

Hidrólisis de la urea - - - + - - + + o -

Fenilalanina desaminasa - - - - - - + -

Lactosa + + o - + o - + o - + - - -

Sorbitol + + + o - + + + - + o -

Sacarosa + o - - + o - + + + + o - + o -

Arabinosa + + + o - + + - - +

Gas de la glucosa

+ + - + + + + o - -“+ o –“: indica que ocurre una variación entre las especies, siendo positivas la mayoría.

El procedimiento para realizar la diferenciación de enterobacterias consiste en aislar la cepa enestudio de un medio de cultivo selectivo y manteniéndola en estado puro. El medio recomendadopara el desarrollo selectivo y diferencial de enterobacterias es Eosina Azul de Metileno (EMA,Britania), ya que ofrece las condiciones necesarias para el desarrollo de bacterias gram negativas,

inhibiendo a la población gram positiva, y en el que las colonias toman colores característicos paralos diferentes géneros.

Al tomar una colonia de un cultivo primario de un medio selectivo, hay que tener presente quepueden existir células viables que no hayan formado colonias pero encontrarse alrededor de lacolonia de interés. Por ello, se debe de tener especial atención en que se extraiga el inóculo delcentro de una colonia, bien separada de otras colonias. Luego del tiempo de incubación, de 24horas, a 35 0,5C, se debe realizar una prueba de Gram, para confirmar la presencia de bacilosgramnegativos no esporulados.

A partir del cultivo puro se realizan las diferentes pruebas. A continuación se explica el fundamento,procedimiento e interpretación de los resultados de las pruebas: oxidasa, catalasa, movilidad,fermentación de azúcares, producción de ácido sulfhídrico, fenilalanina, indol, rojo de metilo, voges

proskauer y citrato de sodio.

Prueba de la Oxidasa

Esta prueba sirve para determinar la presencia de enzimas oxidasas. Los citocromos son proteínasque forman parte de algunas proteínas que conforman las cadenas transportadoras de electrones,propias del metabolismo respirador. Determinar la presencia o ausencia de estas proteínasproporcionará información útil para la clasificación de grupos bacterianos. La prueba de la oxidasadetecta la presencia de citocromo c oxidasa en la bacteria.

Se basa en la capacidad del colorante tetrametil-p-fenilendiamonio de oxidarse al ceder electronesal citocromo c. Este colorante es incoloro en estado reducido y puede oxidarse rápidamente enpresencia del citocromo c, produciendo formas coloreadas. Por lo general, el sistemacitocromooxidasa sólo se encuentra en los organismos aerobios, algunos anaerobios facultativos y,excepcionalmente, en algún microaerófilo (Vibrio fetus), pero los anaerobios estrictos carecen deactividad oxidasa. Asimismo, la presencia de oxidasa va ligada a la producción de catalasa, ya que


3/14


3

ésta degrada el peróxido de hidrógeno que se produce como consecuencia de la reducción deloxígeno y cuya acumulación es tóxica. Las bacterias coliformes, son oxidasa negativas.

La cepa a estudiar para realizar esta prueba puede proceder de medios de cultivo como el agarnutritivo o el agar de soja tríptica. Este último da resultados más confiables por su ausencia decarbohidratos.

El reactivo de la oxidasa más recomendado es la solución acuosa al 1% de diclorhidrato detetrametil- p-fenilendiamina (reactivo de Kovacs), recién preparada o refrigerada no más de 1semana. Esta solución es menos tóxica y mucho más sensible que el correspondiente compuestodimetilo (reactivo de Gordon y McLeod: clorhidrato de dimetil - p- fenilendiamina).

Procedimiento

1. Método en placa directa Agregar directamente 2-3 gotas de reactivo a algunas colonias desarrolladas en el agar de soja

tríptica. No inundar toda la placa y no invertirla. Observar los cambios de color. Con el reactivo de Kovacs la reacción se produce en unos 10-

15 segundos, mientras que con el de Gordon y McLeod es dentro de los 10-30 minutos. Las colonias positivas desarrollan un color rosa, que vira progresivamente a marrón, rojo

oscuro y, por último, negro.

2. Método indirecto sobre papel Colocar un trozo de papel de filtro (Whatman Nº1 o equivalente) de 3x3 cm aproximadamente

en una placa de Petri. Agregar 2-3 gotas del reactivo de Kovacs en el centro del papel. Extender con el ansa de siembra una colonia sobre el papel impregnado. El ansa debe ser de

un material no reactivo, como el platino (los materiales reactivos como el hierro o el alambre,pueden producir resultados falsos). También puede utilizarse una varilla de vidrio, o unaplicador de madera o plástico.

La reacción de color positiva se produce a los 5-10 segundos, desarrollándose un intenso colorpúrpura.

3. Discos embebidos Preparar en tubo de hemólisis una suspensión densa del microorganismo en estudio en 0.2 ml

de agua destilada. Colocar un disco de oxidasa Dentro de los 30 segundos siguientes se producirá un color rosado que se intensificará hacia el

fucsia cuando la reacción es positiva. Una reacción lenta, pasando los 2 minutos, debe considerarse negativa.

Interpretación de los resultados:Esta técnica permite diferenciar el grupo Enterobacteriaceae (que carecen de citocromo c) delgénero Pseudomonas (que posee citocromo c). Otros resultados son: Vibrio spp. (+) y Aeromonas

spp. (+)

Prueba de la Catalasa

En los ambientes acuosos que contienen oxígeno disuelto, como el citoplasma de las células,aparecen formas tóxicas derivadas del oxígeno. Las bacterias que viven en ambientes aerobiosnecesitan un grupo enzimático capaz de neutralizar estas formas tóxicas. Entre estas enzimas seencuentra la catalasa que convierte el peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno molecular.

La prueba de la catalasa es positiva cuando una bacteria posee enzima catalasa, y por ello ante lapresencia de peróxido de hidrógeno al 3% produce burbujas de oxígeno.

El peróxido de hidrógeno se forma como uno de los productos finales del metabolismo oxidativoaeróbico de los hidratos de carbono. Si se deja acumular, el peróxido de hidrógeno es letal para lascélulas bacterianas. La enzima catalasa transforma el peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno deacuerdo a la siguiente reacción:


4/14


4

H2O2 H2O + O2 (burbujas de gas)

Procedimiento

1. Prueba en portaobjetos Transferir, con ansa, células del centro de una colonia bien aislada y joven (24 horas), a la

superficie de un portaobjetos en el que previamente se haya colocado una pequeña gota deagua. Emulsionar bien.

Añadir 1 o 2 gotas de peróxido de hidrógeno al 3%. Se recomienda no añadir el organismo alreactivo, especialmente si se utilizan ansas que contengan hierro, ya que se pueden producirfalsos positivos.

2. Prueba en tubos o en placas Añadir unas gotas de peróxido de hidrógeno al 3% directamente sobre la colonia desarrollada

en la superficie de una placa o tubo con Agar Nutritivo. Tener presente que el cultivo sea puro y joven.

La rápida aparición y producción sostenida de burbujas de gas o efervescencia, indica una pruebapositiva. Dado que algunas bacterias pueden poseer enzimas distintas de la catalasa (superóxidodisminutasa o peroxidasas) también capaces de descomponer el peróxido de hidrógeno, laproducción de burbujas diminutas en poca cantidad, formadas luego de 20 a 30 segundos no seconsideran una prueba catalasa positiva.

Interpretación de los resultadosLa prueba de catalasa permite diferenciar bacterias aerobias o anaerobias facultativos de lasaerotolerantes y anaerobias estrictas. Las enterobacterias y el género Pseudomona spp. poseenenzima catalasa (prueba positiva). Los géneros Streptococcus spp. y Clostridium spp. carecen deenzimas catalasa (prueba negativa).

Prueba de Motilidad

Las bacterias pueden desplazarse por medio de sus flagelos. Una de las características de lasenterobacterias es su movilidad. Los flagelos se encuentran principalmente en las formas bacilares,aunque existen otras formas móviles. El flagelo está constituido por moléculas de una subunidadproteínica llamada flagelina. Esta proteína es altamente antigénica, los denominados antígenos H, yalgunas de las respuestas inmunitarias a la infección están dirigidas contra estas proteínas.

Para la determinación de la presencia de flagelos se utiliza un medio semiblando para que permitadicho movimiento, el cual se observa como crecimiento difuso.

Agar Nutritivo semisólido (0,3 – 0,5 %)Extracto de buey 3,0 grPeptona 10,0 grCloruro de Sodio 5,0 gr

Agar 4,0 gr Agua destilada c.s.p 1000 mlpH final: 7,4

Agar semisólido SIMTripteína 20,0 grPeptona 6,1 grSulfato de hierro y amonio 0,2 grTiosulfato de sodio 0,2 gr Agar 3,5 gr Agua destilada c.s.p 1000 mlpH final: 7,3 ± 0,2


5/14


5

Procedimiento

Inocular por punción profunda (hasta 5 mm) con aguja. Incubar durante 1-2 días a 35ºC. Si elresultado es negativo, incubar durante otros 5 días a 22- 25ºC.

Un crecimiento difuso a partir del punto de inoculación se considera como resultado positivo (ver

Fig. 4.1).

Interpretación de los resultados:En la tabla 4.1 se indica la movilidad característica de los algunos géneros de la familiaEnterobacterieaceae. El género Pseudomona sp. presenta movilidad positiva.

Fig. 4.1: Cultivo en medio SIM: determinación de movilidad,producción de ácido sulfhídrico e indol

Prueba TSI (Triple Sugar Iron)

El agar Triple Azúcar Hierro (TSI) es un medio de cultivo diferencial que permite estudiar lacapacidad de producción de ácido y gas a partir del metabolismo de la glucosa, sacarosa y lactosaen un único medio. También permite la detección de la producción de H2S. Es un medio útil para laidentificación de enterobacterias.

El agar se prepara en forma de pico de flauta. Esto determina que existan 2 cámaras de reaccióndentro del mismo tubo. La porción inclinada (pico) expuesta en toda su superficie al oxígeno esaerobia y la porción inferior (fondo) está protegida del aire y es relativamente anaerobia.

El medio contiene 0,1 % de glucosa, 1 % sacarosa, 1 % de lactosa, sulfato ferroso, extractostisulares (sustrato proteínico del crecimiento) e indicador de pH (rojo fenol).


6/14


6

Agar TSIExtracto de carne 3,0 grExtracto de levadura 3,0 grPeptona 15,0 grProteosa peptona 5,0 grLactosa 10,0 gr

Sacarosa 10,0 grGlucosa 1,0 grCloruro de sodio 5,0 grSulfato ferroso 0,2 grTiosulfato de sodio 0,3 gr Agar 12,0 grRojo fenol 0,024 gr Agua destilada c.s.p 1000 mlpH final: 7,3 ± 0,2

Procedimiento

Inocular con aguja los tubos con agar TSI, realizando una punción en profundidad y una estríaen la superficie. Para eso, introducir la aguja hasta 3 - 5 mm del fondo del tubo, al retirarla dejaruna estría sobre el slant (superficie del pico de flauta), sin necesidad de tomar inóculonuevamente.

Incubar a 35°C durante 24 horas.

Observar los colores producidos por la producción o no de ácido tanto en la superficie como en elfondo del medio. Además observar la producción de precipitado negro (producción de SH 2) yruptura/desprendimiento del medio (producción de gases CO2 e H2). En la Fig. 4.2 se ilustranposibles resultados y su interpretación.

Interpretación de los resultados:

En la tabla 4.2 se pueden observar las principales especies de enterobacterias y el comportamientoal ser cultivadas en este medio. Pseudomona aeruginosa (no enterobacteria) es representativa deun metabolismo respiratorio, dando negativa la prueba de fermentación de azúcares.

- Fermentación de la glucosa: viraje a color amarillo en el fondo del slant . Si la bacteria fermentasólo la glucosa, la superficie del slant la utilizará por vía respiratoria y, donde la tensión deoxígeno disminuya lo suficiente, empleará una pequeña proporción por vía fermentativa. Estogenerará una pequeña cantidad de ácidos que serán neutralizados por las aminas derivadas dela descarboxilación oxidativa de las proteínas (proceso que depende del oxígeno). Comoresultado, el medio mantendrá su color rojo en la superficie, al no haber cambio de pH. Por elcontrario, las bacterias crecidas en la profundidad del slant emplearán desde el primer momentola glucosa por vía fermentativa, generando ácidos que no serán neutralizados, provocándose undescenso del pH y el color del medio en el fondo del tubo cambiará a amarillo. Dos géneros que

presentan este comportamiento son Shigella spp. y Salmonella spp.

- Fermentación de la lactosa: viraje a color amarillo en la superficie del slant . Si la bacteriafermenta la lactosa, los ácidos producidos modifican el pH de la superficie del medio. En estecaso las aminas no son capaces de neutralizar la cantidad de ácidos producidos en estafermentación, ya que la lactosa se encuentra en el medio a mayor concentración que la glucosa.Como consecuencia, el color del medio en la superficie cambiará a amarillo. Un género quepresenta este comportamiento es E. coli fermenta la glucosa, la sacarosa y la lactosa, sinproducción de H2S.

- No-fermentación de los azúcares: el slant no cambia de color. Si la bacteria es aerobia estricta(no fermentadora), el medio permanecerá de color rojo. En este caso, los azúcares sonrespirados, degradándose completamente hasta CO2, que se elimina y no modifica el pH. El

género Pseudomona spp. presenta este comportamiento.

- Producción de gas en la fermentación: aparición de burbujas, rotura o elevación del agar delfondo del tubo.


7/14


7

- Producción de ácido sulfhídrico: las cepas productoras de sulfhídrico (SH2) se distinguen por laformación de un precipitado negro de sulfuro de hidrógeno en el fondo del tubo, a partir deltiosulfato, por ello el medio debe tener un pH mayor a 7,2. Algunas bacterias con respiraciónanaerobia son capaces de emplear el tiosulfato sódico como aceptor final de electrones en lacadena transportadora. Como consecuencia, este compuesto se reduce a ácido sulfhídrico, que,

a su vez, reacciona con el hierro (Fe2+

) presente en el medio formando un precipitado negro desulfuro de hierro. Los iones Fe2+ proceden de los iones Fe3+ del citrato férrico y aparecen debidoa los cambios en los potenciales redox producidos al someter al autoclave el medio de cultivo.

Fig. 4.2: Cultivo en agar TSI: fermentación de glucosa, lactosa y sacarosa,

producción de gas y de sulfhídrico.

Tabla 4.2 : Interpretación de los resultados en prueba TSI

EspeciesRespuesta esperadaFondo Superficie SH2

Enterobacter aerogenesEscherichia coliProteus vulgarisShigella sonneiSalmonella typhimuriumSalmonella enteritidisPseudomonas aeruginosa

AG AG AG A A AGK

A A ANC o KKKK

--+-++-

AG: ácido con gas (amarillo); A: ácido (amar illo); K: alcalina (rojo)

Prueba de la Fenilalanina

Esta prueba es aplicada para determinar la capacidad de un microorganismo para desaminar lafenilalanina a ácido fenilpirúvico por vía enzimática. El aminoácido aromático, fenilalanina, esdesaminado mediante un mecanismo oxidativo por una aminoácido oxidasa, la enzima fenilalaninadesaminasa. La acción de la misma elimina un grupo amino (NH2) del aminoácido, liberándolo enforma de amoníaco (NH3) y dejando un enlace doble α-cetoácido.

Para poner en evidencia este tipo de metabolismo se utiliza el agar fenilalanina, rico en este

aminoácido. El agar se prepara en forma de pico de flauta. La presencia del ácido fenilpirúvico,producido luego de la incubación, se demuestra con el agregado de cloruro férrico en medio ácido,el cual se forma un quelato de color verdoso entre el ácido fenil pirúvico y los iones Fe3+.


8/14


8

Agar FenialaninaDL-Fenilalanina 2,0 grExtracto de levadura 3,0 grCloruro de Sodio 5,0 grFosfato disódico 1,0 gr Agar 12,0 gr

Agua destilada c.s.p 1000 mlpH final: 7,3 ± 0,2

Reactivo Cloruro Férrico al 10 %Cloruro férrico FeCl3 12,0 grHCl concentrado 2,5 ml Agua destilada c.s.p 100 ml

Procedimiento

Sembrar en agar pico de flauta con abundante inóculo, estriando en la superficie del slant (picode flauta).

Incubar 18 horas a 35 °C. Revelar con 0,2 ml de la solución de cloruro férrico (FeCl3) al 10 %, inundando toda la estría dedesarrollo.

La lectura del resultado debe realizarse dentro de los 5 minutos de añadida la solución de FeCl 3,para evitar la interpretación de falsos positivos. La producción de ácido fenilpirúvico, prueba positiva,se evidencia por el desarrollo de un color verde oscuro en el slant al añadir la solución.

Interpretación de resultados:La presencia de la enzima fenilalanina desaminasa es característica del género Morganella morganii biogrupo 1 y 2, Proteus spp. y Providencia spp., de la mayoría de otros miembros de la familiaEnterobacteriaceae.

Pruebas IMViC

Prueba del Indol

El indol es uno de los productos de degradación metabólica del aminoácido triptofano. Las bacteriasque poseen la enzima triptofanasa son capaces de hidrolizar y desaminar el triptofano conproducción de indol, ácido pirúvico y amoníaco. La producción de indol es una característicaimportante para la identificación de muchas especies de microorganismos.

La enzima triptofanasa presentes en las bacterias degrada el aminoácido triptófano a indol, que esel compuesto que se detecta en este ensayo.

Si la bacteria posee esta enzima, ante la presencia del aminoácido triptófano en el medio de cultivoproducirá indol. De ser así, al añadir al medio el reactivo de Kovacs o el de Ehrlich, se producirá unanillo de color rojo en la superficie del caldo. Esto se debe a que el indol reacciona con el grupoaldehído del p-dimetilaminobenzaldehído, principio activo de ambos reactivos. De producirse elanillo rojo en la superficie del caldo la prueba será considerada positiva (ver Fig.4.1). La prueba esconsiderada negativa, no hubo producción de indol, cuando el anillo es color amarillo. Un colornaranja indica probable presencia de escatol, un producto de la degradación del indol. El medio decultivo utilizado debe ser rico en triptofano.

Reactivo de Kovacs Alcohol amílico o isoamílico 75 ml

p-metilaminobenzaldehído 5,0 grHCl concentrado 5 ml


9/14


9

Reactivo de EhrlichEtanol absoluto 190 mlp-dimetilaminobenzaldehído 2,0 grHCl concentrado 40 ml

Caldo Triptófano

Digestato tríptico de caseína 10,0 grL-triptofano 1,0 grCloruro de sodio 5,0 gr Agua destilada c.s.p 1000 mlpH final: 7,5 ± 0,1

Procedimiento

1. Con caldo triptófano Inocular con ansa una porción de cultivo puro en 5 ml de medio de cultivo. Incubar a 35 0,5C

durante 24 2 horas.

Añadir 0,2 - 0,3 ml del reactivo y agítese. Reposar 10 minutos y observar los resultados.

2. Con medio SIM Sembrar por punción profunda con aguja de inoculación recta una porción de cultivo puro e

incubar a 35ºC durante 24 horas. Añadir 0,2 - 0,3 ml del reactivo y agítese. Reposar 10 minutos y observar los resultados.

Interpretación de los resultados: ver Tabla 4.2Géneros con enzima triptofanasa: Edwarsiella (+), Escherichia coli (+)Géneros sin enzima triptofanasa: Klebsiella pneumoneae (-), Salmonella (-), Enterobacter (-)

Prueba del Rojo de Metilo

Una de las características taxonómicas que se utilizan para identificar los diferentes géneros deenterobacterias lo constituyen el tipo y la proporción de productos de fermentación que se originanpor la fermentación de la glucosa. Se conocen 2 tipos principales:

La fermentación ácido-mixta La fermentación del 2,3 butanodiol

En la fermentación ácido-mixta se forman, fundamentalmente: ácido láctico, acético y succínico,etanol, H2 y CO2. En la vía del 2,3 butanodiol se forma: alcohol butanodiol, etanol, H 2 y CO2 ypequeñas cantidades de ácido (acetato y succinato).

En la prueba Rojo de Metilo tiene importancia el pH terminal, es decir, se evalúa la producción deácido a partir de la glucosa (fermentación ácido-mixta). El rojo de metilo es el indicador de pHutilizado para determinar la acidez, tiene un intervalo entre 6,0 (amarillo) y 4,4 (rojo).

El medio de cultivo utilizado es el caldo Clark y Lubs o el caldo RM/VP. Debido a que los productosde desecho que se evalúan están en bajas concentraciones, se aconseja fraccionar el medio entubos pequeños con 2 ml de medio de cultivo.

Caldo RM/VPPeptona 5,0 grGlucosa 5,0 grFosfato de hidrógeno dipotásico (K2HPO4) 5,0 gr

Agua destilada c.s.p 1000 mlpH final: 6,9 ± 0,2


10/14


10

Solución indicadora Rojo de MetiloRojo de metilo 0,1 grEtanol 95% 300 ml Agua destilada c.s.p 500 mlpH final: 6,9 ± 0,2

Procedimiento

Inocular el caldo RM/VP con un cultivo puro de no más de 24 horas del microorganismo enestudio

Incubar a 35°C durante 5 días Agregar una gota de la solución indicadora Rojo de Metilo

Interpretación de los resultados:Los resultados positivos son aquellos que han producido aparición de un color rojo, mientras que uncolor amarillo constituye un resultado negativo. Los matices intermedios son resultadoscuestionables, que indican posiblemente una purificación incompleta del cultivo (ver Fig. 4.3).

La fermentación ácido-mixta la realizan las bacterias del grupo de E.coli y los productos finales son

ácidos orgánicos (ácidos fórmico, acético, láctico y succínico) que provocan un fuerte descenso delpH inicial del medio. Enterobacter aerogenes y Klebsiella pneumoniae son negativos.

Fig. 4.3: Prueba de Rojo de Metilo

Prueba de Voges- Proskauer

En la prueba de Voges-Proskauer se determina la vía de fermentación del 2,3 butanodiol (butilén-glicólica), un metabolismo propio de determinadas bacterias coliformes. El acetil-metil-carbinol(acetoína) es un producto intermediario en la producción de butanodiol. En medio alcalino, y en

presencia de oxígeno, la acetoína es oxidada a diacetilo. Este se revela mediante la reacción deldiacetilo con α-naftol, originando dicha mezcla un color rojo-fucsia.


11/14


11

El medio de cultivo utilizado es el caldo Clark y Lubs o el caldo RM/VP, con las mismasespecificaciones realizadas para la prueba Rojo de Metilo respecto al volumen de cultivo. El reactivoes una solución de α-naftol más hidróxido de potasio.

Solución de α-Naftolalfa-naftol purificado 5 gr

alcohol etílico absoluto 100 mlEsta solución, conservada a 5-10°C, se mantieneestable durante 2 semanas

Solución de Hidróxido de PotasioKOH 40 gr Agua destilada 100 ml

Procedimiento

Inocular el caldo RM/VP con un cultivo puro de no más de 24 horas del microorganismo enestudio

Incubar a 35°C durante 48 hs. Transferir 1 ml del caldo RM/VP con el desarrollo microbiano a un tubo limpio y agregar 0,6 ml

de solución de naftol y 0,2 ml de la de KOH. Leer el resultado antes de los 5 minutos de haber agregado las soluciones.

El resultado positivo viene dado por la aparición a los minutos de un color rosa a carmesí (ver Fig.4.4).

Interpretación de los resultadosLa fermentación butilén-glicólica la realizan las bacterias del grupo Klebsiella-Enterobacter . Estaprueba es negativa para Escherichia coli .

Fig. 4.4: Prueba Voges-Poskauer


12/14


12

Prueba del Citrato de Sodio

Esta prueba sirve para determinar si un organismo es capaz de utilizar citrato como única fuente decarbono y energía. Uno de los medios utilizados puede ser el agar Citrato de Simmons, el cualcontiene citrato de sodio como única fuente de carbono, fosfato monoamónico como única fuente defosfato en su metabolismo y azul de bromotimol como indicador de pH. Únicamente las bacterias

capaces de metabolizar el citrato podrán multiplicarse en este medio. El metabolismo del citrato serealiza, en aquellas bacterias que poseen la enzima citrato permeasa, quien participa en el ciclo delácido cítrico. El desdoblamiento del citrato da como producto: oxalacetato y piruvato. El piruvato enmedio alcalino, presencia de iones amonio, da origen a ácidos orgánicos que, al ser utilizados comofuente de carbono, producen carbonatos y bicarbonatos alcalinos.

Esta liberación de iones básicos generará la fuerte basificación del medio que será aparente por uncambio de color del indicador de pH, de verde a azul. Este aumento de pH se visualiza por lapresencia del azul de bromotimol que vira a color azul a pH alcalino (a partir del pH 7,6).

Esta prueba se puede realizar con agar Citrato de Simmons o con caldo Citrato Koser.

Caldo Citrato de Koser

Fosfato de hidrógeno amonio sodio (NaNH4HPO4.H2O) 1,5 gFosfato de hidrógeno dipotásico 1,0 gSulfato de magnesio heptahidratado (MgSO4.7H2O) 0,2 gCitrato de sodio dihidratado (en cristales) 3,0 g Agua destilada c.s.p 1000 mlpH 6,7 ± 0,2

El medio preparado es incoloro, transparente y sin precipitaciones.

Agar Citrato de SimmonsFosfato de hidrógeno amonio (NH4H2PO4 . H2O) 1,0 gFosfato de hidrógeno dipotásico 1,0 gCloruro de sodio 5,0 gCitrato de sodio dihidratado 2,0 gSulfato de magnesio heptahidratado 0,2 g Agar 15,0 g Azul de bromotimol 0,08 g Agua destilada c.s.p 1000 mlpH 6,7 ± 0,2

El medio preparado es color verde.

Procedimiento

1. Con caldo Citrato Koser

Inocular ligeramente con la cepa aislada y joven el medio líquido con aguja.

Incubar a 35 0,5ºC durante 72-96 horas

El resultado positivo se evidencia por un crecimiento variable con desarrollo de turbidez en el caldomientras que un resultado negativo implica la ausencia de crecimiento (ver Fig. 4.5).

2. Con agar Citrato de Simmons

Inocular el agar inclinado en el slant (pico) con una sola estría. Utilizar un cultivo de 24 horas enun medio sólido y cuidando no arrastrar medio de cultivo, ya que se pueden producir falsospositivos por crecimiento a partir del medio de cultivo del inóculo

Incubar a 35 0,5ºC durante 48 horas

La reacción positiva se evidencia por desarrollo de la cepa a lo largo de la estría acompañado de un

color azul en el medio de cultivo. El resultado negativo consiste en la ausencia de crecimientomanteniendo el color verde del medio (ver Fig. 4.6).

Interpretación de los resultados


13/14


13

Dentro de la familia Enterobacteriaceae esta capacidad de usar el citrato la tienen los siguientesgéneros: Enterobacter , Klebsiella, Serratia, Citrobacter y algunas especies de Salmonella. Sinembargo, Escherichia, Shigella, Salmonella typhi y Salmonella paratyphi son incapaces de crecercon esos nutrientes.

Además de los métodos de identificaciones tradicionales existen otras alternativas para recurrir a laidentificación de microorganismos, entre los que se encuentran: los sistemas de pruebas múltiples ytécnicas biología molecular.

Los sistemas de pruebas múltiples son alternativas útiles y económicas, ya que se adquieren kitcomerciales que permiten realizar varias pruebas en simultáneo con menor tiempo de incubación, loque se traduce en mayor agilidad para obtener resultados. En la tabla 4,3 se presentan algunas delas opciones de kit de identificación que actualmente existen en el mercado.

Tabla 4.3 : Sistemas de pruebas múltiples

Nombre del sistema Descripción

API Veinte microcápsulas en una tarjeta pueden proporcionar 21 resultados

Enterotube Cilindro de plástico que contienen 12 compartimentos llenos de medio.Se inoculan secuencialmente todos los compartimentos con una solaaguja y se obtienen 15 resultados

Inolex Enteric 1&2 Micrométodo con 10 unidades capilares en una tarjeta. Dos tarjetasdistintas permiten obtener 20 resultados

Microlab ID Micrométodo que permite 15 resultados en cuatro pasos.

Minitek Discos impregnados de reactivo, colocados mecánicamente enpequeños pocillos. 34 discos proporcionan 36 resultados

Por otro lado, se encuentra la identificación de microorganismos por métodos moleculares, uncampo en verdadero auge en la actualidad. La Microbiología ha evolucionado en las últimasdécadas con el avance en el desarrollo de la Biología Molecular, contribuyendo en la generación denuevas técnicas para diagnóstico molecular, identificación y tipificación de bacterias, hongos, virus y

Fig. 4.5: Prueba de Citrato con caldoCitrato Koser con reacción positiva

Fig. 4.6: Prueba de Citrato con agarCitrato Simmons con reacción positiva


14/14


14

parásitos, estudios epidemiológicos, detección de factores de virulencia y detección de resistencia aantimicrobianos. Dentro de las técnicas moleculares para la identificación de bacterias seencuentran: amplificación de ácidos nucleíco, secuenciación y tipificación del ácido nucleíco, ya sea ADN o ARN.

La elección de la metodología de identificación de microorganismos más adecuada depende de

diversos factores. Para obtener resultados válidos y estandarizados, se deberá seleccionar aquellaspruebas que ofrezcan practicidad, claridad en la interpretación, reproducibilidad de resultados y quepueda ser asumida con los costos disponibles.

Bibliografía

American Public Health Association (APHA), American Water Works Association & Water PollutionControl Federation. 1992. Standard Methods for the examination of Water and Wastewater.. APHA,Washington, D.C.USA. Part 9000.

Díaz, R.,Gamazo C., López-Goñi, I.. 1999. “Manual Práctico de Microbiología”. Cap. 17: Pruebas

bioquímicas para identificación bacteriana. 2ª Ed. Editorial Masson S.A. Barcelona, España. 61 pp.

Merino, L., Giusiano G. 2011. Manual de técnicas moleculares para estudios microbiológicos. Asociación Argentina de Microbiología. Buenos Aires, Argentina. 100 pp.

Cap 4 Pruebas Bioquímicas 2014

Documents

Transcript of Cap 4 Pruebas Bioquímicas 2014