ESTUDIO DE LA COMPOSICIÓN QU˝MICA Y ACTIVIDAD ...

ESTUDIO DE LA COMPOSICIÓN QUÍMICA Y ACTIVIDAD

ANTIBACTERIANA DEL ACEITE ESENCIAL DE LA ESPECIE Chromolaena

meridensis(B.L. Rob.) R.M. King&H. Rob., sinonimia: Eupatorium

meridenseRobinson.

(ASTERACEAE).

ESTUDIO DE LA COMPOSICIÓN QUÍMICA Y ACTIVIDAD

ANTIBACTERIANA DEL ACEITE ESENCIAL DE LA ESPECIE

Chromolaena meridensis (B.L. Rob.) R.M. King & H. Rob., sinonimia:

Eupatorium meridense Robinson.

(ASTERACEAE).

BACHILLERES:NOVOA P. YOMAIRA.GUÉDEZ C. MARY A.

TUTORA: DIOLIMAR BUITRAGO.

MÉRIDA, JULIO DEL 2012.

UNIVERSIDAD DE LOS ANDESFACULTAD DE FARMACIA Y BIOANÁLISIS

ESCUELA DE BIOANÁLISISINSTITUTO DE INVESTIGACIONES

Estudio de la Composición Química y Actividad Antibacteriana del Aceite Esencial de la EspecieChromolaena meridensis.

i

AGRADECIMIENTOS.

En primer lugar el agradecimiento más grande a Dios poracompañarnos todos los días durante este largo trayecto de nuestrasvidas, por haber consolado nuestros corazones cuando tuvimos que

pasar situaciones difíciles, ahora gracias a él culminamos un escalónmás en nuestras vidas para empezar uno nuevo.

A nuestros padres trabajadores incansables, gracias por el apoyo tangrande que desde niñas nos brindaron, hoy logramos cumplir conéxito uno de nuestros propósitos más grandes, por sus consejos tan

valiosos que definitivamente nos han conducido por el caminocorrecto, por habernos animado constantemente a seguir adelante. A

ustedes dedicamos estas palabras y todos los éxitos que podamosalcanzar. Los amamos.

A la profesora Diolimar Buitrago en calidad de Directora de tesis ya la profesora María Eugenia Lucena por compartirnos sus

experiencias y conocimientos, y sobre todo por haber confiado ennosotras para llevar a cabo la realización de este proyecto. MIL

GRACIAS. A todo el personal del Instituto de Investigaciones de laFacultad de Farmacia y Bioanálisis por habernos dado la

oportunidad y brindaros todos los medios para realizar nuestroproyecto de Grado.

A la Ilustre Universidad de los Andes, por abrirnos sus puertas ypermitirnos formar parte de esta gran casa de estudio.


ii

DEDICATORIA.

Nuestro Proyecto de Grado la dedicamos con todonuestro amor a Dios por estar a nuestro lado siempre,por darnos valor y brindarnos la fortaleza que tanto

necesitamos y por habernos regalado una familia tanmaravillosa.

A nuestros padres que nos dieron la oportunidad deformarnos como profesionales, por el inmenso apoyo que

nos dieron, por haber confiado en nosotras porquesiempre me dieron aliento para seguir luchando.


iii

RESUMEN

En el presente trabajo se determinó los componentes químicos del aceite esencial

de Chromolaena meridensis (B.L. Rob.) R.M. King & H. Rob. y se evaluó la

actividad antibacteriana del aceite esencial extraído de las partes aéreas frescas

contra cepas de referencia grampositivas: Staphylococcus aureus ATCC 25923 y

Enterococcus faecalis ATCC29212; y gramnegativas: Escherichia coli ATCC

25922, Pseudomona aeruginosa ATCC27853 y Klebsiella pneumoniae ATCC

23357. El aceite se obtuvo por el método de hidrodestilación empleando la trampa

de Clevenger con un rendimiento de 0,063 %. Su composición química se

determinó por Cromatografía de Gases Acoplada a Espectrometría de Masas,

identificándose 11 compuestos que corresponden en su mayoría a sesquiterpenos

monociclicos que constituyen el 97,75% del total de compuestos, seguido de

monoterpenos con un 0,28%, aldehído 0,54% y alqueno 0,87%. Los componentes

mayoritarios resultaron ser los sesquiterpenos: α – zingibereno (65,26%), α –

curcumeno (13,74%), α - humuleno (8,20), β – sesquifelandreno (4,06%) y β -

cariofileno (2,93%). La actividad antibacteriana se realizó por el Método de

Difusión en Agar con Discos y se determinó la Concentración Inhibitoria Mínima

(CIM), el aceite esencial fue activo contra las cepas de Staphylococcus

aureusATCC 25923, Streptococcus faecalisATCC 29212 y Klebsiella

pneumoniaeATCC 23357, con halos que oscilan entre 6 a 11 mm de diámetro y

una Concentración Inhibitoria Mínima de 10 μg/mL.


iv

ÍNDICE DE CONTENIDO Pág

I. INTRODUCCIÓN……………………………………………………….………. 1

II. ANTECEDENTES……………………………………………………….…….. 5

A. Antecedentes del género……………………………………………….……. 5

A.1. Descripción del género Chromolaena……………………………….…….. 10

A.1.1. Descripción de la especie Chromolaena meridensis (B. L. Rob.)R.M. King & H. Rob., sinonimia: Eupatorium meridense Robinson………… 11

A.1.2. Distribución de la especie Chromolaena meridensis (B. L. Rob.)R.M. King & H. Rob., en Venezuela…………………………………………… 12

A.2. Química del género Chromolaena……………………………………….... 12

A.3. Usos del género Chromolaena…………………………………………..… 20

A.4. Actividad biológica………………………………………………...………… 21

A.4.1. Actividad antibacteriana de especies del género Chromolaena…….. 21

A.4.2. Otras actividades biológicas…………………………………………….. 22

III. MARCO TEÓRICO................................................................................... 23

A. Aceites esenciales…………………………………………………………...… 23

A.1. Definición…………………………………………………………………..… 23

A.2. Distribución y localización………………………………………………….. 23

A.3. Propiedades físicas................................................................................ 24

A.4. Composición........................................................................................... 24

A.4.1. Terpenoides......................................................................................... 25

A.4.1.1. Monoterpenos................................................................................... 25

A.4.1.2. Sesquiterpenos................................................................................. 26

A.4.1.3. Biosíntesis de terpenos.................................................................... 26


v

A.5. Propiedades farmacológicas de los aceites esenciales......................... 28

Poder antiséptico...................................................................................... 28

Propiedades espasmolíticas y sedantes.................................................. 28

Propiedades irritantes............................................................................... 28

A.6. Algunos usos de los Aceites esenciales................................................. 29

A.7. Procedimientos de obtención de los aceites esenciales........................ 30

A.7.1. Por arrastre en vapor de agua............................................................. 30

A.7.2. Por expresión...................................................................................... 31

A.7.3. Por extracción con solventes orgánicos.............................................. 31

A.8. Métodos de análisis de los aceites esenciales....................................... 32

A.8.1. Cromatografía de Gases Acoplada a Espectrometría de Masas(CG/EM)......................................................................................................... 32

B. Determinación de la actividad antibacteriana de los aceites esenciales... 35

B.1. Bacteria.................................................................................................. 35

B.1.1. Bacterias grampositivas...................................................................... 37

a. Staphylococcus aureus.............................................................................. 37

b. Streptococcus faecalis (Enterococos)....................................................... 37

B.1.2. Bacterias gramnegativas..................................................................... 38

a. Escherichia coli.......................................................................................... 38

b. Pseudomona aeruginosa........................................................................... 39

c. Klebsiella pneumoniae............................................................................... 39

B.2. Antibiótico............................................................................................... 40

B.3. Métodos para evaluar la actividad antimicrobiana de aceitesesenciales...................................................................................................... 43


vi

B.3.1. Método de Difusión en Agar................................................................ 44

B.3.1.1. Método de Kirby-Bauer..................................................................... 45

B.3.2. Método de dilución.............................................................................. 46

B.3.2.1. Concentración inhibitoria mínima (CIM)........................................... 47

IV. PROBLEMA.............................................................................................. 48

V. HIPÓTESIS............................................................................................... 49

VI. OBJETIVOS............................................................................................. 50

A. Objetivo general........................................................................................ 50

A.1. Objetivos específicos.............................................................................. 50

VII. MATERIALES Y MÉTODOS................................................................... 51

A. Material vegetal......................................................................................... 51

A.1. Recolección e identificación del material vegetal……………………….. 51

A.2. Clasificación taxonómica........................................................................ 52

B. Obtención y análisis del aceite esencial de Chromolaena meridensis (B.L. Rob.) R.M. King & H. Rob.......................................................................... 52

B.1. Obtención del aceite por el Método de Hidrodestilación........................ 52

B.2. Cromatografía de Gases (CG)............................................................... 53

B.2.1. Cromatografía de Gases acoplada a Espectrometría de Masas (CG-EM)................................................................................................................ 55

C. Evaluación de la actividad antibacteriana................................................. 56

C.1. Preparación de los inoculos bacterianos................................................ 56

C.2. Preparación de las placas de Petri Agar Müeller-Hinton....................... 56

C.3. Impregnación de los discos.................................................................... 58

C.4. Incubación.............................................................................................. 61


vii

C.5. Lectura de la prueba.............................................................................. 61

C.6. Concentración inhibitoria mínima (CIM)................................................. 61

D. Diseño Experimental................................................................................. 63

VIII. RESULTADOS Y DISCUSIÓN............................................................... 65

IX. CONCLUSIONES..................................................................................... 75

ANEXOS........................................................................................................ 76

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS.............................................................. 83


viii

ÍNDICE DE FIGURAS Pág

FIGURA 1: UNIDAD DE ISOPRENO......................................................... 26

FIGURA 2: BIOSÍNTESIS DE MONOTERPENOS YSESQUITERPENOS................................................................ 27

FIGURA 3: DIAGRAMA DE UN CROMATÓGRAFO DE GASES.............. 34FIGURA 4: TIPOS DE ANTIÓBIÓTICOS Y SUS BLANCOS DE ACCIÓN 42

FIGURA 5: LOCALIZACIÓN GEOGRÁFICA DEL LUGAR DERECOLECCIÓN DE LA ESPECIE Chromolaena meridensis.. 51

FIGURA 6: Chromolaena meridensis......................................................... 52

FIGURA 7:DESARROLLO DEL PROCESO DE OBTENCIÓNDELACEITE ESENCIAL DE LA ESPECIEChromolaenameridensis................................................................................ 54

FIGURA 8:CROMATÓGRAFO DE GASES ACOPLADO A UNESPECTROMETRO DE MASAS MARCA HEWLETTPACKARD 5973....................................................................... 55

FIGURA 9: PREPARACIÓN Y ESTERILIZACIÓN DEL MEDIOMÜELLER - HINTON............................................................... 57

FIGURA 10: ESTERILIZACIÓN DE LOS DISCOS DE PAPEL DEFILTRO 59FIGURA 11: IMPREGNACIÓN DE LOS DISCO DE PAPEL DE FILTRO.... 59

FIGURA 12:REPRESENTACIÓN GRÁFICA DE LA UBICACIÓN DELOSDISCOSIMPREGNADOS.......................................................

60

FIGURA 13:CROMATÓGRAMA DEL ACEITE ESENCIAL DE LASPARTESAÉREAS DE LA ESPECIE Chromolaenameridensis................................................................................ 67

FIGURA 14:ESTRUCTURAS QUÍMICAS DE LOS COMPONENTESMAYORITARIOS DEL ACEITE ESENCIAL DE Chromolaenameridensis................................................................................ 69


ix

INDICE DE TABLAS Pág

TABLA I: TRIBUS DE LA FAMILIA ASTERACEAE............................... 7

TABLA II: LISTADO DE LOS GÉNEROS QUE INTEGRAN LA TRIBUEUPATORIEAE....................................................................... 8

TABLA III: ESPECIES DEL GÉNERO Chromolaena............................... 9

TABLA IV: COMPOSICIÓN QUÍMICA DE ALGUNAS ESPECIES DELGÉNERO Chromolaena.......................................................... 13

TABLA V: COMPONENTES VÓLATILES DEL GÉNERO Chromolaena 16

TABLA VI: USOS MEDICINALES DEL GÉNERO Chromolaena............. 20

TABLA VII: ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA DEL GÉNEROChromolaena.......................................................................... 21

TABLA VIII: CLASIFICACIÓN BACTERIANA SEGÚN SUCOLORACIÓN........................................................................ 36

TABLA IX: MICROORGANISMOS Y CONTROLES POSITIVOSUTILIZADOS........................................................................... 60

TABLA X: CARACTERÍSTICAS FÍSICAS Y ORGANOLÉPTICAS DELACEITE ESENCIAL DE LA ESPECIE Chromolaenameridensis............................................................................... 65

TABLA XI: COMPONENTES VOLÁTILES DEL ACEITE ESENCIAL DEChromolaena meridensis........................................................ 68

TABLA XII: ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA DEL ACEITE ESENCIALDE LA ESPECIE Chromolaena meridensis............................ 72


x

ÍNDICE DE CUADROS Pág.

CUADRO 1: COMPONENTES QUÍMICOS DE Chromolaena meridensis.. 15

CUADRO 2: COMPONENTES MAYORITARIOS DEL ACEITEESENCIAL DE Chromolaena odorata..................................... 17

CUADRO 3: COMPONENTES MAYORITARIOS DEL ACEITEESENCIAL DE Chromolaena laevigata................................... 17

CUADRO 4: COMPONENTES MAYORITARIOS DEL ACEITEESENCIAL DE Chromolaena squalidum, Chromolaenaamygdalinum y Chromolaena conyzoides............................... 18

CUADRO 5: COMPONENTES MAYORITARIOS DEL ACEITEESENCIAL DE Chromolaena macrophyllum........................... 18

CUADRO 6: COMPONENTES MAYORITARIOS DEL ACEITEESENCIAL DE Chromolaena marginatum.............................. 18


xi

INDICE DE ANEXOS Pág

ANEXO 1: VOUCHER DE LA ESPECIE Chromolaena meridensisUBICADO EN EL HERBARIO MERF........................................ 77

ANEXO 2: EQUIPO DE HIDRODESTILACIÓN EMPLEANDO LATRAMPA DE CLEVENGER....................................................... 78

ANEXO 3: DISCOS DE PAPEL DE FILTRO DE 4 MILIMETRO DEDIÁMETRO.................................................................................. 79

ANEXO 4: COLOCACIÓN DE LOS DISCOS IMPREGNADOS CON ELACEITE ESENCIAL DE Chromolaena meridensis Y DMSO...... 79

ANEXO 5: ENSAYO DE LA CEPA DE E. coli ATCC 25922......................... 80

ANEXO 6: ENSAYO DE LA CEPA DE K. pneumoniae ATCC 23357.......... 80

ANEXO 7: ENSAYO DE LA CEPA DE P. aeruginosa ATCC 27853............ 81

ANEXO 8: ENSAYO DE LA CEPA DE S. aureus ATCC 25933................... 81

ANEXO 9: ENSAYO DE LA CEPA DE E. faecalis ATCC 29212.................. 82


1

I. INTRODUCCIÓN

En el largo período de la evolución humana y durante mucho tiempo, la inclinación

del hombre hacia el concepto mágico-religioso de su cultura, le llevo a aplicar su

curiosidad y a buscar en la naturaleza remedios de gran valor terapéutico para

combatir diversas enfermedades (Albornoz, 1997).

La necesidad de procurarse alimentos y medicamentos, comenzó probablemente,

probando una y otra vez o también observando el hábito de los animales salvajes

cuando discriminaban las plantas, escogiendo las adecuadas para su nutrición y

evitando las venenosas. No cabe duda que los humanos han tenido que

experimentar situaciones desagradables para conocer las plantas beneficiosas.

Cuando una especie se comprobaba que tenía acción beneficiosa en un individuo,

se le daba a otro y si se notaba el mismo efecto sobre éste, entonces se aceptaba

y generalizaba su consumo (Albornoz, 1980).

El conocimiento de la interrelación hombre, animales y plantas, surgió en los

pueblos primitivos (Albornoz, 1980). Estos pueblos adquirieron información sobre

las propiedades medicinales de gran número de plantas propias de su medio

ambiente, dichos conocimientos generalmente los han acumulados determinados

individuos, sacerdotes, hechiceros, curanderos. etc., quienes los han transmitido


2

de generación en generación a determinados aprendices y a sus descendientes,

dejando útiles descripciones de plantas medicinales y de su utilidad (Domínguez,

1973).

En la actualidad se sigue intensificando la investigación científica de las plantas

medicinalescon el fin de extraer y separar sustancias con actividad biológica o

terapéutica(Albornoz, 1980), cubriendo aspectos adicionales, como la estructura

de los constituyentes químicos, datos espectroscópicos, síntesis y biosíntesis de

una gran variedad de compuestos propios de una especie o productos naturales

también denominados metabolitos secundarios (Marcano y Hasegawa, 1991).

Durante el año 1978, se publicaron en el mundo numerosos trabajos científicos

que informaron de unos 6500 productos aislados, de los cuales un 40% eran

desconocidos anteriormente y de este grupo un 10% mostró ser potenciales

agentes terapéuticos (Albornoz, 1980).

Los productos naturales son sustancias de origen orgánico e inorgánico que se

encuentran en la naturaleza y que pueden ser aislados y procesados por el

hombre. Su formación comienza con la fotosíntesis, luego de la cual los

fragmentos pequeños se recombinan para generar las grandes moléculas

(Albornoz, 1997). Hay muchas clases o categorías de sustancias naturales,

productos del metabolismo vegetal, que se han clasificado según origen, carácter


3

químico, similitud estructural molecular o su acción farmacológica (Albornoz,

1980).Dentro de las estructuras vegetales se encuentran los aceites esenciales,

estos pueden localizarse en sus flores, hojas, frutos y hasta raíces o en toda la

planta (Domínguez, 1973).

Los aceites esenciales son generalmente líquidos aromáticos, miscibles con

lípidos y solventes lipófilos; incoloros, particularmente cuando están frescos, ya

que al oxidarse se resinifican y toman color oscuro (lo cual se previene

depositándolos en recipientes de vidrio de color ámbar totalmente llenos y

cerrados perfectamente) (Albornoz, 1980). Son empleados en perfumería, en la

industria alimenticia o como fuente de materia prima (Domínguez, 1973). Las

familiasricas en aceites esenciales son:Lauráceas, Mirtáceas, Umbellíferas,

Pináceas, Rutáceas, Labiadas, Verbenáceas y Asteraceas (Marcano yHasegawa,

2002).Dentro de esta últimase encuentran numerosos géneros y especiesque han

sido objeto de estudios, en esta ocasiónse estudiará el aceite esencial

deChromolaena meridensis (B.L. Rob.) R.M. King & H. Rob., que hasta 1970 se

denominaba Eupatorium meridense Robinson(Aristeguieta, 1964). Los

componentes volátiles de esta especie no han sido estudiados, por lo que el

presente estudiose basó en la extracción e identificación de


4

loscompuestosquímicos volátilesyanálisis antibacterianodel aceite esencial de

Chromolaena meridensis (B.L. Rob.) R.M. King & H. Rob.


5

II. ANTECEDENTES

A. Antecedentes del género

La familia Asteraceae denominada también Compuesta estáabundantemente

representada en la flora de Venezuela y constituye junto con las Orquídeas,

Gramíneas, Leguminosas y Rubiáceas las familias dominantes en el país

(Aristeguieta, 1964). Es la segunda con mayor número de especies dentro de las

Angiospermas después de las Orchidaceae, agrupa entre 23.000 - 30.000

especies y 1.500 géneros y se encuentra ampliamente distribuida en el mundo

(Bremer, 1994).En Venezuela se encuentra distribuida desde el nivel de mar hasta

los sitios más elevados de los páramos andinos, casi en contacto con las nieves

perpetuas, donde escasamente es posible el desarrollo de plantas superiores

(Badillo, 2001). Al considerar la distribución de las Compuestas en Venezuela, el

país puede ser dividido en 3 regiones: a) Costa y Llano; b) Andes y Codillera

costera; c) región Guayanesa. De estas 3 regiones, la primera es pobre en

endemismo y números de especies de Compuestas. Las dos últimas, en cambio,

representan las áreas de mayor concentración de Compuestas con un alto grado

de endemismo (Badillo, 2001).


6

Las Compuestas son plantas heliófilas en casi su totalidad y se hacen dominantes

y muy diversificadas en sitios con temperaturas bajas, así se explica que en un

país tropical como Venezuela, la gran concentración de especies de Compuestas

esté localizada en las partes Andino - Cordillera Costera y alta Guayana; pues son

regiones montañosas de gran elevación con temperaturas baja, en cambio la

Costa y el Llano ofrecen una topografía plana o de poca elevación, con

temperaturas altas, y por ello el número de especies de Compuestas es muy

reducido en comparación con la gran variedad que se observa en las dos regiones

mencionadas (Badillo, 2001).

Esta familia distribuye sus géneros en 13 tribus (tabla I) (Badillo, 2001). En

Venezuela está representada por 204 géneros y 784 especies nativas o

naturalizadas, incluyendo 13 géneros y 189 especies endémicas (más 2

subespecies y 5 variedades) (Hokche et al, 2008). Dentro de esta familia se

encuentran desde árboles, pasando por arbustos y subarbustos, hasta plantas

herbáceas (Moreno et al, 2006).

La tribu Eupatoriaea está bien representada en el país, las especies de esta tribu

están contenidas en varios géneros (tabla II), los de mayor número de especies


7

corresponden a Eupatorium, Mikania y Chromolaena, este último con un total de

30 especies (tabla III) (Badillo, 2001).

(Badillo, 20 (Badillo, 2001).

(Badillo, 2001).

TABLA I: TRIBUS DE LA FAMILIA

ASTERACEAE

I. BARNADESIEAE

II. MUTISIEAE

III. CARDUEAE

IV. LACTUCEAE

V. VERNONIEAE

VI. LIABEAE

VII. PLUCHEEAE

VIII. GNAPHALIEAE

IX. ASTEREAE

X. ANTHEMIDEAE

XI. SENECIONEAE

XII. HELIANTHEAE

XIII. EUPATORIEAE


8

(Badillo, 2001).

TABLA II: LISTADO DE LOS GÉNEROS QUE INTEGRAN LA TRIBU EUPATORIEAE

AdenostemmaForster FleishmanniaSchultz-Bip

AgeratinaSpach Guayania R. King et H. Rob.

Ageratum L Hebeclinium D C.

Asplundianthus R. King et H. Rob. Heterocondylus R. King et H. Rob.

Austroeupatorium R. King et H. Rob. Idiothamnus R. King et H. Rob.

Ayapana R. King et H. Rob. Imeria R. King et H. Rob.

Badilloa R. King et H. Rob. Isocarpha R. Br.

Barrosoa R. King et H. Rob. KoanophyllonArruda da Camara

Bartlettina R. King et H. Rob. LepidesmianKlatt

Brickellia Elliot Lourteigia R. King et H. Rob.

Campuloclinium D C. MikaniaWilld

Chromolaena D C. Oxylobu(Mociño ex D C.) A. Gray

Conocliniopsis R. King et H. Rob. Siapaea Cav.

Critonia P. Browne Stevia Cav.

Critoniella R. King et H. Rob. Steyemarkina R. King et H. Rob.

Eupatorium L. TrichogoniaGardn


9

(Badillo, 2001).

TABLA III: ESPECIES DEL GÉNEROChromolaena

Chromolaena aridicola Badillo Chromolaena persericea R. King et H. Rob.

Chromolaena bathyphlebia (B. Rob.) R. King et H.Rob.

Chromolaena pharcidodes (B. Rob.) R. King et H.Rob.

Chromolaena columbiana (Heering) R. King et H.Rob.

Chromolaena ponsae Badillo

Chromolaena farinosa (B. Rob.) R. King et H. Rob. Chromolaena santanensis (Aristeg.) R. King etH. Rob.

Chromolaena ivifolia (L) R. King et H. Rob. Chromolaena squalid (DC.) R. King et H. Rob.

Chromolaena laevigata (Lam) R. King et H. Rob. Chromolaena steyermarkiana (Badillo) R. King etH. Rob.

Chromolaena larensis (Badillo) R. King et H. Rob. Chromolaena subscandens (Hieron.) R. King etH. Rob.

Chromolaena leptocephala (DC.) R. King et H.Rob.

Chromolaena ternicapitulata Pruski

Chromolaena maximiliani (Schroeder ex DC.) A.King et H. Rob.

Chromolaena thurnii (B. Rob.) R. King et H. Rob.

Chromolaena meridensis (B. Robinson) R. King etH. Rob.

Chromolaena trujillensis (B. Rob.) R. King et H.Rob.

Chromolaena molina (B. Rob.) R. King et H. Rob. Chromolaena tyleri (B. Rob.) R. King et H. Rob.

Chromolaena moritensis (Aristeg.) R. King et H.Rob.

Chromolaena urticoides (Schultz-Bip. ex Hieron.)R. King et H. Rob.

Chromolaena moritziana (Schultz-Bip. ex Hieron.)R. King et H. Rob.

Chromolaena voglii (B. Rob.) H. Huber, Mitt.

Chromolaena odorata (L) R. King et H. Rob. Chromolaena xestolepidoides (Wurdack) R. Kinget H. Rob.

Chromolaena pellia (Klatt) R. King et H. Rob. Chromolaena xestolepis (B. Rob.) R. King et H.Rob.


10

Esta familia ha sido motivo de muchos estudios químicos que han llevado al

descubrimiento de interesantes estructuras químicas, resultando varias de ellas

promisorias de ser utilizadas,como insecticidas, en la industria de los alimentos,

como aromatizantes, edulcorantes, Además, los estudios químicos sistematizados

han servido de soporte a estudios taxonómicos (De Pérez, 1994). En Venezuela

sus múltiples propiedades medicinales han sido ampliamente estudiadas (Gil et al,

2003), sus numerosas especies vegetales poseen aproximadamente 26% de

acción contra afecciones gastrointestinales, 16% contra enfermedades esqueleto

muscular y un 13% en enfermedades dermatológicas (Arrázola et al, 2002).

A.1. Descripción del géneroChromolaena

Las especies del género Chromolaena se presentan en cabezuelas homogéneas y

organizadas, por lo general de muchas flores, hermafroditas. Hierbas, frútices,

arbustos hasta pequeños árboles. Hojas casi siempre opuestas, por lo general con

inflorescencias corimbosas (Aristeguieta, 1964).

A.1.1.Descripción de la especieChromolaena meridensis (B.L. Rob.)

R.M. King & H. Rob., sinonimia: Eupatorium meridenseRobinson


11

Planta fruticosa, erecta; tallos redondeados, cortamente pubescentes. Hojas

opuestas, brevemente pecioladas, lanceoladas atenuado-acuminada en ambos

extremos, 4-8 cm de largo, 1-2 cm de ancho, brillantes, puberulentas y

marcadamente rugosas, densamente piloso-glandulosas y prominentemente

reticuladovenosas por debajo, erenuladas o subenteras, cartáceas, 3-nervadas

desde cerca de la base, pecíolos alrededor de 0.5 cm de largo. Inflorescencias

corimbos terminales, redondeados, compuestos. Cabezuelas numerosas,

cortamente pediceladas o subsésiles, conteniendo unas diez flores. Involucro

delgado, cilíndrico, de 7-8 mm de largo, 5-6 seriado; brácteas oblonglas,

redondeadas o subtruncadas arriba, cilioladas en los márgenes y subglabras o

puberulentas y glándulas en el dorso. Receptáculo convexo, glabro. Corolas

puberulento-glandulosas en el ápice, 4,5-5 mm de largo. Aquenios de 3-3,5 mm de

largo, glandulosos en las costillas. Papus amarillento y un poco más corto que las

corolas, de 3,5-4 mm de largo (Aristeguieta, 1964).

A.1.2. Distribución de la especieChromolaena meridensis(B.L. Rob.)

R.M. King & H. Rob., en Venezuela

Esta especie es endémica de Venezuela y se encuentra ampliamente distribuida

en la región andina: estado Mérida (Chachopito, cerca de San Rafael, Mucurubá,


12

alrededores de Mérida y La Azulita), estado Trujillo (entre Trujillo y

Boconó)(Aristeguieta, 1964).

A.2. Química del géneroChromolaena

Del género Chromolaena se han estudiado diversas especies como: C. leivensis,

C. opadoclinia, C. odorata, C. arnottiana,C. morii, C. collina, C. connivens, C.

glaberrima, C. pseudoinsignis, C. chasleae, y se han determinadocompuestos de

tipo: sesquiterpenos, triterpenos, flavonoides, ácidos grasos

cíclicos,sesquiterpenlactonas, alcaloides pirrolizidínicos, germacranólidos,

diterpenos(ent-clerodanosy derivados del labdano) yprostaglandinas

provenientesde ácidos grasos libres(Rodríguez y Torrenegra, 2007).En la tabla IV

y Vse presentan los componentes químicos y volátiles hallados en algunas

especies del géneroChromolaena respectivamente, incluyendo los componentes

químicos encontrados enChromolaena meridensis (B.L. Rob.) R.M. King & H. Rob.

(Cuadro 1).

TABLA IV: COMPOSICIÓN QUÍMICA DE ALGUNAS ESPECIES DEL GÉNEROChromolaena

Especie Componentes Lugar Fuente


13

bibliográfica

Chromolaena laevigata

Saponinas, flavonoides,

Esteroides libres,

triterpenoides, Aza-

esteroideles, Taninos,

Alcaloides

Perú (Fuertes et al,

2010)

Chromolaena odorata

Alcaloides

pirrolizidínicos,

(Monoésteres de

retronecina y supininas)

México (Gómezet al,

2011)

Chromolaena pulchella

Alcaloides pirrolizidínicos

con núcleo de necina

España (Gómez et al,

2011)

Acetilivalina, Epazoyina

Acido-hardwikiico, 7,8-

seco-7,8-oxacassan-17-

aleufol,

Deoxipodofilotoxina

Geraniina

México (Torres,

2011)

Chromolaenaperglabra Esteroides, Flavonoides Boyacá –

Colombia

(Rodríguez y

Torrenegra,

2007)

Chromolaenatequendamensis

Cetoácidos (estructuralmenterelacionados conprostaglandinas)

CundinamarcaColombia

(Sanabria etal, 1989)


14

Chromolaenasubscandens

5,4-dihidroxi-7-metoxiflavonol,Β-estigmasterol, Hidroquinona,Eicosanol

CundinamarcaColombia

(Torrenegraet al, 2007)

Chromolaenabullata Flavonoides Colombia (Santander etal, 2007)

Chromolaenatacotana

Flavonoides Colombia (Castañedaet al, 2007)

Flavonoides (cianidina),Taninos (gelatinasal),Esteroides y/o triterpenoides,Flavononol 7-metoxi-aromadendrina

Colombia (Sanabria yCarrero,

1995)

Chromolaenamoritziana Flavonoides (Kanferol,Kanferol-3-O-rutinósido,Rutina e Isoquercetina)

Mérida-Venezuela

(Hidalgo etal, 1998)

Chromolaenameridensis

Ácido 12-oxo-9βH, 13αH-10,15(Z)-fitodienóico [1]flavonoides: eupatolitina[2]

velutina[3],rhamnetina [4]

Mérida-Venezuela

(Delgado,1989)

CUADRO 1: COMPONENTES QUÍMICOSDE Chromolaena meridensis

CONTINUACIÓN DE LA TABLA IV


15

O

O

OOH

OH

OH

OH

MeO

MeO

COOH

[1] [2]

O

OOH

OH

OMeO

OOH

OH

OH

OH

MeOMeO

[3][4]

Especie Componentes % Lugar Fuente Bibliográfica


16

%: Porcentaje de los componentes en el aceite esencial

α pineno[5] 42,2β pineno[6] 10,6pregeijereno [7] 2,8

Chromolaena odorata geijereno [8] 4,7 Nigeria (Owolabi et al, 2010)germacreno D [9] 9,7β-cariofileno[10] 5,4

Chromolaena laevigata globulol[11] 16,2germacreno D[9] 8,6globulol[11] 25,1oxido de cariofileno[12] 17,4

Chromolaena squalidum β-cariofileno[13] 7,1germacreno D[9] 10,4espatulenol[14] 14,2globulol[11] 25,1 Brasil (Maia et al, 2002)oxido de cariofileno[12] 17,4

Chromolaena conyzoides β-cariofileno[13] 7,1germacreno D[9] 10,4espatulenol [14] 14,2globulol[11] 25,1oxido de cariofileno[12] 17,4

Chromolaena amygdalinum β-cariofileno[13] 7,1germacreno D[9] 10,4espatulenol[14] 14,2

Chromolaena macrophyllum limoneno[15] 23,3sabineno[16] 46,7germacreno D[9] 14,8α-zingibereno[17] 57,5

Chromolaena marginatum α-gurjuneno[18] 19,5α-bisaboleno[19] 9,7α-selineno[20] 9

TABLA V: COMPONENTES VOLÁTILES DEL GÉNERO Chromolaena


17

[5] [6] [7] [8]

[9] [10]

OH

[11] [9]

CUADRO 3: COMPONENTES MAYORITARIOS DEL ACEITEESENCIAL DE Chromolaena laevigata

CUADRO 2: COMPONENTES MAYORITARIOS DEL ACEITEESENCIAL DE Chromolaena odorata


18

OH O

[11] [12] [13]

HO H

H

[9] [14]

CUADRO 4: COMPONENTES MAYORITARIOS DEL ACEITE ESENCIAL DEChromolaena squalidum, Chromolaena amydalinum, y Chromolaenaconyzoides

CUADRO 5: COMPONENTES MAYORITARIOS DEL ACEITEESENCIAL DE Chromolaena macrophyllum

[15] [16]


19

CUADRO 6: COMPONENTES MAYORITARIOS DEL ACEITE ESENCIAL DEChromolaena marginatum

H

H

[9] [17] [18]

[19] [20]


20

A.3. Usos del géneroChromolaena

TABLA VI: USOS MEDICINALES DEL GÉNERO Chromolaena

Especie Uso terapéutico Lugar derecolección

Fuente bibliográfica

Chromolaena perglabra Actividad significativa in vitro contraagentes causante de la enfermedad de

Chagas y Leishmaniasis

Tinjacá(Boyacá -Colombia)

(Rodríguez yTorrenegra, 2007)

Chromolaena odorata

Actividad antidiarreica Nigeria (Gutiérrez et al, 2007)

Para infecciones de tejidos blandos yquemaduras

Argentina (Grossi, 2009)

Chromolaena Hookeriana Para calmar la estupefacción Bolivia (Vaera et al, 2002)

Chromolaena bullata Actividad antitumoral oinmunorreguladora (sobre células

tumorales humanas)

Colombia (Santander et al, 2007)

Chromolaena laevigata

Para el dolor de cabeza, comoantiséptico y purgante

Argentina (Marzocca, 1997)

Analgésico catártico Argentina (Amat, 1983)

Promotor abortivo y para la menstruación Argentina (Martínez, 1981)

Chromolaena odorata Antidiarreica y antipirético Argentina (Freire y Urtubey,1999)

Chromolaena puchella

Antiinflamatoria España (Gómez et al, 2011)

Anticancerosa México (Torres, 2011)

Chromolaena tacotanaDisminuye la viabilidad celular de la línea

celular K562(línea celular tumoral)Colombia (Castañeda et al, 2007)

Chromolaena roseorum Las hojas son utilizadas para el dolor decabeza

Ecuador (Lajones, 2006)

Chromolaena moritziana Anticatarral, es usado en tratamiento dela piel y como depurativa

Mérida-Venezuela

(Hidalgo et al, 1998)


21

A.4. Actividad biológica

A.4.1. Actividad antibacteriana de especies del género

Chromolaena

TABLA VII. ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA DEL GÉNERO Chromolaena

Especie Bacterias sensibles Lugar Fuente bibliográfica

Chromolaenasubcandens Staphylococcus aureus Cundinamarca-Colombia

(Torrenegra et al,2007)

Chromolaena odorata Staphylococcus aureus

Bacillussubtilis

Cundinamarca-Colombia

(Sanabria et al, 1998)

Chromolaenatequendamensis

Mycobacterium fortuitum

Brucellasp

Streptococcus hemolyticus

Streptococcus pneumoniae

Streptococcus faecalis

Staphylococcus albus

Staphylococcus aureus

Staphylococcus epidermidis

Micrococcus flavus

Sarcinalutea

Cundinamarca-Colombia

(Sanabriaet al, 1989)

Chromolaenatacotana

Klebsiella pneumoniae

Staphylococcus aureus

Staphylococcus epidermidis

Bogotá-SilvaniaDepartamento de

Cundinamarca(Sanabriay Carrero,

1995)

Chromolaenamoritziana Staphylococcus aureus Mérida-Venezuela (Hidalgo et al, 1998)


22

A.4.2. Otras actividades biológicas

Se han realizado varios estudios de actividad biológica en Chromolaena odorata,

pocos en Chromolaena hirsute y Chromolaena moritziana. Reportándose actividad

pesticida, actividad repelente, efecto antiprotozoario, actividad insecticida,

actividad tripanocida, actividad antibacteriana, actividad antimicrobacterial,

citotoxicidad, efecto antioxidante, mutagenicidad, proliferación de queratocitos

humanos y proliferación de fibroblastos entre otros (Rodríguez y Torrenegra,

2007).


23

III. MARCO TEÓRICO

A. Aceites esenciales

A.1. Definición

Los aceites esenciales o aceites volátiles se encuentran localizados en células y

órganos particulares o se producen por reacciones químicas en un determinado

momento. Generalmente son líquidos y otros sólidos a temperatura ordinaria, casi

siempre incoloros pero que por reacción del aire y de la luz toman una coloración

amarilla más o menos intensa; con sabor acre y picante; aromáticos. Son solubles

en alcohol, éter y ácidos fijos; son insolubles en agua, pero sin embargo, agitadas

con agua le comunican parcialmente su olor (Albornoz, 1997).

A.2. Distribución y localización

Los aceites esenciales pueden encontrarse en animales y en plantas (Tyler et al,

1988). Existirían, según Lawrence, 17.500 especies aromáticas. Los géneros

capaces de elaborar los constituyentes que componen los aceites esenciales

están repartidos en un número limitado de familias, ejemplos: Myrtaceae,

Lauracae, Rutaceae, Lamiaceae, Asteraceae, Apiaceae, Cupressaceae, Poaceae,

Zingiberaceae,Piperaceae, etc (Bruneton, 2001).


24

Los aceites volátiles se localizan en determinados sitios de la estructura vegetal,

en células normales o modificadas o también en estructuras especializadas tales

como cavidades esquizógenas, vasos secretores, pelos glandulares y canales

lisígenos(Albornoz, 1980), pueden almacenarse en las flores, igualmente en hojas

y, aunque sea menos habitual, en corteza, leño, raíces, rizomas, frutos, semillas,

etc (Bruneton, 2001).

A.3. Propiedades físicas

Los aceites esenciales son líquidos a temperatura ambiente, volátiles, lo que los

diferencia de los aceites fijos, muy raramente son coloreados. En general, su

densidad es inferior a la del agua (los aceites esenciales de sasafrás, clavo o

canela, constituyen excepciones). Posee un índice de refracción elevado y la

mayoría desvían la luz polarizada, son liposolubles y solubles en los disolventes

orgánicos habituales, arrastrables al vapor de agua, son muy poco solubles en

ella; no obstante, son lo suficientemente solubles como para comunicarle un olor

neto. Esta agua es agua destilada floral (Bruneton, 2001).

A.4. Composición

Químicamente los aceites son mezclas complejas y muy variables de

constituyentes que pertenecen, de manera casi exclusiva, a dos grupos


25

caracterizados por orígenes biogenéticos distintos: el grupo de los terpenoides por

una parte y el grupo de los compuestos aromáticos derivados del fenilpropano,

mucho menos frecuente (Bruneton, 2001), dentro de este último los más

frecuentes son anetol, eugenol, magnolol y cinamaldehído. Entre los componentes

volátiles aislados de las plantas también se encuentran ácidos libres, cetonas y

compuestos azufrados como allicina e isotiocianato de alilo (Marcano y Hasegawa,

2002).

A.4.1. Terpenoides

En los aceites esenciales se encuentran únicamente los terpenos más volátiles, es

decir, aquellos cuya masa molecular no es demasiado elevada: mono-y

sesquiterpenos (Bruneton, 2001).

A.4.1.1. Monoterpenos

Casi siempre se encuentran hidrocarburos. Estos pueden ser acíclicos (mirceno y

ocimenos), monociclicos (α- y ү-terpineno, p-cinemo) o biciclicos (pinenos, Δ3 –

careno, canfeno, sabineno). A veces constituyen más del 90% del aceite esencial.

También la presencia de numerosas moléculas funcionalizadas: alcoholes,

aldehídos, cetonas, ésteres, éteres, peróxidos y fenoles (Bruneton, 2001).


26

A.4.1.2. Sesquiterpenos

Las variaciones estructurales en esta serie son de la misma naturaleza que en el

caso precedente: siendo los más frecuentes hidrocarburos alcoholes y cetonas.

Algunos ejemplos de sesquiterpenos característicos de aceites esenciales son:

hidrocarburos mono o policíclicos (β-bisaboleno, β- cariofileno y longifoleno),

alcoholes (farnesol, carotol, β-santalol, patchulol), cetonas (nootkatona, cis-

longipinano-2,7-diona, β-vetivona), aldehídos (sinensales), ésteres (acetato de

cedrilo) (Bruneton, 2001).

A.4.1.3. Biosíntesis de terpenos

Los terpenoides están formados por largas estructuras de diversas familias

derivadas de la unidad isopreno C5 (figura 1), los cuales tienen la modalidad de

unirse cabeza-cola. Son estructuras típicas que cuentan con esqueletos

carbonados representados por (C5)n y son clasificados como: hemiterpenos (C5),

monoterpenos (C10), sesquiterpenos (C15), diterpenos (C20), sesterterpenos

(C25), triterpenos (C30) y tetraterpernos (C40) (Dewick, 2002).

FIG. 1: UNIDAD DE ISOPRENO


27

OPPFarnesil PP

(FPP)

OPPIsopentenil PP(IPP) (C5)

Hermiterpenos (C5)

OPPDimetilalil PP(DMAPP) (C5)

IPP

Monoterpenos (C10)

Sesquiterpenos (C15)

OPPGeranil PP

(GPP)

Los monoterpenos resultan de la combinación del dimetilalil difosfato (DMAPP) y

el isopentenil difosfato (IPP) por medio de la enzima feniltransferasa para producir

geranil difosfato (GPP). Los sesquiterpenos se forman adicionándole una unidad

C5 de isopentenil disfofato al geranil difosfato por extensión de la

feniltransferasa originando el precursor fundamental de los sesquiterpenos el

farnesil difosfato (FPP) (figura 2) (Dewick, 2002).

FIG. 2: BIOSÍNTESIS DE MONOTERPENOS Y SESQUITERPENOS


28

A.5. Propiedades farmacológicas de los aceites esenciales

Entre algunas propiedades fundamentales se destacan:

Poder antiséptico.El poder antiséptico que manifiesta frente a diversas

bacterias patógenas, incluso cepas habitualmente resistentes a los antibióticos.

Algunos aceites esenciales también son activos sobre hongos responsables de

micosis y sobre levaduras (Candida) (Bruneton, 2001).

Propiedades espasmolíticas y sedantes. Eficaces para disminuir o

suprimir los espasmos gastrointestinales, estimulan la secreción gástrica,

mejora determinados insomnios y trastornos psicosomáticos diversos y

disminución del nerviosismo (Bruneton, 2001).

Propiedades irritantes.Empleados por vía tópica, provocan aumento de la

microcirculación, sensación de calor y, en ciertos casos, ligera acción

anestésica local. Administrados por vía interna, los aceites esenciales

desencadenan fenómenos de irritación a diferentes niveles (Bruneton, 2001).


29

A.6. Algunos usos de los Aceites esenciales

Los aceites esenciales tienen diversos usos como agentes para sazonar la comida

y bebidas, así como en la perfumería y cosméticos. En tales productos su

actividad antimicrobial se despliega dos veces. Primeramente, los aceites

esenciales protegen a los productos contra contaminación microbiana por el

retraso del ataque o la inhibición del crecimiento de patógenos. Secundariamente,

cuando actúan como aditivos de comida o aplicado como ingrediente del

cosmético (Kalemba y Kunicka, 2003).

Los aceites esenciales pueden actuar beneficiosamente en la salud humana. Son

una alternativa excelente para las preparaciones sintéticas y ésa es la razón para

una valoración extensa de su actividad antimicrobiana (Kalembay Kunicka, 2003).

También se le atribuyen propiedades antisépticas, desinfectantes y

antihelmínticas, éstas propiedades se han aprovechado desde hace tiempo y

especialmente en el caso de infecciones bronquiales, urinarias y las causadas por

cortadas y quemaduras, algunos son diuréticos, sedantes y repelentes (Marcano y

Hasegawa, 2002).


30

A.7. Procedimientos de obtención de los aceites esenciales

A.7.1. Por arrastre en vapor de agua

La hidrodestilación simple consiste en sumergir directamente el material

vegetal a tratar (intacto u ocasionalmente triturado) en un alambique lleno de

agua que a continuación se somete a ebullición. Los vapores heterogéneos se

condensan sobre una superficie fría y el aceite esencial se separará por

diferencia de densidad(Bruneton, 2001).

En la destilación con vapor saturado, el material no está en contacto con el

agua: el vapor de agua se inyecta a través de la masa vegetal dispuesta sobre

placas perforadas. para acortar el tiempo de tratamiento, limitar la alteración de

los constituyentes del aceite esencial y economizar energía, se puede trabajar

a sobre presión moderada. Como consecuencia de la sobrepresión existe un

aumento de la temperatura y puede sufrir la calidad del producto (Bruneton,

2001).

La hidrodifusión consiste en impulsar el vapor de agua a muy baja presión a

través de la masa vegetal, de arriba abajo. la composición de los productos

obtenidos es desde un punto de vista cualitativo, sensiblemente diferente de


31

los productos obtenidos por los métodos clásicos. el procedimiento permite

ganar tiempo y energía (Bruneton, 2001).

A.7.2. Por expresión

El principio del método es muy simple: las “cascaras” se trituran y el contenido de

las glándulas secretoras que se han roto se recuperan por un procedimiento físico.

El procedimiento clásico consiste en ejercer, bajo una corriente de agua, una

acción abrasiva sobre la superficie del fruto. Después de eliminar los desechos

sólidos, el aceite esencial se separa de la fase acuosa por centrifugación

(Bruneton, 2001).

A.7.3. Por extracción con solventes orgánicos

Se puede usar éter de petróleo, hexano o se exprime el material biológico, estos

métodos pueden usarse solos o combinados. La extracción con solventes en

condiciones supercríticas ha dado excelente rendimiento y tiene gran potencial

para la obtención industrial de los aceites esenciales (Marcano y Hasegawa,

2002).


32

A.8. Métodos de análisis de los aceites esenciales

El procedimiento más usado gracias a la volatilidad de los aceites esenciales, es la

Cromatografía de Gases Acoplada a Espectrometría de Masas (CG/EM) (Marcano

y Hasegawa, 2002)

A.8.1. Cromatografía de Gases Acoplada a Espectrometría de

Masas (CG/EM)

La cromatografía de gases es uno de los métodos físicos de separación más

eficaces que se conocen; cada componente de una muestra suministra 3 unidades

de información: posición, altura y anchura de los picos en el cromatograma. La

posición suministra la información cualitativa y los otros proporcionan la

información cuantitativa. Es posible identificar los componentes por la posición de

los picos, pero por lo general la ambigüedad es tan grande que el analista ha de

completar la información con la obtenida por otros métodos analíticos, siendo

preferibles las técnicas multiparamétricas, como la espectroscopia de infrarrojo ola

espectrometría de masas (Dabrio, 1973).El principio básico de todas las técnicas

cromatográficas es el siguiente: Un fluido (fase móvil) circula a través de una fase

estacionaria (sólida o líquida); cuando una mezcla de sustancias se introduce en el

sistema, se produce una serie de equilibrios de distribución entre las dos fases,


33

generalmente de distinta magnitud para cada componente de la mezcla, por lo que

cada uno de ellos se desplazará con diferente velocidad a lo largo del sistema

(Dabrio, 1971).

Los Cromatógrafos de Gases (figura 3) contienen esencialmente:

Una fuente de gas comprimido. Nos proporciona la fase móvil (gas portador).

Los gases más utilizados son hidrogeno, helio, nitrógeno y argón (Dabrio,

1971).

Un regulador de presión o flujo de gas portador (Dabrio, 1971).

Inyector. Dispositivo que permite la introducción de la muestra en la corriente

de gas portador(Dabrio, 1971).

Columna cromatográfica. Tubo de vidrio o metal (acero inoxidable, cobre,

aluminio, entre otros) de longitud que oscila entre 1 - 200 m, cuyo diámetro

inferior puede ser desde 0,1 a 50 mm, según el tipo de columna. Según como

se encuentre en ella distribuida la fase estacionaria y el valor que alcance la

relación de fase(volumen de fase móvil/ volumen de fase estacionaria) se

originan los diferentes tipos de columnas. La separación de la mezcla se


34

realiza en ella, siendo, por tanto, la parte más importante del instrumento

(Dabrio, 1971).

El horno, en cuyo interior se sitúa la columna, que debe poseer una buena

regulación de temperatura (Dabrio, 1971).

El detector. Dispositivo que permite medir de una manera continúa una

propiedad física del gas portador, que se modifica ampliamente con la

presencia de muy pequeñas concentraciones de la sustancia a analizar. Está

situada a la salida de la columna (Dabrio, 1971).

Sistema electrónico de amplificación y medida de la señal eléctrica enviada por

el detector y registrador de la misma (Dabrio, 1971).

Tomado dehttp://es.wikipedia.org/wiki/Cromatograf%C3%ADa_de_gases

FIG. 3: DIAGRAMA DE UN CROMATÓGRAFO DE GASES


35

Ahora bien, la espectrometría de masas es básicamente una técnica en la que los

iones obtenidos de una sustancia, en general orgánica, se separan según su

relación de masa o carga iónica dando lugar, una vez registrados en forma

adecuada al espectro de masas característico de la citada sustancia (Dabrio,

1973). A una molécula se le suministra suficiente energía para obtener fragmentos

más pequeños provenientes de la rotura de los diferentes enlaces originales en la

molécula y el estudio de estos fragmentos dará una idea de cómo estaban unidos

y por tanto, de la estructura molecular(Marcano y Cortés, 1998).

B. Determinación de la actividad antibacteriana de los aceites

esenciales

B.1. Bacteria

Células procariotas universalmente distribuidas, algunas de gran importancia

médica o industrial, cuyas características principales son:

Son unicelulares y pueden tener forma esférica, bacilar o espiral (Barrios,

1988).

Se reproducen asexualmente por fisión binaria (Barrios, 1988).

Pueden ser fotosintéticas o no (Barrios, 1988).

Pueden ser inmóviles o móviles mediante flagelos (Barrios, 1988).


36

Los métodos de tinción diferencial clasifican a las bacterias en grupos diferentes

según sus propiedades de tinción. La tinción de Gram desarrollada por el médico

danés Christian Gram en 1884, es el método de tinción más ampliamente utilizado

en bacteriología. Se trata de unmétodo de tinción diferencial porque divide a las

bacterias en dos clases gramnegativas y grampositivas (Tabla VIII) (Prescott et

al,1999).

CARACTERISTICAS Grampositivas gramnegativas

Reacción al colorante: cristalvioleta

Retiene el cristal violeta y seobservan de color violeta

profundo

No retienen el cristal violeta ypor contraste con la safraninase observan de color rosado

Composición de la paredcelular

Baja en lípidos. Peptidoglicanopresente formando una

monocapa y ácidos teicoicos

Alta en lípidos. Peptidoglicanopresente en una capa internarigida en poca cantidad, nopresenta acidos teicoicos

Susceptibilidad a lapenicilina

Más susceptible Menos susceptible

Requerimiento nutricional

Relativamente complejo enmuchas especies

Relativamente sencillo

Resistencia a la roturamecánica

Más resistente Menos resistente

Ejemplos Más resistente

Escherichia coli

Klebsiella pneumoniae

Pseudomona aeruginosa

(Pelczar y Chan, 1984).

TABLA VIII. CLASIFICACIÓN BACTERIANA SEGÚN SU COLORACIÓN


37

B.1.1. Bacterias grampositivas

a. Staphylococcus aureus

El género Staphylococcusfigura entre las bacterias patógenas más importantes

para el ser humano y son habitantes normales de las vías respiratorias superiores,

la piel, el intestino y la vagina. Pueden dividirse en cepas patógenas y

relativamente no patógenas, basándose en la síntesis de la enzima coagulasa.Las

cepascoagulasa positiva como Staphylococcus aureus son muy resistente al calor,

la desecación y la radiación, por encontrarse en fosas nasales y piel de seres

humanos pueden penetrar rápidamente en los alimentos y producir enterotoxinas

que lo hacen peligros ycausar graves infecciones crónicas como: la intoxicación

alimentaria estafilocócica, además de abscesos localizados, síndrome de shock

tóxico y síndrome de la piel escaldada (Prescott et al, 1999).

b. Streptococcus faecalis(Enterococos)

Los Streptococcus son cocos pequeños de 0,8 a 1 micra de diámetro, con

disposición variable desde cocos en cadenas, hasta aislados o en diplococos, la

mayoría son capsulados, no forman esporas y raramente producen pigmentos, no

tienen cilios, a excepción deStreptococcus faecalis. Se pueden clasificar

basándose en su poder de fermentación, forma de agruparse o su acción


38

hemolítica; así bien, Streptococcus faecalis se clasifica como no hemolítico. Esta

especie se encuentra en las heces humanas, productos lácteos y puede producir

endocarditis lenta y enfermedades gastrointestinales (Paraje y Paraje, 1976).

B.1.2. Bacterias gramnegativas

a. Escherichia coli

Uno de los principales agente causantes de diarreas es E. coli, esta bacteria

circula en la población residente, normalmente sin causar síntomas a causa de la

inmunidad proporcionada por la exposición previa a ésta (Prescott et al, 1999).

Debido a que normalmente se encuentran en el intestino (Pelczar y Chan, 1984),

los alimentos y el agua contaminada son el medio principal a través del cual se

diseminan estas bacterias. Puede causar enfermedad diarreica por varios

mecanismos, y en la actualidad se identifican 6 tipos o cepas deE. coli

diarreogénicas:E. coli enterotoxígena (ECET), enteroinvasiva (ECEI),

enterohemorrágica (ECEH), enteroagregante (ECEAg), difusamente adherente

(ECDA) (Prescott et al, 1999).


39

b. Pseudomona aeruginosa

Es un bacilo chico de 1 a 2 micras, generalmente recto, no forma espora ni

capsula, es móvil por poseer un flagelo terminal. Se caracterizan por producir uno

a más pigmentos como la piocianina y el pigmento eritrogénico. Las infecciones

por Pseudomonasadquieren cada vez más importancia, especialmente en

ambiente hospitalario. Pseudomona aeruginosa es de escasa virulencia en

personas sanas, pero en personas inmunosuprimidas las infecciones se producen

con facilidad; son capaces de agravar lesiones ulcerosas de piel y originar

septicemia con puerta de entrada en otras lesiones, otitis que pueden causar

meningitis, infecciones oculares, intestinales y del aparato respiratorio. El

problema de las infecciones por Pseudomonases cada vez más alarmante, en

especial si se tiene en cuenta su alta resistencia a los antibióticos (Paraje y

Paraje, 1976).

c. Klebsiella pneumoniae

Generalmente se presenta como cocobacilos, rodeados de una capsula grande,

son inmóviles y no esporulados. Están especialmente asociados a procesos

respiratorios, pudiendo ocasionar faringitis, sinusitis, pleuresías y ciertos tipos de


40

neumonías graves; también pueden originar infecciones genitourinarias,

meningitis, peritonitis, diarreas en niños y septicemias. Su importancia clínica

radica en su gran resistencia a los antibióticos (Paraje y Paraje, 1976).

B.2. Antibiótico

Los antibióticos (AB) son compuestos relativamente sencillos producidos por

bacterias u hongos que atacan específicamente a las bacterias. Interfieren en

algún paso del metabolismo donde encuentran un blanco adecuado (Sánchez,

2006).

Los antibióticos se pueden clasificar y agrupar basados en la estructura química y

mecanismo de acción propuesto (figura 4), y así se considera:

Compuesto que inhiben la síntesis de pared bacteriana; entre ellos están

penicilina y cefalosporina, que agrupan semejanza estructural, y también

medicamentos disímbolos como cicloserina, vancomicina y bacitracina

(Chambers, 2003).

Compuestos que actúan de modo directo en la membrana celular del

microorganismo y que afectan su permeabilidad y permiten la fuga de


41

compuestos intracelulares; entre ellos están los detergentes como polimixina

(Chambers, 2003).

Medicamentos que afectan la función de las subunidades ribosómicas 30S o

50S y causan inhibición reversible de la síntesis proteínica; estos productos

bacteriostáticos incluyen cloranfenicol, tetreciclina, eritromicina, clindamicina y

pristinanicinas (Chambers, 2003).

Compuestos que se unen a la subunidad ribosómica 30S y alteran la síntesis

de proteínas, todo lo cual culmina con la muerte del microorganismo; incluyen

los aminoglucósidos (Chambers, 2003).

Medicamentos que afectan el metabolismo de ácido nucleíco como las

rifamicinas (por ejemplo rifampicina) que bloquean la polimerasa de ARN y las

quinolonas, que inhiben a las topoisomerasa (Chambers, 2003).

Antimetabolitos como el trimetropim y las sulfonamidas, que bloquean enzimas

esenciales del metabolismo del fosfato (Chambers, 2003).

Antivirales de varias clases; entre ella:


42

Análogos de ácido nucleico como aciclovir o ganciclovir, que inhiben de

manera selectiva a la polimerasa de ADN viral, y zidovudina o la

lamivudina, que inhiben a la inversotranscriptasa (Chambers, 2003).

Inhibidores de inversotranscriptasa no nucleósidos, como nevoparina o

efavirenz (Chambers, 2003).

Inhibidores de otras enzimas virales esenciales, por ejemplo, inhibidores

de la proteasa de VIH o de la neuraminidasa del virus de la influenza

(Chambers, 2003).

FIG. 4: TIPOS DE ANTIBIÓTICOS Y SUS BLANCOS DE ACCIÓN


43

(Sánchez, 2006).

B.3. Métodos para evaluar la actividad antimicrobiana de aceites

esenciales

Para la evaluación antimicrobiana de aceites esenciales, se aplica generalmente

métodos convencionales probados con capacidades antibióticas. Hay dos técnicas

básicas usadas para la valoración de ambas actividades: antibacterial y

antimicótica de los aceites esenciales:

El método de difusión en agar (pozo o disco de papel) (Kalemba y Kunicka,

2003).

El método de dilución (agar o caldo líquido). Las pruebas y evaluación de la

actividad antimicrobiana de los aceites esenciales son difíciles debido a su

volatilidad, insolubilidad en agua y complejidad (Kalemba y Kunicka, 2003).

Los aceites esenciales son de naturaleza hidrofóbica y de gran viscosidad. Estas

características pueden reducir la capacidad de la dilución o pueden usar

distribución desigual del aceite a través del medio, aun si se usa un agente

correcto disgregante o solubilizante. Se tiene que comprobar si las

concentraciones aplicadas del emulsor o del solvente no afectan el crecimiento y

diferenciación de los microorganismos de pruebas(Kalemba y Kunicka, 2003).


44

Los cultivos de microorganismos se realizan en medios líquidos, bajo condiciones

físicas óptimas para las especies individuales. Los microorganismos tienen que

alcanzar una fase apropiada del crecimiento y un número especificado de células

tienen que ser utilizado para la prueba (Kalemba y Kunicka, 2003).

B.3.1. Método de Difusión en Agar

El principio en que se basa la técnica de ensayo es bastante simple. Cuando se

coloca un disco impregnado en el agar en el que previamente se ha inoculado la

bacteria objeto de la prueba, el disco capta humedad y la sustancia impregnada

difunde rápidamente hacia fuera a través del agar, produciendo un gradiente de

concentración. La sustancia impregnada está presente a una concentración alta

cerca del disco y afecta incluso a gérmenes mínimamente sensibles (los

microorganismos resistentes crecen hasta el disco). A medida que aumenta la

distancia desde el disco, disminuye la concentración de la sustancia y solo los

patógenos más sensibles resultan dañados. Si la sustancia inhibe el agente

bacteriano, en torno al disco se forma un halo claro. Cuanto más ancha es la zona

que rodea el disco, más sensible es el patógeno. El diámetro del anillo es también

función de la concentración inicial de la sustancia, de su solubilidad y de su tasa

de difusión a través del agar (Prescott et al, 2004).


45

El aceite esencial no se usa a menudo en forma pura, generalmente se utilizan

sus soluciones. Se preparan en capsulas de Petri, soluciones del aceite esencial

en diferentes concentraciones y los discos de papel son sometidosa impregnación.

Las placas se almacenan durante algún tiempo para permitir que todos los

componentes del aceite esencial se difundan dentro del agar, después se incuban.

La eficacia del aceite esencial es demostrada por tamaño de la zona de inhibición

del crecimiento del microorganismo alrededor del disco y se expresa generalmente

como el diámetro de esta zona (milímetros o centímetros) (Kalemba y Kunicka,

2003).

B.3.1.1. Método de Kirby-Bauer

En la actualidad, la prueba de difusión en agar mas empleada es el método de

Kirby-Bauer. Consiste en tocar con una asa o aguja de inoculación, 4 o 5 colonias

del patógeno que crece en el agar y se emplea para inocular un tubo con caldo de

cultivo. El cultivo se incuba durante unas pocas horas hasta que se enturbia

ligeramente, luego se toma con un hisopo la suspensión bacteriana y se emplea

para inocular el agar de Mϋeller-Hinton, se deja secar y se coloca sobre este los

discos impregnados, luego se incuba por 16 o 18 horas y posteriormente se miden

los diámetros de inhibición. Finalmente se interpreta empleando una tabla que


46

relaciona el diámetro de la zona de inhibición con el grado de resistencia

microbiana (Prescott et al, 2004).

B.3.2.Método de dilución

El método de dilución en serie en agar se utiliza para bacterias y hongos y su

modificación con caldo líquido se usa solo para hongos. Los cultivos de agar se

realizan en cápsulas de Petri o en tubos, mientras que los cultivos líquidos se

realizan en frascos cónicos con un volumen de 100 ml de medio. Para el caldo

líquido en frascos cónicos, el índice de crecimiento inhibitorio se calcula (% de los

cambios en la biomasa del hongo comparando con el cultivo control) (Kalemba

yKunicka, 2003).

Los resultados se pueden presentar en dos maneras:

El índice de inhibición de crecimiento (Kalemba y Kunicka, 2003).

La concentración inhibitoria mínima (CIM) o la máxima dilución inhibitoria

(MDI)(Kalemba yKunicka, 2003).


47

B.3.2.1. Concentración inhibitoria mínima (CIM)

Proporciona cierta idea de la eficacia de un agente quimioterápico. La CIM es la

concentración más baja de un fármaco que impide el crecimiento de un

determinado patógeno (Prescott et al, 2004).


48

IV. PROBLEMA

¿Cuál sería la composición química y la actividad antibacteriana del aceite

esencial de la especieChromolaena meridensis (B.L. Rob.) R.M. King & H. Rob.

(Asteraceae),recolectadaen San Rafael de Mucuchíes,Mérida- Venezuela, frente a

bacterias grampositivas ygramnegativas representativas, pertenecientes a la

Colección de Cultivo Tipo Americano (ATCC)?


49

V. HIPÓTESIS

Especies del género Chromolaena presentan compuestos químicos volátiles como

monoterpenos, sesquiterpenos y compuestos fenólicos, cabe esperar que en el

aceite esencial de la especie Chromolaena meridensis (B.L. Rob.) R.M. King & H.

Rob. (Asteraceae) estén presentes algunos de estos compuestos y manifiesten

actividad antibacteriana frente a bacterias grampositivas y gramnegativas

representativas, pertenecientes a la Colección de Cultivo Tipo Americano (ATCC).


50

VI. OBJETIVOS

A. Objetivo general

Determinar la composición química y actividad antibacteriana del aceite esencial

deChromolaena meridensis (B.L. Rob.) R.M. King & H. Rob.

(Asteraceae),recolectada en San Rafael de Mucuchíes, Mérida- Venezuela, frente

a bacterias grampositivas y gramnegativas representativas, pertenecientes a la

Colección de Cultivo Tipo Americano (ATCC).

A.1. Objetivos específicos

Recolectar e identificar la especie de estudio en San Rafael Mucuchíes,

Mérida-Venezuela.

Extraer el aceite esencial mediante la técnica de hidrodestilación utilizando una

trampa de Clevenger.

Separar e identificar los componentes del aceite a través de la técnica

Cromatografía de Gasesacoplada a Espectrometría de Masas.

Evaluar la actividad antibacteriana del aceite esencial de la especie

Chromolaena meridensis (B.L. Rob.) R.M. King & H. Rob. (Asteraceae),

utilizando el Método de Difusión en Agar con discos de papel.


51

VII. MATERIALES Y MÉTODOS

A. Material vegetal

A.1. Recolección e identificación del material vegetal

LaespecieChromolaena meridensis (B.L. Rob.) R.M. King & H. Rob.,

fuerecolectada en el Municipio Rangel. San Rafael de Mucuchíes a 3 km del

cementerio vía Las Cañadas. Mérida - Venezuela (figura 5). Luego se realizó la

identificación de la especie por elIngeniero Juan Carmona y se dejóuna muestra

testigo (voucher) bajo el Nº935 en el Herbario MERF de la Facultad de Farmacia y

Bioanálisis,Universidad de Los Andes.

Tomado de https://www.google.co.ve/imagenes.

FIG. 5: LOCALIZACIÓN GEOGRÁFICA DEL LUGAR DE RECOLECCIÓN DE LAESPECIEChromolaena meridensis.


52

A.2. Clasificación taxonómica

(Aristeguieta, 1964)

B.Obtención y análisis del aceite esencial de Chromolaena

meridensis(B.L. Rob.) R.M. King & H. Rob.

B.1. Obtención del aceite por el Método de Hidrodestilación

Para obtener el aceite esencial de la especie en estudio, se recolectaron 1600 gr

de las partes aéreas del material vegetal fresco yposteriormente se licuaron con

agua para lograr mayor rendimiento del aceite. Luego se procedió a la extracción

Reino: Plantae

División: Magnoliophyta

Clase: Magnoliopsida

Orden: Asterales

Familia: Asteraceae

Subfamilia: Asteroideae

Tribu: Eupatorieae

Género: Chromolaena

Especie: Chromolaenameridensis(B.L. Rob.) R.M. King & H.Rob.

FIG. 6:Chromolaena meridensis

Foto tomada por la Prof. DiolimarBuitrago.

.


53

delaceite esencial por medio de un equipo de hidrodestilación, empleando la

trampa de Clevenger (figura 7).

La temperatura en el balón de extracción empleado, se mantuvo a 80°C por un

tiempo de 4 horas aproximadamente para lograr extraer todo el aceite posible

contenido en el material vegetal. Al culminar el proceso de extracción se procedió

a guardar el aceite en un frasco hermético de color ámbar para resguardarlo de la

luz y el oxígeno, se le adicionó sulfato de sodio anhidro para eliminar el exceso de

agua y se almacenó entre 4-5 °C.

B.2. Cromatografía de Gases (CG)

El análisis por Cromatografía de Gases fue realizado en un cromatógrafo de

marca Hewlett-Packard 6890 con un detector de ionización de llama. Se empleó

una columna HP-5 de 30 metros de largo, 0,25 mm de diámetro y 0,25 m de film.

Se usó Helio como gas portador con un flujo de 1 mL/min. Se empleó una

temperatura inicial de 60 ºC (1 min) y luego se calentó a razón de 4 ºC/min hasta

260 ºC. El inyector se mantuvo a 200 ºC y el detector a 230 ºC. Se determinaron

los índices de Kováts que fueron calculados en relación con una serie de n-

alcanos de C8-C24 y comparados con valores reportados en la literatura (Adams,

1995).


54

B.2. Análisis del aceite esencial

FIG. 7:DESARRORRO DEL PROCESO DE OBTENCIÓN DEL ACEITE ESENCIAL DELA ESPECIE Chromolaena meridensis


55

B.2.1. Cromatografía de Gases acoplada a Espectrometría de

Masas (CG-EM)

Los análisis se realizaron en un cromatógrafo de gasesmarca Hewlett-Packard

6890 acoplado a un detector de masas HP5973 (figura 8). El cromatógrafo estaba

equipado con una columna capilar HP-5MS (30 m x 0,25 mm diámetro interno y

espesor de película 0,25 m). La temperatura del inyector y el programa fueron los

mismos usados para el análisis CG. Se inyectó una muestra de 1,0 µL de una

solución al 2% del aceite esencial en n-heptano con reparto 100:1. La

identificación de sus componentes seefectúo mediante comparación

computarizada con las bases de datos: Wiley MS Data y NIST 05.

FIG. 8: CROMATÓGRAFO DE GASES ACOPLADO A UN ESPECTROMETRO DEMASAS


56

C. Evaluación de la actividad antibacteriana

Para la evaluación de la actividad antibacteriana del aceite esencial de la

especieChromolaena meridensis, se seleccionó el Método de Difusión de Agar

usando disco de papel. Esta técnica es la más generalizada y reconocida por su

precisión y confiabilidad para la evaluación de la actividad antimicrobiana, lo que

hace posible una estimación del grado de inhibición del crecimiento del

microorganismo de una forma bastante simple. Los parámetros más importantes

de este método son, el diámetro del disco de papel, la cantidad del aceite esencial

y el tipo de solvente de dispersión (Kalemba y Kunicka, 2003).

C.1. Preparación de los inoculos bacterianos

Cada bacteria fue cultivada en caldo Müeller-Hinton e incubadas a 37ºC durante

18 horas. A partir de este cultivo, se tomó una parte y se diluyó con solución

salina fisiológica estéril (0,85%) hasta obtener una turbidez visualmente

comparable al patrón McFarland Nº 0,5, equivalente a 106-8 UFC/mL (Velasco et

al, 2007).

C.2. Preparación de las placas de Petri Agar Müeller-Hinton

Las cápsulas de Petri de 5-12 cm de diámetro (usualmente 9 cm) se llenaron con

20 ml de caldo de Agar Müeller-Hinton previamente esterilizado (figura 9) y luego


57

se dejaron solidificar a 4°C durante varias horas,una vez solidificado se inocularon

en forma homogénea cada microorganismo de ensayo en la superficie del agar

con un hisopo estéril.

FIG. 9: PREPARACIÓN Y ESTERILIZACIÓN DEL MEDIO AGAR MÜELLER-HINTON


58

C.3.Impregnación de los discos

Se utilizaron discos de papel de filtro de 4milímetros (mm) de diámetro

previamente esterilizados en cámara de flujo laminar bajo rayos UV durante 12

horas aproximadamente (figura 10). Se realizarondiluciones del aceite esencial

conel solvente dimetilsulfóxido (DMSO)y se impregnaron los discoscon 10µl del

aceite puroy diluciones del aceite con concentraciones de 30 μg/mL,15 μg/mL y 10

μg/mL. Tambiénse impregnaron los discos con el solventeDMSO el cual se utilizó

como control negativo para comprobar la posible actividad de este solvente frente

a las bacterias ensayadas (Velasco et al, 2007)(figura 11). Y los controles

positivos estuvieron representados por discos de antibióticos comercialeslos

cuales inhibieronel crecimiento bacteriano de las cepasensayadas grampositivas y

gramnegativas pertenecientes a la Colección de Cultivo Tipo Americano (ATCC)

(tabla IX). En seguida se colocaron en la superficie del agar inoculado, de forma

equidistante los discos de papel de filtro ya impregnados, el control negativo y

controles positivos respectivos para cada microorganismo(figura 12). Los ensayos

se realizaron por duplicado.


59

FIG. 10: ESTERILIZACIÓN DE LOS DISCOS DE PAPEL DE FILTRO

FIG. 11: IMPREGNACION DE LOS DISCOS DE PAPEL DE FILTRO


60

TABLA IX. MICROORGANISMOS Y CONTROLES POSITIVOSUTILIZADOS

MICROORGANISMOS CONTROLES POSITIVOS

GRAM POSITIVAS

Staphylococcus aureus ATCC 25923 Erytromicina® (15 μg)

Enterococcus faecalis ATCC29212 Ampicilina® (10μg)

GRAM NEGATIVAS

Escherichia coli ATCC 25922

Pseudomona aeruginosa ATCC27853 Amikacina® (30μg)

Klebsiella pneumoniae ATCC 23357

1. Aceite puro de Chromolaena meridensis.

2. Aceite diluido (30 μg/mL, 15μg/mL, 10μg/mL)deChromolaena meridensis.

3. Control positivo (antibióticos comerciales)

4. Control negativo (solvente DMSO)

1

FIG. 12: REPRESENTACIÓN GRÁFICA DE LA UBICACIÓN DE LOS DISCOSIMPREGNADOS

2

3 4


61

C.4. Incubación

Posteriormente el medio de cultivo inoculado se dejó en preincubación durante 6 -

7 horas a4 °C y luego se incubaron a37 °C durante 24 horas (De los Ríos et al,

1999).

C.5. Lectura de la prueba

Transcurrido el tiempo de incubación se precedió a realizar la lectura de los halos

de inhibición; el diámetro de la zona de inhibición producto de la actividad

antibacteriana del aceite se expresó en milímetros (mm) (Velasco et al, 2007).En

los casos donde no se observo halo de inhibición la prueba se interpreto como

negativa o resistente.

C.6. Concentración inhibitoria mínima (CIM)

Después de la lectura de los halos de inhibición se procedió a realizar la

concentración inhibitoria mínima (CIM), necesaria para inhibir la producción y

multiplicación del crecimiento visible de las cepas ensayadas que resultaron ser

sensibles (positivas) al aceite esencial de la especie Chromolaena meridensis.

Para esto se empleó el método de Difusión en Agar con Discos que se utilizo

inicialmente para la determinación de la actividad antibacteriana. Se tomó una


62

parte las cepas bacterianas puras con un asa estéril y se colocaron en SSF 0,85

%, que luego fueron comparados con el patrón de turbidez de Mac Farland N° 0.5

(106-8 UFC/mL). La impregnación de los discos de papel de filtro previamente

esterilizados en cámara de flujo laminar bajo rayos UV, se realizó condiluciones

del aceite en un intervalo de concentraciones entre 1,25 μg/mL y 10 μg/mL.

También se impregnaron los discos con el solvente DMSO y los controles

positivos estuvieron representados por los antibióticos comerciales. Los ensayos

se realizaron por duplicado. Transcurrido el tiempo de incubación se realizo la

lectura de los halos de inhibición.


63

D. Diseño Experimental

Recolección.

ecioapiculata

Identificación.

Partes aéreas frescas.

Equipo de Hidrodestilación empleando latrampa de Clevenger.

Separación e identificaciónpor Cromatografía de GasesAcoplada a Espectrometría

de Masas.

Adición de sulfatoanhidro.Frasco hermético color ámbar, 4–5 °C.

Material vegetalChromolaena meridensis.


64

Método de Difusión en Agar usando disco de papel.

Preparación de los inoculos bacterianos en SSF 0,85 % y comparación conel patrón de Turbidez Mac Farland N° 0,5 (106-8 UFC/mL)

Siembra en Agar Müeller - Hinton.

Impregnación de los discos de 4 mm de diámetro con 10 µl del aceite esencial puroydiluido a 30 μg/mL, 15μg/mL y 10 μg/mL de Chromolaena meridensis y con el

respectivo solvente (DMSO).

Preincubación.4 °C – 6 a 7 horas.

Incubación.37 °C – 24 horas.

Lecturas de los halos de inhibición.

CIM a las cepas sensibles frente al aceite esencial.

Resultados ydiscusión.

Conclusión.


65

VIII. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

El aceite esencial de la especie Chromolaena meridensis (B. L. Rob.) R.M. King &

H. Rob., recolectada en San Rafael de Mucuchíes. Mérida-Venezuela, se obtuvo a

partir de las partes aéreas del material vegetal fresco licuadas con agua para un

mayor rendimiento del aceite, las cuales se sometieron a un proceso de

Hidrodestilación empleando la trampa de Clevenger. El aceite obtenido presentó

las siguientes características físicas y organolépticas (tabla X).

TABLA X: CARACTERÍSTICAS FÍSICAS Y ORGANOLÉPTICAS DEL ACEITEESENCIAL DE LA ESPECIE Chromolaena meridensis

CARACTERÍSTICAS ACEITE ESENCIAL

Aspecto Transparente

Color Amarillo

Peso de hojas 1600gr

Volumen del aceite 1 mL

Rendimiento porcentual (%) 0,063


66

Luego de la obtención del aceite esencial, se realizóun análisis para conocer su

composición química empleando un equipo de Cromatografía de GasesAcoplada

a un Espectrómetro de Masas marcaHewlett Packard 5973.En la figura 13 se

presenta el cromatograma de las partes aéreas del aceite esencial

deChromolaena meridensis.

En la tabla XI se muestran los componentes volátiles presentes, tiempo de

retención y abundancia relativa de cada uno de ellos. En total se lograron

identificar 11 compuestos que representan más del 99% de los compuestos

presentes en el aceite esencial y corresponden en su mayoría a sesquiterpenos

monociclicos que constituyen el 97,75% del total de compuestos, seguido de

monoterpenos con un 0,28%, aldehído 0,54% y alqueno 0,87%. Los componentes

mayoritarios resultaron ser los sesquiterpenos: α – zingibereno (65,26%)[17], α –

curcumeno (13,74%)[21], α - humuleno (8,20)[22], β – sesquifelandreno

(4,06%)[23] yβ - cariofileno (2,93%)[24]; cuyas estructuras se representan en la

figura 14.


67

FIG. 13: CROMATOGRAMA DEL ACEITE ESENCIAL DE LAS PARTES AÉREAS DE LAESPECIEChromolaena meridensis


68

TR: Tiempo de retención obtenido en el equipo CG-EM

A: Área

IKcal: Índice de kováts calculado

IKlit: Índice de kováts de la literatura

COMPONENTES TR A % IK cal IK lit

Benzaldehído 5.705 0.54 965 961

Mirceno 6.367 0.13 991 991

α – terpineno 6.650 0.15 1002 1018

α – terpinoleno 9.086 0.87 1092 1088

β - cariofileno 19.592 2.93 1420 1418

α – bergamoteno 20.069 1.98 1438 1436

α - humuleno 20.664 8.20 1459 1454

α – curcumeno 21.500 13.74 1487 1483

α – zingibereno 22.095 65.26 1507 1495

β – bisaboleno 22.319 1.58 1514 1509

β – sesquifelandreno 22.758 4.06 1529 1524

TABLA XI: COMPONENTES VOLÁTILES DEL ACEITE ESENCIAL DEChromolaena meridensis


69

SESQUITERPENOS

[17] [21] [22]

[23][24]

H

H

HH

FIG. 14: ESTRUCTURAS QUÍMICAS DE LOS COMPONENTES MAYORITARIOSDEL ACEITE ESENCIAL DEChromolaena meridensis


70

Según la literatura consultada no existen estudios previos sobre la composición

química del aceite esencial de Chromolaena meridensis, sin embargo se han

estudiado otras especie pertenecientes al género.

En el año 2002 Maia et al, 2002reportó el sesquiterpeno α- zingibereno como

componente mayoritario del aceite esencial de Chromolaena marginatum en una

proporción de 57,5%, lo cual coincide con los resultados reportados

paraChromolaena meridensis, que presenta dicho compuesto en un 65,26%.

En este mismo estudio se reportó el compuestoβ- cariofileno en el aceite esencial

deChromolaena squalidum, Chromolaena amygdalinun y Chromolaena

conyzoides en proporción de 7,1% para las tres especies, mientras que para

Chromolaenameridensis, este compuesto se encontró en un 2,93%.

Por otra parteOwolabi et al, 2010reportó también en su estudioel compuestoβ-

cariofileno,presentecomo uno de los componentesmayoritarios del aceite esencial

de Chromolaena odorataen un 5,4%.

Para el estudio de la actividad antibacteriana del aceite esencial de Chromolaena

meridensis, se empleó el Método de Difusión en Agar con discos de papel

utilizandocepas de referencia grampositivas y gramnegativas, presentando


71

actividad inhibitoria frente a las cepas de Staphylococcus aureusATCC 25923,

Streptococcus faecalisATCC 29212 y Klebsiella pneumoniaeATCC 23357, con

halos que oscilan entre 6 a 11 mm de diámetro y una concentración inhibitoria

mínima de 10 μg/mL . En la tabla a continuación se representan las lecturas de las

zonas de inhibición expresadas en milímetro (mm) y CIM.


72

MicroorganismosAceitepuro

30 15 10 CIM

Staphylococcus aureusATCC 25923 11 8 7 5 10

Streptococcus faecalisATCC 29212 10 8 7 7 10

Escherichia coliATCC25922 R R R R _

Pseudomona aeruginosaATCC 27853 R R R R _

Klebsiella pneumoniae ATCC 23357 9 6 6 6 10

R: Resistente

CIM: Concentración Inhibitoria Mínima

ATCC: Colección de Cultivo Tipo Americano

-: No hubo actividad

Rango CIM: 1,25 μg/mL – 10 μg/mL

TABLA XII: ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA DEL ACEITE ESENCIAL DE LA ESPECIEChromolaena meridensis

Zonas de inhibición expresadas en mm

Concentraciones en μg/mL


73

La actividad antibacteriana que se manifestó se podría atribuir a la presencia de

los compuestosα-zingibereno, β-sesquifelandreno y β-cariofileno, que han sido los

responsables de la actividad antibacteriana en otros géneros.

En un estudio realizadoen Turquía porKahriman et al, 2011 se comprobó que el

componente mayoritario α- zingibereno presente en el aceite esencial de las hojas

deSenecio pandurifolius,demostró una actividad inhibitoria (por el Método de

Difusión en Agar) frente a las cepas de referencia Staphylococcus aureus y

Enterococcus faecalis con halos de inhibición de 15 mm y 12 mm de diámetro

respectivamente, resultando la concentración más baja capaz de inhibir las cepas

6,5 μg/mL. Parael caso de Chromolaena meridensisel compuesto α–

zingiberenotambién está presente en el aceite esencial de las hojas frescas en

mayor proporción y la actividad antibacteriana se manifestó contra las mismas

cepas con halos de inhibición para el caso de Staphylococcus aureusde 11 mm de

diámetro y Enterococcus faecalisde 10 mm de diámetro, con una Concentración

Inhibitoria Mínima de 10μg/.

Por otra parte en un estudio realizado por El-Baroty etal, 2010se caracterizó la

propiedad antibacterial de los compuestos β-sesquifelandreno y β – cariofileno

presentes en el aceite esencial extraído del rizoma de jengibre en gran


74

proporción, frente a las cepas de referencia: Staphylococcus aureus yKlebsiella

pneumoniae.Encontrándose similitud con los resultados reportadosen el presente

estudio, dondela actividad inhibitoria se mostró frente a las mismas cepas y los

componentes β-sesquifelandreno y β – cariofilenotambién están presentes en el

aceite esencial de Chromolaena meridensis.

Aun cuando existen estudios que confirman la actividad inhibitoria de algunos

extractos de diferentes especies del género Chromolaena sobre una variedad de

cepas bacterianas (Torrenegra et al, 2007; Sanabria et al, 1998; Sanabria et al,

1989; Sanabria y Carrero, 1995; y Hidalgo et al,1998), este es el primer estudio

que se realiza para evaluar la actividad inhibitoria del aceite esencial de la especie

Chromolaena meridensis contra cepasde referencia grampositivas

(Staphylococcus aureusATCC 25923 y Streptococcus faecalisATCC 29212) y

gramnegativas (Escherichia coliATCC 25922, Pseudomona aeruginosaATCC

27853y Klebsiella pneumoniae ATCC 23357).


75

IX. CONCLUSIONES

El aceite esencial extraído de las partes aéreas de la especie Chromolaena

meridensis por el método de Hidrodestilaciónempleando la trampa de

Clevenger mostró un rendimiento de 0,063%.

Los componentes identificados de acuerdo al análisis cromatográfico y

espectroscópicoresultaron ser 11 compuestos, en su mayoría sesquiterpenos

monociclicos que representan el 97,75% del total de compuestos, luego

monoterpenos con un 0,28 %, alqueno 0,87 % y aldehído 0,54 %.

Los componentes mayoritarios del aceite esencial, están representados en su

totalidad por los sesquiterpenos: α – zingibereno (65,26%), α – curcumeno

(13,74%), α - humuleno (8.20), β – sesquifelandreno (4,06%) y β - cariofileno

(2,93%).

El aceite esencial de Chromolaena meridensis, presentó actividad inhibitoria

frente a tres de las cepas ensayadas: grampositivas (Staphylococcus aureus

ATCC y Streptococcus faecalis ATCC 29212) y gramnegativas (Klebsiella

pneumoniae ATCC 23357); y una Concentración Inhibitoria Mínima de 10

μg/mL.


76


77

ANEXO 1: VOUCHER DE LA ESPECIEChromolaena meridensis UBICADO

EN EL HERBARIO MERF


78

ANEXO 2: EQUIPO DE HIDRODESTILACION EMPLEANDO LA TRAMPA DECLEVENGER


79

ANEXO 4:COLOCACIÓN DE LOS DISOS IMPREGNADOS CON ELACEITE ESENCIAL DE C. meridensisy CON DMSO

ANEXO 3:DISCOS DE PAPEL DE FILTRO DE 4 MILÍMETROS DEDIÁMETRO


80

ANEXO 5:ENSAYO DE LA CEPA DEE. coli ATCC 25922

ANEXO 6:ENSAYO DE LA CEPA DE K. pneumoniaeATCC 23357


81

ANEXO 7: ENSAYO DE LA CEPA DE P. aeruginosaATCC 27853

ANEXO 8: ENSAYO DE LA CEPA DE S. aureusATCC 25923


82

ANEXO 9: ENSAYO DE LA CEPA DE E. faecalisATCC 29212


83

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Adams, R. (1995). Identification of Essential Oil Components by Gas

Chromatography/Mass Spectroscopy.USA: Allured Publishing.

Albornoz, A. (1997). Medicina tradicional herbaria. Caracas-Venezuela: Instituto

Farmacológico Latino. (Tercera edición).

Albornoz, A. (1980). Productos Naturales: Estudio de las sustancias y drogas

extraídas de las plantas. Caracas-Venezuela: Impresos Urbina. (Cuarta edición).

Amat, A. (1983). Taxones de Compuestas Bonaerenses Críticos para la

Investigación Farmacológica. Acta Farmacológica Bonaerense, 1, (2), 23-26.

Aristeguieta L. (1964). Flora de Venezuela. Compositae. Volumen X primera

parte. Mérida- Venezuela: (Edición especial del Instituto Botánico).

Arrázola, R. S; Atahuachi, M; Sarabia, E; y López, A. (2002). Diversidad Florística

Medicinal y Potencial Etnofarmacológico de las Plantas de los Valles de

Cochabamba-Bolivia. Revista Colombiana de Ecología y Conservación

Ambiental, 12, 53-85.

Badillo, V. (2001). Lista Actualizada de las Especies de la Familia Compuestas

(Asteraceae) en Venezuela. Ernstia, 11, (3), 199 - 213.


84

Barrios, A. (1988). Bacteriología y Virología Básicas. Mérida-Venezuela:

Venezolana. (Primera edición).

Bremer, K. (1994). Asteraceae. Cladistics and Classification. Oregon USA:

Timber Press. 752. Obtenido el día 2 de Marzo del 2010, desde

http://www.socbot.org.ve/congreso/memorias/PDF/F-03.pdf.

Bruneton, J. (2001). Farmacognosia Fitoquímica Plantas Medicinales.

Zaragoza-España: Acribia. 227-229. (Segunda edición).

Castañeda, D; Urueña, C; Rodríguez, O; y Torrenegra, R. D. (2007). Un flavonoide

de Chromolaena tacotana induce despolarización de la membrana mitocondrial en

células normales. Scientia et technica, 8, (33), 317.

Chambers, H. (2003). Fármacos antimicrobianos. Consideraciones generales:

Las bases farmacológicas de la terapéutica. Goodman & Gilman, 2. México

DF: McGraw-Hill Interamericana. (Décima edición).

Dabrio, B. (1971). Cromatografía de Gases I. España- Madrid: Alhambra.

(Primera edición).

Dabrio, B. (1973). Cromatografía de Gases II. España- Madrid: Alhambra.

(Segunda edición).


85

Delgado, P. (1989).Contribución al Estudio Fitoquímico del Género Chromolaena.

Componentes Químicos de la C. meridensis (B. L. Robinson) K y R., y la C.

subscandens (Hieron) K y R. Tesis de Post grado en Química de Medicamentos.

Mérida-Venezuela. Universidad de los Andes. Facultad de Farmacia.

De los Ríos, C; Hidalgo, D; Quintero, M, Márquez, G; y Cresente, O. (1999).

Estudio preliminar in vitro de la actividad biológica de Chromolaena voglii

(Robinson) H. Huber. Revista de la Facultad de Farmacia, 36, 2-5.

De Pérez, C. (1994). Química del Género Chromolaena (Compositae). Revista

Académica Colombiana Científica, 19, (72), 141 - 145.

Dewick P. M. (2002). Medicinal Natural Products a Biosynthetic Approach.

England: Jhon Wiley & Sons. (segunda edición)

Domínguez, X. (1973). Métodos de Investigación Fitoquímica. México: Limusa.

(Primera edición).

El-Baroty, G; El-Baky, H; Farag, R; y Saleh, M. (2010). Characterization of

Antioxidant and Antimicrobial Compounds of Cinnamom and Ginger Essential Oil.

African Journal of Biochemistry Research, 4, (6), 167 – 174.

Freire, S. E; y Urtubey, E. (1999). Compuestas Medicinales de la Provincia

Biogeográfica Pampeana. Claves para su Determinación e Iconografía. Parte II.


86

Compuestas con Capítulos Isomorfos y Papús Filosos. Grupo 3. Acta

Farmacológica Bonaerense, 4, (18), 283-294.

Fuertes, C; Jurado, B; Gordillo, G; Negrón, L; Nuñez, E; Esteban, M; y Távara, A.

(2010). Estudio Integral de Plantas Biocidas del Algodonero. Ciencia e

investigación, 1, (13), 34 - 41.

Gil, O. R; Mejías, R; Carmona, J; Mejías, R, y Rodríguez, M. (2003). Estudio

Etnobotánico de algunas plantas medicinales expendidas en los herbolarios de

Mérida, Ejido y Tabay (Estado Mérida-Venezuela). Revista de la Facultad de

Farmacia, 4, (1), 69-76.

Gómez, M. A; Torres, J. M; Manrique, J. J; Cerda, C. M, Rio, R.E; Motilva, V;

García, S; Talero, E; Ávila, J; y Joseph, P. (2011). Nuevas Pirrolizidinas de

Chromolaena pulchella. Revista Latinoamericana de Química, 38, (suplemento

especial), 39.

Grossi, G. P. (2009). Manejo de Pacientes con Úlcera Venosa de Miembros

Inferiores. Tesis de Post Grado en Clínica Médica. Argentina. Universidad

Nacional de Rosario.


87

Gutiérrez, S. P; Zavala, M. A; Pérez, C; y Arias, L. (2007). Antidiarrhoeal Activity of

Different Plants Used in Traditional Medicine. African Journal of Biotechnology,

6, (25), 2988-2994.

Hidalgo, D. B; Ríos, C; Crescente, O; y Caserta, A. (1998). Antibacterial and

Chemical Evaluation of Chromolaena moritziana. Journal of Etnopharmacology,

3, (59), 203-206.

Hokche, O; Paul, E; y Huber, O. (2008). Nuevo Catálogo de la Flora Vascular de

Venezuela. Caracas-Venezuela: Fundación Instituto Botánico de Venezuela Dr.

Tobías Lasser.

Kahriman, N; Tosun, G; Terzioglu, S; Alpay , S; y Yaylı, N. (2011). Chemical

Composition and Antimicrobial Activity of the Essential Oil from The Flower, Leat,

and Stem of Senecio pandurifolius. Record of Natural Products, 5,(2), 82-91.

Kalemba, D; y Kunicka, A. (2003). Antibacterial and Antifungal Properties of

Essential Oils. Current Medicinal Chemistry, 10, (10), 813-829.

Lajones, A. (2006). Plantas Medicinales Utilizadas por los Habitantes del Sitio

la Siberia y de la Parroquia Bolívar. Ecuador: Ecocosta Guayaquil.


88

Maia, J; Zoghbi, M; Andrade, E; Da Silva, M; Luz, A;y Da Silva J. (2002). Essential

Oils Composition of Eupatorium Species Growing wild in the Amazon.

Biochemical Systematics and Ecology, 30, (11) 1071-1077.

Marcano, D; y Hasegawa, M. (1991). Fitoquímica Orgánica. Caracas-Venezuela:

Litopar. (Primera edición).

Marcano, D; y Cortés, L. (1998). Fundamentos de Química Orgánica. Caracas-

Venezuela: SADPRO.

Marcano, D; y Hasegawa, M. (2002). Fitoquímica Orgánica. Caracas-Venezuela:

Torina. (Segunda edición).

Martínez, C. (1981). Las Plantas Utilizadas en Medicina Popular en el

Noroeste de Corrientes. San Miguel de Tucumán: Misceláneas.

Marzocca, A. (1997). Vademécum de Malezas Medicinales de la Argentina

Indígenas y Exóticas. Argentina: Orientación Grafica Editora.

Moreno, M; Oscar, E; Crescente, V; Ortiz, M; y Quintero, M. (2006). Composición

Química y Actividad Toxica Del Aceite Esencial de Simsia pubescens Triana

Shailili M. Interciencia, 31, (10), 745-747.


89

Owolabi, M.S; Ogundajo, A; Yusuf, K. O; Lajide, L; Villaneva, H. E; Tuten, J. A; y

Setzer, W. N. (2010). Chemical Composition and Bioactivity of the Essential Oil of

Chromolaena odorata from Nigeria. Records of Natural Products, 4, (1), 72-78.

Paraje, R; y Paraje, A. (1976). Microbiología Clínica. Buenos Aires- Argentina:

Panamericana. (Segunda edición).

Pelczar, M. J; y Chan, E. (1984). Elementos de Microbiología. Mexico: Mc Graw

Hill. (Segunda edición).

Prescott, L; Harley, J; y Klein, D. (1999).Microbiología. Madrid-España: Mc Graw

Hill interamericana. (Cuarta edición).

Prescott, L; Harley, J; y Klein, D. (2004). Microbiología. Madrid-España: Mc Graw

Hill interamericana. (Quinta edición).

Rodríguez, A; y Torrenegra, G. (2007). Química y Actividad Biológica de

Chromolaenaperglabra.Scientia et Technica Año XIII, 13,267-278.

Sanabria, A; y Carrero, M. T. (1995). Un Flavononol con Actividad Antimicrobiana

de Chromolaena tacotana. Revista Colombiana de Ciencias Químico -

Farmacéuticas, 24, 24-28.


90

Sanabria, A; García, A. M; Torres, A. M; y Mantilla, R. (1989). Actividad

Antimicrobiana de Chromolaena tequendamensis (Hieron). R. King. H. Robinson.

Revista Colombiana de Ciencias Químico - Farmacéuticas, 17, 39-43.

Sanabria, A; Mendoza, A; y Morena, A. L. (1998). Actividad Antimicrobiana in vitro

de Angiospermas Colombianas. Revista Colombiana de Ciencias Químico-

farmacéuticas, 27, 47-51.

Sánchez, C. (2006). ¿Antibióticos, ayer, hoy y mañana…?. Revista Química Viva,

(2), 63 - 70.

Santander, S. P; Urueña, C; Rodríguez, O. E; y Torrenegra, R. D. (2007). El

Flavonoide CB2 Obtenido de Chromolaena bullata Induce Activación de Células

Dendríticas Humanas. Scientia et Technica, 13, (33), 313.

Torrenegra, R. D; Guzmán, A. J; y Rodríguez, O. E. (2007). Análisis Fitoquímico

de la Especie Chromolaena subscandes (Hieron) R.M. King. H. Rob., y

Determinación de su Actividad Antimicrobiana. Scientia et Technica, 13, (33),

271-273.

Torres, J. M. (2011). Estudio Químico de Especies Vegetales para la Obtención de

Principios Activos Anticancerosos y Antiinflamatorios. Boletín de la Sociedad

Química de Moxicoco, 5, (2), 65.


91

Tyler, V; Brady, L; y Robbers, J. (1988). Pharmaconogsy.Philadelphia: Lea &

Febiger. (Novena edición).

Vaera, Y; Vaera Yaiporu, Y; y Ivira, Ñ. (2002). Plantas del Chaco II. Usos

Tradicionales Izoceño - Guaraní. Santa Cruz: Geneview Bourdy. (Segunda

Edición).

Velasco, J; Rojas, J; Salazar, P; Rodríguez, M; y Díaz, T. (2007). Antibacterial

Activity of the Essential Oils of Lippia Oreganoides Against Multiresistant Bacterial

Strains of Nosocomial Origin. Natural Product Communications, 2, (1), 85 - 88.

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