Cultivos Iniciadores en Quesería:T di ió M d id dTradición y Modernidad

Ana Rodríguez González y Beatriz Martínez Fernández

Grupo DairySafe, IPLA‐CSIC

II Jornadas TécnicasII Jornadas TécnicasNuevas Tecnologías en Seguridad y Calidad de los Productos Lácteos

Cáceres, 14 de Noviembre de 2013

INSTITUTO DE PRODUCTOS LÁCTEOS DE ASTURIAS

CSICCSIC

Tecnología y Biotecnología de P.L.Microbiología molecularFermentos lácticos y bioconservaciónFermentos lácticos y bioconservaciónFísico-química

Microbiología y Bioquímica de P.L.Probióticos, prebióticos y exopolisacáridosCultivos lácteos funcionalesCultivos lácteos funcionales

QuesosWWW. IPLA.CSIC.ES

Quesos de

España

FERMENTOS LÁCTICOS Y BIOCONSERVACIÓN(DairySafe)(DairySafe)

CALIDAD Y SEGURIDAD DECALIDAD Y SEGURIDAD DE PRODUCTOS LÁCTEOS

Líneas de InvestigaciónLíneas de InvestigaciónDiseño de cultivos iniciadoresBacteriocinasBacteriófagos y endolisinasBacteriófagos y endolisinas

Introducción

• Reseña histórica• Cultivos iniciadores

– Composiciónp– Tipos– Funciones– Propagación

• Fermentos autóctonos– Afuega´l Pitu

• Perspectivas– Seguridad– Calidad

Introducción

Friso de la LecheríaFriso de la Lechería (bajorrelieve sumerio del III milenio a.C.)

Descubrimiento accidental hace unos 8.000 años en el Fertile Crescent

(Valle del Trigris y Eúfrates (antigua Mesopotamia)

Microbiota contaminante Cuajada ácida Microbiota contaminanteacidificación

Almacenada en bolsas fabricadasLeche

Cuajada ácida queso frescoCoagulación

ácon estómagos de animales enzimáticaqueso

Introducción

(Ácidos grasos y C 14)(Ácidos grasos y C-14)

NeolíticoHace 7000 años en EuropaHace 7000 años en Europa

Introducción

Back-slopping Uso de una pequeña porción de leche Back-slopping coagulada como inóculo

S. XIX: identificación de las bacterias lácticas de la leche

Storch (Dinamarca) 1890Conn (EEUU)

Weigmann (Alemania)Streptococcus lactis

nata

FermentosCultivos iniciadores

pSt. cremoris

bacterias acidificantes

Starters Mantequilla de mejor calidad

Cultivos iniciadoresUna o más cepas de una o más especies bacterianas que se utilizan

i l d t d t i d l fi d i i ipara inocular un producto crudo o pasterizado con el fin de iniciar su fermentación

Ingredientes alimenticios

Sabor

Vida útilActividad metabólica

SaborAromaTextura

Seguridadmetabólica Textura

NutrientesSalud

Cultivos iniciadores

BACTERIAS LÁCTICASMicroorganismos Gram +

Inmóviles no esporuladosInmóviles, no esporuladosAnaerobios aerotolerantes

En general carecen de catalasag

Phylum Firmicutes (G+C < 50%)StreptococcusLactococcusOenococcus

GRAS: generally regarded as safe (FDA, 2001)

OenococcusEnterococcusLactobacillusLeuconostoc

QPS: QualifiedPresumption of Safe(EFSA 2007)Leuconostoc

Pediococcus(EFSA, 2007)

Cultivos iniciadoresLas bacterias lácticas utilizan rutas homo y heterofermentativas

para transformar los carbohidratos en ácido láctico

β (1,4)

GlucosaLactosa:azúcar mayoritario de la leche (4-5% g/100 mL)

Vía Homofermentativa Vía Heterofermentativa

(1,4)Galactosa

LactococcusStreptococcus Leuconostoc

Lactobacillus (Grupo III)Enterococcus

Pediococcus

Lactobacillus (Grupo III)

Lactobacillus (Grupo I y II)

LACTICO >85%

LácticoAcéticoEtanol

COpH

85%FórmicoAcéticoEtanol

CO2

Cultivos iniciadoresPROTEOLISIS

Caseína

Caseína

Oligopéptidos

Aminoácidos

TransaminaciónDeshidrogenación

α-ceto-acidosAldehídos

(www.rug.nl)

gDecarboxilación

ReducciónAlcoholesésteres

Cultivos iniciadoresFUNCIONES

Aumenta actividad del cuajo,

sinéresis del coágulo y Producción de aromas

Metabolismo del citrato:diacetilo, acetaldehido

sinéresis del coágulo y desuerado

(c. enzimática)

Producción de

Producción de aromas

P d ió d

MADURACIÓN(Ojos)

acido lácticoPrecipitación de las

caseínas(coagulación ácida) Actividad

Producción de gas

P d ió d ( g ) Actividad proteolítica

TEXTURAÓ

Producción de sustancias

antimicrobianas

Producción de exopolisacáridos

TEXTURAY

AROMA

CONSERVACIÓNpH

Bacteriocinas…

Cultivos iniciadoresTIPOSSegún la función

Primarios: producción de ácido láctico a partir de la lactosa

Secundarios: desarrollo y control del sabor, aroma y textura

Según la tª óptima de crecimientoMesófilos: Tª óptima 30ºC

Termófilos: Tª óptima 42ºC p

Según la composicióng pIndefinidos

Definidos

Cultivos naturales de lecheCultivos naturales de suero Cepa única

Definidos MúltiplesMixtos

Cultivos iniciadoresPrimarios mesófilos definidos

Lactococcus lastis ssp. lactis L(+) lactatoL. lactis ssp. cremoris L(+) lactato

L. Lactis ssp. lactis biovar. diacetylactis L(+) lactato y diacetiloLeuconostoc mesenteroides ssp. cremoris D(+) lactato, diacetilo, euco ostoc ese te o des ssp c e o s ( ) actato, d acet o,

etanol y CO2

Quesos: Gouda, Cheddar, Cottage, Camembert, Feta

Leches fermentadas nórdicas: Langfil (Suecia, Noruega)Viilli (Finlandia)

Cultivos iniciadoresPrimarios termófilos

Streptococcus thermophilus L(+) lactato, acetaldehidoLactobacillus delbruekii ssp. bulgaricus D(+) lactato, acetaldehido

Lb. acidophilus, Lb. helveticus DL-lactato

Quesos de pasta cocida: Gruyere, Emmental, Grana, MozarellaSinergismo

Yogur

Caseína Aminoácidosé tidL t b ill

Sinergismo

péptidos

Ácido fórmico

Lactobacillus

StreptococcusÁcido fórmico Streptococcus

Cultivos iniciadoresCultivos naturales o artesanales

Mezcla no definida de especies y cepas distintas

Producción diaria (temperatura y pH controlado)Selección de cepas

mejor adaptadas

Suero a 45ºC hasta pH 3,3 (fermentos naturales de suero) Lb helveticusQuesos de pasta dura: Parmiggiano Reggiano y Grana Padano Lb. helveticusLb. delbrueckii ssp. lactisLb. fermentumSt. thermophilus

Quesos de pasta dura: Parmiggiano Reggiano y Grana PadanoQuesos de pasta hilada: Mozzarella

p

Leche a 65ºC, 10-15 min, y enfriar a 37-45ºC (fermentos naturales de leche)

Q it li t di i l St. thermophilusLb. delbrueckii ssp. bulgaricusLb. caseiLb helveticus

Quesos italianos tradicionales

Lb. helveticusEnterococcus faecalisEnt. faecium

Cultivos iniciadoresPropagación

Condiciones asépticas

GMPGMP

Medios y condiciones “personalizados”personalizados

Concentración:

Centrifugación

Ultrafiltración DVS

(Cárcoba, Tesis Doctoral)

Fermentos autóctonos

Uso de fermentos comerciales

Ventajas Inconvenientes

Uso de fermentos comerciales

Control de la fermentación Ci “ é did “ d í iControl de la fermentaciónEstandarización del producto

Cierta “pérdida “ de característicasorganolépticas singulares

Fermentos autóctonos

Quesos con identidad propia(sabor y aroma diferenciales)

- Respetan la microbiota autóctona y susproporciones relativas

- Adaptadas al crecimiento rápido en el tipo del h tili d(sabor y aroma diferenciales) leche utilizado

- Equilibrio con los fagos endémicos de la zona

Fermentos autóctonos

Mezcla de cepas lácticas seleccionadas en funciónMezcla de cepas lácticas seleccionadas en función de sus características fisiológicas, metabólicas y

tecnológicastecnológicas, aisladas de la microbiota del queso de leche cruda

Estudio microbiotaqueso leche cruda

AislamientoY

caracterizaciónProducción

INDUSTRIAcaracterizaciónSelección INDUSTRIAL

Fermentos autóctonosAfuega´l Pitu

DOP

Los BeyosLos BeyosIGP

C í CabralesDOPGamoneu

DOP

CasínDOP

Fermentos autóctonos

Queso AFUEGA’L PITULeche de vacaCoagulación ácida (pH 4,4±0,28)Consumo fresco 2-3 días; madurado 2-3 semanas)

100

Consumo fresco 2-3 días; madurado 2-3 semanas)

60

80

BA

L20

40% B

0Cuajada 3 7 15 30 60

Lactobacillusdías maduraciónCu LactobacillusLeuconostocLactococcus

días maduraciónqueso

(Cuesta et al., 1996)

Fermentos autóctonos

Lactococos

59 2%33,3%

7,5%

Lactococos

180 cepas59,2%

L lactis subsp lactis

180 cepas

3,9%

L. lactis subsp. lactisL. lactis subsp. lactis biovar. diacetylactisL. garviae

58,8%

11,7%

11,9%

Leuconostoc

40 cepasLeuconostoc citreumLn mesenteroides

13,7% 40 cepas

Ln. mesenteroidesLn. paramesenteroides

subsp. mesenteroidesLn. mesenteroides Ln. mesenteroides

Fermentos autóctonos

LactococcusCapacidad acidificante : >0.65-0.98%

180 32 cepasConsumo de citrato

Actividad proteolítica Producción de compuestos aromáticosResistentes a bacteriófagosAusencia lisogenia 94,00

96,00

98,00

100,00

CompatibilidadNo producción de aminas biógenas

86,00

88,00

90,00

92,00

Leuconostoc40 11 cepas(J.I. Sánchez, Tesis doctoral)

LeuconostocProducción de compuestos aromáticosProducción de dextranoResistencia a la acidez

40 11 cepas

Resistencia a la acidezResistencia al NaClNo producción de aminas biógenas

Fermentos autóctonos

Leuconostoc citreum

56 %25%

Leuconostoc citreum(8 cepas) A comparativoAnálisis comparativo

MicrobiotaParámetros56 %19%

Lactococcus lactisL lactis subsp lactis

físico-químicos

AnálisisLactococcus lactissubsp. lactis

(8 cepas)

L. lactis subsp. lactisbiovar. diacetylactis

(6 cepas)

Análisissensorial

MEZCLASA B C D E F M l D723

522

623

423

422

432

Mezcla D

Fermento IPLA-0013 2 3 3 2 2 Fermento IPLA 001IPLA 947 - IPLA 838 – IPLA 616

Fermentos autóctonos

Medio de cultivo de bajo costeMedio de cultivo de bajo coste

Cultivo individual de cepas en biorreactorCultivo individual de cepas en biorreactor(pH, pO2, fuente de carbono)(pH, pO2, fuente de carbono)

C lti tiC lti tiCultivo continuo(individual, mixto)Cultivo continuo(individual, mixto)

Concentración de biomasa(filtración tangencial)Concentración de biomasa(filtración tangencial)

Liofilización (ensayo de crioprotectores)Liofilización (ensayo de crioprotectores)(ensayo de crioprotectores)(ensayo de crioprotectores)

Fermentos autóctonos

bi obi obiogesostartersbiogesostarters

IPLA001 500 Cantidad neta: 105 ml

IPLA 001

Lote:IPLA001 120710

Conservar congelado (-20ºC)Modo de empleo: D iluir con leche atemperada y añadir a l a cuba de cuajado.

Usar preferentemente

IPLA001 500Fermento láctico congelado,concentradoIngredientes: Cultivo microbiano( y ), leche en polvo.Lactococcus Leuconostoc

para 500 L de leche

Lote:IPLA001 120710 Usar preferentementeantes del fin de : 01/2011

Fabricado por:Bio-Ges Starters, S.A.Avda. Portugal, 41 24071 León (ESPAÑA)

Tfno : 987 291813 Fax: 987 291947

Fermento autóctono para queso Afuega`lPitu, elaborado por Bioges con cepas aisladas por el IPLA-CSIC

Contiene lactosa. Antes de usar ver ficha Tfno.: 987 291813 Fax: 987 291947CIF: A-24469249RGSA: 31.02073/LE

Contiene lactosa. Antes de usar ver fichatècnica.

Fermentos autóctonos

Perspectivasp

CALIDAD

Nutritivoy éenergético

N i i SNutritivoy 

energético

Sano, seguroy 

apetecibleSEGURIDAD

BeneficiosoNutritivo Sano seguro Beneficiosopara 

la salud

Nutritivoy 

energético

Sano, seguroy 

apetecible

Beneficiosopara

Nutritivoy

Sano, seguroy

Respetuoso con el medio Biodiversidadpara 

la saludy 

energéticoy 

apeteciblecon el medio ambiente

Biodiversidad cultural

Perspectivasp

CULTIVOS OBJETIVOS

PROTECTORES ↑Vida útil↑ SalubridadSalubridad

C bi lé iINICIADORES/ADJUNTOS

Cambios organolépticos↑Valor añadido

PROBIÓTICOS ↑ Funcionalidad

Perspectivas: Seguridadp g

BACTERIOCINAS

Péptidos antimicrobianosT ló i t tTecnológicamente aptasAmplio espectro de inhibiciónHistoria de consumo seguro: BAL

Ala

Gly Gly

SDha

LeuMet

LysIle Ala Ala Abu

Abu

Ala

Ala

S

S

S

Pro Gly

LysAla

AlaS

S

AlaDhb

Ile Leu

Lys Met Abu AbuAsn Ile Dha

His

HisSer Val

Nisina: E-234

Perspectivas: seguridadp g– Diseño de cultivos iniciadores protectores (nisina Z)

activos en quesos de coagulación ácida y de pasta

Fermento IPLAFermento IPLA Fermento IPLAFermento IPLA 001001 nisZnisZ Fermento IPLAFermento IPLA 001001 nisZ nisZ Fermento IPLAFermento IPLA 001001 nisZ nisZ

activos en quesos de coagulación ácida y de pasta lavada.

Fermento IPLAFermento IPLA--001001(Cárcoba, 2000)(Cárcoba, 2000)

Fermento IPLAFermento IPLA--001001--nisZnisZ(A)(A)

28%28%-- IPLA 729IPLA 729

Fermento IPLAFermento IPLA--001001--nisZ nisZ (B)(B)

18% 18% -- IPLA 729IPLA 729

Fermento IPLAFermento IPLA--001001--nisZ nisZ (C)(C)

56% 56% -- IPLA 729IPLA 72956% 56% -- IPLA 947IPLA 94719% 19% -- IPLA 838IPLA 83825% 25% -- IPLA 616IPLA 616

28% 28% -- IPLA 947IPLA 94719% 19% -- IPLA 838IPLA 838--1125% 25% -- IPLA 616IPLA 616

38% 38% -- IPLA 947IPLA 94719% 19% -- IPLA 838IPLA 838--1125% 25% -- IPLA 616IPLA 616

56% 56% IPLA 729IPLA 72919% 19% -- IPLA 838IPLA 838--1125% 25% -- IPLA 616IPLA 616

Evolución del fermentoAfuega´l pitu

Evolución del fermentoAfuega´l pitu2000

2400

10

12

fc/g

IPLA-001 IPLA-001-nis+ (A) IPLA-001-nis+ (B) IPLA-001-nis+ (C)

Afuega l pituAfuega l pitu

400

800

1200

1600

2

4

6

8

Log

uf U

A/g

Leuconostoc citreum IPLA 616Lactococcus lactis IPLA 947

0 3 6 9 12 15 0 3 6 9 12 15 0 3 6 9 12 1500

0 3 6 9 12 15

Tiempo (días)L. lactis IPLA 729L. lactis biovar. diacetylactis IPLA 838UA/g

Perspectivas: seguridadp g

Rilla et al., 2003

Perspectivas: seguridadp g

Fermento comercial; Fermento IPLA-001; Fermento IPLA-001-nisZ+

5

10

15

20

Áci

do lá

ctic

o (m

g/g)

0,1

0,15

0,2

0,25 Ácido pirúvico (m

g/ 0,4

0,6

0,8

1

1,2

Diacetilo*5

10

15

Eta

nol*

0

5Á

0

0,05

/g)

0 6

0,8

co (m

g/g)

0,4

0,5

Ácido but

0

0,2

0

0,6

0,8 3-M

567

na*

0

0,2

0,4

0,6

0 5 10 15 20 25 30

Áci

do a

cétic

0 5 10 15 20 25 300

0,1

0,2

0,3

tírico (mg/g)

0

0,2

0,4

0,6

1 8 15 30

Metilbutanal*

01234

1 8 15 30

Ace

toin

Tiempo de maduración (días) Tiempo de maduración (días)

Perspectivas: calidadp

Producción deProducción de cultivos iniciadores

CongelaciónLiofilización

Producto lácteo fermentadoMateria prima Fermentación en la industria láctea

AcidezTemperaturas extremas

Salinidad

fermentadoBacteriófagosCompuestos

antimicrobianos

Calidad higiénica

SaborSalinidadBacteriófagos

Compuestos antimicrobianos

antimicrobianos Sabor

Aroma

Textura

RESPUESTA AL ESTRÉS

Perspectivas: calidadpPresión selectiva Resistencia a bacteriófagos

GM17 Cepas más robustas

Perspectivas: calidadp

RIBOTIPADO

RFLP-PFGERAPD

RFLP PFGE

Perspectivas: calidadpTecnologías de alto rendimiento

GenómicaProteómicaMetabolómicaFenómica…

Muchas graciasg