Evaluación de la respuesta del frijol común a la inoculación con Rhizobium y Micorriza Vesículo-Arbuscularla inoculación con Rhizobium y Micorriza
Vesículo-Arbuscular
la inoculación con Rhizobium y Micorriza
Vesículo-Arbuscular
Proyecto especial de graduación presentado como requisito parcial para optar
al título de Ingeniero Agrónomo en el
Grado Académico de Licenciatura
iii
Evaluación de la respuesta del frijol común a la inoculación con Rhizobium y
Micorriza Vesículo-Arbuscular
Diego José Paladines Cueva
Resumen. El frijol (Phaseolus vulgaris L.) es un cultivo importante en Latino América y
África. La baja fertilidad de los suelos es una de las limitantes del rendimiento. El objetivo
fue evaluar la respuesta del frijol común a la inoculación con Rhizobium y micorrizas
vesículo-arbusculares (MVA). Se evaluaron cuatro tratamientos de inoculación: 1)
Rhizobium, 2) MVA, 3) Rhizobium + MVA y 4) Sin inoculación, en las variedades de frijol
Amadeus 77 y Seda. Los ensayos se condujeron en tres lotes: 1) La Vega 4 con bajos
contenidos de N y P; 2) Lote 25 bajo en N y alto en P más fertilización; 3) Bancales con
sustrato suelo, arena y compost bajo en N y alto de P. Se utilizó un diseño de bloques
completos al azar con seis repeticiones en campo (lote 25 y vega 4) y tres en bancales. A la
floración se midieron la biomasa, nodulación (escala 1-9), infección de raíces y esporas
MVA en el suelo. A la madurez se evaluó el rendimiento. Las mayores diferencias fueron
debidas a las diferencias en N y P en los lotes. La nodulación e infección de raíces fueron
favorecidas por condiciones de bajo N y P y afectadas por los contenidos altos de nutrientes
en el suelo y la fertilización. Se observó una competencia entre la nodulación por Rhizobium
y la infección de raíces por MVA.
Palabras clave: Conteo de esporas, infección de raíces, nodulación, Phaseolus vulgaris L.,
rendimiento.
Abstract. Bean (Phaseolus vulgaris L.) is an important crop in Latin America and Africa.
Low fertility of soils is one of the limiting factors of yield. The objective was to evaluate
the response of common bean to inoculation with Rhizobium and vesicle-arbuscular
mycorrhizae (VAM). Four inoculation treatments were evaluated: 1) Rhizobium, 2) VAM,
3) Rhizobium + VAM and 3) without inoculation, in the varieties of Amadeus 77 and Seda
beans. The trials were conducted in three lots: 1) La Vega 4 with low N and P contents, 2)
Lot 25 low in N and high P plus fertilization, 3) Substrates with soil, sand and compost low
in N and high P. A randomized complete block design with six and three replicates was
used. Flowering biomass, nodulation (scale 1-9), root infection and VAM spores in the soil
were measured. At maturity, the performance was evaluated. The largest differences were
due to the differences in N and P in the lots. Root nodulation and infection were favored by
low N and P conditions, and affected by high nutrient contents in soil and fertilization. A
competition between Rhizobium nodulation and VAM root infection was observed.
Key words: Infection root, nodulation, Phaseolus vulgaris L., spore count, yield.
iv
CONTENIDO
1. INTRODUCCIÓN .............................................................................................. 1
4. CONCLUSIONES .............................................................................................. 13
5. RECOMENDACIONES .................................................................................... 14
Cuadros Página
1. Resultados de los análisis de suelos de los lotes Vega 4, Lote 25/ZII y Bancales. Zamorano. Honduras, 2017. ................................................................ 4
2. Conteo de esporas de micorriza vesículo-arbuscular en los lotes, Vega 4 Lote 25/ZII y Bancales. Zamorano. Honduras, 2017. ........................................ 4
3. ANDEVA de nodulación, infección, número de esporas, biomasa y rendimiento de factores e interacciones. Zamorano. Honduras, 2017. ............... 7
4. Efecto de lote en nodulación, infección de raíces, número de esporas, biomasa y rendimiento. Zamorano. Honduras, 2017. ........................................ 8
5. Efecto de la inoculación con Rhizobium y micorriza vesículo- arbuscular (MVA) en la nodulación, infección de raíces, número de esporas,
biomasa y rendimiento. Zamorano. Honduras, 2017. ........................................ 9
6. Efecto de genotipo en nodulación, infección, número de esporas, biomasa y rendimiento. Zamorano. Honduras, 2017. ......................................... 9
7. Efecto de la interacción lote × genotipo en nodulación (escala 1-9).
Zamorano. Honduras, 2017. ............................................................................... 10
8. Efecto de la interacción genotipo × lote para la variable biomasa (gplanta-1).
Zamorano. Honduras, 2017. ............................................................................... 10
9. Efectos de la interacción genotipo × lote para la variable rendimiento (kgha-1). Zamorano. Honduras, 2017. ................................................................ 11
10. Efecto de la interacción lote × inóculo para la variable biomasa (gplanta-1).
Zamorano. Honduras, 2017. ............................................................................... 11 11. Efectos de la interacción lote × inóculo para la variable rendimiento
(kgha-1). Zamorano. Honduras, 2017. ............................................................... 12
Figuras Página
1. Escala de nodulación temprana (1-9). Donde: 1= ausencia de nódulos, 3= < 10 nódulos pequeños (< 1 mm), 5= 10-20 nódulos pequeños-medianos
(1-2 mm), 7= 20-30 nódulos medianos-grandes (2-3 mm), 9= > 30 nódulos
grandes (> 3 mm). ............................................................................................... 5
Anexos Página
1. Procedimiento para clarificar y teñir muestras de raíces. .................................... 18 2. Procedimiento para aislar esporas de micorriza. ................................................. 19
1
1. INTRODUCCIÓN
El fríjol común (Phaseolus vulgaris L.) es un grano básico que cumple un papel muy
importante en la dieta de la mayoría de la población en Centro América y es considerado
una fuente barata de proteínas y calorías. En Honduras, el frijol es el segundo grano básico,
después del maíz, en producción y consumo. Su cultivo se concentra en varias regiones del
país, principalmente en los departamentos de El Paraíso, Francisco Morazán, Olancho y la
región de Occidente (Escoto 2004).
La producción es realizada en fincas pequeñas con condiciones topográficas de laderas con
suelos pobres de bajo contenido de materia orgánica y nutrientes, además, con períodos
frecuentes de sequía. Además, los pequeños agricultores cuentan con un bajo nivel
tecnológico y una escasa disponibilidad de recursos para la implementación de prácticas de
manejo y poca rentabilidad (Graham et al. 2003). La baja disponibilidad de nutrientes en el
suelo causa un impacto relevante ya que es indispensable para el balance nutricional del
desarrollo de las plantas (López et al. 1985).
La forma más común de aumentar la cantidad de nutrientes del suelo es el uso de
fertilizantes sintéticos (Aguado 2012), sin embargo, esta adición tiene factores negativos en
aspectos ambientales y sanitarios (Fernández et al. 2002). Además de los efectos negativos
mencionados, el factor económico afecta a pequeños agricultores y de subsistencia
impidiéndoles adquirir estos fertilizantes. Una alternativa más económica es la de optar por
la biofertilización que consiste en el uso de microorganismos, principalmente hongos y
bacterias, que viven en simbiosis o asociadas a las plantas para aumentar la disponibilidad
de nutrientes y brindar protección (Grageda et al. 2012).
El Rhizobium es una bacteria Gram negativa que se asocia en las raíces de las leguminosas
y forma nódulos en los cuales capta el nitrógeno atmosférico (N2) y lo reduce a amoniaco,
este proceso se lo conoce como fijación biológica de nitrógeno (FBN). La disponibilidad
del nitrógeno puede aumentar 60-80% por medio de la actividad del Rhizobium (Cuadrado
et al. 2009). El Nitrógeno (N) forma parte de las estructuras de clorofila, enzimas y proteínas
que son necesarias para el desarrollo foliar y radicular de las plantas (Benites 2016). Las
micorrizas de tipo vesículo - arbuscular (MVA) son hongos del Phylum Glomeromycota
que se asocian a la raíz y ayudan a la planta a incrementar el volumen de raíces, absorción
de fósforo (P) principalmente, además de N, potasio (K) y calcio (Ca), además ayuda a
tolerar cambios de temperatura y acidez (Grageda et al. 2012). El P cumple aspectos
importantes para las plantas, forma parte del núcleo, ADN, ARN, fosfolípidos (forman la
membrana), fotosíntesis (ATP, ADP y NADPH), respiración, entre otras reacciones de gran
importancia para la planta (Srivastava et al. 1996).
2
La interacción de los dos microorganismos mencionados se da directamente en la rizósfera,
esta interacción favorece a la actividad del Rhizobium incrementando la cantidad de nódulos
(Linderman 1992). A pesar del enorme potencial de los beneficios en el crecimiento y
productividad de los cultivos cuando se les inocula con cepas de Rhizobium y de MVA, la
utilización de estos inoculantes en Centro América es todavía limitado. Desde hace dos
décadas Zamorano produce ambos tipos de inoculantes y promueve su utilización en Centro
América. La evaluación de la respuesta a la doble inoculación con cepas de Rhizobium y
MVA en el cultivo de frijol común ha sido escasamente estudiada en la región, sin embargo,
existen estudios con respuesta positiva a la doble inoculación con cepas de MVA y
Trichoderma (Westermann 2004). Algunos estudios demuestran los beneficios de estas
tecnologías, sobre todo bajo condiciones limitantes de fertilidad de suelo y baja cantidad de
insumos, condiciones que caracterizan a la mayoría de los pequeños productores de frijol
de la región (Graham et al. 2003). El objetivo del estudio fue:
Evaluar la respuesta del frijol común a la inoculación con cepas de Rhizobium y
micorrizas vesículo-arbusculares (MVA) en el crecimiento y rendimiento del cultivo.
3
Ubicación del estudio.
El proyecto se realizó en las instalaciones del Programa de Investigaciones en Frijol (PIF)
de la Escuela Agrícola Panamericana (EAP) Zamorano, Valle del Yegüare, Departamento
de Francisco Morazán, ubicada a 30 km de Tegucigalpa, Honduras, a una altura de 800
msnm. El estudio se llevó a cabo durante los meses de mayo-septiembre del 2017, con
temperaturas máximas y mínimas promedio de 31 y 19 °C.
Tratamientos.
Los tratamientos evaluados fueron la inoculación con Rhizobium, inoculación con
micorrizas vesículo - arbuscular (MVA), inoculación de la mezcla Rhizobium con MVA y
sin inoculación (testigo), y dos genotipos (Amadeus 77 y Seda), para un total de ocho
tratamientos. La variedad mejorada de frijol Amadeus 77 presenta las siguientes
características: hábito de crecimiento arbustivo- indeterminado tipo II y de madurez
temprana de 68 – 70 días después de siembra (DDS). La semilla es de color rojo claro
brillante, de forma ovoide alargada y un peso de 25 g/100 semillas. La variedad criolla Seda
presenta las siguientes características: hábito de crecimiento arbustivo indeterminado tipo
II, con guía corta- intermedia, madurez precoz 66 - 68 DDS. Color de semilla tipo rojo de
seda, de forma ovoide y un peso de 19 g/100 semillas, de alto valor comercial y de
preferencia por el agricultor por sus características físicas y organolépticas. A pesar de ser
susceptible a factores bióticos y abióticos, su producción y consumo siguen siendo
importantes en la región.
El estudio se desarrolló en tres lotes que presentaron características diferentes en cuanto a
la concentración de nitrógeno (N) y fósforo (P) principalmente. Los análisis de suelo
realizados en Laboratorio de Suelo de Zamorano (Cuadro 1), indican que el Lote 25/Zona
II presentó un bajo contenido de N y alto en P; La Vega 4 de Monte Redondo bajo en N y
P; y los Bancales del PIF con sustrato de suelo: arena (1:1), bajo en N y alto en P. Por otro
lado, los análisis en el Laboratorio de Biotecnología Aplicada del PIF para la determinación
de esporas de micorrizas residentes en el suelo sugieren bajos contenidos (Cuadro 2).
4
Cuadro 1. Resultados de los análisis de suelos de los lotes Vega 4, Lote 25/ZII y Bancales.
Zamorano. Honduras, 2017.
Localidad pH Ω
% mg/kg (Extractable)
M.O β N total § P φ K Ca Mg Na
Lote 25 6.19 2.57 0.13 229 516 1694 182 638
Vega 4 6.26 1.14 0.06 12 156 1236 103 46
Bancales 6.36 1.86 0.09 40 334 1040 80 15
Rango Medio 2
30 Por: Saturación de bases
Ω Relación suelo, agua 1:1. β Método de Walkley y Black (1947). § Estimado como 5% de la materia orgánica. φ Solución extractora Mehlich 3, determinado por colorimetría. Solución extractora Mehlich 3, determinado por espectrofotometría de absorción atómica.
Cuadro 2. Conteo de esporas de micorriza vesículo-arbuscular en los lotes Vega 4, Lote
25/ZII y Bancales. Zamorano. Honduras, 2017.
Lote Esporas (gsuelo-1)
Inoculaciones.
La inoculación con Rhizobium se realizó humedeciendo la semilla con una solución de agua
con azúcar al 5%, recubriendo la semilla con inoculante a base de turba como medio inerte
y una mezcla de cepas CIAT 632 (R. etli) y CIAT 899 (R. tropici). Para la inoculación de
con MVA se aplicó a la siembra 10 g por semilla del biofertilizante Mycoral®, compuesto
por tres especies de micorriza (Glomus sp, Acaulospora sp y Entrephospora sp).
Diseño de ensayos.
Las parcelas experimentales en campo (Lote 25/Zona II y Vega 4 de Monte Redondo)
consistieron de cuatro surcos de 5 m de largo con 0.7 m entre surcos y 0.1 m entre plantas,
para un total de 200 plantas por unidad experimental. En el caso de Bancales, la unidad
experimental consistió en dos surcos de 1.2 m de largo con 0.5 m entre surcos y 0.1 m entre
plantas para un total de 24 plantas por unidad experimental.
5
Manejo agronómico y fertilización.
Los ensayos en los lotes de la Vega 4 de Monte Redondo y Bancales del PIF no se realizaron
fertilizaciones; pero en el Lote 25/Zona II se realizó una fertilización a la siembra con 130
kg/ha de 18-46-0 y 65 kg/ha urea, para tener un nivel medio-alto de N y P. El manejo
agronómico para el mantenimiento de los ensayos se hizo según lo recomendado por Rosas
(2003).
Variables medidas.
A la floración (R6). En los lotes Vega 4 de Monte Redondo y Lote 25/Zona II, con una
tijera de poda se cosecharon diez plantas de los dos surcos centrales. En Bancales, se
cosecharon cinco plantas de cada surco con el fin de determinar las siguientes variables:
Peso seco de la biomasa aérea. El follaje se introdujo en bolsas de papel para
posteriormente ser secado en horno a 70 °C por 48 horas.
Nodulación e infección. Las raíces fueron extraídas con palas, lavadas con agua y jabón
e introducidas en bolsas plásticas. La nodulación se evaluó mediante la escala visual de
1-9, en donde 1 = ausencia de nódulos y 9 = >30 nódulos grandes (Figura. 1). El
porcentaje de infección de raíces por MVA se determinó por medio del protocolo
descrito por Jarstfer (1970).
Figura 1. Escala de nodulación temprana (1-9). Donde: 1= ausencia de nódulos, 3= < 10
nódulos pequeños (< 1 mm), 5= 10-20 nódulos pequeños-medianos (1-2 mm), 7= 20-30
nódulos medianos-grandes (2-3 mm), 9= > 30 nódulos grandes (> 3 mm).
Número de esporas por g de suelo. Para cada tratamiento, se colectó una muestra de
suelo con el fin de ser analizado siguiendo el protocolo descrito por Jarstfer (1963).
A la madurez de cosecha. En los lotes Vega 4 de Monte Redondo y Lote 25/Zona II se
cosecharon 20 plantas de los surcos centrales por tratamiento. En Bancales, se cosecharon
diez plantas por tratamiento.
6
Rendimiento. Esta variable fue expresada en kg/ha ajustado al 14% de humedad, según
la ecuación [1].
= { ×[
PS= Peso de las semillas en g.
NP= Número de plantas cosechadas.
DP= Densidad de plantas por ha.
%H= Porcentaje de humedad de la semilla.
Diseño experimental.
Los tratamientos fueron distribuidos en un diseño de bloques completos al azar con un
modelo factorial de 3 × 4 × 2 y los factores fueron lote (L), inóculo (I) y genotipo (G). En
el campo se utilizaron seis repeticiones y en Bancales tres.
Análisis estadístico.
Los datos obtenidos en cada uno de los experimentos fueron analizados con el paquete
estadístico Statistix 8.1, mediante análisis de varianza (ANDEVA) y separación de medias
por diferencia mínima significativa (DMS) al P≤0.05.
7
3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Se presentaron diferencias significativas por efecto de lotes (L) en la nodulación (escala
visual 1-9), infección de raíces y rendimiento; de la inoculación (I) en la infección de raíces
y de genotipos (G) en la nodulación y rendimiento (Cuadro 3). También se efectos
significativos de las interacciones L × I en la biomasa y el rendimiento y L × G en la
nodulación, biomasa y rendimiento.
Cuadro 3. ANDEVA de nodulación, infección, número de esporas, biomasa y rendimiento
de factores e interacciones. Zamorano. Honduras, 2017.
Factores
Lote (L) 0.00 **- 0.02 * 0.14 NS 0.24 NS- 0.00 **-
Inóculo (I) 0.60 NS 0.02 *- 0.71 NS 0.24 NS 0.77 NS
Genotipo (G) 0.00 **- 0.11 NS 0.97 NS 0.74 NS 0.00 **-
Interacciones
L×I 0.92 NS 0.45 NS 0.89 NS 0.03 *- 0.03 *
L×G 0.00 **- 0.45 NS 0.11 NS 0.02 * 0.00 **-
I×G 0.84 NS 0.32 NS 0.88 NS 0.27 NS 0.23 NS
L×G×I 0.85 NS 0.83 NS 0.30 NS 0.73 NS 0.54 NS
NS, *, ** No significativo, significativo al P ≤ 0.05 y significativo al P ≤ 0.01.
Los lotes donde fue desarrollado el experimento presentaron diferencias significativas en
las variables de nodulación, infección, biomasa, y rendimiento. Sin embargo, en la variable
de esporas (gsuelo-1) no presentó diferencia significativa (Cuadro 4).
Según Rosas y Bliss (1985), las condiciones óptimas para la evaluación de Rhizobium se
encuentran en suelos con bajo nitrógeno y baja población de cepas nativas. Así mismo,
Nielsen et al. (1998) sostienen que suelos con bajo contenido de nutrientes en especial de
fósforo presentan condiciones favorables para que la MVA pueda asociarse con las raíces
de las plantas.
Los suelos utilizados en los ensayos no fueron esterilizados con el fin de simular las
condiciones típicas en el campo, por ello se presentó nodulación e infección con cepas
residentes de Rhizobium y MVA en las parcelas testigo sin inoculación. La baja nodulación
e infección en el Lote 25/Zona II es atribuida por el medio- alto contenidos de N y P en
8
el suelo (Cuadro 1) más la fertilización a la siembra con 18–46–0 y urea. Esto está
fundamentado por Linderman (1988,1992) y Nielsen et al. (1998) donde afirman que la
infección de la raíz por parte de la MVA baja en presencia de altos contenidos de P en el
suelo. En cambio, en la Vega 4 de Monte Redondo y Bancales del PIF de bajos contenidos
de N y P y sin fertilización, se presentaron resultados mayores para estas dos variables.
En cuanto a la diferencia en la variable de biomasa, los resultados indican que el Lote
25/Zona II obtuvo los mayores pesos por planta (Cuadro 4). Esto se le atribuye a la
fertilización pre siembra realizada y al alto contenido de fósforo presente en el suelo. Estos
resultados concuerdan con estudios de Nicolás et al. (1999) y Apáez et al. (2013) donde
afirman que la biomasa de la planta aumenta en presencia de dosis mayores de N y P. Esto
se debe a que los nutrientes en la planta estimulan el crecimiento vegetativo lo cual le
permite tener mayor área de contacto en las hojas para captar la luz solar y realizar la
fotosíntesis (Abayomi et al. 2008).
Cuadro 4. Efecto de lote en nodulación, infección de raíces, número de esporas, biomasa y
rendimiento. Zamorano. Honduras, 2017.
Valor P 0.00 ** 0.00 ** 0.14 NS 0.00 ** 0.00 **
NS, ** No significativo y significativo al P ≤ 0.01.A-C Valores con diferencia significativa.
Los inóculos evaluados en el experimento no presentaron diferencias significativas en las
variables de nodulación, biomasa, número de esporas y rendimiento. Sin embargo, en la
variable de infección si hubo diferencia significativa, observándose que la inoculación con
Rhizobium, disminuye la infección de raíces por la MVA (Cuadro 5).
Los resultados de la nodulación e infección indican la presencia de MVA y Rhizobium
residentes interactuando en la rizósfera, ya que todos los inóculos y el testigo presentaron
interacción (Cuadro 5). Los lotes donde se llevaron a cabo los ensayos han sido sembrados
con frijol durante varios años consecutivos, lo cual incrementa la población de estos
microorganismos en el suelo y su presencia en la rizósfera.
9
Cuadro 5. Efecto de la inoculación con Rhizobium y micorriza vesículo- arbuscular (MVA)
en la nodulación, infección de raíces, número de esporas, biomasa y rendimiento.
Zamorano. Honduras, 2017.
Inóculo (I) Nodulación
(escala 1–9)
Rhizobium
+ MVA 5.7 41.1 AB 4.3 79.4 1,610
Testigo 5.5 39.4 AB 4.7 80.3 1,600
Valor P 0.60 NS 0.02 * 0.72 NS 0.24 NS 0.76 NS
NS, *No significativo y significativo al P ≤ 0.05 A-B Valores con diferencia significativa.
Los genotipos no presentaron diferencias significativas en la biomasa, número de esporas e
infección de raíces; no obstante, en la nodulación y rendimiento si hubo diferencias
significativas. Amadeus 77 tuvo menor nodulación que el criollo Seda, pero lo superó en el
rendimiento (Cuadro 6). La capacidad de fijar N2 está determinada por la cantidad de
nódulos presentes en la raíz (Baldwin y Fred 1929). De igual manera estudios realizados
por Díaz y Moncayo (2011) y Rizo y Gaibor (2015) obtuvieron resultados similares en la
diferencia de nodulación entre estos dos genotipos.
A pesar de que la infección de la micorriza puede ser afectada por el genotipo, el
comportamiento de este microorganismo tiende a ser más generalista (Barea y Azcon 1983).
Así mismo, los resultados obtenidos por Montaño (2001) concuerdan en no tener
diferencias significativas la infección de las micorrizas según la variedad (Cuadro 6).
El objetivo del mejoramiento genético se basa en la generación de cultivares con
características genéticas que le ayuden expresar su mayor potencial (Rosas et al. 2003). Por
esta razón el genotipo mejorado (Amadeus 77) presenta mayores rendimientos en
comparación con el genotipo criollo (Seda). Así mismo, estudios realizados por Valladares
(2009) y Díaz y Moncayo (2011) sostienen la diferencia de rendimiento de estos dos
genotipos.
Cuadro 6. Efecto de genotipo en nodulación, infección, número de esporas, biomasa y
rendimiento. Zamorano. Honduras, 2017.
Seda 6.9 A 37.8 4.6 77.3 1,437 B
Valor P 0.00 ** 0.11 NS 0.97 NS 0.74 NS 0.00 **
NS, ** No significativo y significativo al P ≤ 0.01.A-B Valores con diferencia significativa.
10
En la interacción L × G en la nodulación (escala 1-9) el genotipo Seda presenta mayor
nodulación en todas las localidades; en algunos estudios se ha observado que las variedades
criollas presentan mayor nodulación que las mejoradas (Rosas y Varela 1995). Amadeus
77 presentó mayor nodulación en Bancales y Seda en Bancales y en la Vega 4. La
nodulación en el Lote 25/Zona II fue significativamente menor por la presencia de
nutrientes y la fertilización a la siembra.
Cuadro 7 Efecto de la interacción lote × genotipo en nodulación (escala 1-9). Zamorano.
Honduras, 2017.
Genotipo Vega 4 Lote 25 Bancales
Amadeus 77 4.0 B b 2.9 B c 6.5 B a
Seda 7.5 A a 4.7 A b 8.4 A a A-B=Diferencias entre genotipo dentro de lote. a-c = Diferencias entre lote dentro de genotipo.
Para la variable biomasa en la localidad Vega 4, Amadeus 77 presentó los mayores
resultados en comparación con Seda. Sin embargo, en Lote 25/Zona II y en Bancales no
hubo diferencias. Ambos genotipos presentaron mayor biomasa en el Lote 25/Zona II
(Cuadro 8).
Cuadro 8. Efecto de la interacción genotipo × lote para la variable biomasa (gplanta-1).
Zamorano. Honduras, 2017.
Amadeus 77
Seda
50.8 B b 145.3 A a 28.8 A c A-B Diferencias entre genotipo dentro de lote. a-c Diferencias entre lote dentro de genotipo.
El rendimiento de Amadeus 77 fue mayor que el de Seda en el Lote 25/Zona II y Bancales
(Cuadro 9). En cuanto a las diferencias entre genotipo en las localidades, Amadeus 77
presentó los mayores rendimientos en el Lote 25/Zona II y Bancales, los cuales fueron
significativamente mayor a los de la Vega 4. Así mismo el genotipo Seda, presentó
diferencias significativas únicamente en Lote 25/Zona II y la Vega 4.
Para la interacción L × I se presentó la mayor biomasa en los tratamientos Rhizobium +
MVA y el testigo sin inoculación (Cuadro 10). Así también, los inóculos en el Lote 25/Zona
11
II presentaron mayor cantidad de biomasa que la Vega 4 y Bancales. La mayor cantidad de
nutrientes en el suelo más la fertilización contribuyeron a mayor producción de biomasa en
este lote (Nicolás et al. 1999).
Cuadro 9. Efectos de la interacción genotipo × lote para la variable rendimiento (kgha-1).
Zamorano. Honduras, 2017.
Vega 4 Lote 25 Bancales
Amadeus 77 1,207 A b 2,043 A a 2,077 A a
Seda 1,266 A b 1,563 B a 1,483 B ab A-B=Diferencias entre genotipo dentro de lote. a-b = Diferencias entre lote dentro de genotipo.
Cuadro 10. Efecto de la interacción lote × inóculo para la variable biomasa (gplanta-1).
Zamorano. Honduras, 2017.
Rhizobium 58.0 A b 140.2 B a 23.1 A c
Micorriza 55.1 A b 137.7 B a 28.4 A c
Rhizobium+MVA 55.0 A b 157.7 A a 25.4 A c
Testigo 54.9 A b 160.8 A a 25.0 A c A-B Diferencias entre inóculo dentro de lote. a-c Diferencias entre lote dentro de inóculo.
En la Vega 4 el rendimiento el tratamiento con Rhizobium alcanzó el valor más alto. Por
otro lado, en los lotes Bancales y Lote 25/Zona II no se obtuvieron diferencias en
rendimiento por efectos de inoculación. El inóculo Rhizobium no presentó diferencias entre
lotes; con el de MVA, Rhizobium + MVA y el testigo se obtuvieron los mayores
rendimientos en el Lote 25/Zona II y Bancales.
12
Cuadro 11. Efectos de la interacción lote × inóculo para la variable rendimiento (kgha-1).
Zamorano. Honduras, 2017.
Rhizobium 1,560 A a 1,638 B a 1,817 A a
Micorriza 1,033 B b 1,767 AB a 1,830 A a
Rhizobium+MVA 1,277 AB b 1,997 A a 1,556 A ab
Testigo 1,075 B b 1,808 AB a 1,916 A a A-B Diferencias entre inóculo dentro de lote. a-b Diferencias entre lote dentro de inóculo.
13
La nodulación por Rhizobium e infección por micorrizas vesículo-arbusculares (MVA)
estuvieron influenciados por los contenidos de N y P en los lotes donde se condujeron
los ensayos.
La mayor nodulación e infección de raíces se presentaron en condiciones de bajo N y
alto P en Bancales.
Se presentó menor infección por MVA en los tratamientos con Rhizobium, sugiriendo
una posible competencia entre estos simbiontes.
14
Continuar el presente ensayo preliminar con estudios adicionales de inoculación con
Rhizobium y micorrizas vesículo-arbusculares (MVA).
Realizar un mejor monitoreo de las poblaciones de Rhizobium y MVA residentes y su
competencia con el inóculo.
Realizar estudios bajo condiciones controladas sin presencia de poblaciones residentes
para estimar los efectos individuales y en combinación de Rhizobium y MVA.
Hacer una caracterización física y química de los suelos más completa previa a los
ensayos.
15
6. LITERATURA CITADA
Abayomi YA, Ajibade TV, Sammuel OF, Saadudeen BF. 2008. Growth and yield responses
of cowpea (Vigna unguiculata L.) Walp genotypes to nitrogen fertilizer (NPK)
application in the Southern Guinea Savanna zone of Nigeria. Asian J. Plant Sci.
7(2):170-176.
Aguado G. 2012. Introducción al uso y manejo de los biofertilizantes en la agricultura.
[internet]. México: Instituto nacional de investigaciones forestales, agrícolas y
pecuarias (INIFAP), Secretaría de agricultura, ganadería, desarrollo rural, pesca y
alimentación (SAGARPA). ISBN:978-607-425-807-3.
Apáez P, Escalante JA, Ramírez P, Koch SD, Sosa E, Olalde VM. 2013. Eficiencia
agronómica de nitrógeno y fósforo en la producción de frijol chino en espaldera de
maíz. Terra latinoamericana. 31(4):285.293.
Baldwin IL, Fred EB. 1929. Nomenclature of the root-nodule bacteria of the leguminosae.
JB. 17(2):141-150.
Barea J, Azcon C. 1983. Mycorrhizas and their significance in nodulating nitrogen-fixing
plants. Adv in agro. 36:1-54.
Benites J. 2016. Las leguminosas en la alimentación y en la fertilidad de los suelos. Leisa.
32(2):5-7.
Cuadrado B, Rubio G, Santos W. 2009. Caracterización de cepas de Rhizobium y
Bradyrhizobium (con habilidad de nodulación) seleccionados de los cultivos de
fríjol caupi (Vigna unguiculata) como potenciales bioinóculos. Colomb Cienc Quím
Farm. 38(1):78-104.
Díaz JR, Moncayo LP. 2011. Selección de cepas de Rhizobium y genotipos de frijol común
con alta expresión simbiótica en condiciones de sequía y baja fertilidad [Tesis].
Escuela Agrícola Panamericana, Zamorano-Honduras. 30 p.
Escoto N. 2004. El cultivo de frijol: Manual técnico para uso de empresas privadas,
consultores individuales y productores [internet]. Tegucigalpa: SAG-DICTA.
[consultado 2017 ene 20]. http://www.dicta.hn/files/Manual-cultivo-de-FRIJOL-
2004.pdf.
16
Fernández M, María N, Felipe M. 2002. Fijación biológica de nitrógeno: factores limitantes.
CCMA. 2:195-202.
Grageda O, Díaz A, Peña J, Vera J. 2012. Impacto de los biofertilizantes en la agricultura.
REMEXCA. 3(6):1261-1274.
Graham PH, Rosas JC, Estevez C, Peralta E, Tlusty B, Acosta J, Arraes PA. 2003.
Addressing edaphic constraints to bean production: The bean/cowpea CRSP project
in perspective. Elsevier. 82:179-192.
Jarstfer AG. 1963. Spore isolation. University of Florida. Soil science department.
Gainesville USA. 2171 p.
Jarstfer AG. 1970. Method for staining roots. University of Florida. Soil science
department. Gainesville USA. 2171 p.
Linderman R. 1992. Vesicular-Arbuscular Mycorrhizae and Soil Microbial Interactions.
Amer Soc Agron. 52:45-70.
Linderman R. 1988. Mycorrhizas interactions with the rizosphere microflora: The
mycorrhizosphere effect. APS. 78(3):366-371.
López M, Fernández F, Van Schoonhoven A. 1985. Frijol: Investigación y producción
[internet]. Colombia. CIAT. [consultado 2017 ene 20]. http://ciat-
library.ciat.cgiar.org/Articulos_Ciat/Digital/SB327.F7_C.2_Fr%C3%ADjol_Inves
tigaci%C3%B3n_y_producci%C3%B3n.pdf.
Montaño G. 2011. Evaluación de los beneficios de la inoculación con micorriza arbuscular
en el cultivo de frijol común (Phaseolus vulgaris L.) [Tesis]. Escuela Agrícola
Panamericana, Zamorano-Honduras. 30 p.
Nielsen KL, Bouma JT, Lynch JP, Eissenstat DM. 1998. Effects of phosphorus availability
and vesicular-arbuscular mycorrhizas on the carbon budget of common bean
(Phaseolus vulgaris). New Phytol. 139:647-656.
Nicolás NF, Uribe S, López E, Camacho R, Turrent A. 1999. El sistema maíz-leguminosa-
frijol y la fertilización mineral en terrazas de muro vivo. Agron. Mesoam. 10(2):59-
67.
Rizo J, Gaibor J. 2015. Diferencias en nodulación y desarrollo de líneas avanzadas de frijol
común (Phaseolus vulgaris L.) en suelos deficientes en nitrógeno [Tesis]. Escuela
Agrícola Panamericana, Zamorano-Honduras.16 p.
Rosas JC. 2003. El Cultivo del Frijol Común en América Tropical. 2da ed. Tegucigalpa
(Honduras). Imprenta LitoCom. 57 p.
17
Rosas JC, Bliss FA. 1985. Principios y prácticas para la conducción de ensayos sobre
fijación de nitrógeno en condiciones de campo. Ceiba. 27(1):23-41.
Rosas JC, Gallardo O, Jiménez J. 2003. Mejoramiento genético del frijol común mediante
enfoques participativos en Honduras. Agron. Mesoam. 14(1):01-09.
Rosas JC, Varela O. 1995. Habilidad combinatoria del crecimiento, fijación de nitrógeno y
rendimiento de grano en frijol común. Ceiba. 6(2):237-245.
Valladares R. 2009. Respuesta de 12 genotipos de frijol a la inoculación con Rhizobium
bajo condiciones de estrés hídrico y baja fertilidad [Tesis]. Escuela Agrícola
Panamericana, Zamorano- Honduras. 20 p.
Srivastava D, Kapoor R, Srivastava S, Mukerjl K. 1996. Vesiculas arbuscular mychorriza
an overview. In: Mukerji KG ed. Concepts in Mycorrhizal Research. Dordrecht
(Netherlands): Springer. p.1-39.
Westermann R. 2004. Respuesta del pasto Brachiaria híbrido cv. Mulato a la inoculación
con los hongos benéficos Thrichoderma harzianum y Micorrizas [Tesis]. Escuela
Agrícola Panamericana, Zamorano-Honduras. 11 p.
18
Anexo 1. Procedimiento para clarificar y teñir muestras de raíces.
Tomar en cuenta.
Disponer de equipo adecuado para utilizarlo y contar con mayor seguridad y
protección personal (anteojos, guantes y delantal).
Para retener las muestras de raíces, utilizar el diseño denso polymer tissue
¨cassettes¨ de Fisher Scientific de plástico.
Tener sumo cuidado con el manejo de químicos reactivos, de ser posible utilizar
una cámara especial si el procedimiento implica calentamiento de químicos.
Asegurarse de entender el procedimiento leyendo las introducciones
cuidadosamente. Clarificación:
1. Recolectar las muestras de raíces y lavarlas con agua.
2. Preparar los cassettes con las muestras dejándolas en un beaker con agua mientras se
prepara la solución de KOH.
3. Utilizar un beaker para verter una medida suficiente de solución de KOH al 10% de
forma que los cassettes puedan ser cubiertos.
4. Calentar la solución de KOH hasta que la temperatura llegue a 80 °C.
5. Depositar los cassettes en la solución por 30 minutos (tiempo promedio para la
mayoría de raíces).
6. Lavar con agua cinco veces.
Usar un beaker con 30% de agua oxigenada a bajo calor (10 minutos a ≤ 50°C) si
a pesar de hacer el proceso de clarificación con KOH las muestras de raíces
presentan pigmentos de color oscuro como café, negro y morado. Por último,
lavarlas cinco veces para seguir con el proceso de tinción.
Tinción:
1. Utilizar un beaker para verter una medida suficiente de Azul de Tripano (0.5 %) de
forma que los cassettes puedan ser cubiertos.
2. Sin meter los cassettes, calentar el Azul de Tripano hasta que la temperatura llegue a
80 °C.
3. Manteniendo la temperatura de 80 °C, situar los cassettes en el beaker de Azul de
Tripano hasta que la temperatura baje a 50°C. Enjuagar los cassettes una sola vez con
agua.
19
4. Reunir las placas necesarias para montar un promedio de diez raíces y cubrirlas con un
cubreobjetos presionando de manera leve para poder observarlas en el microscopio.
Tener en cuenta que se debe manipular las muestras con pinzas y guantes debido a que
el tinte es cancerígeno.
5. Si las muestras no se van a analizar al instante, colóquelas en el refrigerador en una
bolsa plástica marcada.
Anexo 2. Procedimiento para aislar esporas de micorriza.
1. Pesar 100 g de muestra de suelo o medio de crecimiento utilizado.
2. Utilizar un beaker para mezclar la muestra con agua durante el tiempo que sea necesario
hasta que los sólidos del suelo queden disueltos en el líquido (15-40 segundos).
3. Vaciar el agua del beaker y tamizar la mezcla utilizando tamices.
4. Utilizar un embudo pequeño para pasar el material filtrado a un tubo de ensayo, de ser
posible agregar agua hasta alcanzar casi el tope del borde del tubo.
5. Colocar los tubos en una centrifugadora a 3,000 rpm por 3 minutos.
6. Agregar a la solución 40% (p/v) de sacarosa, mezclar bien y centrifugar a 3000 rpm
durante 1 minuto.
7. Vaciar los tubos sin perturbar el sedimento de sacarosa (las esporas se encuentran en
conjunto con el sustrato).
8. Ubicar la mezcla de esporas en un plato Petri de plástico para ser observadas en el
estereoscopio
Portada
Portadilla