Enzimas de restricción

Equipo: 5Alvarez Herrera Priscila SamanthaCarranza Trinidad RodrigoGuerrero Velázquez VanessaHuanosta Murillo Luis Enrique

Endonucleasas o enzimas de restricción?•Los científicos descubrieron enzimas de

restricción (endonucleasas) en bacterias en los años setenta.

•Comprobaron que estas enzimas cortaban el ADN viral en fragmentos pequeños y no funcionales, con lo que protegían a la bacteria de un virus invasor.

•De allí el nombre de enzimas de restricción.

•No todas las endonucleasas son enzimas de restricción

¿Qué son las enzimas de restricción?

• Enzimas bacterianas que:

A) reconocen secuencias específicas de 4 a 8 pares de bases, denominadas sitios de restricción o secuencia de reconocimiento.

B) Escinden o rompen ambas hebras de DNA en ese sitio.

Funciones

•Proteger a la célula de la invasión de DNA extraño. (Principal)

•Para evitar que su DNA sea también cortado, las bacterias modifican su DNA: generalmente lo metilan.

•Así en la célula se tienen tres tipos distintos de endonucleasas:

Tipo I, Tipo II y Tipo III.

Tipo I y tipo III

•Reconocen secuencias palindrómicas •Tienen actividad de restricción (cortan) y

modificación (metilan).•No cortan justo donde reconocen sino a

cierta distancia:Tipo I cortan lejos de la secuencia de

reconocimiento, ya sea río arriba o río abajo. 

Tipo III cortan de 5-8 bases antes o después de la secuencia que reconocen.

Tipo II o enzimas de restricción

•Reconocen secuencias palindrómicas.

•Cortan al DNA en el interior de las secuencias de reconocimiento.

•No metilan

•Se obtiene corte en la doble cadena en la región del palíndrome.▫Extremos cohesivos o pegajosos (clonación

molecular)▫Extremos romos

Qué tipo de corte hacen las enzimas de restricción?

Extremos cohesivos para clonación

•Las enzimas de tipo II son las que se utilizan en biología molecular porque:

▫Cortan directo la secuencia de inserción▫No modifican la secuencia blanco.

Factores que afectan la reacción de restricción

•Contaminantes como otras proteínas, fenol, cloroformo, etanol, EDTA, SDS y una alta concentración de sales.

•Contaminantes cargados negativamente. •Superenrollamiento de plásmidos.

Análisis de restricción del DNA

• Un segmento de DNA puede ser cortado por varias enzimas de restricción.

• Mapa de restricción▫ Diagrama

donde se muestran sitios de corte de enzimas de restricción.

Análisis de restricción del DNA

•Se utilizan para:

▫Clonación molecular▫Estudios para clasificación de

microorganismos.▫Obtención de patrones de RFLP.▫Identificación en evidencias forenses

¿Y la práctica?

Vector recombinante y enzimas disponibles en el laboratorio

• Dos enzimas de restricción en una mezcla, cortan formando extremos cohesivos▫ BamHI▫ Ndel

• Vector recombinante presenta sitios de restricción. Solo uno para NdeI y solo uno para BamHI

Ensayo de restricción

Enzima de restricción

E1 E2

1 uL NdeI + +

1 uL BamHI +

Continúa..

Incubar a 37°C por 1.5 h.

Añadir 0,5 μl de RNasa (1 μg/ml)

Incubar 30 min a 37°C.

Guardar muestra a -20°C