ECOLOGIA MOLECULAR DE SISTEMAS GASTROINTESTINALES

ANTECEDENTES:

•Es una necesidad conocer la ecologia gastrointestinal:

*Comunidades que aloja

*tamaño de ella

*Immpacto que pueden tener sobre el animal

METODOS USADOS PARA IDENTIFICAR Y CUANTIFICAR POBLACIONES MICROBIALES

•INDIRECTOS:

Técnicas microbianas:

* aislamiento de cultivos

* Selección

Desventajas:

*solo se especula sobre la población

*puede elegirse un método no muy adecuado para la

población es estudio.

*se basa en características fenotípicas

•DIRECTOS

. Han demostrado que existen diferencias fisiológicas en colonias con caracteristicas geneticas similares, como un reflejo de evolución.

*TECNICAS MODERNAS

. Se basan en la comparación de secuencias homologas de biopolimeros(acidos nucleicos)

.se hace en base a una tarjeta de secuencia de RNA O DNA.

ventajas:

*provee información especifica del medio ambiente que representa la población

microbial.

* Permite hacer una clacificación mas acertada de los microorganismos.

BENEFICIOS

*Ha generado información que permite comprender mejor el sistema microbial natural.

*Provee una descripción completa de las comunidades microbiales complejas.

Análisis de las bases Ácido-nucléicas de Análisis de las bases Ácido-nucléicas de los ambientes gastro intestinaleslos ambientes gastro intestinales

Antecedentes

Microbios del tracto GI, tipificadosDiversidadComplejidad-Interacciones

Interrelaciones:ComunalismoMutualismoCompeticiónDepredación

•Problemas para ecologistas ruminales

-Falta de clasificación filogenética -Técnicas de cultivo

•Bacteroides, especies abundantes

•Definición por Cato y Salmon (1976):Gram negativoAnaeróbicoNo móvilNo esporaOvaladoFermentación de CHO’sProducción de Succinato

•Genética - 10 géneros - Fibrobacter

AntecedentesAntecedentes

Otros problemas con la técnicas de cultivoOtros problemas con la técnicas de cultivo Vogels (1980)Ecología de metanógenos Vogels (1980)Ecología de metanógenos

asociados con superficies de protozoarios asociados con superficies de protozoarios ciliados.ciliados.

Krumholz (1983) Única función relacionada con Krumholz (1983) Única función relacionada con el acarreo de hidrógeno y carbono.el acarreo de hidrógeno y carbono.

Finlay (1994) Es necesario investigar esta Finlay (1994) Es necesario investigar esta relación a fondo.relación a fondo.

AntecedentesAntecedentes

Limitado conocimiento de ecología de Limitado conocimiento de ecología de metanógenosmetanógenos Limitado conocimiento en la relación Bacterias Limitado conocimiento en la relación Bacterias

sulfato-reductoras (SRB) y metanógenos.sulfato-reductoras (SRB) y metanógenos. Reconocida desde 60’s y 70’s.Reconocida desde 60’s y 70’s. La mayor investigación hasta 1994 (Morvan) con La mayor investigación hasta 1994 (Morvan) con

relaciones entre ARB y metanógenos en la rumia.relaciones entre ARB y metanógenos en la rumia. Mayoría de estudios en humanos en I.G.Mayoría de estudios en humanos en I.G. Enfatizan la necesidad de estudiar relaciónes - Enfatizan la necesidad de estudiar relaciónes -

dieta. actividad microbiana y enfermedades dieta. actividad microbiana y enfermedades humanas.humanas.

AntecedentesAntecedentes Problemas asociados a enumeración en cultivos.Problemas asociados a enumeración en cultivos.

Investigaciones d ecologíaInvestigaciones d ecología Tazas de degradación y productos de formación.Tazas de degradación y productos de formación.

Otras interacciones, deducidas de:Otras interacciones, deducidas de: Características fisiológicas Características fisiológicas Aislamientos de cultivos purosAislamientos de cultivos puros

El entendimiento completo de la ecología, debe El entendimiento completo de la ecología, debe ser con combinación de técnicas ya establecidas y ser con combinación de técnicas ya establecidas y técnicas moleculares.técnicas moleculares.

AntecedentesAntecedentes

En ecología microbiológica molecular es En ecología microbiológica molecular es necesario distinguir entre:necesario distinguir entre: IdentificaciónIdentificación Cuantificación Cuantificación Monitoreo de funciones o actividadMonitoreo de funciones o actividad

También separar:También separar: Métodos de identificación que requieranMétodos de identificación que requieran

Aislamientos de cultivos purosAislamientos de cultivos puros Técnicas para identificar miembros de una Técnicas para identificar miembros de una

comunidad.comunidad.

AntecedentesAntecedentes Métodos cuantitativosMétodos cuantitativos

Enumeración de células sencillas que acarrean ac. nuc. Enumeración de células sencillas que acarrean ac. nuc. blancoblanco

Cuantificación de poblaciones (cuantificación total de Cuantificación de poblaciones (cuantificación total de población de DNA o RNApoblación de DNA o RNA

Definir métodos específicos de conteoDefinir métodos específicos de conteo

Ej. Presencia de gen metabólico particular, indica la Ej. Presencia de gen metabólico particular, indica la potencial degradación de cierto compuesto, pero no potencial degradación de cierto compuesto, pero no ofrece información de la viabilidad del organismo o ofrece información de la viabilidad del organismo o la expresión de dicho genla expresión de dicho gen..

La información de análisis de N-A.B depende del tipo de La información de análisis de N-A.B depende del tipo de ac. nuc. blanco y el marco técnico y conceptual del ac. nuc. blanco y el marco técnico y conceptual del diseño de la prueba. diseño de la prueba.

AntecedentesAntecedentes

Análisis de bases nucléicas de ecología microbialAnálisis de bases nucléicas de ecología microbial Más de una década (1985).Más de una década (1985). Pocos estudios empleando hibridación de ac nucléicos Pocos estudios empleando hibridación de ac nucléicos

en ecología GI.en ecología GI. Gran número de estudios de pruebas de ac nuc. En Gran número de estudios de pruebas de ac nuc. En

detección de patógenos.detección de patógenos. Durante los últimos 10 años, nuevas Durante los últimos 10 años, nuevas

investigaciones en ecología microbiana investigaciones en ecología microbiana molecularmolecular Pero no han sido aplicadas a ambientes de GI.Pero no han sido aplicadas a ambientes de GI. Pueden tener un uso potencial.Pueden tener un uso potencial.

AntecedentesAntecedentes

Monitoreo de actividad promedio de Monitoreo de actividad promedio de poblaciones microbianas.poblaciones microbianas. Cuantificación de rRNA, después de Cuantificación de rRNA, después de

extracción de RNA (1991, 1993).extracción de RNA (1991, 1993).

Monitoreo de genes de expresión (1993).Monitoreo de genes de expresión (1993). Detección Detección In situIn situ de genes de expresión en de genes de expresión en

células simples.células simples. No funcionan para signos cuantitativos.No funcionan para signos cuantitativos.

AntecedentesAntecedentes Desarrollo de Bioluminiscencia (1991).Desarrollo de Bioluminiscencia (1991).

Fusión de genes “Flux” en organismos “indígenas”Fusión de genes “Flux” en organismos “indígenas” Reintegración de organismos modificados en Reintegración de organismos modificados en

ambienteambiente Monitoreo no destructivo de transcripción genéticaMonitoreo no destructivo de transcripción genética Desventajas, requiere oxígeno para Desventajas, requiere oxígeno para

luminiscencialuminiscencia No puede ser combinada con hibridación de rRNA No puede ser combinada con hibridación de rRNA

blanco, por la pérdida de luminiscencia en la blanco, por la pérdida de luminiscencia en la fijación celular.fijación celular.

AntecedentesAntecedentes

Procedimientos de fijación (1995)Procedimientos de fijación (1995) Optimizados para mantener la actividad de Optimizados para mantener la actividad de ββ - -

galactosidasa después de la fijacióngalactosidasa después de la fijación Sustratos cromogénicos Sustratos cromogénicos ββ –galactosidasa –galactosidasa

evaluados por su capacidad para precipitar evaluados por su capacidad para precipitar colores después de la fijación.colores después de la fijación.

Cámara y software de análisis de imágenes.Cámara y software de análisis de imágenes. Cuantifica la intensidad de fluorescencia y la Cuantifica la intensidad de fluorescencia y la

actividad de actividad de ββ –galactosidasa debido a los –galactosidasa debido a los niveles rRNA dobles.niveles rRNA dobles.

AntecedentesAntecedentes

Marcadores para genes de expresión Marcadores para genes de expresión (GFP) 1994.(GFP) 1994. Flourescen después de fijación y Flourescen después de fijación y

compatibles con hibridaciones de rRNA compatibles con hibridaciones de rRNA blanco en células completasblanco en células completas

Evaluar varios parámetros simultáneosEvaluar varios parámetros simultáneos

Métodos Basados en DNAMétodos Basados en DNA Salyers y colaboradores Salyers y colaboradores

(1985):(1985): Técnicas de ácidos nucleicos usadas Técnicas de ácidos nucleicos usadas

por primera vez para cuantificar por primera vez para cuantificar poblaciones bacterianas del TGI poblaciones bacterianas del TGI (Kuritza y Salers, 1985).(Kuritza y Salers, 1985).Extracción de DNA de

bacterias en heces de humanos

Sondas específicas de DNA (Clonado aleatoriamente, fragmentos de DNA identificados por radiación de .4 a 2.5 kb).

Para cuantificación de: Bacteroides vulgatus y B. Thetaiotaomicron.

El nivel de detección fue bajo como para El nivel de detección fue bajo como para permitir el uso de técnicas basadas en permitir el uso de técnicas basadas en cultivos, sin embargo permitió la cultivos, sin embargo permitió la diferenciación entre especies que no eran diferenciación entre especies que no eran distinguibles con pruebas bioquímicas.distinguibles con pruebas bioquímicas.

Metodología similar, (Attwood et al. 1988Metodología similar, (Attwood et al. 1988):): Cuantificación de Cuantificación de Bacteroides ruminicolaBacteroides ruminicola

subs. subs. brevis brevis en líquido ruminal (2 x 10en líquido ruminal (2 x 1077 células/ml).células/ml).

Sondas de DNASondas de DNA

También usadas para investigar También usadas para investigar diversidad de especies.diversidad de especies.

Uso reducido comparada con Uso reducido comparada con ARN (por la alta probabilidad de ARN (por la alta probabilidad de hibridación cruzada).hibridación cruzada).

Flint et al. (1990)Flint et al. (1990):: sonda del gen codificador de celulasa sonda del gen codificador de celulasa

de de Fibrobacter succinogenesFibrobacter succinogenes revel reveló ó ppolimorfismos de fragmentos olimorfismos de fragmentos restringidosrestringidos entre cepas de esta entre cepas de esta especie.especie. Se encontró alta divergencia Se encontró alta divergencia interespecies.interespecies.

Cepa A Cepa B Cepa C

Fragmento de DNA codificador de celulasa

Polimorfismos de fragmentos restringidos

Lin (1993), analizó 15 cepas deLin (1993), analizó 15 cepas de Fibrobacter Fibrobacter y encontróy encontró::

94 % de homologia 94 % de homologia

con DNAcon DNA

99.8% de homología con 16 rRNA99.8% de homología con 16 rRNA

Menos variación entre las cepas

Menos variación entre las cepas

Métodos basados en RNAMétodos basados en RNA

Análisis comparativo de la secuencia de Análisis comparativo de la secuencia de pequeñas subunidades de rRNA (16S rRNA)pequeñas subunidades de rRNA (16S rRNA)

En el futuro se utilizará la subunidad 23S rRNAEn el futuro se utilizará la subunidad 23S rRNA

Análisis de la secuencia de las moléculas de la Análisis de la secuencia de las moléculas de la subunidad 16S rRNA, en una amplia variedad subunidad 16S rRNA, en una amplia variedad de microorganismos reveló que se presentan de microorganismos reveló que se presentan varias “regiones” que varían en la varias “regiones” que varían en la “conservación” de la secuencia“conservación” de la secuencia

Dichas “regiones” de la molécula del Dichas “regiones” de la molécula del 16S rRNA han permitido el desarrollo de 16S rRNA han permitido el desarrollo de sondas de hibridación de sondas de hibridación de oligonucleótidos generales y específicasoligonucleótidos generales y específicas

•Oligonucleótidos que complememntan regiones de secuencia de 16S r RNA universalmente conservadas:

Para cuantificar 16S r RNA de

cualquier fuente (Prueba

Universal)

Generales

Específicas

Oligonucleótidos que complementan regiones que varian en secuencia (p.e. microorganismos específicos)

Utilizadas en sondas selectivas ( de especie, género o grupo filogenetico)

Análisis de comunidades microbiales Análisis de comunidades microbiales basados en 16S rRNA implica:basados en 16S rRNA implica: Técnicas de amplificación de ácidos Técnicas de amplificación de ácidos

nucleicosnucleicos Colanación y secuenciación de la Colanación y secuenciación de la

información de 16S rRNA obtenida información de 16S rRNA obtenida directamente de las muestras.directamente de las muestras.

Comparación de la secuencia obtenida Comparación de la secuencia obtenida con una base de datos de secuencias de con una base de datos de secuencias de microorganismos previamente obtenidasmicroorganismos previamente obtenidas

La comparación sirve para dar un lugar a La comparación sirve para dar un lugar a nuevas secuenciasnuevas secuencias en la clasificación en la clasificación filogenéticafilogenética

Uso del Fibrobacter como un Uso del Fibrobacter como un Organismo Modelo para Desarrollar Organismo Modelo para Desarrollar

Técnicas Basadas en RNArTécnicas Basadas en RNAr

Sondas Sondas de oligonuclede oligonucleóótidos espectidos especííficas ficas de la 16S RNAr (cepas de F. de la 16S RNAr (cepas de F. Succinogenes y Lachnospira multiparus)Succinogenes y Lachnospira multiparus)

Los cambios en los niveles de 16S RNAr, Los cambios en los niveles de 16S RNAr, se monitorearon exitosamentese monitorearon exitosamente

No fue exitoso con el uso de agar para No fue exitoso con el uso de agar para F. SuccinogenesF. Succinogenes

Los resultados demostraron la habilidad Los resultados demostraron la habilidad de la prueba para monitorear de la prueba para monitorear poblaciones abundantes o cambios en poblaciones abundantes o cambios en la actividad.la actividad.

La creación del nuevo género fibrobacter se La creación del nuevo género fibrobacter se facilito por la secuencia comparativa de 16S RNAr.facilito por la secuencia comparativa de 16S RNAr.

La secuencia comparativa de 6 cepas de B. La secuencia comparativa de 6 cepas de B. SuccinogenesSuccinogenes

El análisis de la secuencia combinado con El análisis de la secuencia combinado con características fenotípicas (2 subespecies: F. características fenotípicas (2 subespecies: F. Succinogeges y F. Elongata)Succinogeges y F. Elongata)

Aislamiento del rumen, también del intestino y del Aislamiento del rumen, también del intestino y del coloncolon

Cepas fenoCepas fenotítípicamente igual, pero picamente igual, pero filogenéticamente diferente (F. Intestinales)filogenéticamente diferente (F. Intestinales)

La información secuencial del 16S RNAr de 6 La información secuencial del 16S RNAr de 6 cepas de fibrobacter (F. Succinogenes y F. cepas de fibrobacter (F. Succinogenes y F. IntestinalesIntestinales))

Utilidad de emplear sondas de diferente Utilidad de emplear sondas de diferente especificidadespecificidad

Materiales y MétodosMateriales y Métodos

Sintesis y marcacion de Sintesis y marcacion de Oligonucleotidos.Oligonucleotidos.

Extraccion de Acido Nucleico.Extraccion de Acido Nucleico. Hibridacion de Membrana.Hibridacion de Membrana.

USO DE METODOS A BASE DE rRNA PARA USO DE METODOS A BASE DE rRNA PARA ESTUDIAR LA ECOLOGIA Y SISTEMA DE OTRAS ESTUDIAR LA ECOLOGIA Y SISTEMA DE OTRAS POBLACIONES BACTERIANAS EN EL MEDIO DE POBLACIONES BACTERIANAS EN EL MEDIO DE

TRACTO GASTROINTESTINALTRACTO GASTROINTESTINAL

Los analisis comparativos de 16S rRNA fueron Los analisis comparativos de 16S rRNA fueron desarrollados y refinados con la ecologia de desarrollados y refinados con la ecologia de fibrobacterfibrobacter

Ha servido para:Ha servido para: Asignar familias a generosAsignar familias a generos Especies a generos i.e. Ruminococcus (R. albus, R. Especies a generos i.e. Ruminococcus (R. albus, R.

Flavefaciens y R. Callidus)Flavefaciens y R. Callidus) Interaciones entre micooorganismosInteraciones entre micooorganismos

Prevotella ruminicolaPrevotella ruminicola

Se observo que existe una gran diversidad genetica Se observo que existe una gran diversidad genetica en las diferentes cepas de P. Ruminicola, por lo que en las diferentes cepas de P. Ruminicola, por lo que de ahí se pueden formar tres nuevas spps.de ahí se pueden formar tres nuevas spps.

Tambien se han realizado estudios con el E. Coli BJ4 Tambien se han realizado estudios con el E. Coli BJ4 para estudiar su distribucion, tiempo generacional, para estudiar su distribucion, tiempo generacional, distribucion, etc.distribucion, etc.

Uso De Métodos Basados En rRNA Uso De Métodos Basados En rRNA Para Caracterizar Y Cuantificar Para Caracterizar Y Cuantificar

Poblaciones Protozoarias Y Poblaciones Protozoarias Y Fungicas En Ambientes Del Fungicas En Ambientes Del Conducto GastrointestinalConducto Gastrointestinal

Número limitado de estudiosNúmero limitado de estudios Ejemplo Prueba de oligonucleótidos Ejemplo Prueba de oligonucleótidos

específicos de Archaea con niveles de específicos de Archaea con niveles de flouroesenciaflouroesencia

Protozoos ciliados comunes (2)Protozoos ciliados comunes (2) Especies de Especies de EntodiniumEntodinium y y Dasytricha Dasytricha

ruminantiumruminantium 96 y 520 Archaea en promedio respectivamente 96 y 520 Archaea en promedio respectivamente

- Citoplasma- Citoplasma

Polimorfos del metanogenico Polimorfos del metanogenico Methano corpusculum parvumMethano corpusculum parvum

18S rRNA análisis – posición 18S rRNA análisis – posición taxonómica del taxonómica del NeocallimastixNeocallimastix (Microorganismo anaerobio (Microorganismo anaerobio importante)importante)

Más cercanos a Chytridiomycetes Más cercanos a Chytridiomycetes (Basidiomycetes, Ascomycetes y (Basidiomycetes, Ascomycetes y Chytriodiomycetes)Chytriodiomycetes)

Uso de métodos basados en rRNA Uso de métodos basados en rRNA como monitor en las relaciones de como monitor en las relaciones de

poblaciones microbianas en los poblaciones microbianas en los ambientes del conducto ambientes del conducto

GastrointestinalGastrointestinal Pruebas de Oligonucleótidos 16S rRNAPruebas de Oligonucleótidos 16S rRNA

Medios más sensitivos que DNAMedios más sensitivos que DNA Bacterias degradadoras de piridinediol Bacterias degradadoras de piridinediol

((Synergistes jonesiiSynergistes jonesii)) Niveles radiactivos para niveles bajosNiveles radiactivos para niveles bajos

Métodos probablemente aplicables a Métodos probablemente aplicables a especies silvestresespecies silvestres

Relaciones Filogenéticas entre cultivos Relaciones Filogenéticas entre cultivos colectados y su rol en el ambiente, se colectados y su rol en el ambiente, se asume una aplicación limitadaasume una aplicación limitada

Problemático para Manipulación Problemático para Manipulación genética o transferencia de genesgenética o transferencia de genes

Reintroducción de cepas de laboratorio Reintroducción de cepas de laboratorio en ecosistemas microbiales fallidosen ecosistemas microbiales fallidos Exclusión competitiva por relaciones de Exclusión competitiva por relaciones de

poblaciones residentespoblaciones residentes Ejemplo Ejemplo E. coliE. coli Uso de pruebas rRNA como objetivo Uso de pruebas rRNA como objetivo

Instrumento en la asistencia en el Instrumento en la asistencia en el conocimiento de la colonización conocimiento de la colonización

Evaluación de diferentes estados fisiológicosEvaluación de diferentes estados fisiológicos

En Estudios futuros:En Estudios futuros: Mayor uso de mediciones explícitasMayor uso de mediciones explícitas Pruebas de rRNAPruebas de rRNA Caracterización de eventos de Caracterización de eventos de

Colonizacion y ExclusiónColonizacion y Exclusión

Caracterización y Propósito

de las sondas de los

Oligonucleótidos

Evaluación de doble estabilidad

Evaluación de sonda especifica

Evaluación de doble estabilidad

Tm = Temperatura de fusión.

Td ó Trd = Teperatura de disociación ó temperatura de doble retención.

Temperatura de lavado de hibridación = Td.

Evaluación de sonda específica

Uso de sondas blancas de rRNA.

Búsqueda de blancos y noblancos (BANCOS).

Número de sondas probadas.

Sondas “animados”

Inspeccionando ambientes diferentes ce complejidad comparable.

Caracterización y Propósito de las sondas de los Oligonucleótidos

Análisis secuencial comparativo de las moléculas rRNA ha servido como propósito de la sonda para la fundación oligonucleótidos. Esto ha traído como resultado un número sustancial de publicaciones que describen el propósito de sondas de hibridación de oligonucléotidos en general y específicos (Ver tabla 7.1 resumen de sondas potenciales interés desarrollados en los estudios de ecología microbiana del tracto gastrointestinal. La mayoría de estos estudios siguen el acercamiento de caracterización y propósito de sonda descritos en detalle por Stahl y Amann (1991). Esta sección presenta varios consideraciones adicionales contra el respecto de la caracterización y propósito de la sonda de los oligonucleótidos que ninguno ha sido todavía explícitamente discutido.

Evaluación de doble estabilidad.

Parámetro importante para el contexto del uso del blanco en las hibridaciones cuantitativas de la sonda rRNA es la temperatura de fusión (Tm).

La Tm para oligonucleótidos, se define, como la temperatura de equilibrio los oligomeros a que medio se disocian.(Stahl y Amann 1991, Tijseen 1993).

La temperatura de disociación (Td) o temperatura de la doble retención (Tdr) definido como el punto medio de temperatura de la transición entre la doble estructura (los oligonucléotidos limitaron a la sucesión complementaria) y el blanco disociado dejado-solo, no corresponde a las condiciones de equilibrio y por consiguiente pueden ser diferente a la Tm.

La temperatura de lavado de hibridación, es un parámetro importante experimental y generalmente es igual Td. El valor de Td esta dada por la estabilidad de la sonda-blanca doble de los oligonucleótidos y concecuentemente, depende de la longitud de la sonda y composición del nucleótido, estructura del alto-orden en la región de sucesión designado y las condiciones de hibridación (temperatura y tiempo de hibridación, la concentración de sal del buffer de hibridación, sonda de concentración, etc.). Aunque empíricamente derivado de las relaciones (Stahl y Amann 1991, Tijsenn 1993) se habían desarrollado para estimar el valor Td, ellos no incorporaron todos los parámetros y, por consiguiente, se recomendaba para definir la hibridación y condiciones del lavado experimental para cada nueva sonda (Stahl and Amann 1991, Raskin et al. 1994b). Esto es especialmente cuando se usan sondas para diferenciar entre blancos que difieren en sólo unos nucleótidos (Ver Sección 4.2).

Aunque la determinación experimental de valores de Td es altamente recomendado, empíricamente derivado relacionado para estimar el valor Td debe usarse a priori durante el proceso del propósito de la sonda. Es a menudo posible alterar el valor predecidó de Td marcando por una sonda más larga o más corta (aunque el propósito de la sonda no siempre permite mucha flexibilidad). Obviamente, la especificidad de la sonda no debe comprometerse durante este proceso. Cuando se esta usando sondas múltiples para determinar la abundancia/actividad de poblaciones múltiples en la misma muestra, es preferible diseñar un juego de sondas con valores de Td que están relativamente cerca o cerrados de cada uno. La disponibilidad de sondas con valores similares de Td es principalmente una materia de convivencia experimental al emplear las membranas de hibridizaciones. Sin embargo, cuando las sondas múltiples son usadas simultáneamente en hibridaciones de células enteras (las señaladas por (Amann et al. 1990a) o designado a las poblaciones diferentes), pueden las condiciones de hibridación perfeccionarse para todas las sondas involucradas sólo si sus valores de Td son muy similares.

4.2 Evaluación de sonda específica.

Especificidad de las sondas es un propósito esencial de consideración cuando se usan sondas blancas de rRNA para la cuantificación de abundancia población y actividades en comunidades microbianas natural, que potencialmente albergan a nuevos microorganismos. Bajo la apropiada hibridación y condiciones del lavado (relativamente alta estrechez), es a menudo diferenciar entre blancos que difieren a un solo nucleotido (Stahl y Amann 1991). Sin embargo, desde la posición y composición de una desigualdad entre la sonda y la influencia designado por magnitud de la hídrido destabilización (para una revisión vea Stahl y Amann 1991) y no hay una regla adecuada para predecir estabilidad híbrida basado en la sucesión, todavía es necesario evaluar la especificidad de nuevas sondas experimentalmente.

La evaluación de especificidad de sonda generalmente empieza con una búsqueda de blancos y no blancos usando complementariamente grupos que usan bancos de datos de sucesión de rRNA [Banco Ribosomal Datos Proyectos (RDP), Maidak et al., 1994) y la Herramienta de Búsqueda de Alineación Local Básica Local alineación búsqueda Herramienta (BLAST), servicios network (Altschul et al. 1990)]. Si algunas especies designados intencionalmente tienen un número pequeño de desigualdades sola entre la sonda y la suceción del rRNA correspondiente, puede ser posible bajar la hibridación y lavado estreches para incluir el signo de hibridación contribuidos por estos microorganismos. Sin embargo, haciendo esto, la hibridación a las especies de noblanco con un número pequeño de desigualdades puede componer especificidad de la sonda. Por consiguiente. Las búsquedas del banco de datos son esenciales identificar desigualdades en noblancos y especies del blanco. Obviamente, estas búsqueda sólo son tan buenas como los bancos de datos y desde que más sucesiones del rRNA están poniendose disponibles rápidamente, la caracterización y el propósito de la sonda es un proceso dinámico que necesita evaluación constante.

Una evaluación de especificidad de la sonda experimental involucra el número de sondas probadas contra un número relativamente grande de número blanco y especies de noblancos que usan la hibridación determinada y estreches del lavado experimentamente (Devereux et al. 1992, Manz et al. 1992, Raskin 1994b, Wagner et al. 1994). La selección del juego de estudio del organismo y resultados de hibridación debe ser interpretada usando la información obtenida de las búsquedas del banco de datos. Como evaluación de especificidad de la sonda experimental se ilustra blanqueand o aquí los 16S rRNA de fibra-digerir microorganismos de importancia en herbívoros RECLUTA tractos ambientales. Una sonda circunscribe el género Fibrobacter (sonda S-G-Fibr-0225-a-A21 Tabla 7.1), mientras un segundo blanco de la sonda el Fibrobacter intestinalis (sonda S-S-F.int-0136-a-A20 Tabla 7.1) Además una sonda universal (sonda S-*-Univ-1392-a-A-15, Tabla 7.1), blanquendo los 16S rRNA de todos los organismos conocidos, se usó virtualmente. La especificidad de estas tres sondas se probó contra la colección de 80 referencias que

extrajo RNAs de Eccarrya, Archea, y Bacterias. Sesenta y 65 organismos de noblancos (devereux et al. 1992) y 15 Fibrobacter fatiga, los que eran representativos de la diversidad de Fibrobacter conocida y para que 16S sucesiones del rRNA habían sido previamente determinadas (Montgomery et al. 1988) (Lin et al. 1994). Las muestras de RNA se aplicaron a las membranas de Immobilon-N, y la hibridación se realizó anteriormente describiendo. Plantilla de una de las membranas así como se muestra autoradiográfos de las tres membranas hechos en la Figura 7.2.

Este experimento de la especificidad de la sonda se ha demostrado excelentemente: la sonda que hizo híbrido fuertemente a los 16S rRNA de los organismos designado y no hizo híbrido a las sucesiones de noblancos. La sonda específica-género (S-G-Fibr-0225-a-A-21) hizo híbridación a los 16S rRNA de todo las tensiones de Fibrobacter aplicados a la membranas, mientras la sonda especie- específica para F. Intestinalis (S-S-F. int-036-a-A-

20 ) sólo hizo hídrido a los cinco F. Intestinales fatigan. Estos autoradiografos también permiten estimaciones de hibridización de fondo señale para las muestras del noblancos. Los signos de hibridación de fondo estaban significativamente menos de 1% del signo de hibridación de muestras designando (Lin et al. 1994). En un estudio más temprano que usó la misma colección de refrencia RNAs para probar la especificidad de una colección de sondas para SRB la media hibridación del por ciento de muestras del noblanco varió de 0.1 a 0.4 % (Devereux et al. 1992). Si una búsqueda del banco de datos indica que estas suceciones del noblanco tienen sólo alguno desigual con una sonda particular, el quatificación preciso de hibridación del fondo es extremadamente importante. Por otro lado, desde la diversidad grande actualmente representada en 16S bancos de datos de rRNA no es simultaneamente presentan en una sola muestra medioambiental, pueden exagerarse las preocupaciones anteriores de hibriación del fondo.

Una segunda estrategia importante que puede usarse para probar la especificidad de la sonda experimentalmente es el “animado” de sondas. Subsecuentemente los grados diferentes de conservación en sucesiones del rRNA permite el propósito general y la hibridación de los oligonucléotidos sondeo , varias sondas con niveles del incremento de especificidad (e, g., familia-, género-, y las sondas especie-específica) puede usarse para caracterizar un solo ambiente. Si cada juego de sondas abarca la diversidad completa de especies designado presente en una cierta muestra, el de la suma de las cantidades de 16S rRNA cuantificada por un juego de sondas específicas (e.g., sondas especie-específicas) debe igualar la cantidad determinadapor una sonda más general (e.g., sondas genero-específicas). Así, la consistencia entre la hibridación produce un aumento a las sondas general y específico la confianza la selectividad del blanco-grupo y la integridad de nuestra comprensión de diversidad natural dentro de la reunión designado general.

Uso de Sondas para Uso de Sondas para identificar nuevas identificar nuevas poblacionespoblaciones

Los incosistentes resultados de Los incosistentes resultados de hibridación usando sondas generales hibridación usando sondas generales y específicas indican que por lo y específicas indican que por lo menos una sonda carece de menos una sonda carece de especificidad.especificidad.

Alternativamente...Alternativamente...

Existe la posibilidad de que residuos Existe la posibilidad de que residuos de especies no cultivadas de especies no cultivadas relacionadas a la sonda del grupo relacionadas a la sonda del grupo blanco no puedan ser detectadas por blanco no puedan ser detectadas por una o más de los juegos de sondas.una o más de los juegos de sondas.

Por ejemplo:Por ejemplo:

Si el uso de la sonda general indica Si el uso de la sonda general indica que hay una cantidad significativa de que hay una cantidad significativa de el grupo blanco presente en una el grupo blanco presente en una muestra del medio ambiente que no muestra del medio ambiente que no es cuantificada por la combianción es cuantificada por la combianción de varias pruebas específicas, de varias pruebas específicas, entonces se dice que hay una nueva entonces se dice que hay una nueva población.población.

Evaluación de la diversidad de Evaluación de la diversidad de FibrobacterFibrobacter

Se usaron 6 sondas de Se usaron 6 sondas de FibrobacterFibrobacter Se reveló que laSe reveló que la F. Succionógenes F. Succionógenes

fué la únicafué la única (cuantitativamente) (cuantitativamente) importante de las especies de importante de las especies de Fibrobacter Fibrobacter presentes en el intestino presentes en el intestino del ciego de un del ciego de un ponypony..

Sin embargo...Sin embargo...

El uso de tres sondas de subespecies El uso de tres sondas de subespecies de de F. Succionógenes F. Succionógenes demostraron demostraron que ninguna de éstas estaba que ninguna de éstas estaba presente en forma cuantitativa...presente en forma cuantitativa...

Por lo que las Por lo que las F F restantes, podría restantes, podría decirse que eran una nueva decirse que eran una nueva población.población.

La La F con secuencia 16SrRNAF con secuencia 16SrRNA

Fue identificada usando un Fue identificada usando un amplificador selectivo, clonando y amplificador selectivo, clonando y secuenciando el DNA aislado de secuenciando el DNA aislado de muestras cecales de muestras cecales de ponypony..

Extracción de RNAExtracción de RNA

Caracterización de comunidades Caracterización de comunidades microbianasmicrobianas Depende de adecuada recuperación de Depende de adecuada recuperación de

RNARNA Problemas de muestreo (Técnica) Problemas de muestreo (Técnica)

Heterogeneidad en muestra, problemas Heterogeneidad en muestra, problemas de extracción de ac. nucleicosde extracción de ac. nucleicos

Ambientes heterogéneosAmbientes heterogéneos Grandes variaciones: por distribución a Grandes variaciones: por distribución a

pequeña escalapequeña escala Bact. Celuloliticas Presentes en mat. Bact. Celuloliticas Presentes en mat.

CeluloliticoCelulolitico

Posibilidad de que RNA de plantas Posibilidad de que RNA de plantas contribuye al RNA total de las muestrascontribuye al RNA total de las muestras Estudios limitados mencionan lo contrarioEstudios limitados mencionan lo contrario Por tanto se requieren estudios en este Por tanto se requieren estudios en este

aspectoaspecto

Degradación de RNADegradación de RNA

Trabajo con RNA Trabajo con RNA

Evitar contaminación con Evitar contaminación con ribonucleasasribonucleasas

(Descomposición de RNA)(Descomposición de RNA)

Estudios de especifidad (15 cepas de F. Estudios de especifidad (15 cepas de F. succinogenes):succinogenes): Cepa B1 no hibridizo con la sonda utilizada Cepa B1 no hibridizo con la sonda utilizada

(X)(X) Misma cepa hibridizo con otra sonda (Y) Misma cepa hibridizo con otra sonda (Y)

(diferentes regiones de 16S rRNA)(diferentes regiones de 16S rRNA) Por lo tanto, actividad de ribonucleasas es Por lo tanto, actividad de ribonucleasas es

diferente en cada región de la molécula de diferente en cada región de la molécula de RNA (algunos sitios degradados y otros RNA (algunos sitios degradados y otros intactos)intactos)

Mas suceptible a degradación

Sondas de fragmentos de 16S rRNA universalmente conservadas

Menos suceptible a degradación

Sondas de fragmentos de 16S rRNA especificas

•Degradación de RNA se presenta en casos raros

•Cuando se presenta queda de manifiesto la importancia del manejo cuidadoso de las muestras y los extractos de RNA

Potencial limitada y Potencial limitada y variabilidadvariabilidad La adecuada caracterización de La adecuada caracterización de

comunidades microbiales usando la comunidades microbiales usando la hibridación de membranas depende de:hibridación de membranas depende de:

Que el rendimiento de extracción de RNA sea Que el rendimiento de extracción de RNA sea adecuado adecuado

Que las relativas concentraciones aisladas de Que las relativas concentraciones aisladas de rRNAs correspondan a sus abundancias rRNAs correspondan a sus abundancias naturales naturales

Las muestras comúnmente contiene Las muestras comúnmente contiene una mezcla de células que difieren en una mezcla de células que difieren en su susceptibilidad para romperse, su susceptibilidad para romperse, ejemplo:ejemplo:

El protocolo de lisis mecánica (bead-El protocolo de lisis mecánica (bead-beating) se creyó aseguraba la beating) se creyó aseguraba la recuperación del RNA de una manera recuperación del RNA de una manera uniforme de una gran variedad de uniforme de una gran variedad de microorganismos.microorganismos.

Las paredes celulares de la bacteria gram-positiva

y ciertas Eucarias (pared con quitina) son más difíciles de romper que las paredes de las bacterias

gram-negativas

Por ésta razón el Procedimiento de molido Por ésta razón el Procedimiento de molido se ha modificado e investigado aún más:se ha modificado e investigado aún más:

Por ejemplo:Por ejemplo: Se ha investigado el efecto del tiempo de molido, ySe ha investigado el efecto del tiempo de molido, y La cantidad de Zirconio/sílice sobre el rendimiento La cantidad de Zirconio/sílice sobre el rendimiento

total y específico del RNA de muestras ambientalestotal y específico del RNA de muestras ambientales

Resultados obtenidos son:Resultados obtenidos son: La expresión presenta variabilidad significativaLa expresión presenta variabilidad significativa Y la concentración de RNA no cambia gráficamente Y la concentración de RNA no cambia gráficamente

al incrementar el tiempo de molido.al incrementar el tiempo de molido.

5.3 Eficiencia en la recuperación 5.3 Eficiencia en la recuperación de rRNAde rRNA

La seguridad en sistemas de La seguridad en sistemas de hibridación de membranas depende hibridación de membranas depende de un buen procedimiento de de un buen procedimiento de extracción de RNA.extracción de RNA.

Fibrobacter intestinalisFibrobacter intestinalis

La cantidad de F. intestinalis recuperado de La cantidad de F. intestinalis recuperado de muestras ruminales muestras ruminales linealmente con linealmente con de de número de células.número de células.

Intervalo de confianza de 0.95Intervalo de confianza de 0.95

Precipitación, rinse y suspensión. Precipitación, rinse y suspensión.

Recuperación de RNA en presencia de Recuperación de RNA en presencia de fluido ruminal es menos eficiente que de fluido ruminal es menos eficiente que de cultivos puros, por retención de ácido cultivos puros, por retención de ácido nucléiconucléico

Presencia de ADN en Extractos de Presencia de ADN en Extractos de ARNARN

En la extracción ARN, cantidades En la extracción ARN, cantidades substanciales de ADN, son también extraidassubstanciales de ADN, son también extraidas

Aun cuando las condiciones de hibridación y Aun cuando las condiciones de hibridación y lavado son rigurosas, la posibilidad lavado son rigurosas, la posibilidad permanece permanece

Con la espectrofotometría UV, la pesencia de Con la espectrofotometría UV, la pesencia de ADN, sobrestima la cantidad de ARNADN, sobrestima la cantidad de ARN

Un método para evitar esto, es la Un método para evitar esto, es la electroforesis de gel de poliacrilamidaelectroforesis de gel de poliacrilamida

Separa las diferentes fracciones de Separa las diferentes fracciones de acidos nucleicos presentes en extractos acidos nucleicos presentes en extractos de ARNde ARN

La ventaja es que el ARN, puede ser La ventaja es que el ARN, puede ser cuantificado sin confundir los efectos cuantificado sin confundir los efectos de cualquier ADN que este presentede cualquier ADN que este presente

Tambien se usa cuando se tienen otras Tambien se usa cuando se tienen otras substancias en los extractos de ARN substancias en los extractos de ARN (p.e CHO´S fenólicos)(p.e CHO´S fenólicos)

6.- HIBRIDACION6.- HIBRIDACION

Cuando se realice hibridacion de membrana, es Cuando se realice hibridacion de membrana, es importante determinar la relacion entre la cantidad de importante determinar la relacion entre la cantidad de a poblacion blanco y la magnitud de la respuesta de a poblacion blanco y la magnitud de la respuesta de hibridacionhibridacion

(1) Extraccion.- Concentracion de 16S rRNA(1) Extraccion.- Concentracion de 16S rRNA (2) Hibridacion.- Relacion entre la cantidad de (2) Hibridacion.- Relacion entre la cantidad de

16S rRNA y la respuesta de hibridacion16S rRNA y la respuesta de hibridacion

6.1 Linearidad6.1 Linearidad

La cantidad de 16S rRNA puede ser La cantidad de 16S rRNA puede ser determinada por la respuesta de hibridacion con determinada por la respuesta de hibridacion con una RNA de referencia conocidauna RNA de referencia conocida

continuacion...continuacion...

Sin embargo esto no es tan sencillo Sin embargo esto no es tan sencillo porque la hibridacion depende de:porque la hibridacion depende de: El tipo de membranaEl tipo de membrana HibridacionHibridacion Condiciones de lavadoCondiciones de lavado Metodo utilizado para cuantificar Metodo utilizado para cuantificar

hibridacionhibridacion

Lo que si se puede hacer es establecer Lo que si se puede hacer es establecer relaciones lineales en rangos mas relaciones lineales en rangos mas pequenospequenos

6.2. Fuentes de Variabilidad 6.2. Fuentes de Variabilidad en Hibridaciones de en Hibridaciones de

MembranasMembranas Condiciones experimentales optimizadas y Condiciones experimentales optimizadas y

evaluadasevaluadas Análisis de Hibridación CuantitativaAnálisis de Hibridación Cuantitativa Especies poco abundantes y/o poblaciones Especies poco abundantes y/o poblaciones

con baja actividadcon baja actividad Tipo de soporte de membrana de Tipo de soporte de membrana de

DesnaturalizaciónDesnaturalización Variación de detectabilidad entre marcas Variación de detectabilidad entre marcas

comercialescomerciales

Variabilidad – variaciones locales en las Variabilidad – variaciones locales en las propiedades de las membranas, propiedades de las membranas, depende de cada paso del depende de cada paso del procedimientoprocedimiento

Methanosarcina acetivoransMethanosarcina acetivorans C2A RNA C2A RNA 2 condiciones de Desnaturalización2 condiciones de Desnaturalización Cuantificación por autoradiografía, Cuantificación por autoradiografía,

densitometría y conteo centelleantedensitometría y conteo centelleante Variabilidad Tipo I.- Introducida por Variabilidad Tipo I.- Introducida por

secado y variaciones locales en secado y variaciones locales en propiedades de membranaspropiedades de membranas

Variabilidad Tipo II.- Introducida por Variabilidad Tipo II.- Introducida por desnaturalización y dilucióndesnaturalización y dilución

Variabilidad Tipo III.- Introducida por Variabilidad Tipo III.- Introducida por pasos de prehibridación e hibridaciónpasos de prehibridación e hibridación

Variabilidad Tipo IV.- Asociada con el Variabilidad Tipo IV.- Asociada con el último paso de lavadoúltimo paso de lavado

Variabilidades Tipo II y III, no son Variabilidades Tipo II y III, no son estadísticamente significativasestadísticamente significativas

Paso de lavado (Variabilidad Tipo Paso de lavado (Variabilidad Tipo IV) parece introducir parte de la IV) parece introducir parte de la variabilidadvariabilidad

Variabilidad Tipo I, aplicar secados Variabilidad Tipo I, aplicar secados múltiples de la misma muestramúltiples de la misma muestra

Aplicación de secados por Aplicación de secados por triplicadotriplicado

Aplicación de series de referencia Aplicación de series de referencia a cada membrana en las que el a cada membrana en las que el muestreo se apliquemuestreo se aplique

En gran número de muestras, En gran número de muestras, lavar en los mismos vasos para lavar en los mismos vasos para evitar la introducción de evitar la introducción de Variabilidad Tipo IVVariabilidad Tipo IV

7. Direcciones Futuras de la 7. Direcciones Futuras de la Ecología Microbial del Ecología Microbial del

Conducto Gastro Intestinal.Conducto Gastro Intestinal.

Representa un potencial para las Representa un potencial para las aplicaciones en el estudio de la aplicaciones en el estudio de la ecología del conducto Gastrointestinalecología del conducto Gastrointestinal

Monitorea evolución de Monitorea evolución de Microorganismos y sus cambios Microorganismos y sus cambios beneficos y genótipicosbeneficos y genótipicos

Reclasificación de MicroorganismosReclasificación de Microorganismos

Trascendencia en el área de Trascendencia en el área de NutriciónNutrición

Conocer la estructura del ecosistema del Conocer la estructura del ecosistema del conducto Gastro Intestinalconducto Gastro Intestinal

Cuantificar y conocer las interacciones Cuantificar y conocer las interacciones entre las diferentes relaciones entre las diferentes relaciones microbialesmicrobiales

Manipular la estructura del ecosistema Manipular la estructura del ecosistema para eficientizar el uso de los alimentospara eficientizar el uso de los alimentos

ConclusionesConclusiones

Progresos gracias a las nuevas Progresos gracias a las nuevas herramientasherramientas

Poblaciones grandes dificiles de definirPoblaciones grandes dificiles de definir Existe muchos factores que influencianExiste muchos factores que influencian Interes de los macroecologos por los Interes de los macroecologos por los

microorganismosmicroorganismos El autor anticipa grandes beneficios El autor anticipa grandes beneficios

entre microbiologos y macroecologos.entre microbiologos y macroecologos.