Universidad nacional Micaela Bastidad de Apurmac- ingeniera agroindustrialPRACTICA N6 CARACTERIZACIN DE COLORANTES DE ACHIOTE Y COCHINILLA I.-OBJETIVO

Identificar los colorantes por medio de espectrometra y cromatografa

II.-INTRODUCCIN El conocimiento sobre los parmetros de extraccin nos permite optimizar la obtencin de colorantes de diverso origen. La caracterizacin de los colorantes se va mas hacia el conocimiento de las propiedades fsico- qumicas de estos compuestos, independientemente de la cantidad que se obtenga a partir del uso de una tecnologa apropiada. La caracterizacin de colorantes es una de las etapas importantes en el reconocimiento de aquellas caractersticas que debe cumplir un colorante de calidad. Por ello, la presente prctica tiene por finalidad ayudar al estudiante a reconocer las tcnicas mas adecuadas aplicadas ala verificacin de tales caractersticas. III.-FUNDAMENTO TERICOCOLORANTE NATURAL sin les Colorante orgnico natural, pigmento o sustancia que se obtiene a partir de materia vegetal o animal, con un limitado proceso qumico o l y sometidos posteriormente a pruebas de identidad y pureza que permita ser utilizados en alimentos, productos de perfumera y belleza, en alguna parte de stos o en todo y que directamente o a travs de su reaccin con otras sustancias, es capaz de impartir el color que le caracteriza.

LA CROMATOGRAFA La cromatografa es una tcnica que se emplea en el fraccionamiento de protenas. Consiste en la aplicacin de una muestra compleja de protenas a una columna de cristal en la que se ha situado una matriz slida porosa que est inmersa en el solvente. A continuacin se bombea una gran cantidad de solvente a travs de la columna. Las diferentes protenas se van retrasando de manera distinta segn sus interacciones con la matriz, por lo que pueden ser recogidas separadas a medida que son eluidas por el fondo de la columna. Segn la matriz escogida, las protenas se pueden separar de acuerdo a su carga, su hidrofobicidad, su tamao o su capacidad de unirse a grupos qumicos particulares.

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Universidad nacional Micaela Bastidad de Apurmac- ingeniera agroindustrialLa pureza de las fracciones obtenidas se suele comprobar electroforesis en geles de poliacrilamida. En toda cromatografa hablaremos de los siguientes trminos:

mediante la

matriz de la columna. Sustancia que est empapada de solvente y que se empaqueta en la columna. Tambin se denomina el lecho de la columna. longitud de la columna. Longitud del dispositivo en el que se empaqueta la columna. Es importante en algunos tipos de cromatografa como la de filtracin en gel y poco importante en otras como la cromatografa de afinidad.

volumen de la columna. Volumen total de gel que se empaqueta en una columna cromatografa. volumen muerto de la columna. Cantidad de solvente que tiene que atravesar la columna para asegurar que se ha reemplazado completamente. Coincide con el volumen de solvente que sale de la columna desde que se aplica la muestra hasta que empieza a salir la primera protena. En general, y dependiendo del tipo de cromatografa puede ser de 1 a varias veces el volumen de la columna.

'Run Throught'. Es, en columnas de intercambio inico o de afinidad, el volumen de solvente ms protenas que atraviesa la columna sin quedar retenido en ella. Correspondera en el caso de la cromatografa de afinidad al volumen de solvente que contiene las protenas no afines al ligando. TIPOS DE CROMATOGRAFA EN COLUMNA

El principio de separacin de la cromatografa es la aplicacin de un criterio de separacin a las protenas que se desplazan a lo largo de una matriz slida porosa. Este criterio de separacin se basa en alguna propiedad que es diferentes entre las protenas que se quieren separar : peso molecular, carga elctrica, afinidad de una de ellas por alguna otra, etc... En funcin de cual sea el criterio de separacin que se aplique diferenciamos tres tipos de cromatografa en columna: Cromatografa de intercambio inico La cromatografa de intercambio inico se realiza sobre que tienen una carga neta, positiva en el esquema. La carga de la matriz de la columna as como la carga de las protenas depender del pH del solvente y de su fuerza inica (proporcional a la concentracin de iones). En unas condiciones determinadas sern retenidas en la columna las protenas que tengan una carga complementaria a la de la matriz del gel

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Universidad nacional Micaela Bastidad de Apurmac- ingeniera agroindustrial(las protenas cargadas negativamente sern retenidas por una matriz cargada positivamente), siendo eluidas las restantes. Para eluir las protenas retenidas se puede variar la carga inica del solvente o su pH de forma que se alcance el punto matrices isoelctrico de la protena de inters o el de la matriz, neutralizando de este modo la fuerza que retiene a las protenas L en la columna. La cromatografa de filtracin en gel se realiza empleando unas matrices formadas por unas esferas porosas. El volumen de los poros es muy elevado y su dimetro est determinado. Cuando penetran en el lecho de la columna dos protenas de tamaos tales que una penetra en los poros de las bolas de gel y la otra no, la primera se reparte entre el espacio entre las bolas y el interior de los poros, reducindose la concentracin en la fase libre entre las bolas. La segunda protena, por tamao, slo puede encontrarse entre las bolas. El flujo de solvente es ms elevado entre las bolas que en el interior de los poros de stas, por lo que el efecto neto es el de acelerar el desplazamiento de las protenas de mayor peso molecular respecto al de las de menor peso molecular. En esta cromatografa se eluyen primero las protenas mayores, y en segundo lugar las menores, y tiene una gran influencia en el resultado la longitud de la columna y el volumen de la misma. Columnas largas aseguran separaciones de mayor calidad. Empleando patrones de protenas de peso molecular conocido se emplea para determinar el peso molecular de protenas de tamao desconocido. Cromatografa de afinidad y de inmunoafinidad En la cromatografa de afinidad las bolas de gel que conforman el lecho de la columna presentan unido en su superficie un ligando, una molcula ante la que tiene afinidad una o ms de las protenas presentes en la mezcla a separar. Al atravesar la columna el ligando secuestra sobre la superficie de las bolas de gel la protena afn, y deja pasar el resto. La elucin de la protena afn se puede conseguir modificando las propiedades de carga del ligando (variando el pH hasta alcanzar su punto isolctrico, variando la fuerza inica del solvente, etc...) con lo que se reduce la intensidad de la interaccin hasta anularla. La naturaleza del ligando es muy variada, puede ser un receptor (protena) unido a las bolas, que seleccionar su/s ligando/s de una mezcla compleja, o el antgeno empleado en una inmunizacin el que recubre las bolas y que retendr del suero del animal aquellos anticuerpos que lo reconocen (anticuerpos purificados por afinidad), o en el caso concreto de la inmunoafinidad el ligando que recubre las bolas son anticuerpos que retienen en la columna a aquellas protenas que contienen los eptopos que reconocen.

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Universidad nacional Micaela Bastidad de Apurmac- ingeniera agroindustrialEn ocasiones la cromatografa de afinidad se realiza incubando el gel recubierto con el ligando directamente con la solucin que contiene las protenas a purificar. Posteriormente se empaqueta la columna y se procede a la elucin, primero de las protenas no unidas ('run throught') y posteriormente de las retenidas (eluido especfico). La cromatografa es usada para separar mezclas de sustancias en sus respectivos componentes. Todas las formas de cromatografa trabajan bajo el mismo principio. Hacer una capa fina con el papel cromatografito. Aplicar una pequea cantidad de la muestra con la ayuda de un capilar. A su lado, aplicar soluciones acuosas estndares de colorantes. Utilizar la mezcla de disolventes n y avanzar la cromatografa. Es un mtodo rpido y eficaz para la identificacin y separacin de mezclas de colorantes. La tcnica descripta a continuacin sirve para la identificacin rpida de los colorantes permitidos por el Cdigo Alimentario. El esquema general de trabajo comprende las siguientes etapas: Preparacin de la muestra. Eleccin de las condiciones de corrida. Papel Solvente de desarrollo Tcnica cromatografa Seleccin de patrones Siembra de la muestra Desarrollo del cromatograma Comparacin de las manchas con las de los patrones (Rf y forma).

ESPECTROMETRAEl espectrmetro, o espectrgrafo, es un aparato capaz de analizar el espectro caracterstico de un movimiento ondulatorio. Se aplica a variados instrumentos que operan sobre un amplio campo de longitudes de onda. Los mtodos espectro mtricos son mtodos instrumentales empleados en qumica analtica basados en la interaccin de la radiacin electromagntica, u otras partculas, con un analito para identificarlo o determinar su concentracin. Tabla N 1. Colores De La Luz Visible Longitud de onda de la Color absorbido

Color observado

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Universidad nacional Micaela Bastidad de Apurmac- ingeniera agroindustrialabsorcin mxima(nm) 380-420 420-440 440-470 470-500 500-520 520-550 550-580 580-620 620-680 680-780

Violeta Azul violeta Azul Verde azuloso Verde Verde amarillento Amarillo Naranja Rojo Prpura

Amarillo verdoso Amarillo Naranja Rojo Prpura Violeta Azul violeta Azul Verde azuloso Verde

Tabla N 2 principales colorantes Naturaleza quimica Tetrapiroles (lineales y cclicos) Carotenoides (tetraterpenoides) Flavonoides ejemplos Ficobilinas Clorofilas Carotenoides Flavonas Flavonoles Blanco-crema Chalconasauronas Amarillo-blanco Antocianinas Amarillo 330-360 340-390 Amarillo Xantonas Quinonas Xantonas Rajo-azul Naftoquinonas Amarillo Antraquinonas Rojo-azul-verde Derivados indigoides e ndoles Pirimidas Uterinas sustituidas Flavinas Blanco-amarillo Fenoxazinas Amarillo fenazinas Amarillo-rojo Amarillo-purpura (betacianinas) Amarillo-rojo 530-554 Indigo Rojo-purpura Betelainas Azul-rosado (betaxantinas) 470-485 420-460 340-400 480-550 380-340 310-350 400-500 Color predominante Azul verde Amarillo rojo Verde Amarillo anaranjado

n m610-650 (ficocianidinas) 540-570 (ficoeritrinas) 640-660

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Universidad nacional Micaela Bastidad de Apurmac- ingeniera agroindustrialFuente: Lock Sing O. 1997 IV.-MTODO En esta prctica se desarrolla la caracterizacin de colorantes a partir de dos mtodos que son los siguientes:

Mtodo de Cromatografa de Absorcin, este mtodo esta basado en ladeterminacin de la longitud de onda de mxima absorcin de una solucin diluida de achiote

V.-MATERIALES

Mtodo de Cromatografa de

papel,

este

mtodo

esta

basado en la separacin cromatografa de las especies colorantes. muestra de colorantes (achiote) muestra de colorantes (cochinilla) vaso de precipitado de 250ml. Fiola de 25ml Papel filtro Capilar de vidrio Espectrofotmetro Regla Alcohol etlico(96)

VI.-PROCEDIMIENTO Para la cromatografa de absorcin

Pesamos dos muestras de exactamente 0.5gr. de colorante. Se Coloca el colorante en una fiola de 25ml. Enrasamos (96) con hasta alcohol etlico

disolverlo

completamente. Se realizo una homogenizacin De la solucin coloreada (naranja palido), tomar una alcuota de 3ml con ayuda de una pipeta y vertimos el contenido en otra fiola de 25ml.

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Universidad nacional Micaela Bastidad de Apurmac- ingeniera agroindustrial Volvimos a enrasar con alcohol (96) y agitamos hasta conseguir homogeneidad. Luego, verter el contenido en una de las celdas del espectrofotmetro para realizar la medicin de longitud de ondas de 420 hasta500nm, haciendo la medicin cada 5nm. Preparamos la muestra patrn (alcohol 96) Hacemos la medicin en blanco. Realizamos las rectificaciones de los valores para que sena mas exactos, para ello tomamos los como referencia los valores mas altos. Para cromatografa en papel

En un vaso de precipitado vertimos ms o menos 10ml de eluente (alcohol etlico 96).

lpiz.

Preparamos una tira rectangular de papel filtro, aun centmetro del

borde del lado menor, trazamos una lnea con ayuda de una regla y un

Luego, preparamos las soluciones de colo rante, estas deben ser muy concentradas. Con ayuda de un capilar de vidrio, colocamos las muestras en forma de pequeos puntos sobre la lnea trazada con lpiz en el papel. Identifique los puntos de muestra colocados. Luego, colocamos el papel en el vaso de precipitado y dejamos que el eluente separe las especies colorantes.

VII.-RESULTADOS 1.- Los datos tomados son de la muestras de achiote: absorbanc ia longitud de onda 600 0,003 595 0,001 590 0,005

500 495 490

0,551 0,723 0,894

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Universidad nacional Micaela Bastidad de Apurmac- ingeniera agroindustrial585 580 575 570 565 560 555 550 545 540 535 530 525 520 515 510 505 0,002 0,004 0,007 0,003 0,009 0,011 0,014 0,017 0,024 0,03 0,046 0,062 0,086 0,136 0,193 0,284 0,392 485 480 475 470 465 460 455 450 445 440 435 430 425 420 415 410 405 0,986 0,997 0,994 1,018 1,244 1,173 1,144 1,06 0,994 0,954 0,919 0,871 0,8 0,709 0,643 0,59 0,525

absorbocion (A) longitud de onda(nm) 630 0,064 625 0,064 620 0,063 615 0,067 610 0,068

560 555 550 545 540

0,105 0,106 0,103 0,102 0,102

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Universidad nacional Micaela Bastidad de Apurmac- ingeniera agroindustrial605 600 595 590 585 580 575 570 565 0,072 0,071 0,08 0,086 0,089 0,091 0,098 0,099 0,097 535 530 525 520 515 510 505 500 495 490 485 480 0,104 0,105 0,106 0,103 0,109 0,102 0,104 0,099 0,101 0,086 0,094 0,093

2.- muestra obtenida de la cochinilla

De la segunda parte: determinando el factor de retencin (Rf) Rf =Ls/Le 1.-Del anlisis de achiote Ls = 4cm Le = 4.2cm Rf =Ls/Le Rf = 4/4.2 =0.9523 2.-Del anlisis de cochinilla Ls = 8.2cm Le = 8.4cm Rf =Ls/Le Rf = 8.2/8.4 =0.9761

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Universidad nacional Micaela Bastidad de Apurmac- ingeniera agroindustrialPor lo tanto el: Rf = 4/4.2 =0.9523 de achiote Rf = 8.2/8.4 =0.9761 de cochinilla VI. DISCUCIONES:

Los datos que se obtuvieron en la prctica fueron bastante practico en el caso de la cromatografa fue algo fcil por que solo utilizamos el equipos y la dos muestras ( el colorante(achiote y cochinilla) y caso de obtuvieron resultados ptimos. una muestra blanco) y en el factor de retencin tambin las muestras fueron eficientes ya que

Los resultados de cada de las muestras fueron los siguientes: Longitud de onda Para achiote = 1.244nm Para cochinilla = 0.109nm Factor de retencin

Rf = 4/4.2 =0.9523 de achiote Rf = 8.2/8.4 =0.9761 de cochinilla VIII.-CONCLUSIONES

Se puede decir que

la cromatografa de absorcin, a una longitud de bibliografa el rango

465nm (1.244nm) la absorbencia alcanza el pico ms alto, es decir la absorbancia mxima de la achiote y en la permisibles es entre (600 A-405)

Se puede decir que

la cromatografa de absorcin, a una longitud de bibliografa el rango

515nm (10.109nm) la absorbencia alcanza el pico ms alto, es decir la absorbancia mxima de la cochinilla y en la permisibles es entre (630-480A)

De la misma forma se puede decir que en la cromatografa en papel la retencin es de 0.9523 para el achiote y esto esta en el rango de un color naranja y a una longitud de honda entre 450-470

De la misma forma se puede decir que en la cromatografa en papel la retencin es de 0.9761 para el achiote y esto esta en el rango de un color naranja y a una longitud de honda entre 450-470

El mejor resultado de la retencin de agua fue de cochinilla tuvo mayor distancia de recurrido desde el punto de inicio.

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Universidad nacional Micaela Bastidad de Apurmac- ingeniera agroindustrialIX.- CUESTIONARIO 1,- Haga un listado de los colorantes ms empleados en la agroindustria, indicando el color, nombre comercial y su origen. La FDA los define como: Es cualquier colorante, pigmento u otra sustancia obtenida por sntesis o artificio similar o extrada, aislada o derivada, con o sin intermediarios del cambio final de identidad a partir de un vegetal, animal o mineral u otra fuente y que cuando es aadida o aplicada a los alimentos, medicamentos o cosmticos, al cuerpo humano o a cualquier parte, por si misma es capaz de impartir color

A) NaturalesProvienen de elementos vegetales, animales o minerales Son permitidos Son inocuos Son obtenidos de material biolgico No necesitan certificacin E100 Curcumina Amarillo natural 3 Fuente: rizoma de la crcuma Color: amarillo intenso Utilidad: curry, caramelos, mermeladas, embutidos, mostazas, sopas, caldos, conservas de pescado, conservas vegetales, yogur y queso fresco Toxicidad: minima, 0 a 3 mg/kg (JEFCA) E101 Riboflavina Fuentes: lcteos, hgado y pescados Color: amarillo Utilidad: suero de leche, leche entera y enriquecer alimentos Toxicidad: IDA: 0 a 0.5 mg/kg E120 Cochinilla Rojo natural 4 Fuente: hembras dactylopus coccus Color: rojo Utilidad: conservas vegetales, mermeladas, helados, productos crnicos, yogur,queso fresco, bebidas alcohlicas y bebidas no alcohlicas Toxicidad: no se conocen efectos adversos para la salud E140 Clorofila Fuentes: algas, csped, alfalfa Color: verde Utilidad: gomas, chicles, helados y bebidas refrescantes Toxicidad: no se ha establecido un lmite mximo a la ingestin diaria E150 - Caramelo Fuentes: calentamiento de sacarosa y otros azucares Color: dorado oscuro Utilidad: Panadera, pastelera, helados, gaseosas y bebidas alcohlicas Clases: I Obtenido calentando el azcar sin ms adiciones o bien aadiendo tambin cido actico, ctrico, fosfrico o sulfrico, o hidrxido o carbonato sdico o potsico. II Obtenido calentando el azcar con anhdrido sulfuroso o sulfito sdico o potsico. III Obtenido calentando el azcar con amoniaco o con una de sus sales (sulfato, carbonato o fosfato amnico) IV Obtenido calentando el azcar con sulfito amnico o con una mezcla de anhdrido sulfuroso y amoniaco.

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Universidad nacional Micaela Bastidad de Apurmac- ingeniera agroindustrialToxicidad: FAO/OMS para aditivos alimentarios fija la ingestin diaria admisible en 200 mg/Kg de la clase III y IV. E153 Carbn medicinal vegetal Fuentes: carbonizacin de materias vegetales. Color: verde Utilidad: decolorar parcialmente mostos, vinos, vinagres y desodorizar aceites. Toxicidad: no se ha establecido un lmite mximo a la ingestin diaria. E160 Carotenoides E160a Alfa, beta y gamma caroteno E160b Bixina, nobixina E160c Capsantina, capsorrubina E160d Licopeno Fuentes: Beta caroteno: papaya, camote, aj, hojas verdes Capsantina: pimiento rojo, pimentn Bixina, norbixina o achiote: Semilla bixa orellana Licopeno: tomate Color: amarillo, naranja y rojo Utilidad: mantequilla, margarina, yogur, queso, bebidas refrescantes, helados y productos crnicos Toxicidad: piel naranja Xantofilas E161a FlavoxantinaE 161b LutenaE 161c CriptoxantinaE 161d RubixantinaE 161e VioloxantinaE 161f RodoxantinaE 161g Cantaxantina Fuentes: vegetales, yema de huevo, salmn y crustceos Color: amarillo y anaranjado Utilidad: pldoras, alimento de animales Toxicidad: piel naranja E162 Rojo de remolacha Betania betalana Fuentes: beta vulgaris: beterraga Color: rojo Utilidad: helados, yogurt, repostera, bebidas refrescantes, conservas vegetales, mermeladas y conservas de pescado Toxicidad: no se conocen efectos nocivos de este colorante y la OMS no ha fijado un lmite a la dosis diaria admisible. E - 163 Antocianos Fuentes: frutas y flores Color: rojos, azulados o violetas Utilidad: vino, derivados lcteos, helados, caramelos, productos de pastelera, conservas vegetales, crnicos, sopas y bebidas refrescantes Toxicidad: IDA: 0 a 200 mg/kg X.-BIBLIOGRAFA

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Universidad nacional Micaela Bastidad de Apurmac- ingeniera agroindustrial Salvador Badui Dergal, cuarta edicin,qumica de los alimentos Pg.409. Matissek, Schnepel y Steiner anlisis de alimentos fundamentosmtodos-aplicacin Pg.291.

GIBAJA S. 1998. Pigmentos Naturales Qunonicos. Primera Edicin. Editorial Universidad Nacional Mayor de San Marcos. Lima, Per.

LOCK O. 1997. Colorantes Naturales. Primera Edicin. Pontificia Universidad Catlica del Per. Lima, Per. pp. 137-163.p

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