Control Biológico de la Roya del Cafeto con Microorganismos...

Microbiomas y Control Biológico como Alternativa de Manejo de la

Roya del Café

Luis C. Mejía

INDICASAT AIP

Todo organismo en la naturaleza tiene un enemigo

Control Biológico: Uso de un organismo para suprimir la actividades y poblaciones de otro organismo

Microbioma La totalidad de microorganismos, sus elementos genéticos (genomas), e interacciones en un ambiente en particular. Término acuñado por Joshua Lederberg quien argumentaba que los microorganismos que habitan el cuerpo humano deben ser considerados como parte del genoma humano debido a la influencia que tienen en la fisiología del mismo.

Las comunidades microbianas son mezclas de especies que van desde mutualistas

hasta patógenos

Entender por qué ellas tienen los efectos que tienen en diferentes especies de plantas es importante desde perspectivas fisiológicas, genéticas, ecológicas y evolutivas. La composición de especies de los microbiomas de plantas usualmente varía entre órganos y superficies (interna=endofítica vs externa=ectofítica) de las mismas y también puede variar dependiendo de la localidad, tipo de suelo (para el caso de los microbiomas de raíces) y genotipo (Berg et al 2005, Santamaría y Bayman 2005, Lundberg et al. 2012, Mejía et al 2009, Turner et al 2013). Nuestro grupo en INDICASAT y STRI estudia endófitos y fitopatógenos con el propósito de entender los mecanismos que rigen los efectos que ellos tienen en sus plantas hospederas

Para qué sirve entender qué microorganismos tenemos en las plantas y qué hacen?

-Nuevas drogas -Nuevos químicos -Aplicaciones agrícolas (protección y producción vegetal) -Bioremediación -Procesos industriales -Manejo de ecosistemas

Fuente rica de compuestos

Mejia et al 2009 Microbial Symbiosis

Hongos endófitos: hongos que asintomáticamente infectan y colonizan tejidos internos de las plantas

sin causar daño a su hospedero (Petrini 1992)

JF White

Control Biológico

• El control biológico puede definirse como el uso de un organismo para suprimir la actividades y poblaciones de otro organismo y se ha utilizado para manejar insectos plaga, patógenos y malas hierbas y otros tipos de plantas no deseadas (ver Pal y McSpadden Gardener 2006).

• El control biológico de organismos tipo roya ha sido evaluado en muchos cultivos con buenos resultados y en el caso del cafeto se han usado microhongos y bacterias de la superficie de las hojas) para control de roya del cafeto (Ganley et al. 2008, Jackson et al. 2012, Podile y Kishore 2002, Vandermeer et al. 2009).

• La recurrencia de las epidemias de roya junto con el impacto socio-económico y ambiental que conlleva la prevención, manejo y control de las mismas, principalmente mediante el uso de químicos fungicidas, son motivos significativos para más investigación y desarrollo de alternativas de control.

Estrategias de Control Biológico Control biológico clásico

Uso de un agente de control biológico que proviene del mismo sitio de origen y que ha coevolucionado con el organismo que se quiere controlar.

Control biológico aumentativo

Detección de enemigos naturales del organismo que se quiere controlar en sitios diferentes a su lugar de origen y el posterior aumento de los niveles del mismo en áreas seleccionadas para que los mismos supriman las actividades o poblaciones del organismo a ser controlado. En el caso particular del cafeto se ha evaluado esta estrategia para control biológico de H. vastatrix usando bacterias endofíticas y se han obtenido resultados prometedores en Brasil (Shiomi et al 2006, Haddad et al. 2009).

Control biológico mediante conservación

Manejo del ambiente para incrementar la sobrevivencia, capacidades fisiológicas y/o efectividad de un agentes de control biológico sobre un organismo blanco en un área específica (ver Barbosa 1998).

Endófitos para control biológico de enfermedades del cacao y sus efectos en la fisiología y expresión génica del hospedero

Cultivo de cacao, Theobroma cacao (Arbol de chocolate)

Enfermedades importantes del cacao: Amenazas contra la viabilidad económica del

cultivo

Mazorca negra Phytophthora spp.

Necrotrofo

Moniliasis Moniliophthora roreri

Hemibiótrofo Escoba de Bruja

Moniliophthora perniciosa

Hemibiótrofo

Sistema experimental

Sin

endófito

Con

endófito

Hojas de cacao con hongos endófitos

son más resistentes a daño por

patógeno que hojas sin endófitos

E+P+ E+P+ E-P+

E-P+

E+P+

E+P+

E-P+

E-P+

E+P+

Los endófitos limitan daño

causado por patógenos en su

hospedero

0

5

10

15

20

25

Joven Madura

E- P+

E+ P+

Pro

porc

ión

de á

rea

folia

r da

ñada

Edad de hoja

Arnold AE, Mejía LC, Kyllo, D, Rojas, E, Maynard, Z, Robbins, N, Herre, EA. 2003. Proc. Natl. Acad. Sci. USA.100, 15649-15654.

Los endófitos ayudan a resistir pérdida

de hojas causada por patógeno

0

5

10

15

20

25

30

E-P+ E+P+

TreatmentTratamiento

Pérd

ida d

e h

oja

s

Arnold AE, Mejía LC, Kyllo, D, Rojas, E, Maynard, Z, Robbins, N, Herre, EA. 2003. Proc. Natl. Acad. Sci. USA.100, 15649-15654.

Treatment

% fru

its w

ith M

. ro

reri

sp

ore

s

20

30

40

50

60

70

a

b

abab

C. gloeosporioides

control

C. rosea

B. dothidea

Farm

AL BB RC RL

% fru

its w

ith M

. ro

reri

sp

ore

s

0

10

20

30

40

50

60

70

C. rosea

control

A B

Mejía et al. 2008. Biological Control

A) Media (ES) % frutas de T. cacao en las que patógeno M. roreri esporuló después de 6-9 aplicaciuones en 4 fincas de Bocas del Toro, Panama. B) Media (ES) %frutas de T. cacao con esporas de M. roreri para el mismo período

Hongos endófitos limitan daño causado por patógeno, en campo

Cuáles son los mecanismos mediante los cuales los

hongos endófitos ayudan a sus plantas hospederas a

defenderse de patógenos?

Mecanismos directos (antibiosis, hiperparasitismo) Mecanismos indirectos (inducción de genes de resistencia de la planta hospedera)

0 10 20 30 40 50 60 70 80

Other cellular processes

Other metabolic processes

Response to abiotic or biotic stimulus

Response to stress

Other biological processes

Developmental processes

Unknown biological processes

Transport

Cell organization and biogenesis

Protein metabolism

Electron transport or energy pathways

Transcription,DNA-dependent

Signal transduction

DNA or RNA metabolism

GO

Bio

log

ica

l P

roc

es

s

Percentage of cacao genes differentially expressed due to

endophyte colonization, by GO category. N=188 and 724 genes

in 1st and 2nd microarray experiment respectively

El hongo endófito dominante Colletotrichum tropicale regula la expresión de cientos de genes en T. cacao

Mejia et al. 2014 Frontiers in Microbiology

Hojas de T. cacao inoculadas con endófito(E+) tienen mayor contenido de lignina que hojas de cacao sin endófito (E-)

E+

E-


Sobre expresión de gen Tc00g042540 inducible por endófito reduce daño por Phytophthora capsici en hojas de T. cacao.


Panama (Divisa)

Mexico

Genotipos de Jatropha curcas

Endófitos también ayudan a controlar antracnosis de Jatropha curcas, una planta de interés para producción de biodiesel

Biodiversidad y ecología de hongos en

microbiomas de plantas tropicales

basado en secuenciamiento masivo de ADN

Microbiomas de plantas tropicales

Métodos • Hojas son colectadas, refrigeradas y transportadas al

laboratorio • Tres hojas por cada uno de 6 individuos por especie • Hojas procesadas inmediatamente o secadas en silica y

procesadas dentro de semanas o meses • Secuenciamiento masivo de amplicones (ITS1) • Extracción de ADN con kit comercial (Mobio, Qiagen) • Secuenciamiento Illumina SBS • Lecturas (secuencias) analizadas usando el programa

QIIME

Especies de plantas muestreadas para secuenciamiento masivo de ADN de hongos

Sample_ID Host species Host Family Order major Group Condition Location

C_A_M Curatella_americana Dilleniaceae Dilleniales Core Eudicots Pentapetalae Healthy Chiriqui

D_I_A Diphysa_robinioides Fabaceae Fabales Rosids I Healthy Chiriqui

O_V Ocotea_veraguensis Lauraceae Laurales Magnoliids Healthy Chiriqui

MDA8H Cyathea Cyatheaceae Cyatheales Pterydophyta Healthy Darien



MDA7H Arecaceae Arecaeae Arecales Commelinids Healthy Darien

MDA6H Arecaceae Arecaeae Arecales Commelinids Healthy Darien

MDA4D Psychotria_cf_correa Rubiaceae Gentianales Asterid I Disease Darien

MDA2D Psychotria_cf_correa Rubiaceae Gentianales Asterid I Disease Darien

MDA4H Psychotria_cf_correa Rubiaceae Gentianales Asterid I Healthy Darien



3Healthy1 Theobroma_cacao Malvaceae Malvales Rosids II Healthy Esmeralda

C41 Cecropia Urticaceae Rosales Rosids I Healthy Gamboa

11_C_2 Pteridium_aquilinum Dennstaedtiaceae Pteridales Pteridophyta Healthy Pcandela

PLHE1 Cyatheaceae Cyatheaceae Cyatheales Pteridophyta Healthy Soberania

PLHE2 Cyatheaceae Cyatheaceae Cyatheales Pteridophyta Healthy Soberania

PLP2-D Arecaceae Arecaeae Arecales Commelinids doublecheck Soberania

PLP1 Arecaceae Arecaeae Arecales Commelinids Healthy Soberania

PLPH1 Psychotria_horizontalis Rubiaceae Gentianales Asterid I Healthy Soberania

PLPHE3 Psychotria_horizontalis Rubiaceae Gentianales Asterid I Healthy Soberania

Diversidad de hongos foliares

Num samples: 15 Num observations: 6155 Total count: 780326 Counts/sample summary: Min: 165.0 Max: 123380.0 Median: 53784.000 Mean: 52021.733 Std. dev.: 31927.527

6155 especies (99% similaridad dentro de OTUs)

Abundancia y diversidad de clases de hongo

Abundancia relativa de géneros

Capnobotryella

Unidentified Myriangiales

Phomopsis

Colletotrichum

Principal coordinates plot of microbiome samples (fungal taxa)

Chiriquí

Chucanti, Darién

Soberanía and Bocas (cacao)

Resultados preliminares basados en enfoque de metagenómica

• Los microbiomas de plantas tropicales son altamente diversos. El número de especies de hongos endófitos foliares por muestra varió entre 60-250.

• El número total de especies de hongos encontrados varió entre 350 a 500 cuando se consideraron endófitos y ectófitos

• Especies de plantas creciendo en las mismas localidades tienden a compartir diversidad similar de hongos aún cuando vienen de linajes de plantas bastante diferentes

Microbioma del café y control biológico de la roya

Microorganismos del cafeto

• En el caso del cafeto, se han aislado hongos y bacterias endófitas a partir de hojas, frutas, raíces y semillas en diferentes países de América, Africa y Asia, con el propósito de caracterizar su diversidad y estudiar su potencial de controlar plagas y patógenos de este cultivo.

• En cuanto a búsqueda de controladores biológicos de H.

vastatrix en el microbioma del cafeto, se han reportado especies de bacterias de los géneros Bacillus y Pseudomonas con capacidad de inhibir la germinación y reducir la incidencia de roya (Daivasikamani y Rajanaika 2009, Haddad et al. 2009, Shiomi et al. 2006).

Estudio de hongos endófitos asociados al cafeto, en Renacimiento (Chiriquí, Panamá)

Objetivos generales:

Levantar un conocimiento básico sobre biología de hongos endófitos del cafeto

Determinar el potencial como agentes de control biológico de Hemileia vastatrix, agente causal de la roya del cafeto.cacao

Roya del cafeto

Enfoque de metagenómica para caracterización de microbiomas de plantas

(Secuenciación masiva de ITS y 16S)

Grupos abundantes de bacterias en café Xhantomonodaceae Proteobacteria Planococcaceae Other

Resultados: Porcentaje de colonización de hongos endófitos en

hojas de café Sitio 1 Sitio 2 Sitio 3 Sitio 3 Sitio 4 Sitio 5

Promedio ± ES

47.9 ± 7.3 45.5 ± 6.3 37.5 ± 10 22.9 ± 5.2 11.3 ± 9.5 10.4 ± 5.7

Número de hojas

3 9 3 3 3 3

Pedacitos de hojas

96 288 96 96 96 96

Número de hongos endófitos aislados: 282 Número de morfoespecies: 131

Resultados: Pruebas de antagonismo contra Hemileia vastatrix

-Un hongo endófito con actividad antagonista a H. vastatrix. 96% identidad de secuencia ITS con Pleosporales -También otro endófito del mismo orden con actividad antifúngica

Genomic and classical approaches to functionally and taxonomically characterize the foliar microbiome of coffee.

H. vastatrix germination in water

H. vastatrix germination in water in the presence of endophyte 4.2.2

Results: endophytes of coffee morphotyped and one isolate found to inhibit coffee rust pathogen Hemileia vastatrix germination

Proyecto: Desarrollando tecnología de biocontrol para los agricultores combatir una enfermedad del café

de importancia global

• Financiado principalmente por fondos de Ciencia e Innovación de la Embajada de Reino Unido en Panamá

• El propósito principal del proyecto es estudiar comunidades de microbios (microbioma del café) para aislar y probar agentes promisorios de control biológico del Hemileia vastatrix, hongo causante de la roya del café, enfermedad más importante de este cultivo a nivel local e internacional.

Harry Evans, CoPI, CABI

Robert Barreto. UFV

Colaboradores

Metas del Proyecto

1) Apoyar el desarrollo de capacidades científicas en Panamá y promover colaboraciones científicas internacionales

2) Generar conocimiento que permita el desarrollo de control biológico del café 3) Entrenamiento de estudiantes e investigadores en control biológico de enfermedades de plantas y en metagenómica de microorganismos.

Microbioma del cafeto: Sitios de Muestreo en Panama

Piedra Candela

Cerro Iglesias

Boquete

Cinco individuos por variedad Hojas, Frutas y Tallo. Raiz y suelo colectado para análisis futuro

Cómo cambian las comunidades de hongos del cafeto en función del tiempo, localidad, fenología y variedad de café y variables climáticas?

Geisha Catuai Criollo (Convencional y Orgánico)

Geisha Catuai

Geisha Catuai Criollo (Orgánico)

Resumen

• Todas las plantas son colonizadas por microorganismos. En muchos casos se ha demostrado que hongos endófitos son capaces de proteger a sus hospederos contra patógenos y plagas

• El muestreo de hongos endófitos realizados en el cafeto, en Renacimiento sugiere que hay una diversidad de hongos endófitos comparablae con estudios realizados en otras regiones

• Las pruebas de antagonismo de hongos endófitos de café contra H. vastatrix sugieren buen potencial de encontrar hongos endófitos nativos con capacidad de inhibir la germinación de esporas de este hongo y por lo tanto una alternativa para su manejo.

Pensamientos finales Todos los organismos tienen enemigos naturales Podemos utilizar microorganismos que son enemigos de plagas y patógenos de plantas para hacerlas más resistentes y productivas El control biológico ofrece una alternativa efectiva de manejo de enfermedades de cultivos agrícolas que es amigable con el ambiente, las salud de las personas y por lo tanto con gran potencial de impacto social

FAO

Agradecimientos

INDICASAT AIP

Productores y técnicos de café por acceso a cafetales -Sr. Roberto Brenes -Café de Eleta -Sr. Kelly Hartman -Sr. Miguel Cervantes Embajada Británica en Panamá FAO por la invitación a este evento

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