FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

TEMA: MEDIOS DE CULTIVO

CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES

RAFAEL CAMPOS HENRY

EL MEDIO DE CULTIVO

• HISTORIA:• El desarrollo histórico de la formulación medio de cultivo se

inicia con la definición de la solución nutritiva de Knop.

• 1902: Medio de cultivo de Haberlandt.

• 1934: Medio de cultivo de Gauttheret.

• 1943: Medio de cultivo de White.

• Década de los 50: define la relación de los minerales usados en

los cultivos actuales.

• 1962: se formulan el medio de cultivo MS (Murashige & Skoog)

• 1968: se formulan el medio de cultivo B5 (Gamborg et al).

Componentes del medio de cultivo

1. COMPONENTES INORGÁNICOS:

Agua Sales minerales (macronutrientes y

micronutrientes)

2. COMPONENTES ORGÁNICOS:

Vitaminas Carbohidratos Aditivos orgánicos complejos Aminoácidos. Reguladores de crecimiento Agar

COMPONENTES INORGÁNICOS

AGUA

Mayor componente utilizado. Es necesario su destilación,

deionización o desmineralización. Las impurezas son inhibidores de los

cultivos. Su adecuada purificación se alcanza

utilizando filtros de carbón activado, columnas de intercambio iónico y filtros de acetato de celulosa del tipo Milli - Q

SALES MINERALES: El medio basalMACRONUTRIENTES O MACROELEMENTOS:El medio basal debe incluir macronutrientes C, H, O, P, K, N, S, Ca y Mg.Su incorporación esta en una concentración mayor a 30 ppm (mg/l)

NITRÓGENO

• Macronutriente que mas influye en el crecimiento y desarrollo de los cultivos in vitro

Absorbido en sus dos mayores formas iónicas: catión(NH4 +) y anión (NO3

- y NO2-)

Cuando el N es asociado en forma de sales inorgánicas de amonio las células muestran síntomas de toxicidad pero al asociarse al N en forma de nitrato se estimula el crecimiento celular.

El N en forma de nitrito provoca síntomas de toxicidad a partir de 1.1 mM y resulta completamente inhibitorio a partir de 10.8 mM.

En pocos casos otras fuentes de N como urea, caseína hidrolizada, glutamina, alanina y acido amino butírico puede reemplazar a al nitrato o amonio.

Fósforo

Segundo macronutriente en importancia Absorbido primariamente como anión fosfato monovalente

(H2PO4-) y menos rápidamente como anión fosfato divalente (H2PO42-)

En el medio basal es incorporado como fosfato de potasio monobásico (KH2PO4) 1.25 mM

El P es una parte esencial de azucares fosfatados que participan en la fotosíntesis, respiración, y otros procesos metabólicos; también es parte de ARN y ADN y fosfolípidos presentes en las membranas.

Juega un rol importante en el metabolismo de la energía ya que esta presente en ATP, ADP, AMP y Ppi

Su deficiencia en el medio puede ser rápida debido a su rápida absorción e interacción con otros componentes como Fe, K, y sacarosa .

Su absorción es influencia por la presencia de otros minerales.

Potasio

Es incorporado como ion acompañante de nitratos, fosfatos y en algunos casos cloruros.

En el medio basal el K+ es suministrado a una concentración de 20mM

Activador de muchas enzimas esenciales para la fotosíntesis y la respiración y activación de enzimas para formar almidones y proteínas.

Contribuye a establecer el potencial osmótico y su presión de turgor.

Azufre

Es absorbido como ion sulfato divalente (SO42-), acompañante del macronutriente Mg y de los micronutrientes Zn y Mn.

Su importancia radica en la constitución de proteínas , específicamente de aa cisteína y metionina, las vitaminas tiamina y biotina, así como la coenzima A

Esencial para la respiración y la síntesis y ruptura de ácidos grasos

Magnesio

Es absorbido como ion divalente (Mg 2+) y adicionado en forma de sulfato de magnesio

Se ha establecido una relación antagónica con el Ca : Ca 0.5 a 1.2 mM - Mg 1.5 mM o Ca 2.1 mM - Mg 3 mM

Importante por su presencia en la clorofila y en las rutas metabólicas que utiliza ATP como factor de traslación.

Cofactor y activador de muchas enzimas en la fotosíntesis, respiración y formación de ADN y ARN.

Calcio

Es absorbido como ion divalente (Ca 2+) En el medio basal MS es incorporado en forma de

cloruro a 3.0mM Como su transporte por el xilema depende de la

transpiración de la planta las condiciones de alta humedad en el aire del cultivo in vitro puede producir su deficiencia en los ápices de los brotes provocando necrosis apical.

Esencial para el normal funcionamiento de las membranas en todas las células

Formación de la pared celular Actualmente se conoce que en el citosol el calcio

establece una relación de reversibilidad con la calmodulina que activa diversas enzimas

Fierro

Único elemento mineral esencial que no es absorbido como ion libre en el medio de cultivo.

Ocupa la posición media entre los micro y macronutrientes

Usualmente es incorporado en la forma de quelato de fierro con etileno diamino tetracetico (EDTA) o el sequestrone.

Es esencial porque forma parte de ciertas enzimas y muchas proteínas que llevan electrones durante la fotosíntesis y respiración.

La carencia de Fe resulta un incremento del contenido de ADN y a.a libres y reducción de ARN .

Micronutrientes o microelementos:Los micronutrientes que deben incorporarse al medio basal son B, Zn, Mn, Cu, Mo, Co, Cl, I y recientemente se ha destacado el rol del Ni.Su incorporación esta en una concentración menor a 30 ppm (mg/l)

Manganeso

Absorbido ampliamente como Mn 2+ Juega un rol estructural en el sistema de membranas

del cloroplasto su ausencia causa desorganización de los tilacoides y aun cuando es escaso su efecto en la estructura del núcleo y mitocondria

El ion Mn 2+ activa numerosa enzimas pero también inhibe el metabolismo nitrogenado

Es cofactor de AIA – oxidasa.

Molibdeno

Es incorporado como sales de molibdato (MoO4 2 +)

su mejor función es ser parte de la enzima nitrato reductasa, reduce iones nitrato a iones nitrito.

Juega un rol importante en la ruptura de las purinas como adenina y guanina por su esencialidad en la enzima xantina dehidrogenasa.

Parte esencial de una oxidasa que convierte el acido abscisico aldehído en abscisico (ABA)

Cobalto

Incorporado como sal de cloruro en el medio basal MS

No parece ser necesario cuando el medio tiene N en forma de nitrato y amonio

No es inhibitorio usado a altas concentraciones (0.4mM)

Es cofactor de la vitamina B12 y de la DAHP sintasa del citoplasma

Iodo

Incorporado en el medio basal MS como KI Función poco conocida Acción estimulatoria en el crecimiento de

explantes in vitro

Boro Es casi totalmente absorbido en forma de H3BO3 Su deficiencia provoca fracaso en la elongación

normal del ápice radicular y la inhibición de la síntesis de ADN y ARN

Esencial en la funcionalidad, integridad y permeabilidad de las membranas; influye en la absorción del fosforo y la glucosa.

Estimula la actividad de la AIA - oxidasa

Cloro

Es absorbido como ion cloruro Cl- En el medio basal MS es incorporado como

sales de Cloruro de calcio y cloruro de cobalto. Funciones importantes como estimular la

oxidación del agua durante la fotosíntesis así como la división celular en las hojas y raíces y un importante soluto osmóticamente activo

Tanto el Cl como el Na se incorporan en el medio basal durante el ajuste del pH en forma de HCl o NaOH

Zinc

Es absorbido como ion divalente Zn 2+ En el medio basal MS ingresa como sal de

sulfato. Es importante porque participa en la formación

de la clorofila o previene su destrucción Requerido en la producción de acido

indolacetico y esta estrechamente ligado a muchas enzimas celulares actuando como cofactor de la péptidasa

Cobre

Es absorbido como ion cúprico divalente Cu 2+ o como ion cuproso monovalente Cu+

Es incorporado como sal de sulfato Esta presente en diversas enzimas o

proteínas que participan en el proceso de oxidación y reducción ejemplo la citocromo oxidasa y la plastocianina

Níquel

No es considerado en la composición del medio basal

Esencial para las plantas específicamente formando parte de la enzima ureasa que por hidrolisis catalítica de la urea la desdobla en CO2 y NH4 + .

COMPONENTES ORGÁNICOS

Carbohidratos

generalmente los medios no tienen condiciones optimas de iluminación, concentración de CO2, y tenores de clorofila, es por esto que se les debe adicionar azucares como fuente exógena de energía metabólica y esqueletos carbónicos, que brindaran el crecimiento de las células.

sacarosa.- el más usado en concentraciones de 3%, a veces es posible usarlo en concentraciones altas de 12-18%

Glucosa.- no es tan eficaz como la anterior pero a mostrado éxito en propagación y embriogénesis somática del algodón.

Azucares reductores (hexosas).- como celobiosa, maltosa y rafinosa en determinados cultivos son mejores que la sacarosa.

Otros compuestos orgánicos, como ácidos orgánicos y alcoholes no son exitosos cuando se usan como fuentes de carbono, aquí están por ejemplo el manitol y el sorbitol.Cultivos fotomixotróficos pueden satisfacer sus necesidades de carbón tanto por suplementos de carbohidratos como de CO2, hay suspensiones celulares que podemos mencionar como: Datura inoxia, Glycine max, Nicotiana tabacum.

Vitaminas

Es necesario la incorporación de vitaminas a medios para que los explantes crezcan y se vuelvan verdes.Las usadas con mas frecuencia y conocidas son: tiamina, ácido nicotínico, y piridoxina.Tiamina.- en forma de tiamina-pirofosfato es un factor esencial en la reacción de respiración aeróbica, fotosíntesis y biosíntesis de algunos aminoácidos terpenoides.Piridoxina.- actúa en la biosíntesis de aminoácidos durante la foto respiración. Ácido nicotínico.- biosíntesis de alcaloides

Mio-inositol

Generalmente esta agrupado en el grupo de las vitaminas, es un compuesto de hexitol o compuesto cíclico. Ha sido utilizado como componente obligado en todo medio y a una concentración alta.Estimulador en el crecimiento de callos y la formación de brotes .Es también incorporadas a moléculas de fosfolípidos que constituyen la membrana plasmática y otras membranas celulares. Actúa en la conjugación de las auxinas.

Aminoácidos individuales

Caseína hidrolizada

Extracto de levadura

AMINOACIDOS

Sustancias complejas y otros aditivos orgánicos

Hay muchas sustancias en el uso de los cultivos de tejidos que forman parte de los medios entre ellas tenemos:• Agua de coco.- su primera utilización fue en

embriones de zanahorias desde ahí se usa en numerosas especies y estimulando a diferentes sistemas, estimula el crecimiento de los callos de tabaco, división de granos de polen en Brassica.

• Es una sustancia compleja constituida por una amplia variedad de componentes orgánicos e inorgánicos.