C^iosziot . 597 - OSTI.GOV

C^iosziot . 597Sp ISSN 0081-3397

ACTIVIDAD ENZIMATICA DEL COMPLEJO CELULOLITICO

PRODUCIDO POP Trichoderma reesei. HIDROLISIS

ENCIMATICA DE LA CELULOSA

por:

ALFONSEL JAEN, M.

NEGRO ALVAREZ , M.J

SAEZ ANGULO, R.

MARTIN MORENO, C.

CENTRO DE INVESTIGACIONES ENERGETICAS, MEDIOAMBIENTALES Y TECNOLOGICAS

MADRID, 1986

CLASIFICACION INIS Y DESCRIPTORSB14.00ENZYME ACTIVITYENZYMESHYDROLISISLIGNINSUBSTRATESpH VALUETEMPERATURE DEPENDENCE CELLULOSE

Toda correspondencia en relacidn con ests trabajo debe dirigirse al Servicio de Documentacidn Biblioteca y Publicaciones, Centro de Investigaciones Energeticas, Medioambientales y Tecnoldgicas, Ciudad Universitaria,28040-Madrid, ESPA&A.

Las solicitudes de ejemplares deben dirigirse a este mismo Servicio.

Los descriptores se ban seleccionado del Tbesauro del INIS para-describir las materias qua con tie ne este informe con vistas a su recuperacion. Para mas detalles con suite se el informe IAEA-INIS-12 (INIS: Manual de India a- cion) y IAEA-INIS-13 (INIS: Tbesauro) public ado por el Or- ganismo Internacional de Energxa Atomica.

Se autoriza la reproduccion de los resumenes ana- liticos que aparecen en esta publicacion.

Este trabajo se ha recibido para su impresion en Junio de 1986.

DepSsito legal na M~31300-1986 NIPO 230-86-017-6 I.S.B.N. 84-505-4242

INDICE

' Pagina1. INTRODUCCION

1.1. Naturaleza y v£ as de transformacion de 1 os mat.e-riales celulSsicos ................................. 1

1.2. Produccion de las enzimas celuloliticas ......... 3

1.3. Pretratamiento de los materiales celulosicos ... 5

1.4. Hidrolisis enzimatica de la celulosa ............ 5

1.5. Interes y objetivos del trabajo .................. 6

2. MATERIALES Y METODOS

2.1. Precipitacion y concentracion del complejo enzi-matico ......................................... 8

2.2. Medida de la actividad enzimatica ............... 8

2.2.1. Determinacion de la actividad sobre papelde filtro ........................... 9

2.2.2. Determinacion de la actividad sobre CMC .. 12

2.2.3. Determinacion de la actividad de [3-glu-cos idasa ...................................... 15

2.3. Determinacion de azucares reductores ............ 17

2.3.1. Metodo del DNS ............................... 17

2.3.2. Metodo de Nelson-Somogyi ................... 18

2.4. Determinacion de proteinas solubles ................ 19

2.5. Experiencias de hidrolisis ....................... 20

3. RESULTADOS Y DISCUS ION ................................. 22

4. BIBLIOGRAFIA .............................................. 38

A N E X 0 I - Indice de figures ............................... 42

-1 “

1 . INTRODUCCION

1.1. Naturaleza y vias de transformacion de 1 os materialesceluldsicos .

La celulosa es un polimero de unidades de D-glucosa p ro- ducido como consecuencia del proceso de fotosintesis y que se deposita,en las paredes celulares de todas las plantas superio res, en forma de fibras cristalinas que determiner la direccion del crecimiento celular y confieren la rigidez necesaria para el desarrollo de las plantas terrestres. Algunas algas , bongos, bacterias e incluso invertebrados marines (tunicados) tambien producer celulosa, sin embargo , la fuente mas importante de este polimero la cons tituyen las plantas super lores en las que e£te material es sintetizado continuamente mediante fotosintesis

- 11 con una produceidn anual de unas 2x10 Tm.

Aunque la celulosa ha sido ampliamente utilizada por el bomb re en diferentes actividades tales como construccion, industries papeleras y textiles y tambien como combustible, en la actualidad y como prevision del agotamiento del petroled y materiales fosiles, se esta dirigiendo una gran atencion a la posibilidad de utilizarla como fuente renovable para la produce ion de energia y de compuestos quimicos.

Existen diversas formas en las que los materiales celulosicos pueden ser transformados para su posterior utilizacion. Mediante los procesos quimicos o bioquimicos, la celulosa es hidrolizada de manera bastante selective en sus monosacaridos constitutivos que pueden ser sometidos posteriormente a sucesivas modificacones. En los procesos termoquimicos de conversion, la materia organica es degradada de forma no selective para transformarse, fundamenta1mente, en una mezcla de gases y liquidos. A continuacion se recoge el esquema de las alterra tivas basicas de conversion de los materiales celuldsicos . '

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MATERIAL

1PROCEEDS QUIMICOS

Y BIOQUIMICOS

CELULOSICO

lPROCESOS TERMOQUIMICOS

Digestion Hidrolisis Gasificacion Pirolisis Licuefaccion anaerobia acida o directa

enzimatica

r~Fermentacion-E tano1 -Lactico -Otros '

Deshidratacion-Furfural-Hidroximetil—furfural

Hidrogenacion-Xilitol-Manito 1 -Otros

Oxidacion-Acido s mono y dicarboxi 1 i cos

Los proce.sos de transformacion quimica o bioquimica supo- nen la hidrolisis de los materiales celulosicos utilizando ac i dos o enzimas respectivamente . En el caso de la hidrolisis qu£ mica se emplean acidos como el sulfurico, clorhldrico o fluor- hidrico y los principales inconvenientes que presents es tan re- lacionados con la heterogeneidad del hidrolizado debido a la presencia de hemicelulosa y lignina en el material celuldsico de parti da. For otra parte, este tipo de procesos requiere altos costes de inversion por la corrosividad de los acidos empleados en las condiciones de presion y tempe ratura en las que debe llevarse a cabo la hidrolisis.

En el caso- de la hidrolisis enzimatica, el principal in- convenient^ es la baja tasa de conversion motivada por la presencia de lignina que actua como una barrera en la penetracion de las enzimas en las fibras celulosicas, as £ como por la pro- pi a e s true tur a cristalina de la celulosa que dificulta extraor dinariamente la accion de dichas enzimas. Presents, sin embar

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go, esta via de transformacion , las ventajas derivadas de su especifidad y de la posibilidad de efectuar el proceso en con diciones suaves que no requieren el empleo de materiales espe dales .

En el proceso de transformacion por via enzimatica, algunos de cuyos aspectos se estudian en el presente trabajo, se pueden diferenciar tres etapas fundamentales, que son: la produce i6n de enzimas a partir de microorganismos celuloliticos, el pretratamiento del material celulosico para favorecer el rendimiento de la hidrolisis posterior y la fase de hidrolisis propiamente dicha. A continuacion se exp 1ican brevemente cada una de estas etapas.

1.2. Produccion de las enzimas celuloliticas.

Las enzimas capaces de degradar la celulosa, genericamen- te denominadas celulasas, son producidas por un gran numero de bongos y bacterias. Entre los bongos celuloliticos, 1 os mejo-res productores son: Trichoderma, Penici11ium y Aspergillus y entre las bacterias: Cellulomonas y Clostridium. Gran parte de estos microorganismos producen enzimas extracelulares por 1o que pueden ser separadas facilmente del medio de cultivo para su posterior utilizacion.

La produccion de enzimas celuloliticas ha sido estudiada fundamentalmente en bongos y muy espec ialmente en Trichoderma reesei del que existen ac tualmente numerosos mutantes hiperpro ductores . Estos microrganismos producen, para hidrolizar la celulosa, una complicada mezcla de enzimas que const! tuyen e'l denominado comp 1e j o celulolitico y que actual sinergicamente . sob re las fibras cristalinas de la celulosa has ta degradarlas en sus componentes basicos, es decir glucosas. Es te complejo esta constituido a 1 menos por tres grupos enzimaticos de dife rente ac cion:

■ 1. Endoglucanasas (1,4 Q-D-glucan-glucanohidrolasas: E.C,3.2,1.4.) qua hidrolizan al azar enlaces 1,4, Q glucosidicos, generando extremes no reductores L

2. Exoglucanasas (1,4 |3-D-glucan-glucohidrolasas: E.C. 3. 2.1.91. y 1,4 (3-D- glucan-celobiohidrolasa: E.C. 3.2.1.74=) que actuan sob re los extremes no reductores generados por la accion de las endoglucanasas liberando unidades de glucosa y celobiosa respectivamente.

3. (3- glucosidasa o celobiasa (1,4 (3-D- glucosido-glucohi drolasa: E.C. 3.2.1.21.) que actua sob re celobiosa y oligosaca ridos transforman doles en glucosa.

Se podr£ a decir que existen tres objetivos fundamentales para la consecucion de un proceso de produccidn de enzimas optimo. En primer lugar, disponer de cepas mutantes hiperpro- duc toras estables; en segundo , establecer.las condiciones de cultivo adecuadas para la obtencion de un complejo enzimatico equilibrado en la proporcion de sus distintos componentes, ca paz de llevar a cabo una hidrolisis complete de los sustratos celulosicos y por ultimo abaratar los cos tes de los medios de cultivo, utilizando por ejemplo residues de actividades industrial e s , tales como cerveceras o industries lacteas, 1o cualpermitiria, por otro 1 ado, resolver los problemas re1acionados con la eliminacion de dichos residues. Es to requiere profundi- zar en el conocimiento de ciertos aspectos tales como selec- cion de nuevas cepas, bioquimica de la produccidn y secrecion de enzimas y estudio de los mecanismos de accion de las mia- mas,que permitiria establecer procesos de produccidn bien de- fin i dos reduciendo los costes de esta etapa que es, en la ae-t tualidad, la que encarece en mayor medida el proceso de trans formacidn de sustratos celulosicos por via enzimatica.

1.3. Pretratamiento de los materiales celulosicos .

Otro de los aspectos fundamentales a tener en cuenta para que un proceso de hidrolis is enzimatica de la celulosa sea viable , lo constituye la necesidad de encontrar el pretratamiento mas efectivo para cada tipo de sustrato. La presencia de lignina y existencia de zonas cristalinas en las fibras celulosicas hacen imprescindible pretratar por metodos fisicos o quimicos los sustratos lignocelulosicos antes de efectuar su hidrolisis, con objeto de alterar su estructura y facilitar el posterior a- taque por las enzimas .En lineas generales,puede decirse que los pretratamientos quxmicos ,aunque efectivos , suelen ser de ele- vado coste y por lo tanto requieren el estudio de la posibilidad de reciclar los agentes quxmicos empleados con objeto de abaratar el proceso. *

Entre los metodos fisicos , la molienda , el uso de extru- sores y sobre todo el tratamiento de explosion de vapor son los que presentan me j ores perspectives .En cualquier caso parece claro que el pretratamiento empleado debe ser tal,que permita. no solo alterar la estructura de la fibre para favorecer el rendimiento de la hidrolisis sino tambien obtener el resto de los componentes del material celulosico ( lignina y hemice- 1 u1 os as fundamentalmente ) de forma que puedan ser utilizados en otros procesos par a 1elos, par a as f lograr un aprove chamien- to integral de todas las fracciones que pueden incidir decisi- vamente en el balance economico global de la transformacion.

1.4. Hidrolisis enzimatica de la celulosa.

El sustrato celulosico una vez s ome tido a 1 pretratamiento seleccionado de acuerdo con sus caracterxsticas especlficas es hidrolizado mediants la accion de las enzimas celulolxticas has ta glucosa . Las condiciones del proceso, temperature , tiempo de

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hidrolisis , concentracion de enzimas y relacion solido-liquido dependen del sustrato e1 egido y de la actividad hidrolxti- ca del complejo utilizado y deben por tante ser determinadas experimentalmente . Puesto que dos de los factores que influ_ yen en gran medida en el coste de la hidrolisis de la celulo_ sa con enzimas son la ba j a actividad especifica de las enzimas y la inhibicion que experimentan por la acumulacion de los productos finales generados como consecuencia de su accion , fundamentalmente celobiosa y glucosa , el diseno de un proceso de hidrolisis enzimatica debe contemplar la posibilidad , por un lado , de reciclar las enzimas qug podrian utilizarse de nuevo para sucesivas hidrolisis y por otro de separar el hidrolizado a medida que se produce para evitar la acumulacion de cantidades elevadas de productos finales . Otra posibilidad de eliminar este problema,seria el diseno de procesos de sacarificacion y fermentacion simultaneos que permitan redu- cir o eliminar la inhibicion originada por los productos de hidrolisis al ser transformados por fermentacion a medida que se producen .

1.5. Intere's y objetivos del trabajo.

Los procesos de transformacion de biomasa y entre ellos el de hidrolisis enzimatica de los materiales lignocelulosicos tienen en la actualidad un extraordinario interes porque supo- nen la posibilidad de generar productos quimicos o biologicos de indudable valor a partir de materias primas renovables .Sin embargo y como se puede deducir de las consideraciones realizadas en anteriores apartados la transformacion de celulosa via enzimatica,presenta todavia dificultades que hacen necesario el estudio basico de ciertos aspectos cuyo conocimiento profundo es absolutamente necesario para el des arrollo

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y optimizacion de la tecnologia del proceso.

El objeto del presente trabajo es, por un lado, el de sist.ematizar la metodologia de caracterizacion de la actividad enzimatica de un complej o celulo1£tico, as £ como presentar los resultados obtenidos de apHear esta metodolog£a a1 complejo producido,en los laboratories de la Division de Biomasa, a par tir de cultivos de Trichoderma reesei QM9414. Se incluye , por otro lado, la evaluacion de las condiciones optimas para la ac tuacion de las enzimas de dicho complejo, as £ como los results dos prelimiriares sobre su capacidad para hidrolizar la biomasa lignocelulosica de Onopordum nervosum.

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2.MATERIALES Y METODOS.

2.1. PrecipitaciSn y concentracion del complejo enzimatico.

El complejo enzimatico fue concentrado, a partir del 1f- quido obtenido por filtraciSn del medio de cultivo de Tricho- derma reesei QM9414,uti1izando un equipo de ultrafiltracion tangencial (PELLICON,Mi11ipore) que permite concentrar hasta 9 veces molecu las de peso molecular superior a 10.000/ entre las que se encuentran los componentes del complejo celulolitico. El concentrado obtenido fue tratado con acetona en frio y el precipitado de proteinas resultante se liofilizo y almacenS en nevera hasta su utilizacion.

La determinecion de las artividades del complejo enzimatico as 1 como los estudios de hidrolisis se llevaron a cabo disolviendo el liofilizado en tampon citrato 0,05 M. El pH 6p- timo del tampon fue determinado experimentalmente, ta1 y como se recoge en el apart ado de resultados.

2.2. MedIda de la actividad enzimatica. .

Puesto que el complejo enzimatico esta constituido por diversas enzimas (ver apartado 1.2.) es necesario emplear dife_ rentes ensayos para determiner la actividad de cada una de - e 1 las . Las tres pruebas mi's utilizadas para deducir la capacidad de un complejo celulolitico de hidrolizar celulosa son: la actividad sobre papel de filtro, la actividad sobre carboxd^ metil-celulosa (CMC) y la actividad de J3-glucosidasa. A continuacion, se recoge la metodologia detallada para la realiza- cion de cada una de estas pruebas, de acuerdo con las normas elaboradas por la I.U.P.A.C. en 1984 con objeto de unificar

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los distintos metodos que habxan sido u ti1iz ados has t a esa fe_ cha y que dificultaban por tanto'la comparacion de resultados entre distintos grupos de trabajo.

2.2.1. Determinacion de la actividad sobre papel de f i 11 r o .

a) Reactivos:

- Tira de papel de filtro Whatman n° 1 (1x6 cm) .- Tampon citrato 0,05 M, pH 4,8.- DWS .- Solucion de glucosa en tampon citrato (10 mg/ml)..

b) Procedimiento:

b.l.) Deben hacerse a 1 me nos dos diluciones en tampon citrato de la solucion de enzima cuya actividad se quiere medir. Una de ell as debe liberar en el medio de reaccion algo menos de dos mg y la otra algo mas de dos mg de azucares redactor es expresados como glucosa . Aunque las diluciones que liberan esta cantidad de reductores deben ser estudiadas para cada caso particular, se puede deducir de nuestras experiences con distintas soluciones de celulasas, que estas corresponden,generalmente, a concentraciones de proteinas solubles (calculadas segun el metodo de Lowry) comprendidas entre -- Img/ml y 0,1 mg/ml.

b. 2 . ) Los patrones de glucosa se preparan a partir de una solucion de glucosa,en tampon citrato 0,0 5M , pH 4,8, de lOmg/ml de concentracion. Las diluciones, realizadas con el mismo tampon citrato, deben tener una concentracion final de3,3, 2,5, 1,65 y 1,0 mg en 0,5 ml respectivamente.

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, b. 3 . ) La reaccion enzimatica se lleva a cabo en tubosde ensayo de unos 25 ml de capacidad. En la siguiente tabla, se deta 11 an los volumenes de reactivos que deben incorporarse en las distintas muestras .

MUESTRA PATRONES BLANCO PROBLEMA GLUCOSA ENZIMA

Tampon citrato

Solucion enzima (2 diluciones)

Glucosa

Tira de papel filtro

* de la dilucion de glucosa correspondrente. ■

b.4 . ) Las muestras problema se atemperan a 50 °C antes de anadir la tira de papel de filtro. Es importante que el pa_ pel quede s ume rgido,e n su mayor parte, en la mezcla de reac-- cion. La incubacion de las muestras se realiza durante 60 minutos a 50 °C en un bano con agitacion.

b.5.) Una vez transcurrido el tiempo de incubacion, se anaden 3 ml del reactivo DNS a todos los tubos, incluyendo muestras problema, patrones de glucosa, bianco de enzima y ce ro. Despues de agitar se introducen durante cinco minutos en un bano con agua hirviendo y se transfieren posteriormente a un bano de agua fria. Se anaden 20 ml de agua destilada a cada tubo y se agitan invirtiendolos varias veces has ta que la mezcla sea uni forme . Luego se de j an reposar unos 20 minutos para que la pulpa de papel se deposits en el fondo de los tubos y se lee la densidad optica del sobrenadante a 540 nm. •

1 ml

0,5ml

1 ml 1 ml 1,5 ml

0,5 ml

0,5 ml*

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frente a la muetra cero.

c) Calculo de la actividad :

c.1.) Definicion de la unidad de papel de filtro(UPF) : -

La UPF esta basada en la Unidad Internacional (Ul) , que corresponde a una conversion de sustrato de 1 pmo1 en un minuto . En el caso de actividad enzimatica sobre papel de filtro , la UPF se define como la formacion de 1 pmo1/min de azu'cares reduct or es medidos como poder redactor de glucose, en las condiclones de ensayo descritas previamente.

Debido a la ausencia de linealidad entre la dilucion de enzima y los azu’cares redactor es 1 iber ados durante el ensayo , la actividad enzimatica sobre papel de filtro debe medirse a diluciones de la solucion de enzima tales que liberen en el medio de reaccion una cantidad absolute de 2 mg de azu'cares reductores,expresados como glucosa,que es el punto en donde la relacion entre ambas variables se hace razonablemente lineal. Haciendo las transformaciones correspond!entes se comprueba que 2 mg de glucosa en las condiciones de ensayo descritas corresponden a 0,37 pmoles de glucosa 1iberados por minuto y por ml de la dilucion enzimatica ensayada o lo que es lo mismo 0,37 UI por ml de dilucion.

c.2.)Calculo de las UPF de la solucion enzimatica:1. Ajustar los valores de absorbancia obtenidos para

los distintos patrones de glucosa a una recta.2. Calcular sobre la ecuacion de es a recta los valo-

res de glucosa que corresponder£an a las absorbancia s obtenidas para las muestras poblema ( despues

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de deducir el valor del bianco de enzima correspondien te) . '

3. Representar en papel semilogaritmico los valores de glucosa obtenidos frente a las concentraciones ( inverses de las diluciones ) de solucion de enzima corres pondiente, y estimar el valor de la concentracion que liberaria exactamente 2 mg. de azucares reductores:

- 0 3 7UFP/ml.de la solucion de enzima original = 'C

C= Concentracion de enzima que liberaria 2,0 mg. de glucosa. .

Cuando se trata de soluciones de ba j a actividad enzimatica, puede ser que JLncluso la muestra no diluida libere en el ensayo menos de los 2 mg. de azucares reductores. En este caso,el 'calculo de actividad se realize a partir de la cantidad de glucosa liberada empleando la siguiente expresion :

UFP/ml. de solucion de enzima = mg. de glucosa liberados x 0,185*

* 1 mg. de glucosa liberada equivale a o , 18 5 UI/ml:

1,01 mg de glucosa = ------------------- pmol/min. ml . = 0,185 UI/ml.

0,18 x 0,5 x 60

2.2.2. Determinacion de la actividad sobre CMC.

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a) Reactivos :

- Carboximeti1 celulosa (1%) . La carboximetil ce^lulosa ( vis cosidad media, D.S = = o, 5 ) se disuelve en agua caliente y luego se anade tampon citrato 0,5 M pH=4,8 en una proporcion tal que la concentracion final de citrato sea 0,05 Mo

- Tampon citrato 0,05 M pH 4,8.- DNS .- Solucion de glucosa en tampon citrato ( 10 mg/ml ).

b) Procedimiento : .

b.l.) Deben hacerse al menos dos diluciones en tampon citrato de la solucion de enzima cuya actividad se quiere medir.Una de ellas debe de liberar en el medio de reaccion algo menos de 0,5 mg y la otra algo mas de 0,5 mg de azucares reductores expres ados como glucosa.

b.2.) Los patrones de glucosa se preparan a partir de una solucion de gl-ucosa en tampon citrato 0,5 M pH 4,8 a una concentracion de 5 mg/ml . Las diluciones realizadas con el mismo tampon citrato deben tener una concentracion final de 1,0 , 0,7 , 0,5 y 0,25 mg en 0,5 ml respectivamente.

b.3.) La reaccion enzimatica se lleva a cabo en tubes de ensayo de unos 25 ml de capacidad. En la siguiente tabla , se deta1lan los volumenes de reactivos que deben incorporars e en las distintas mues tras .

MUESTRA PATRONES BLANCOPROBLEMA GLUCOSA ENZIMA CER0

CMC 1% 0,5 ml ------ ------ ---

Solucion enzima 0,5 ml ------ 0,5 ml ---( 2 diluciones)Glucosa ------ 0,5 ml* ----- ---

Tampon citrato 0,5 ml 0,5 ml 1 ml

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* de la diluciSn de glucosa correspondiente. .

b.4) Las mues tras poblema se incuban a 50 0C durante 30 minutes en un bano de agitacion.Transcurrido este tiern- po se anaden 3 ml de DNS a todos los tubos incluyendo muestras problema , patrones de glucosa , bianco de enzima y cero. Se agitan y se introducen en un bano de agua hirviendo durante 5 minutos , transcurridos los cuales se trans fieren a un bano de agua fria.Se anaden 20 ml de agua destilada a cada uno de ellos , se agitan y se lee la densidad optica de las mues tr as a 540 nm frente a la muestra cero.

' c) Calculo de 1 a actividad :

Teniendo en cuenta que la relacion entre concentracion de enzima y azucares liberados se hace aproximadamente lineal cuando, la cantidad de azucares redactores liberados como glucosa oscila alrededor de 0,5 mg (en las condiciones de ensayo descritas previamente), la actividad sobre CMC debe medirse utilizando diluciones de enzima que produzcan algo mas y algo menos de este valor para as £ deducir la cpn- centracion de enzima que liberaria exactamente 0,5 mg de glucosa.

De acuerdo con el valor de Unidad Internacional de fi- nido en el apart ado correspondiente a la actividad sobre p ape1 de filtro se deduce que 0,5 mg de glucosa corresponded a 0,185 pmoles de glucosa por minuto y por ml de la dilucion enzimatica ensayada , es decir, 0,185 Ul/ml. V

El calculo de la actividad en la solucion de enzima problema se realizan segun se detalla a continuacion:

1. A j us tar los valores de absorbancia obtenidos para los distintos patrones de glucosa a una recta.

2. Calendar sobre la ecuacion de la recta Ids valor es

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de glucosa que correspondent a las absorbancias obtenidas para las muestr'as problema ( despues de deducir el valor del bianco de enzima ).

3. Representar en papel s emilogaritmico los valores deglucosa obtenidos frente a las concentraciones ( inverses de las diluciones empleadas ) de- solucion de enzima correspondientes y estimar el valor de la concentracion que liberaria exactamente 0,5 mg de azucares reduc tores .

UI / m,l de la solucion de enzima =—2_i_iA§—

C = Concentracion de enzima que liberaria 0,5 mg de glucosa.

La determinacion de la actividad enzimatica sobrepapel de filtro y sobre CMC es tan b as ados en los metodos descritos por Mandels y col . ( 19 7 6 ).

2.2.3 o Determinacion de la actividad de Q- glucosidasa ( Bailey et al. 19 81 ) .

a) Reactivos :- 4- nitrof enil-f3~D-glucopiranos ido ( Merck Rf a 6753 )

1 mM en tampon citrato 0,05 M pH 4,8 .- Solucion de 4-nitrofenol ( 10 pg/ml ) en tampon ci

trato 0,05 M pH 4,8 .- Carbonate sodico 1M.

b) Procedimiento :

b.lo) Los patrones de 4-nitrofenol s e preparan a par-tir de la solucion de 4-nitrofenol en tamponcon las siguientes concentraciones : 10 , 7,5 , 5 , 2,5 y 1,25

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pg/ml.

b.2.) La reaccion enzimatica qua consists an la liberation da 4-nitrofenol a partir da 4-nitrofenil-(3™D- glucopira'nosido se lleva "a cabo an bano da agitation a 50 °C durante 10 minutes o Las mues tras se preparan como se details an la siguiente tabla.

4-nitro f enil-(3-D- glucopiranosido 1 mM

MUESTRAPROBLEMA PATRONES CERO

1,8 ml 1,8 ml

Solution enzima 0,2 ml

4-nitrofenol 2 ml *

Tampon citrato 0,5 M pH 4,8 0,2 ml

* de la dilution da 4-nitrofenol correspondiente.

b o 3.) Transcurridos 1os 10 minutos , la reaction se de tien a anadiendo a cada mues tra 1 ml de CO N a 1 M„3 2La lettura se realize frente a la mues tra cero a 40 0 nm.

c) Calculo de la actividad :

La actividad enzimatica de f3~glucosidas a se suele expresar en nKat . El nKat se define como la cantidad de enzima que libera 1 nmol/sg de 4-nitrofenol de la mezcla reaccionante en las condiciones describes ( 1 nKat=0,06 UI ).

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2.3. Determinacion de azucares reductores .

La determinacion de azucares reductores se ha lle- vado a cabo por dos metodos : Somogyi-Nelson y DNS .

2.3.1. Metodo del DNS ( Miller,1959 )

a) Reactivo DNS.

- Hidroxido sodico 1 %- Sulfito sodico 0,05%- Sales de Rochelle(Tartrato Na-K) 20 %- Fenol des til ado 0,2 %

El reactivo, que es b as t ant e inestable , debe tener un color amarillo anaranj ado.

b) Procediraiento :

Anadir 3 ml del reactivo DNS a cada tubo de ensayo con 1ml de la muestra problema.Colocar las mue s t ras e n un baho de agua en ebullicion durante 5 minutos y dejar enfriar posteriormente en un baho de agua fria . Anadir 20 ml de agua destilada a cada tubo y leer a 540 nm frente a un bianco preparado en las mismas condiciones en el que la muestra problema es sustituida por agua destilada. Debido a la inestabili- dad del reactivo es necesario hacer una curva de calibrado para cada ensayo .

. En las condiciones descritas , es te metodo permite determiner valores de reductores,expresados como glucosa.

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comprendidos entre 0,2 y 4 mg/m1.

2.3.2. Metodo de Nelson Somogyi (Nelson, 1944).

a) Reactivos:* Solucion I:Tartrato sodico-potasico 12 9Carbonato disodico anhidro 24 9Carbonate monos odico 16 9Sulfato sodico 144 9Agua destilada 800 mlSolucion II:Sulfato de Cobre ( SO Cu.SH^O) 4 9Sulfato disodico 36 9Agua destilada 200 m 1

El reactivo cuprico se prepara en el memento de su utilizacion mezclando 4 volumenes de la solucion I y un volumen de la solucion II.

* Solucion A :

- SO ^ H ^ concentrado- Agua destilada

* Solucion B :- Na^HAsO .7H 0

Agua destilada

25 g21 ml

200 ml

3 g25 ml

El reactivo arsenomollbdico se prepara mezclandolas soluciones A y B en frasco topacio que se de j a a 3 7 ° C durante 24 boras . Debe quedar de color amarillo.

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b) Procedimiento:

En un tubo Folin se anade 1 ml de reactivo cuprico a 1 ml de muestra . La mezcla se somete a ebullicion en un bano durante 30 minutos.Transcurrido este tiempo , los tubes se de j an enfriar transfiriendolos a un bano de hielo y posteriormente se anade 1 ml de reactivo arsenomolibdico agitando vigorosamente la mezcla.Los tubos se enrasan a 25 ml con agua destilada y se leen a 640 nm frente a un bianco pre- par ado en las mismas condiciones y en el que la muestra es sustituida por agua destilada .Como patron se utilize una solucion de glucosa de 100 ppm.

En las condiciones describes el metodo permits determinar valores de azucares reductores , medidos como glucosa,comprendidos entre 10 y 200 pg/ml. •

2.4. Determinacion de proteinas solubles:

El metodo utilizado para la derminacion de proteinas fue el de Lowry et al (1951) .

a) Reactivos:

A. Solucion de CO^Na^ al 2 % en N aOH 0,1 N .B. Solucion de SO^Cu al 0,5 % en tartrato potasico al 1 %C. Este reactivo se prepara mezclando 50 ml de la solu

cion A y 1 ml de la solucion B.D. Reactivo de Folin diluido 1 a 1 con agua destilada,

b) Procedimiento:

- 20 -

Se afiaden 5 ml del reactive C a 1 ml de muestra se agita la muestra y se de j a reposar durante 10 minutes .Luego se adiciona 0,5 ml del reactive D se agita nuevamente y se espera unos 30 minutes para conseguir desarrollo del color. Paralelamente a la muestra se utilize una curva patron de sero- albumina con concentraciones de 50 , 75 y 100 pg/ml.La lecture se efectua a 7 5 7 nm frente a un bianco preparado en las mismas condiciones y en el que la .muestra es sustituida por 1 ml de agua destilada.

2.5. Experiencias de hidrol is is :

Para llevar a cabo las experiencias de hidrolisis, se anadia al sustrato ( en el” caso de sustratos lignocelulosicos , estos fueron previamente molidos has ta un tamano de par- ticula de 2mm ) la solucion de enzima en tampon citrato 0,05M pH 4,8 ( excepto en los c as os en que se e ns ay ab a distintos va-

flores de pH ). La concentracion de enzima en e1 tampon y la relacion entre el peso de sustrato y el volumen de tampon se especifican para cada caso en el apartado. de res u1tados . La hidrolis is se efectuo en tubos de ensayo en un b a ho termosta- tizado con sistema de agitacion .Finalizado el perfodo de hidrolisis las muestras fueron filtradas para separar el residue insoluble del hidrolizado.Sobre este ultimo se realizaran los analisis correspondientes al contenido de azucares reductores evaluado por el metodo de Somogiy-Nelson , proteinas solubles por el metodo de Lowry y g1u cos a por el metodo en-imatico c o- mercial de Gluco-quant (Boehringer-Mannheim).

Los sustratos utilizados en las experiencias fueron de dos tipos : celulosicos puros (Solka-Floc HW-200) y lignocelulosicos (biomasa de Onopordum nervosum) . en

este ultimo caso el sustrato fue sometid'o a dos tipos de pretratamiento quxmico diferentes con objeto de comprobar la incidencia de 1 os mismos en el rendimiento de la hidrcTlisis A continuacion se detallan 1os procedimientos para ambos pretratamientos .

Pretratamiento 1 . A un gramo del sustrato ligno-celulosico se le anadieron 50 ml de una solucion de H ^0 ^ al 1 % . El pH de la suspension resultants se ajusto a 11,5 conNaOH 3N y se de j o agitando durante 24 boras a temperatura ambiente . El residue resultants de filtrar esta suspension se lavo repetidas veces con agua hasta neutralidad y se de j o secar en estufa a 60 °C. -

Pretratamiento 2 . Se llevo a cabo de igual mane-ra que el pretratamiento 1 pero en ausencia de la solucion de

3.RESULTADOS Y DISCUSION

. Las condiciones optimas para la actividad delcomplej o enzimatico de Trichoderma reesei QM 9 4 14 s e estu- diaron utilizando como sustrato para la hidrolisis Solka Floe HW-200 por ser este un sustrato celulosico puro .Pues to que el valor de pH del medio y la temper a tu r a influyen deci- divamente en el comportamiento de las enzimas , fueron estas las primeras condiciones .que se ensayaron dentro de un rango elegido de acuerdo con los res u11 ados pub 1ic ado s anterior -- nente . _,Para el pH se probaron valores comprendidos entre 3,8 y 6,3 y para la temperatura entre 3 0 ° y 5 5 ° C . La hidrolisis se llevo a cabo durante un periodo de tiempo de 4 boras para evitar problemas de inhibicion que podrlan originarse como consecuencia de la acumulacion de los productos de hidrolisis durante periodos largos.Para realizar estas experiencias se utilize una actividad enzimatica por gramo de sustrato de 18 UPF y 40 nKat de f3~g lucos i das a y una re lac ion solido liquido en el medio de reaccion (tampon citrato 0,0 5 M) del 5 % (p/v) .La tasa de hidrolisis se evaluo a partir de los azucares re- ductor es y la glucos a solubi lizados en el hidrolizado resultants .

Las figuras 1 y 2 mues tran los resultados obtenidos para los diferentes pH y temperaturas ensayadas .Se observe en ambos casos que los pH superiores a 5 producen una clara disminucion en la liberacion de azucares reductores y de glucos a . Puesto que la produccion de azucares reductores informa de la actividad del conj unto de enzimas del complejo, mientras que la glucosa lo hace mas especificamente de la actividad de la (3~glucosidasa , parece ser que esta ultima en* zima es la mas sensible a los valores altos de pH ya que la

-23-

relacion entre la glucosa y los azucares reductores totales producidos (figura 3) disminuye considerablemente a medida que aumenta el pH del medio .De estos resultados se puede concluir que el valor de pH para el optimo funcionamiento del complej o enzimatico esta comprendido entre 4,3 y 4,8.

Con respecto la temperatura se observa una mayor produccion de reductores y glucosa cuando se eleva la temperatura alcanzandose los valores maximos entre 50 y 5 5 °C.

En los procesos de hidrolisis enzimatica de celulos a debido al alto coste de las enzimas empleadas seria acon- sejable su recuperacion a partir del hidrolizado para utili- zarlas en sucesivas hidrolisis . For es te motive , es importante la evaluacion de las proteinas que se solubilizan en el hidrolizado a medida que progresa la hidrolisis de las cadenas celulosicas. En este caso se evaluo la cantidad de proteinas solubles presentes en el medio despues de 4 horas de hidrolisis , encontrandos e , como se recoge en la figura 4 en la que se representan estos valores expres ados como porcentaje del contenidoinicial de proteinas en el medio , la maxima recuperacion a 5 0 ° C y pH 4,8 . Estos resultados coincidenplenamente con los valores optimos de hidrolisis encontrados en es as condiciones y a partir de ellos se decidio efectuar en los ens ayos sucesivos la hidrolisis del material celulosico en tampon citrato 0,0 5M pH 4,8a 50 ° C .

Puesto que un proceso de hidrolisis debe llevarse a cabo durante un periodo largo de tiempo , es necesario estudiar la estabilidad de la actividad enzimatica de la preparacion , a la temperatura seleccionada como optima. '•En la figura 5 , en la que se representan los valores de la

AZUC

ARES

RED

UCTO

RES

(mg/

ml)

-24-

12 -

Fig. 1 i Efecto del pH en la produccion'de azuca res reducto-

res por hidrdlisis enzimatica del So Ik a floe IIW-20 0

a distintas temperaturas : (0) 3 0 ° C , ( x) 3 5 ° C ,

(•) 40 °C , (□) 45°C , (&) 50°C y (■) 5 5 °C .Tiempo

de hidrdlisis: 4 boras . Relacion solido-l£quido(p/v) :5 %.

k

GLUC

OSA

(mg/

ml)

-25-

8

6 .

4

2

3

Fig. 2

----------r--------------------"i--------------------- 1-------- -—' 4 5 6

PH

: Efecto del pH en la produccion de glucose por

hi dr6 lis is enzimatica de Solka floe 11W-200 a

distintas temperatures; (0) 3 0 ° C , • (X) 3 5 ° C , ( e)

40 °C , (O) 4 5 ° C , (A) 5 0 0 C y (■) 5 5 °C . Tiempo de

hidrdlisis : 4 boras .Relacion solido-liquido

(p/v);5% . .

>

GLUC

OSA/

AZUC

ARES

RED

UCTO

RES

— 26-

0,7-

0,6 -

0,5

0,4.

0,3 =

0,2.

0,1-

3 5T6

pll .

Fig. 3 : Influencia del pH en la relacion entrc glucosa y

azticares reductores producidos en la hidrolisis

de Solka floe HW-200 a distintas temperatures :

(0) 3 0 ° C , ( X) 3 5 0 C , (•) 4 0 ° C , (□) 45°C, (A) 50°C y/(■) 55°C. Relacion s61ido-1iquido (p/v) : 5%.

PROT

EINA

SOL

UBLE

(%).

-27-

50 '

30 -

10 •

Fig 4 ; Efecto del pH en la recuperacion de enzima ( ex-

pr^esada como porcentaje del valor inicial de pro -

teina en el medio de hidrolisis) en el hidrolizado

de Solka floc: (0) 30°C , (x)35 °C, ( •)4 0 ° C , (□)45°C,

(&) 50 °C y (■) 5 5 ° C . Tiempo de hidr6lis is: 4 boras.

Relacion solido-llquido (p/v): 5%.

-28-

de la actividad sobre papal de filtro y de la (3 -glucosidasa durante 96 boras de incubaci-on a 5 0 0 C , se observe que esta ultima se mantiene mas o menos constants durante este perxodo y que la actividad sobre papal de filtro disminuye a partir de las 48 boras en un 25 % aproximadamente del valor inicial .

— 80-

Q 60-

T1EMPO (NORAS)

Fig 5 j Variacion de la actividad enzimatica de:(o) 13-G lucos idas a y (•) papal de filtro , en funcion del tiempo de incubacion , a 5 0 0 C , del comp 1e j o enzimatico producido por Trichodorma reesei Q M 9 414 .

-29-

Una vez fijadas estas condiciones previas se estudio ■ la influencia , en el rendimiento de la hidrolisis , de la concentracion de sustrato en el medio de reaccion as £ como de la cantidad de enzima empleada por unidad de peso de sustrato . Para estos ensayos se utilizaron ademas de Solka Floe otros sustratos de naturaleza lignocelulosicas con objeto de comprobar al mismo tiempo la capacidad del complejo enzimatico obtenido para hidrolizar celulos as no puras . El sustrato elegido fue Onopordum nervosum goiss , un cardo silvestre que por su contenido en celulosa (30% de la materia seca) y sus caracteristicas de productividad (15-20 Tm de peso seco/Ha) en tierras marginales puede considerarse como una especie adecuada para ser cultivada y trans formada con fines energeticos . Como ya se discutio en el apartado 1.3 de la introduccion, la naturaleza de los materiales lignocelulosicos hace necesario el empleo de pretratamientos antes de realizar su hidrolisis con objeto de alterar su estructura y favorecer el rendimiento del proceso .Por este motive y tomando como referencia algunos traba j os pub 1icados sobre pretratamientos de sustratos 1ignocelulosicos , de composition similar a la del 0.nervosum se eligieron dos pretratamientos , uno con HO en medio alcalino y otro con NaOIl (el procedimiento empleado para efectuar cada uno de ellos se detalla en el apartado correspondiente a Materiales y Me - todos).

Las relaciones solido-lfquido en el medio de hidrolisis estudiadas para los diferentes sustratos fueron 5% y 10% (p/v) . Aunque en principle se penso tambien ensayarconcentr aciones superiores de spstrato,estas resultaron experime talmente des aeons e j ab 1 es , s obre. todo en el- caso de los sustratos lignocelulosicos,debido a su b a j a densidad.El rango de concen- - tracion de enzimas ens ay ado vario entre el 2% y el 8% , exp re -

-30-

sados como mg de proteina utilizada por cada 10 0 mg de sustra- to (la actividad enzimati ca sobr'e papel de filtro y de |"3 -glucosidasa por mg de proteina fue 0,9 UPF y 2 nKat respectivamente).

En las figuras 6,7,8 y 9 s e representan los resultados obtenidos para los cuatro sustratos empleados ex - presados como mg de azucares reductores solubilizados durante 48 horas de hidrolisis con las diferentes proper clones de e n- zima.Se puede observar comparando las distintas graficas que, con respecto a la concentracion de sustrato en el medio de la reaccion,cuando esta se eleva desde el 5 % hasta el 10 % ,conservando la misma relacion e nz ima/s us t r a to , e-1 rendimien-to de la hidrolisis expresado como produccion de azucares reductores por unidad de peso de sustrato se mantiene mas o menos constants en todos los casos . E sto supone la posibilidad de obtener,utilizando la concentracion del 10 % , un hidroli-zado con doble concentracion de azucares reductores sin per- der eficiencia en el rendimiento de hidrolisis .

En cuanto a la influencia de la proporcion de enzima en el rendimiento del proceso de hidrolisis , se observe a part ir de los resultados re-pres entados en las figuras 6,7,8 ,9 y 10 (en esta ultima , se recogen los valores de azucares reductores producidos despues de 48 horas de hidrolisis en funcion de la relacion peso de enzima-peso de sustrato, para la relacion solido/liquido del 10 %) que el aumento del rendimiento no es proporcional a1 aumento de la concentracion de enzima lo que puede ser debido por un 1 ado, a la aparicion de fenomenos de inhibicion por la a It a concentracion de los productos de hidrolisis en el hidrolizado y por otro,a la pro- pia estructura del sustrato celulosico y a que a medida que

AZUC

ARES

RED

UCTO

RES

(mg/

100

mg s

ustr

ato) o 50

24 3 23 8 24 32

TIEMPO(HORAS) TIEMPO(HORAS)

Fig . 6 : Efecto de la proportion de enzima ( expres ada como

gramos de proteina por 100 g de sustrato) en la

production de azucares reductores durante la hidro-

lisis enzimatica de Solka floe HW-200 . Rela-cion

sSlido-lIquido(p/v) : 5% (A) y 10% (B) .

AZUC

ARES

-3 2**

OS -P

O +J

TIEMPO(BORAS)

cnMosOE-<UoQWas

tnwas<uDN<

24 32TIEMPO(BORAS)

Fig 7: Efecto de la proporcion de enzima (expresada como

gramos de proteina por 100 g de sustrato ) en la

producciSn de azucares redactores durante la hidro-

lisis enzimatica de Onopo rdum nervos um no pretratado,

Relacion solido-llquido (p/v) : 5 %(A) y 10%(B).

AZUC

ARES

RED

UCTO

RES(

mg/1

00 m

g su

stra

to]

— 33 —

o 30

O 20

K 10

24 32

TIEHPO(BORAS)

24 32

TIEMPO(BORAS)

Fig.8 : Efecto de la proportion de enzima(expresado como

gramos de proteina por 100 g de sustrato) en la

production de azflcares reductorea durante la hi -

drolisis enzimatica de 0. nervosum pretratado con

H2°2 en medio basico.Relacion solido-liquido

(p/v) : 5% (A) y 10% (B). -

-3 4-

10 —

24 32TIEMPO (KORAS)

40 -

30 -

24 32 48TIEMPO (HORAS)

Fig 9 : Efecto de la proporcion de enzima (expresada como gra_

mos de proteina por 10 0 g de sustrato) en la produccion

de azucares reductores durante la hidrolisis enzimatica

de Onopordum nervosum pretratado con NaOH . Re 1 acion

solido-llquido (p/v) : 5% (A) y 10% (B) .

AZUC

ARES

RED

UCTO

RES

(mg/

lOOm

g su

stra

to)

50

40

30

20

10

—i-- 1---- r0,5 1 2

i I6 12

PROTEINA ( g/100 g sustrato)

Fig. 10 : Efecto de la proporcion de proteina en la

racion de azticares reduc tores en 48 ho ras' \ \

drolisis: (x) 0.nervos urn no pretratado, (o)

vosum pretratado con H O en medio hasico

O.nervosum pretratado con NaOH , (a) Solka

H W- 2 0 0 .Relacion solido-liquido (p/v) :]. 0%

1 ibe-

de li i

O.nerr ( • )

floe

-36-

progresa la hidrolisis,la fraccion de residue no hidrolizado es cada vez mas rica en zonas cristalinas , difxcilmente ata- cables por las enzimas con lo cua1 por encima de una cierta tas a de sacarificacion , la continuidad del proceso se ve muy dificultada aunque la proporcion de enzimas en el medio sea elevada.

Con respecto a la incidencia del pretratamiento en el aumento del rendimiento en la hidrolisis de materiales lignocelulosicos se observa como los dos pretratamientos se- leccionadtis aumentan sensiblemente la produce ion de azucares reductores .En este punto,hay que sehalar que los azucares reductores no indican exclusivamente la hidrolisis de la fraccion de celulosa ya que la presencia de xilanasas en la preparacion hace que se liberen reductores como consecuencia de la hidrolisis de las hemicelulos as presentes en el sustrato .La medida de la glucosa presente en el hidrolizado daria una idea mas clara de la degradacion de las fibras de celulosa por el complejo enzimatico .Sin embargo, como una de las caracteristicas del complejo de Trichoderma reesei es la b aj a actividad de su (3-glucosidasa y su rapida inhibicion por glucosa,es conveniente realizar los estudios cineticos correspondientes antes de poder evaluar en terminos de produccion de glucosa la evolucion de un proceso de hidrolisis.

A partir de los resultados obtenidos,se puede deducir que el pretratamiento de la materia lignocelulosica antes de realizar la hidrolisis con enzimas tiene una influencia decisive en el rendimiento de la misma . Pues to que los pretratamientos uti1izados en este caso han sido seleccionados en base a datos de bibliografia y no se han realizado estudios de optimization de los mismos para la biomasa de Onopordum

nervosum , ser£a importante evaluar en sucesivos estudios la efectividad de diversos pretratamientos en fund on de su incidencia en el rendimiento de la hidrolisis enzimatica y en el coste global del proceso de transformacion.

-38-

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-42-

ANEXO I

INDICE DE FIGURAS Pagina

1. Efecto del pH en la produccion de azucares reductorespor hidrolisis enzimatica de Solka floe HW-200 a d is - tintas temperatures ....... .................. .......... . 24

2. Efecto del pH en la produccion de glucose por h i dr 51 i_sis enzimatica de Solka floe HW-200 a distintas temperatures .............................. ................. . 25

3. Influencia del pH en la relacion entre glucosa y azuca re s reductores producidos en la hidrdlis is de Solkafloe HW-200 a dis tintas temperatures ................ 26

4. Efecto del pH en la recuperacion de enzima (expresada como porcentaje del valor inicial de proteina en el medio de hidrolisis) en el hidrolizado -de Solka floeHW-200

5. Variacion de la actividad enzimatica de: (3-glucosida sa y papel de filtro, en funcion del tiempo de incubacion, a 50 °C, del complejo enzimatico producido por Trichoderma reesei QM 9414 .................. .....

6. Efecto de la proporcion de enzima (expresada como gra mos de proteina por 100 g. de sustrato) en la produccion de azucares reductores durante la hidrolisis enzimatica de Solka floe HW-200 ...................

2 7

28

3 I

7. Efecto de la proporcion de enzima (expresada como gramos de proteina por 100 g. de sustrato) en la produc_ cion de azucares reductores durante la hidrolisis enzi_ matica de Onopordum nervosum no pretratado ......... . . 32

8. Efecto de la proporcion de enz'ima (expresada como gra

f-

-43-

/mos de proteina por 100 g. de sustr'ato) en la produc cion de azucares reductores- durante la hidrolisis enzi_ matica de Onopordum nervosum pretratado con H^O^ en m®. dio.basico ................................................. 33

9. Efecto de la proporcion de enzima (expresada como gramos de proteina por 100 g. de sustrato) en la produccion de azucares reductores durante la hidrolisis enzi matica de Onopordum nervosum pretratado con NaOH ..... 34

10. Efecto de la proporcion de proteina en la liberacion de azucares reductores en 48 boras de hidrolisis de los diferentes sustratos utilizados .................... 35

CIEMAT-597Division de Biomasa. Madrid

"Enzymatic activity of the cellulolytic complex produced by Trichoderma reesei. Enzymatic hydrolysis of cellulose".

ALFONSEL, M. j NEGRO, M.J.; SAEZ, R. | MARTIN, C. (19861 43 pp. 10 figs. 10 ref a.The enzymatic activity characterization of the cellulolytic complex

obtained from Trichoderma reesei QM 9414 and the influence of the enzymatic hydrolysis conditions on the hydrolysis yield are studied. Pure cellu lose and native or alkali pretreated biomass from Onopordum nervosum have been used as substrates.

The values of pH, temperature, substrate concentration and enzyme-subs trate ratio for the optimum activity of that complex, evaluated as glucose and reducing sugars production, have been selected. Previous studies on enzymatic hydrolysis of O. nervosum have shown a remarkable effect of the alkaline pretreatments on the final hydrolysis yield.

INIS CLASSIFICATION. AND DESCRIPTORS: B14.0Q. enzyme Activity. Enzymes. Hydrolisis. Lignin. Substrates. pH Value. Temperature Dependence. Cellulose.



ALFONSEL, M.; NEGRO, M.J.; SAEZ, R.; MARTIN, C. (1986) 43 pp. 10 figs. 10 refs.The enzymatic activity characterization of the cellulolytic complex


The values of pH, temperature, substrate concentration and enzyme-subs trate ratio for the optimum activity of that complex, evaluated as glucose and reducing sugars production^ have been selected. Previous studies on enzymatic hydrolysis of Q. nervosum have shown a remarkable effect of the alkaline pretreatments on the final hydrolysis yield.

INIS CLASSIFICATION AND DESCRIPTORS; B14.00. enzyme Activity. Enzymes. Hydrolisis. Lignin. Substrates. pH Value. Temperature Dependence.Cellulose.

T


"Enzymatic activity of the cellulolytic com plex produced by Trichoderma reesei. Enzymatic hydrolysis of cellulose".ALFONSEL, M.( NEGRO, M.J.i SAEZ, R. j MARTIN, C. (19861'43 pp. 10 figs. 10 refs.

The enzymatic activity characterization of the cellulolytic complex obtained from Trichoderma reesei QM 9414 and the influence of the enzymatic hydrolysis conditions on the hydrolysis yield are studied. Pure cellu lose and native or alkali pretreated biomass from Onopordum nervosum have been used as substrates.

The values of pH, temperature, substrate concentration and enzyme-subs trate ratio for the optimum activity of that complex, evaluated as glucose and reducing sugars production, have been selected. Previous studies on enzymatic hydrolysis of O. nervosum have shown a remarkable effect of the alkaline pretreatments on the final hydrolysis yield. .

INIS CLASSIFICATION AND DESCRIPTORS: B14.00. enzyme Activity. Enzymes. Hydlollsis. Lignin. Substrates. pH Value. Temperature Dependence. Cellulose.

rCIEMAT-597

Division de Biomasa. Madrid


ALFONSEL, M. i NEGRO, M.J.; SAEZ, R.; MARTIN, C. (19861 ’43 pp. 10 figs. 10 refs.The enzymatic activity characterization of the cellulolytic complex


The values of pH, temperature, substrate concentration and enzyme-subs trate ratio for the optimum activity of that complex, evaluated as glucose and reducing sugars production, have been selected. Previous studies on enzymatic hydrolysis of 0. nervosum have shown a remarkable effect of the alkaline pretreatments on the final hydrolysis yield.

INIS CLASSIFICATION AND DESCRIPTORS; 814.00. enzyme Activity. Enzymes. Hydrolisis. Lignin. Substrates. pH Value. Temperature Dependence. Cellulose.

CIEMAT-597 CIEMAT-597Division de Biomasa. Madrid Division de Biomasa. Madrid

"Actividad enzimStica del complejo celuloliti co producido por Trlchoderma reesel. Hldrdlisis enzimStica de la celulosa".

"Actividad euzim&tica del complejo celulolitico producido por Trlchoderma reesei. Hidr61isis enzimStica de la celulosa".

ALFONSEL, H.; NEGRO, M.J.; SAEZ, R.; MARTIN, C. (1986)43 pp. 10 figs. 10 refs. IEn este trabajo, se recoge la metodologia para la caracterizaciOn de •

la actividad enzimAtica de un complejo celulolltico y su aplicaciOn al #caso concrete del complejo enzimAtico producido por Trlchoderma reesei *QM 9414. Asimismo, se estudia la influencia de las concllciones del proce- < so de hidrOlisis en el rendimiento del mismo. Los sustratos utilizados *han sido celulosa pura y biomasa de Onopordum nervosum nativa o pretrata- [da en medio alcalino. J

Los resultados obtenidos han permitido fijar las condiciones de pH, .temperature, relaciOn sOlido-llquido y relaciOn enzima-sustrato para la .actividad 6ptima de dicho complejo. Los estudios realizados sobre Q. ner- ,vosum han mostrado la influencia positive de los pretratamientos alcall- |nos en la eficiencia de la hidrOlisis enzimAtica posterior. I

CLASIFICACION INIS Y DESCRIPTORES: B14.00. Enzyme Activity. Enzymes. |Hydrolisis. Lignin. Substrates. pH Value. Temperature Dependence. ICellulose. • I

ALFONSEL, M.; NEGRO, M.J.j SAE2, R.; MARTIN, C. (1986)43 pp. 10 figs. 10 refs.En este trabajo, se recoge la metodologia para la caracterizaciOn de

la actividad enzimAtica de un complejo celulolltico y su aplicaciOn al caso concrete del complejo enzimAtico producido por Trlchoderma reesei QM 9414. Asimismo, se estudia la influencia de las condiciones del proceso de hidrOlisis en el rendimiento del mismo. Los sustratos utilizados han sido celulosa pura y biomasa de Onopordum nervosum nativa o pretrata- da en medio alcalino.

Los resultados obtenidos han permitido fijar las condiciones de pH, temperatura, relaciOn sOlido-llquido y relaciOn enzima-sustrato para la actividad Optima de dicho complejo. Los estudios realizados sobre O. nervosum han mostrado la ‘.nfluencia positiva de los pretratamientos alcall- nos en la eficiencia de ..a hidrOlisis enzimAtica posterior.

CLASIFICACION INIS Y DESCRIPTORES: B14.00. Enzyme Activity. Enzymes. Hydrolisis. Lignin. Substrates. pH Value. Temperature Dependence. Cellulose.

CIEMAT-597 CIEMAT-597Division de Biomasa. Madrid Division de Uiomasa. Madrid

"Actividad enzimStica del complejo celulolitico producido por Trlchoderma reesei. Hldrdlisis enzim&tica de la celulosa".

ALFONSEL, M.; NEGRO, M.J.; SAEZ, H.; MARTIN, C. (1986)43 pp. 10 figs. 10 refs.En este trabajo, se recoge la metodologia para la caracterizaciOn de

la actividad enzimAtica de un complejo celulolltico y su aplicaciOn al caso concrete del complejo enzimAfcico producido por Trlchoderma reesei QM 9414. Asimismo, se estudia la influencia de las condiciones del proceso de hidrOlisis en el rendimiento del mismo. Los sustratos utilizados han sido celulosa pura y biomasa de Onopordum nervosum nativa o pretrata- da en medio alcalino. •

Los resultados obtenidos han permitido fijar las condiciones de pH, temperature, relaciOn sOlido-llqxiido y relaciOn enzima-sustrato para la actividad Optima de dicho complejo. Los estudios realizados sobre O. nervosum han mostrado la inf luencia positive de los pretratamientos alcali- nos en la eliciencia de la hidrOlisis enzimAtica posterior.

CLASIFICACION INIS Y DESCRIPTORES: 814.00. Enzyme Activity. Enzymes., Hydrolisis^ Lignin. Substrates. pH Value. Temperature Dependence.Cellulose.' , ,

"Actividad enzimStica del complejo celuloliti co producido por Trlchoderma reesei. Illdrdllsls enzimStlca de la celulosa".

ALFONSEL, M.; NEGRO, M.J.j SAEZ, R.; MARTIN, C. (1986)43 pp. 10 figs. 10 ref a.En este trabajo, se recoge la metodologia para la caracterizaciOn de

la actividad enzimAtica de un complejo celulolltico y su aplicaciOn al caso concrete del complejo enzImAtico producido por Trlchoderma reesei QM 9414. Asimismo, se estudia la influencia de las condiciones del"proceso de hidrOlisis en el rendimiento del mismo. Los sustratos utilizados

’ ban sido celulosa pura y biomasa de Onopordum nervosum nativa o pretrata- da en medio alcalino.

Los resultados obtenidos han permitido fijar las condiciones de pH, temperatura, relaciOn sOlido-llquido y relaciOn enzima-sustrato para la actividad Optima de dicho comple jo. Los estudios realizados sobre 0. nervosum han mostrado la influencia positiva de los pretratamientos alealint s en la eficiencia de la hidrOlisis enzimAtica posterior.

CLASIFICACION INIS Y DESCRIPTORES: B14.00. Enzyme Activity. Enzymes. Hydrolisis. Lignin. Substrates. pH Value. Temperature Dependence.Cellulose. !

C^iosziot . 597 - OSTI.GOV

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