EL LABORAROTIO DE BIOLOGIA MOLECULAR INTRODUCCION El desarrollo tecnolgico ha impactado directamente en el quehacer cientfico bsico, adecuando innovaciones tcnicas a la prctica mdica actual, sobre todo al considerar que las enfermedades humanassonelresultadodeunainteraccinentrelaconstitucingenticadeunindividuoyel ambiente.Partiendodeesteconcepto,laindividualidadgenticadecadapersonaresulta trascendental, no slo para las enfermedades bsicamente de origen gentico, como en los casos deenfermedadesmendelianasclsicas,sinoquetambinenenfermedadesmultifactorialescon alta frecuencia poblacional, como las enfermedades crnicas del adulto o trastornos peditricos y las enfermedades de carcter infeccioso. Estas ltimas han cobrado una gran importancia debido a sucapacidaddecontagioypropagacinatravsdegrandesdistanciasyconelpotencialde producir una pandemia. ElLaboratoriodebiologamoleculartieneporobjetivoprincipal,elofrecerunainfraestructura completa, altamente especializada, que permita conjuntar el conocimiento biomdico y el anlisis molecular,conelfindeproporcionarundiagnsticobasadoenevidencia,confiable,rpidoya gran escala, con el cual impactar en las diferentes especialidades de la medicina actual. EnellaboratoriodeBiologaMolecularlacombinacindedistintastcnicasmoleculares(PCR puntofinal,PCRentiempoReal,microarreglos,hibridacindecidonuclicos,secuenciacin), permitedesarrollaryaplicartcnicascuyoflujodetrabajoesrelativamentesimple,conunalto grado deconfiabilidad, aplicables a gran escala y deforma automatizada. Al contar con estetipo depruebasesposibleconvertiraunlaboratoriodediagnsticomolecularenunlaboratorio referencial. EstoexigedepartedeunlaboratoriodeDiagnsticoMolecular,laexperienciatantoanivelde investigacinbsica,comoelconocimientoclnicoymdico,detalformaqueseacapazde instrumentar los controles de calidad que respalden la informacin derivada de estudios gentico-moleculares,yaqueadiferenciadeotrotipodeestudiosdelaboratorionoslotienenunvalor predictivo,diagnsticoodehistorialdelasaluddeunapersona.Enformaadicional,el conocimiento del genotipo de una persona por medio de un anlisis molecular, automticamente proporciona informacin de sus familiares, con o sin su consentimiento o participacin activa. Por estasrazones,lainformacingenticadeunindividuodebersermantenidabajomxima confidencialidad. Deestaforma,unlaboratoriodedicadoaldiagnsticomolecular,noslodebedetenerla capacidaddeemitirunresultadoclnicamentetil,sinotambinsercapazdeimpactar directamente en el conocimiento cientfico que permita avanzar hacia una mejor comprensin de laenfermedad,permitiendodeestaformaunaretroalimentacinquepermitallevarloa convertirse en un centro referencial. OBJETIVOS Reconocerlosdiferentesequiposeinstrumentosutilizadosenellaboratoriodebiologa molecular, asi como su uso y cuidado Conocer y aplicar las medidas de bioseguridad dentro del laboratorio de biologa molecular ACTIVIDADES Seindicoel:nombre,usoytiposdelosdiferentesequiposymaterialesdellaboratoriode biologa molecular. NOMBRE : TERMOCICLADOR Untermociclador,tambinconocidocomomquinadePCRorecicladortrmicodePCResun aparatousadoenBiologaMolecularquepermiterealizarlosciclosdetemperaturasnecesarios paraunareaccinencadenadelapolimerasadeamplificacindeADNoparareaccionesde secuenciaconelmtododeSanger.Elmodelomscomnconsisteenunbloquederesistencia elctrica quedistribuyea travs deuna placa una temperatura homognea durante tiempos que pueden ser programables, normalmente con rangos de temperatura de 4 C a 96 C. Dado que las reaccionesincubadasenelaparatosonensolucionesacuosas,suelenincluirunaplacadetapa calentada constantemente a 103 C para evitar la condensacin de agua en las tapas de los tubos dondeocurrelareaccin,yasevitarquelossolutosseconcentren,loquemodificaralas condicionesptimasparalaenzimapolimerizanteylatermodinmicadelapareamientodelos iniciadores.Tambinexistenotrastecnologasmenospopularesutilizandodistribucindeaire caliente en tubos suspendidos, logrando el mismo objetivo de transferir calor eficientemente a la reaccin para que cambien los ciclos de temperaturas Desdehacealgunosaosvariascompaasquefabricanycomercializanestosaparatoshan cambiadolaresistenciaelctricaporlatecnologaPeltieraprovechandolaspropiedadesdelos semiconductores.Estematerialofrecemejoruniformidadenlatemperaturayrampasde incrementoydecrementodelatemperaturamuchomspronunciadas,obteniendomejores resultadosenlosprocesosdelPCR.Enlabsquedademejorarlaprecisin,exactitudy homogeneidad de la temperatura tambin se han introducido metales como el oro, la plata y otras aleaciones en los bloques de los pozos, logrando estabilidad y reproducibilidad en los ensayos. NOMBRE : TERMOCICLADOR A GRADIENTE Hoyda,sehaimplementadoenloslaboratoriosunTermocicladorenGradiente.LaPCRde gradienteesactualmenteelmtodoqueseutilizaparaseleccionarlascondicionestrmicas ptimas de la reaccin. Un gradiente de temperaturas programado libremente hasta 20C no slo permiteoptimizarlatemperaturaderenaturalizacin,sinotambintodoslospasosde temperatura de un protocolo de la PCR en las aplicaciones ms complejas. Gracias a la tecnologa dependienteconstante,siempreseutilizanndicesdecalentamientoyrefrigeracinconstantes, de forma que los resultados del experimento gradiente se pueden realizar con sencillez y precisin en aplicaciones rutinarias. En la bsqueda de mejorar la precisin, exactitud y homogeneidad de la temperaturatambinsehanintroducidometalescomoeloro,laplatayotrasaleacionesenlos bloques de los pozos, logrando estabilidad y reproducibilidad en los ensayos. NOMBRE : MICROPIPETAS Lamicropipetaesuninstrumentodelaboratorioempleadoparasuccionarytransferirpequeos volmenes de lquidos y permitir su manejo en las distintas tcnicas analticas. Losvolmenescaptablesporestosinstrumentosvaransegnelmodelo:losmshabituales, denominados p20, p200 y p1000, admiten un mximo de 20, 200 y 1000 l, respectivamente. Es de destacar que el uso de micropipetas permite emplear distintos lquidos sin tener que lavar el aparato:paraello,seempleanpuntasdesechables,deplstico,quehabitualmenteson estriles. Existen varios tipos de puntas: por ejemplo, las amarillas para pipetear volmenes pequeos (por ejemplo, 10 l), y las azules para pipetear volmenes grandes (por ejemplo, 800 l). NOMBRE : CAMARA DE ELECTROFORESIS Laelectroforesisesunmtodobsicoenelcampodelabiologamolecularparaelanlisis( Separacin, purificacin, preparacin) de los cidos nucleicos y protenas. As como el microscopio permite visualizar microorganismos y estructuras similares, la electroforesis nos ayuda a observar loscidosnucleicosyprotenas.Elprincipiodelaelectroforesisconsisteenlamigracindelas molculas a travs de un gel u otro tipo de matriz de naturaleza porosa, en el cual, por accin de uncampoelctrico,sernseparadasdeacuerdoasutamaoopesomolecular,enla electroforesis horizontal generalmente se trabaja con ADN o ARN. NOMBRE : CAMARA DE ELECTROFORESIS DEL TIPO VERTICAL USO:Enlaelectroforesisdetipovertical,seanalizantantomolculasdeADNcomoprotenas, mientras que en la electroforesis horizontal generalmente se trabaja con ADN o ARN. NOMBRE : FUENTE DE PODER Lafuentedepoder,porlotanto,puededescribirsecomounafuentedetipoelctricoquelogra transmitir corriente elctrica por la generacin de una diferencia de potencial entre sus bornes. Se desarrollaenbaseaunafuenteideal,unconceptocontempladoporlateoradecircuitosque permite describir y entender el comportamiento de las piezas electrnicas y los circuitos reales. NOMBRE : TRANSILUMINADOR PrcticotransiluminadorquelepermitirlavisualizacindelasbandasdeDNAengelesde agarosa teidos con bromuro de etidio. Equipado con 8 tubos fluorescentes de 312 nm (UV-B) y un ampliofiltroUV.Sobresubase,disponedeunacampanadeobservacinquehacedecmara oscuraofreciendoproteccinfrentealosrayosUVyeliminandointerferenciasyaumentandoel contraste. Dicha campana de observacin est equipada con una puerta frontal para manipular el gelcmodamenteyunaampliaventanadeobservacinquereducelafatigaocular.Adems, dispone tambin de lmparas de luz blanca para iluminacin del recinto interior. Eltransiluminadorpresentalaposibilidaddeacoplarcmarasdigitalesconlosadaptadores adecuados(noincluidosenelequipo)parafotografiarydocumentarlosgelesylautilizacinde lmparas de otras longitudes de onda como 245 nm (UV-C) y 365 nm (UV-A). NOMBRE : CABINA DE BIOSEGURIDAD ascabinasdebioseguridad(CBS),comnmenteconocidascomocabinasdeseguridadbiolgica, son equipos proyectados para ofrecer proteccin al usuario y al ambiente de los riesgos asociados almanejodematerialinfecciosoyotrosmaterialesbiolgicospeligrosos,excluyendomateriales radiactivos,txicosycorrosivos,mejorandolascondicionesgeneralesbajolascualesserealizan una gran variedad de actividades en los laboratorios clnicos y de investigacin en el rea de salud pblica. Estosequiposgarantizanlaexistenciadeambientescontrolados,indispensablespararealizar actividadesqueporsuscaractersticasresultanpotencialmentepeligrosasparalasaluddel hombre y del ambiente. Existen tres Clases de CBS: Clase I, Clase II, Clase IIILas CBS Clase II, se clasifican en 4 tipos A1, A2, B1, B2. NOMBRE : MICROCENTRIFUGA Microcentrfugaesunamquinacentrfugaespecializadautilizadaenellaboratorioclnico.sta pone en rotacin una muestra ms pequea para separar por fuerza rotatoria sus componentes o fases (generalmente una slida y una lquida), en funcin de su densidad. Esta es de uso para los tubos capilares. El tubo capilar consiste en un tubo de plstico transparente cerrado por su extremo inferior con un tapn. Perpendicularmente al tubo de plstico y en su parte inferior, se perfora y se introduce un tubo de vidrio de pequeo dimetro, que hace de capilar a travs del cual se descarga la columna de fluido viscoso. Una regla colocada en su parte exterior o marcas sobre el tubopermiten medir la altura de la columna de fluido en funcin de tiempo. NOMBRE : SHAKER Esundispositivoqueseutilizaenloslaboratoriosdequmicaybiologaparamezclarlquidoso preparar disoluciones y suspensiones Unagitadortpicotieneunaplacaosuperficiequeoscilahorizontalmente,propulsadoporun motor elctrico. Los lquidos que van a ser agitados estn contenidos en vasos, .l.tubos o matraces Erlenmeyer que se colocan sobre la superficie vibrante o, a veces, en tubos de ensayo o viales que se insertan en los agujeros de la placa. NOMBRE : VORTEX es un dispositivo simple que se usa comnmente en los laboratorios para agitar pequeos tubos o frascosdelquido.Secomponedeunmotorelctricoconelejedetransmisinorientado verticalmenteyunidoauntrozodegomaocauchomontadoenformadecopa,ligeramente excntrico. A medida que el motor gira la pieza decaucho oscila rpidamente en un movimiento circular. Cuando un tubo de ensayo o recipiente adecuado se coloca en el soporte de goma (o toca su borde) el movimiento se transmite al lquido en su interior y se crea un vrtice. La mayora de losmezcladoresdevrticetienenunaconfiguracindevelocidadvariableypuedenser configurado para ejecutarse de forma continua, o para que funcione slo cuando una dbil presin se aplica a la goma. Poseen unos pies de ventosa en la base para evitar desplazamientos. Los agitadores tipo vortex son bastante comunes en los laboratorios de ciencias biolgicas. En los laboratorios de cultivos celulares y de microbiologa se pueden utilizar para suspender las clulas. En un laboratorio de bioqumica o de anlisis puede ser utilizado para mezclar los reactivos de un ensayo o para mezclar una muestra experimental y un diluyente. NOMBRE : TICKS/RACK Las puntas micro cortas tienen un rango de 0.2-10ul - Las puntas micro con punta extendida son ideales para obtencin total de la muestra del fondo de los microtubos - Las puntas serie 1-4032 son ideales para usarse con las pipetas Eppendorf por su compatibilidad exacta. - Las puntas serie 1-4034 estn graduadas y pueden usarse con pipetas multicanal por su diseo exacto y ajuste preciso. - Disponibles en bolsa, gradillas no estril y gradillas estril NOMBRE : TUBO EPENTOF Untubodemicrocentrfuga(comnmenteapodados"eppendorf",enreferenciaalmayor manufacturadordeestostubos,lacasaEppendorf)esunpequeocontenedorcilndricode plstico,conunfondocnicoytpicamenteunatapaunidaalcuerpodeltuboparaevitarsu desprendimiento.Sonempleadosprofusamenteen biologamolecularybioqumicanoslopara lacentrifugacin,sinoque,dadosubajocosto,seempleanamenudocomosimplesviales contenedores de sustancias qumicas. Los tubos estn fabricados de polipropileno,1 y pueden emplearse a temperaturas muy bajas (-20 C) o con disolventes orgnicos como el cloroformo. Su tamao oscila entre los 200 L y los 2 mL. Lacapacidadmscomnmenteusadaesde1,5mL,siendoporotrapartelosde200llosms empleadosparaPCR.Ladesinfeccindelostubosesposible(1atm,120C,20minutos),pero dadosubajocostoyladificultaddelimpiezadelasuperficiedeplstico,lostubosde microcentrfuga son usualmente desechados despus de su uso. CUESTIONARIO 1.- Mencione cuales son las soluciones mas importantes en un laboratorio de biologa molecular>> Solucion molar y normal IPTG es un inductor de actividad -galactosidasa en E. coli. Se usa comunmente con X-Gal para deteccin de expresin de lac en aplicaciones de clonacin permitiendo deteccin de moleculas recominantes. X-Gal es usado como indicador para expresar -galactosidasa codificada en el lacZ operon lac. El cloroformo es un componente primario en la extraccin de cidos nucleicos para eliminar completamente el fenol en muestras acuosas. El fenol slido en forma cristalina se usa para purificacin de cidos nucleicos. El fenol/cloroformo en solucin se ofrece con un pH de 6.5-6.9 para purificacin de DNA a una proporcin de 1:1. El fenol saturado se ofrece con un pH de 6.6 +/-0.1 para uso en purificacin de DNA. Incluye un buffer para aplicaciones que requieren un pH de 8.0. El fenol saturado con pH 4.3 +/-0.2 es para uso en purifaciones de RNA. La proteinasa K es una enzima estable (>50mg/ml) y altamente activa purificada de album del hongo Engyodontium. La guanidina HCL es un degradante ionico que desnaturaliza la mayoria de las proteinas. Tambin se usa en el asilamiento de RNA. El Tiocianato de guanidinio se usa en el aislamiento de RNA. La formamida se usa como desnaturalizador en aplicaciones de electroforesis e hibridacin. Degrada el DNA y el RNA para separar las bandas de doble hlice El cloruro de cesio de grado ptico sirve para purificacin de DNA por centrifugacin de densidad de gradiente. El glicerol se usa para prevenir congelacion durante la preparacin de enzimas y bacterias. 2.- Enumere 4 equipos o instrumentos den utilidad en el laboratorio de biologa molecular que no estn mencionados anterior -Fraccionamiento Offgel -Microarrays -Nanodrop -PCR Termocicladores tiempo final Termocicladores tiempo real -Bioanalizador 3.- Indique 5 normas de bioseguridad que se deben seguir en el laboratorio de biologa molecular Es recomendable almacenar los reactivos especficos (enzimas, primeros, nucletidos) en un congelador propio para evitar contaminacinSeparar zonas de trabajo para evitar contaminaciones cruzadas y degradacin de las muestras: de preparacin de material, de extraccin de cidos nucleicos Usar bata distinta a la de uso general y guantesespeciales con cambios frecuentes. Usar guantes especiales para manipulacin de ciertas sustancias nocivas Modificaciones fsicas de estaciones de trabajo 4.- Proponga que normas de bioseguridad seben seguir cuando se manipula material gentico humano, virus y bacterias. No usar maquillaje en el area de trabajo No ingerir alimentos Utilizar ropa adecuada ( pantaln zapatos cerrados) Sujetarse el cabello y usar gorro de preferencia Manipular de forma cuidadosa los qumicos de zona roja CONCLUCIONES Sepuedeconcluirqueseaprendidemaneraeficazlosdistintosequiposusadoseneste laboratorioysuutilidadydiferenciacinademsdereconocerquelasnormasdebioseguridad deben ser seguidas para evitar accidentes.