EVALUACIN Y CARACTERIZACIN DE MICORRIZAS ARBUSCULARES ASOCIADAS A

YUCA (Manihot esculenta sp) EN DOS REGONES DE LA AMAZONA COLOMBIANA.

DANIELA LEN VELANDIA

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

FACULTAD DE CIENCIAS

MICROBIOLOGIA AGRICOLA Y VETERINARIA

BOGOTA D.C DICIEMBRE DE 2006

EVALUACIN Y CARACTERIZACIN DE MICORRIZAS ARBUSCULARES ASOCIADAS A

YUCA (Manihot esculenta sp) EN DOS REGIONES DE LA AMAZONA COLOMBIANA.

DANIELA LEN VELANDIA

TRABAJO DE GRADO COMO REQUISITO PARCIAL PARA OPTAR AL TITULO DE

MICROBILOGO AGRCOLA Y VETERINARIA

JOSE SALVADOR MONTAA DIRECTOR

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

FACULTAD DE CIENCIAS

MICROBIOLOGA AGRCOLA Y VETERINARIA

BOGOTA D.C DICIEMBRE DE 2006

NOTA DE ADVERTENCIA

Articulo 23 de la resolucin No 13 de Julio de 1946

La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus

trabajos de tesis. Solo velar por que no se publique nada contrario al dogma y a la moral catlica

y porque las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en

ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia

EVALUACIN Y CARACTERIZACIN DE MICORRIZAS ARBUSCULARES ASOCIADAS A

YUCA (Manihot esculenta sp) EN DOS REGIONES DE LA AMAZONA COLOMBIANA.

DANIELA LEN VELANDIA

APROBADO

_______________________________ ______________________________

Jos Salvador Montaa MSc Clara Patricia Pea MSc.

Director Co-Director Instituto SINCHI

_______________________________

Gladys Ines Cardona MSc.

Asesor Instituto SINCHI

______________________________ ______________________________

Adriana Arcos Ingeniero Agronomo MSc Maria Ximena Rodrguez PhD

Jurado 1 Jurado 2

Bogota D.C. Diciembre 2006

EVALUACIN Y CARACTERIZACIN DE MICORRIZAS ARBUSCULARES ASOCIADAS A

YUCA (Manihot esculenta sp) EN DOS REGONES DE LA AMAZONA COLOMBIANA.

DANIELA LEN VELANDIA

APROBADO

----------------------------------------- -----------------------------------------

Angela Umaa MPhil, David Gmez MSc.

Decana Acadmico Director de Carrera

DEDICATORIA

Dedicada a mis padres por su amor incondicional, constante esfuerzo y dedicacin durante todos

estos aos.

AGRADECIMIENTOS

A mis directores de tesis Jos, Gladys y Clarita por su cordinacin, direccin, apoyo y por

compartir sus invaluables conocimientos conmigo.

Al Instituto Amaznico de Investigaciones Cientficas SINCHI por haber permitido el desarrollo

del presente trabajo de investigacin.

A las comunidades Indgenas del Sur del Trapecio Amaznico y a los propietarios de los arreglos

agroforestales del municipio de San Jos de Guaviare por permitir el muestreo.

A todo el personal vinculado con el laboratorio de Biotecnologa del Instituto Sinchi por compartir

recursos y conocimientos.

A la Dra. Mara Mercedes Zambrano, Directora Cientfica de Corpogen por su asesora cientfica.

A los eminentes cientficos Dirk Redecker y Francisco de Souza por su inters, asesora cientfica,

y por compartir su experiencia e informacin.

A Adriana Arcos por facilitarme documentacin relacionada con esta investigacin.

A mis hermanos Pacho, David y Lucha, y a mi Abuelita por su compaa y su apoyo durante todo

este proceso.

A mi prima Paula por su colaboracin e inters.

A mi Danny por estar siempre conmigo apoyndome en todo y por su valiosa colaboracin y

compaa en la realizacin de este proyecto.

A Fiona, Figo, Ramona y Galileo por estar siempre ah.

TABLA DE CONTENIDO

37 Introduccin .................................................................................................................... 3 38 Marco Terico y revisin de literatura ............................................................................ 8

38.1 Micorrizas ................................................................................................................ 8 38.2 Importancia de las micorrizas ................................................................................ 11 38.3 Clasificacin de HMA ........................................................................................... 12 38.4 Ciclo de vida de HMA .......................................................................................... 14 38.5 Etapas del desarrollo de Hongos de Micorriza Arbuscular en sistemas suelo/planta 15

38.5.1 Germinacin de las esporas ............................................................................ 16 38.5.2 Colonizacin ................................................................................................... 18

38.6 Poblaciones de HMA en ecosistemas naturales ..................................................... 19 38.7 Planta hospedera y produccin de esporas ............................................................ 21

38.7.1 Manihoto esculenta (YUCA) y su relacin con los HMA .............................. 24 38.8 Aproximaciones moleculares al estudio de HMA ................................................. 25

38.8.1 Deteccin de HMA en races ........................................................................ 27 38.8.2 Espaciadores internos de trascripcin (ITS) ................................................... 28

38.9 Mtodos de estudio de diversidad de HMA ........................................................... 30 38.9.1 Mtodos de cultivo de races y rganos de micorriza ..................................... 30 38.9.2 Anlisis moleculares del genoma fungal ........................................................ 32

38.10 rea de Estudio .................................................................................................... 35 38.10.1 Sur del Trapecio Amaznico ........................................................................ 35 38.10.2 San Jos del Guaviare La regin Colombiana ............................................. 40 38.10.4 La regin amaznica de Colombia, comprende las cuencas de los ros que tributan al Amazonas y de algunos que lo hacen al Alto Orinoco. Limita al norte con el ro Guaviare y hacia el occidente no sobrepasa la cota de los 500 m. en la vertiente de la Cordillera Oriental (Herrera, 1989). ......................................................................................................... 40 38.10.5 La Amazona colombiana comparte con la cuenca hidrogrfica del ro Amazonas ciertos rasgos de clima y morfologa. El 70% de esta inmensa regin, est cubierta de bosques tropicales hmedos tipo hylea, para cuyo desarrollo se requiere de una temperatura media superior a los 22C y una precipitacin anual superior a los 2.000 mm., con lluvias constantes, repartidas a lo largo del ao y un perodo seco, corto y marcado (Herrera, 1989). .. 40 38.10.6 En Colombia se encuentran algunas de las reas con mayor precipitacin de la cuenca amaznica: en los altos ros Putumayo, Caquet, Napo, en la regin fronteriza con Venezuela y Brasil, en el Guaina y Vaups esta alcanza los 3.500 - 4.500 mm anuales. Estas reas habran conservado la vegetacin selvtica durante varios perodos largos en el pleistoceno y holoceno cuando, al bajar la temperatura y disminuir la pluviosidad por efectos de episodios glaciales, grandes extensiones de bosque fueron transformados en sabanas. En estas reas con mayor pluviosidad se habran refugiado especies de animales y de flora de adaptacin selvtica. El aislamiento prolongado de estos refugios, habra permitido que sus habitantes evolucionaran en formas distintas. Se explicara as la amplia variacin de especies de la Amazona, donde no hay barreras geogrficas que la justifiquen. Esta hiptesis se podra aplicar, durante los ltimos episodios secos, a poblaciones humanas, para explicar la gran variacin lingstica y la distribucin de algunas caractersticas culturales dentro del rea; sin embargo no ha sido puesta a prueba todava por los arquelogos (Herrera, 1989). .............................................. 40 38.10.7 Morfolgicamente la planicie amaznica es una inmensa regin sedimentaria. Los sedimentos ms antiguos, depositados durante el terciario, en un mar o lago salobre, sufrieron posteriormente procesos erosivos, de manera que el relieve es de lomeros. Intercaladas en este paisaje hay elevaciones mayores, superficies an ms antiguas, reductos de formaciones montaosas del precmbrico, que forman mesetas y colinas rocosas y son parte del Escudo de las Guayanas. Tambin sobresale en el relieve la regin de pie de monte andino, formada por terrazas, serranas y terrenos levemente ondulados que se alinean en un cinturn al pie de la

Cordillera Oriental. Los materiales que la constituyen provienen en su mayor parte de erosin y lavado de la cordillera, por lo tanto, all pueden encontrarse los mejores suelos (Herrera, 1989). ......................................................................................................................... 40 38.10.8 Las superficies ms recientes estn formadas por los sedimentos fluviales, que forman autnticas planicies a lo largo de los ros ms caudalosos. Se pueden distinguir en ellas tres niveles: terrazas antiguas del plioceno-pleistoceno , que hoy se encuentran sobre el nivel actual de los ros, y las llanuras aluviales de inundacin (vrzea), con dos niveles, el ms alto de los cuales se inunda cada 5 10 aos cuando vienen las grandes crecientes ("conejeras") y el ms bajo, lo hace en un lapso corto de tiempo todos los aos, y recibe peridicamente sedimentos rejuvenecedores, ptimos para la agricultura (Herrera, 1989). .................................. 41 38.10.9 Los ros que forman llanuras de inundacin extensas, son frecuentemente, aquellos que nacen en las vertientes orientales de los Andes. Desde all, arrastran sedimentos en suspensin que les dan una apariencia barrosa; de ah su apelativo de "ros de aguas blancas". Los sedimentos que cargan, propician el desarrollo de vida orgnica numerosa y variada. Otros ros nacen dentro del Escudo de las Guayanas o en las superficies de denudacin, atraviesan suelos empobrecidos y sus aguas cristalinas o ambarinas adquieren en gran volumen, una coloracin oscura, debida a la presencia de minsculas porciones de cidos hmicos; de ah su apelativo de "ros de aguas negras" (Herrera, 1989).Estos se caracterizan por su extrema acidez, pobreza de nutrientes y escasez de la fauna acutica (Herrera, 1989). ................................. 41 38.10.10 Considerados en general los suelos de la Amazona son pobres, tanto en materia orgnica como en minerales. An los del pie de monte y las vegas inundables son inferiores a los suelos andinos frtiles. Los nutrientes para la frondosa vegetacin, no se encuentran en el delgado suelo, sino en la capa de hojarasca y detritus que lo cubre, de donde las plantas los obtienen directamente a travs de races "alimentadoras" y hongos micorriza (Herrera, 1989). .................................................................................................................................... 41 38.10.11 Con respecto a los solidos en suspensin que transportan los rios Cotuhe, Putumayo y Amazonas, la mayor parte esta representada por arcillas, limos y arenas finas, ademas de algunas fracciones de plancton procedente de los lagos de sus llanuras de inundacin. 41 38.10.12 Por su parte, el rio amazonas supera ampliamente el Putumayo en el transporte de solidos en suspensin y alcanza una concentracin de 116 mg/l. En contraste, los afluentes del amazonas encontrados en la orilla colombiana presenta una concentracin promedio de solidos disueltos de 29 mg/l que corresponde a 4 veces menos que lo encontrado en el amazonas. .................................................................................................................................... 41

38.11 Antecedentes del estudio ..................................................................................... 44 39 FORMULACIN del problema y justificacin ........................................................... 47

39.1 Formulacin del problema ..................................................................................... 47 39.2 Justificacin ........................................................................................................... 47

40 Objetivos ....................................................................................................................... 49 40.1 Objetivo General .................................................................................................... 49 40.2 Objetivos Especficos ............................................................................................. 49

44 Materiales y Mtodos .................................................................................................... 50 44.1 Muestreo ............................................................................................................... 50

44.1.1 Muestreo de races .......................................................................................... 52 44.1.2 Muestreo de suelo .......................................................................................... 52

44.2 Material Biolgico ................................................................................................ 53 44.3 Iniciadores para PCR ............................................................................................. 53 44.4 Mtodos .................................................................................................................. 54

44.7.1 Tincin de races (Philips & Hayman 1970) .................................................. 54 44.7.2 Determinacin del porcentaje de colonizacin ............................................... 55 44.7.3 Extraccin de esporas ..................................................................................... 57 44.7.4 Evaluacin morfolgica de las esporas ........................................................... 59

44.8 ExtraccionExtraccin de DNA ............................................................................. 59

44.8.1 Amplificacin de la regin ITS ....................................................................... 61 44.8.2 Purificacin de los productos PCR ................................................................. 63 44.8.3 5.4.5 Clonacin ............................................................................................... 63 44.8.4 5.4.3 Anlisis de restriccin de DNA ribosomal (ARDRA)Digestin de los productos PCR ............................................................................................................................ 63 44.8.6 La digestin de los productos de PCR se realizo de acuerdo a lo reportado por Redecker et al, 1997. utilizando las enzimas de digestin Hinf I y Taq I. La digestin con Hinf I se realizo a 37C durante 1 hora y la digestin con Taq I se realizo a 65C por 1 hora. Los productos de las digestiones fueron visualizados por electroforesis en geles de agarosa ultrapura al 3% con buffer TAE. Se utilizo dos marcadores de peso molecular (50 pb y 100 pb). ............................................................................................................................ 64 44.8.7 ........................................................................................................................ 64 44.8.8 5.4.4 Visualizacin de los productos y lectura de patrones de restriccin. ... 64 44.8.9 La comparacin de los patrones de bandas obtenidas despus de la digestin con las respectivas enzimas (RFLP) se realizar utilizando el software Quantity one de Bio-Rad .................................................................................................................................... 65 44.8.10 5.4.6 Secuenciacin ...................................................................................... 65

45 Resultados .................................................................................................................... 67 45.1 Porcentaje de colonizacin .................................................................................... 67 45.4 Recuento de esporas ............................................................................................... 69 45.5 Anlisis Fisicoqumicos ......................................................................................... 70 45.6 Anlisis morfolgico .............................................................................................. 74 45.7 Extraccin de DNA ............................................................................................... 79 45.8 Amplificacin. ....................................................................................................... 80 45.11 Clonacin ............................................................................................................. 83 45.12 Anlisis de patrones ARDRA .............................................................................. 86 45.13 Secuenciacin ..................................................................................................... 94

46 Discusin de resultados ................................................................................................. 97 46.1 Porcentaje de colonizacin de HMA y su relacin con recuentos de esporas y el contenido de fsforo (ppm) en el suelo. ........................................................................................ 97 46.2 Recuento de esporas de HMA ............................................................................. 100 46.3 Porcentaje de colonizacin de HMA y su relacin con los valores del pH, el contenido de materia orgnica, acidez intercambiable y % de saturacin de Aluminio. .................. 102 46.4 Evaluacin Morfolgica de Esporas .................................................................... 104 46.5 Extraccin de DNA .............................................................................................. 106 46.6 Amplificaciones con primers generales y gnero- especficos, clonacin y secuenciacin ...................................................................................................................................... 108

47 Conclusiones ............................................................................................................... 113 48 RECOMENDACIONES ........................................................................................... 114 49 ................................................................................................................................... 116 62 Referencias .................................................................................................................. 116 11 Anexos..117

NDICE DE FIGURAS

Figura No 1 Clasificacin de los HMA del orden Glomales7

Figura No 2 Ciclo de vida de HMA...11

Figura No 3 Estructura morfolgica de las micorrizas vesiculo arbuscular...12

Figura No 4 Chagra del Sur del Trapecio Amaznico......36

Figura No 5 Arreglo Agroforestal de San Jos del Guaviare...38

Figura No 6 rea de muestreo Sur del Trapecio Amaznico...43

Figura No 7 rea de muestreo San Jos del Guaviare....44

Figura No 8 Tipos de muestreos empleados en campo45

Figura No 9 Proceso de tincin de races47

Figura No 10 Determinacin del porcentaje de colonizacin...48

Figura No 11 Aislamiento de esporas..49

Figura No 12 Recuento de esporas..49

Figura No 13 Representaciones esquemticas de los genes rRNA con sitios de anillamiento de los

primers52

Figura No 14 Porcentaje de colonizacin total de HMA en Manihot esculenta en el Sur del

Trapecio Amaznico y San Jos del Guaviare57

Figura No 15 Porcentaje de colonizacin de HMA por arbsculos y vesculas en Manihot

esculenta en el Sur del Trapecio Amaznico y San Jos del Guaviare.57

Figura No 16 Recuentos de esporas de HMA en suelos rizosfricos de Manihot esculenta en el

Sur del Trapecio Amaznico y San Jos del Guaviare.59

Figura No 17 Relacin entre porcentaje de colonizacin y concentracin de fsforo en suelos

rizosfricos de Manihot esculenta en dos regiones de la Amazona Colombiana

..61

Figura No 18 Porcentaje de colonizacin y su relacin con acidez intercambiable y porcentaje de

saturacin de aluminio..62

Figura No 19 Esporas encontradas en suelos rizosfricos de las muestras del sur del Trapecio

Amaznico65

Figura No 20 Esporas encontradas en suelos rizosfricos de las muestras de San Jos del

Guaviare.65

Figura No 21 Primera y segunda PCR anidada 69

Figura No 22 Clones positivos muestras Sur del Trapecio Amaznico..71

Figura No 23 Clones positivos de los arreglos agroforestales 2, 7,10 y 13 del muestreo de San

Jos del Guaviare..71

Figura No 24 Clones positivos para GIGA5.8R..72

Figura No 25 Anlisis ARDRA CHTR173

Figura No 26 Anlisis ARDRA CHTR373

Figura No 27 Anlisis ARDRA Arreglo Agroforestal 2...74

Figura No 28 Anlisis ARDRA Arreglo Agroforestal 7...74

Figura No 29 Anlisis ARDRA Arreglo Agroforestal 10.75

Figura No 30 Anlisis ARDRA Arreglo Agroforestal 1375

Figura No 31 Anlisis ARDRA (GIGA5.8R) Arreglo Agroforestal 776

Figura No 32 Anlisis ARDRA (GIGA 5.8 R) Arreglo Agroforestal 10....77

Figura No 33 Secuenciacin del clon 12 del arreglo agroforestal 13.78

Figura No 34 Secuencia del clon 6 del arreglo agroforestal 10...78

NDICE DE TABLAS

Tabla No 1 Caractersticas de los lugares de muestreo...44

Tabla No 2 Secuencias de iniciadores.46

Tabla No 3 Enzimas de restriccin usadas en los ensayos de ARDRA de los amplificados de

HMA..54

Tabla No 4 Porcentaje de colonizacin de HMA en races de Manihot esculenta...56

Tabla No 5 Recuento de esporas a partir de 100g de suelo rizosfrico.58

Tabla No 6 Anlisis fisicoqumicos de las muestras de suelo rizosfrico del Sur del Trapecio

Amaznico y San Jos del Guaviare...59

Tabla No 7 Caractersticas fenotipicas de las esporas encontradas en los suelos rizosfricos de

Manihot esculenta en las muestras del sur del Trapecio Amaznico y San Jos del Guaviare

64

Tabla No 8 Morfotipos encontrados por muestra...66

Tabla No 9 Datos clonacin...70

RESUMEN

Se caracteriz la poblacin micorrtica asociada a races de yuca (Manihot esculenta) colectadas

en 2 regiones de la Amazona Colombiana (Chagras del Sur del trapecio Amaznico y arreglos

agroforestales (A.AF) en San Jos de Guaviare). Se evaluaron diferentes variables como fueron:

porcentaje de colonizacin, recuento de esporas, identificacin taxonmica por caractersticas

macro y microscpicas, caractersticas fisicoqumicas del suelo y caracterizacin molecular.

Respecto al porcentaje de colonizacin se observ que en todas las muestras analizadas se

encontr colonizacin por MA evidencindose un valor mayor en las muestras colectadas en San

Jos de Guaviare. De igual forma el nmero de esporas por gramo de suelo fue mayor en estas

muestras con respecto a las colectadas en chagras del sur del trapecio amaznico. Los

recuentosmsbajos se encontraron en las rizsferas de yuca colectadas en chagras bajo el

paisaje de llanura aluvial en el sur del trapecio amaznico.

En la identificacin taxonmica se encontraron 12 morfotipos en las muestras del sur del trapecio

amaznico y 10 morfotipos en las muestras de San Jos de Guaviare. Hubo predominancia de

especies del gnero Glomus, y en menor porcentaje especies de los gneros Acaulospora y

Gigaspora.

Para la caracterizacin molecular, se extrajo DNA a partir de races de yuca colonizadas por

diferentes gneros de hongos MA. A partir de este se realiz una PCR general utilizando primers

universales (ITS4-NS5), obtenindose un fragmento de aproximadamente 1200 pb. Del producto

obtenido de la PCR general se realizaron PCRs anidadas con primers gnero especficos (GLOM

5.8 R, GIGA 5.8 R, ACAU 1660, ARCH 1311, LETC 1670), reportados por (Redecker et al, (2000)

para la identificacin molecular de hongos MA.

En las muestras evaluadas se observ solamente amplificacin con los primers GIGA 5.8 R y

GLOM 5.8 R, especficos para amplificar secuencias de Glomus y Gigaspora respectivamente.

Dos de las seis muestras colectadas en chagras del sur del trapecio amaznico (CHTR1 y

CHTR3) amplificaron con el primer GLOM 5.8 R, evidencindose un fragmento de

aproximadamente 200 pb, sin embargo no se observ amplificacin en ninguna de las muestras

con el primer GIGA 5.8 R. De las muestras colectadas en A.AF en San Jos de Guaviare, 4 de las

6 amplificaron con el primer especfico GLOM 5.8 R (Arreglos agroforestales 2, 7, 10 y 13)

obteniendo un fragmento de aproximadamente 200 pb y 2 con el primer especfico para Gigaspora

GIGA 5.8 R (A.AF 7 y 10), obtenindose un fragmento de aproximadamente 300 pb.

Los productos PCR con el fragmento de inters fueron clonados dentro del vector TOPO pCR2.1

de Invitrogen y transformados en clulas de E. coli DH5- qumicamente competentes. De cada

muestra evaluada se obtuvo un promedio entre 3 y 17 clones con el inserto de inters, 10 clones

para las muestras del sur del trapecio amaznico y 68 clones para las de San Jos de guaviare.

De cada clon se extrajo el DNA plasmdico, se purific y se realizaron los anlisis de ARDRA

con las enzimas de restriccin Hinf I y Taq I de Invitrogen. Se construy una matriz de presencia y

ausencia con los resultados de las 2 enzimas, agrupando los clones segn su semejanza gentica

por medio del coeficiente de Dice y el mtodo de agrupamiento de UPGMA.

En las muestras del sur del trapecio amaznico se encontr en general una alta similaridad entre

los clones evaluados, a diferencia de lo encontrado en las muestras de San Jos de Guaviare,

donde los clones fueronmsdismiles, encontrndose con esto una mayor diversidad. De acuerdo

a estos agrupamientos se escogieron los clones para la secuenciacin. Hasta la fecha solamente

se tienen datos de 2 secuencias. La primera corresponde al clon nmero 3 del A.AF 10, el cul

report un 94% de similitud en el alineamiento con el clon Giga 3538.1 aislado de races de Inga

parteno en Costa Rica. La otra secuencia corresponde al clon 12 del A.AF 13 la cual fue alineada

con el clon de Glomus Pa106 con una similitud del 92%, clon aislado de races colonizadas por

HMA de Prunus africana.

El mayor porcentaje de colonizacin y diversidad de hongos MA en las muestras colectadas en

A.AF en San Jos de Guaviare se relacion con: niveles bajos de fsforo (0.61-5.51 ppm),

porcentaje de carbono orgnico con niveles medios y bajos (1.14 2.62 %) y valores de pH

extremadamente cidos (4.05-5.0). Igualmente se observ que la cobertura de los A.AF

proporciona mayor oferta de recursos y por lo tanto mejores beneficios para el establecimiento de

esta simbiosis.

ABSTRACT

A mycorrhizal population associated to yucca roots was characterized. There were collected in 2

regions of the Colombian Amazon (chagras from the South of the Amazonic trapezium and

agroforestal arrangements AF.A in San Jos del Guaviare). There were evaluated different

variables which were: colonization percentage, spores recount, taxonomic identification by

macroscopic and microscopic characteristics as well, physicochemical characteristics of the soil,

and molecular characterization. In reference to the colonization percentage, in all the samples

analyzed it was found that AMF colonization showed a greater value in the sample collected in San

Jos del Guaviare. Also, the number of spores per gram of soil was bigger in these samples than

in the samples collected in the chagras of the South of the Amazonic trapezium. The lowest spore

recounts were found in the yucca rhizospheres collected in chagras under the landscape of llanura

aluvial in the South of the Amazonic trapezium.

In the taxonomic identification there were found 12 morphotypes in the samples collected from the

South of the Amazonic trapezium and 10 morphotypes in the samples collected in San Jos del

Guaviare. Species of the genera Glomus were the ones which prevailed although there were also

found species from Acaulospora and Gigaspora in a lower percentage.

For the molecular characterization, DNA was extracted from yucca roots colonized by different

genera of AMF. With this DNA a general PCR was performed using ITS4-NS5 universal primers

obtaining a fragment of ca. 1200bp. From the product obtained from the general PCR there were

performed nested PCRs with genera-specific primers (GLOM 5.8 R, GIGA 5.8 R, ACAU 1660,

ARCH 1311, LETC 1670) reported by (Redecker et al., 2000) for the molecular identification of

AMF.

In the samples evaluated there was only observed amplification with the specific primers GIGA 5.8

R and GLOM 5.8 R to amplify Glomus and Gigaspora sequences respectively. 2 of the 6 samples

collected in chagras of the South of the Amazonic trapezium (CHTR1 and CHTR3) amplified with

the GLOM 5.8 R primer showing a fragment of ca. 200bp. However it was not observed any

amplification in none of the samples tested with the GIGA 5.8 R primer. From the samples

collected from AF.A in San Jos del Guaviare, 4 of the 6 samples amplified with the GLOM 5.8 R

primer (AF.A 2, 7, 10, and 13) obtaining a fragment of ca. 200bp and 2 with the Gigaspora-specific

primer GIGA 5.8 R (AF.A 7 and 10), obtaining a fragment of ca. 300bp.

The PCR products with the intended fragment were cloned inside the TOPO pCR2.1 vector from

Invitrogen and transformed in chemical competent E. coli DH5-alpha cells. From each sample

tested it was obtained an average between 3 and 17 clones with the intended fragment, 10 clones

for the samples from the South of the Amazonic trapezium, and 68 clones for the ones from San

Jos del Guaviare. From each clone plasmidic DNA was extracted, purified and ARDRA analysis

were performed with the restriction enzymes Hinf I and Taq I from Invitrogen. It was built up a

presence-absence matrix simultaneously considering the results for the 2 enzymes, grouping the

clones according to their genetic resemblance by means of the Dice coefficient and the UPGMA

grouping method.

In the samples from the south of the amazonic trapezium it was found, in general, a high similarity

between the tested clones in contrast to the findings in the samples from San Jos del Guaviare,

where the clones were more different thus finding a greater diversity. According to these groupings

the clones to be sequenced were chosen. Until now, there only exist data from 2 sequences. The

first, corresponds to clone number 3 of the AF.A 10 which reported 94% of similarity in the

alignment with clone Giga 3538.1 isolated from roots of Inga parteno in Costa Rica. The other

sequence corresponds to clon 12 of AF.A 13 which was aligned with Glomus Pa106 clone with

92% of similarity, the clon isolated from roots colonized by Prunus aficana AMF.

The greater colonization percentage and AMF diversity in the samples collected in AF.A in San

Jos de Guaviare were related to: low phosphorus levels (0.61 - 5.51 ppm), low and medium levels

of organic carbon percentage (1.14 2.62 %) and extremely acid pH values (4.05 5.0). Likewise,

it was observed that the covering of the AF.A gives a higher resource offering, thus giving better

benefits for the symbiosis establishment.

INTRODUCCIN

En la Amazona Colombiana los suelos son pobres, tanto en materia orgnica como nutrientes,

estos ltimos se encuentran en la capa de hojarasca y detritus de donde las plantas los obtienen a

partir de races alimentadoras y hongos de micorriza (Pea et al., 2006).

Los agroecosistemas de la amazona colombiana presentan como rasgo caracterstico la no

utilizacin de agroqumicos, a pesar de establecerse en suelos muy poco frtiles. La fertilidad de

los suelos en tales agroecosistemas es altamente dependiente de la participacin de la microbiota

del suelo en procesos de descomposicin, mineralizacin, solubilizacin y fijacin simbitica de

nutrientes. Por esta razn se afirma que las comunidades vegetales de la Amazona se establecen

bajo un potencial de microorganismos transformadores y enriquecedores del suelo. De ah la

importancia de conocer la riqueza microbiana presente (www.

geocities.com/RainForest/Jungla/1143/Micorrizas.htm, septiembre 2006).

En los suelos amaznicos, las micorrizas arbusculares, son casi una relacin obligada para el

establecimiento de las especies vegetales tanto en condiciones naturales como en

agroecosistemas. El conocimiento de la diversidad de estos microorganismos, el estudio de la

simbiosis que establecen con la vegetacin, su relacin con factores fisicoqumicos del suelo y

otras poblaciones biolgicas, el aporte en el establecimiento de especies vegetales, su uso en la

recuperacin de zonas degradadas y en el desarrollo potencial de biofertilizantes, son algunas de

las razones que han llevado al Instituto Amaznico de Investigaciones Cientficas (Sinchi) a

abordar esta comunidad como tema de investigacin.

La fase inicial de investigacin sobre HMA consiste en identificar las condiciones naturales de la

simbiosis, con el fin de conocer la ocurrencia y distribucin nativa de los hongos de micorriza

arbuscular. Por esto se evalu el porcentaje de colonizacin, nmero de esporas presentes en

suelo rizosfrico, morfotipos encontrados e identificacin molecular a partir de races de plantas

micorrizadas.

Uno de los puntos ms difciles de abordar sobre este grupo de microorganismos es su

caracterizacin taxonmica, lo cual limita el conocimiento de su diversidad y su aplicacin. La

razn bsica es que estos organismos son simbiontes obligados, por lo que no pueden ser

aislados y mantenidos in vitro; adems la nica estructura que permite diferenciaciones

morfolgicas entre gneros y especies son las esporas que producen y que pueden ser fcilmente

aisladas en el suelo (Dodd et al., 1996 citado en Antoniolli, 1999).

A pesar de que las caractersticas morfolgicas de las esporas han sido usadas por aos para su

determinacin, no existen claves taxonmicas suficientes y actualizadas que lleven a una fcil y

correcta determinacin, por lo que en muchos casos se necesita de expertos dedicados a esta

labor para la correcta determinacin de un morfotipo, y an entre ellos existen discrepancias sobre

gnero y especies reportadas (Pea et al., 2006).

El entendimiento de la importancia de la diversidad de HMA en los ecosistemas naturales ha sido

un gran reto. El hecho de que muchas plantas puedan ser colonizadas por la mayora de HMA

indica una ausencia de especificidad de los hospederos, lo que puede contribuir al mantenimiento

de la diversidad fungal en los suelos. Los estudios de la diversidad de los HMA y la ecologa de la

simbiosis se han soportado en datos de la ocurrencia y frecuencia de diferentes tipos de esporas y

mtodos de clasificacin morfolgicos los cuales estn limitados por la pequea cantidad relativa

de diversidad morfolgica entre especies. Los hongos se clasifican bajo una base de morfologa

de las esporas y su desarrollo. Es frecuentemente difcil identificar los taxones en material de

campo de los aislamientos por la condicin y preservacin variables de las esporas (Antoniolli,

1999).

La sola utilizacin de datos de esporas puede dar origen a conclusiones errneas sobre la

diversidad de las poblaciones de hongos ya que el nmero de esporas no refleja la presencia de

hongos no esporulantes ni el grado o nivel de colonizacin por especies particulares en las races

vegetales. Ms an, aunque las esporas muestran una baja diversidad morfolgica estas son

altamente diversas a nivel gentico. Las tcnicas de biologa molecular ofrecen la posibilidad de

tener mtodos rpidos, sensibles y confiables para la identificacin de aislamientos fungales tanto

como componentes de las poblaciones de esporas como estructuras vegetativas en races y

suelo. Tambin tienen el potencial de proveer informacin cuantitativa en cuanto al desarrollo

vegetativo del HMA (Antoniolli, 1999).

El nmero de esporas presentes en el suelo no siempre est relacionado con presencia de HMA

en raz, ya que en algunas especies la produccin de esporas ocurre despus de que es

alcanzado el umbral de la colonizacin. Adems, la produccin de esporas esta influenciada y

puede ser afectada por diversos factores. El porcentaje de colonizacin vara en diferentes

especies (Abbot y Robson, 1984 b; Ebbers et al., 1987; McGee, 1989; Gazey et al., 1992;

Tomeroup, 1983 y Gemma et al., 1989). Esto es importante en los estudios de HMA ya que un

nmero alto de esporas en el suelo no es criterio suficiente para decir que hay una colonizacin

eficiente dentro de la raz. Por esto, con las tcnicas moleculares, amplificando directamente DNA

de la raz se puede aclarar si hay o no una colonizacin efectiva y conocer el genero de HMA que

esta colonizando la raz.

En aos recientes, el desarrollo de tcnicas moleculares basadas en PCR ha dado una

aproximacin alternativa y valiosa a la identificacin morfolgica. Estas tcnicas moleculares

incluyen: Amplificacin de regiones variables tales como los genes ribosomales espaciadores

internos de trascripcin (ITS) o espaciadores intergnicos (IGS), polimorfismos en la longitud de

los fragmentos de restriccin (RFLPs) , amplificacin de secuencias cortas repetidas

(microsatlites) y amplificacin al azar de DNA polimorfito (RAPD). Aunque estos mtodos han

sido aplicados exitosamente a estudios de HMA el uso potencial de la regin ITS para disear

primers a ser usados para identificacin de especies y cuantificacin no ha sido bien explorado. La

utilizacin de la regin ITS tiene ventajas porque los genes pueden ocurrir en copias mltiples y

las regiones son lo suficiente variables para permitir una clara discriminacin entre especies

cercanamente relacionadas (Antoniolli, 1999).

En cuanto al rea de estudio los inventarios de micorrizas arbusculares de la regin amaznica

son escasos y en muchos casos los morfotipos aislados no han sido descritos o incluidos en las

guas taxonmicas publicadas, por lo que el conocimiento de la diversidad de estos hongos en la

regin es limitada. De all la necesidad de usar otras tcnicas que apoyen estos estudios. En el

ao 2001 Schler et al revolucion la taxonoma de Glomales a partir del anlisis molecular de

las secuencias SSU del rRNA, lo cual permiti reconocer las tcnicas moleculares como una

alternativa vlida para su estudio.

Con base en lo anterior, y teniendo en cuenta que no existe informacin detallada acerca de la

heterogeneidad de especies presentes en la regin amaznica colombiana, se plante la

realizacin de un trabajo de investigacin, cuyo objetivo general fue: Caracterizar la poblacin

micorrtica presente en races de plantas de yuca (Manihot esculenta) aisladas de dos regiones

de la Amazona Colombiana. El anlisis de la regin ITS del rDNA se constituye una herramienta

molecular valiosa para la identificacin de estos hongos de manera rpida y confiable,

complementando la metodologa tradicional.

La yuca (Manihot esculenta) ha sido uno de los principales cultivos agrcolas de las comunidades

amaznicas, adems de ser, su base alimenticia. Es empleada como ritual de intercambio cultural

y comercial. Es por esto que fue seleccionada como modelo de estudio (Arias, J et al., 2005). La

yuca es tambin una especie vegetal que tiene gran afinidad con la simbiosis de HMA debido a

sus necesidades nutricionales en suelos tan pobres como los de la regin amaznica.

MARCO TERICO Y REVISIN DE LITERATURA

Micorrizas

Las asociaciones simbiticas entre races vegetales y hongos fueron denominadas en 1885 por el

patlogo forestal alemn A. B. Fran como micorriza, derivado de la palabra en griego que traduce

raz fungal (Aristn, 1999).

Las micorrizas, de las que hace muchos aos se sabe son comunes en rboles forestales, hoy en

da se consideran como las races nutricias normales de la mayora de las plantas, incluyendo

cereales, hortalizas, plantas de ornato y, por supuesto, los rboles (Agrios, 2002).

Hay tres tipos de micorrizas que se distinguen por la forma en que las hifas del hongo se

encuentran dispuestas dentro de los tejidos corticales de la raz:

Las ectomicorrizas. Se caracterizan por formar en las clulas corticales una red de micelio

caracterstica denominada red de Hartig. Estas races comnmente son hinchadas y en algunas

combinaciones que se establecen dentro el hongo y su hospedante se encuentran

considerablemente ms bifurcadas que las races no micorrizales. Las ectomicorrizas se forman

principalmente en rboles forestales debido a los basidiomicetes que forman setas y bejines y a

varios ascomicetes. Las esporas de los hongos ectomicorreicos se forman sobre el suelo y son

diseminadas por el viento. Las hifas de estos hongos frecuentemente producen un manto

fungoso estrechamente entretejido en torno a las races nutricias y dicho manto tiene un grosor

que varia desde el dimetro de una a dos hifas hasta como de treinta a cuarenta. Dichos hongos

penetran tambin en las races, pero solo crecen alrededor de las clulas corticales,

reemplazando a parte de la lmina media entre las clulas y formando la denominada red de

Hartig (Agrios, 2002).

Los rboles con asociaciones ectomicorrticas son dominantes en bosques de confieras, en

regiones boreales fras o alpinas, y muchos bosques de hoja ancha en regiones templadas o

mediterrneas, pero tambin se presentan en sabanas tropicales o subtropicales o en bosques

lluviosos. La mayora de los hospederos de ectomicorrizas son los rboles o arbustos, pero

existen asociaciones formadas por unas pocas plantas herbceas. Los hongos ectomicorriticos

contribuyen significativamente con la biomasa de los ecosistemas de bosque. Las hifas de los

hongos ectomicorriticos tienen capacidad saprofitita, pueden absorber fsforo y nitrgeno de

fuentes inorgnicas y orgnicas (Bledsoe 1992).

En las endomicorrizas el hongo crece dentro de las clulas corticales de la raz y forma

estructuras caractersticas (Currah 1991). Existen dos tipos de endomicorrizas, el grupo ms

comn se distingue por presentar hifas aseptadas, vesculas y estructuras ramificadas que le

confieren el nombre de micorrizas vesculo-arbusculares. El segundo grupo est constituido por

hongos con hifas septadas que invaden las clulas de la raz sin romper la membrana plasmtica

y crecen dentro de la clula formando estructuras globosas (Richardson et al., 1993).

Las micorrizas arbusculares se originan a partir de hifas que proceden de los propgulos

existentes en el suelo (esporas maduras, fragmentos de raz micorrizados, o plantas micorrizadas

que crecen en vecindad). Cuando una hifa contacta con la superficie de una clula epidrmica de

la raz, forma un apresorio que originara seguidamente la hifa colonizadora que penetrara en

dicha clula o atravesara el espacio intercelular. En la zona externa del cortex de la raz forma

unas estructuras intracelulares tpicas que son los ovillos; en la zona media las hifas crecen

normalmente en forma longitudinal en los espacios intercelulares; Mientras que en la zona interna

las hifas penetran intracelularmente y forman los arbusculos por ramificacin dicotmica repetida,

a nivel de los cuales se produce el intercambio de nutrientes.

Tambin habra que destacar la formacin de vesculas en el cortex cuya funcin es el

almacenamiento de reservas lipidicas. Tras la colonizacin interna se produce la ramificacin y

desarrollo del micelio externo, que es clave en la captacin de nutrientes y da lugar a nuevos

puntos de colonizacin en la propia raz o en otras prximas. Sobre la red tridimensional de hifas

que constituye se forman las esporas, estructuras de resistencia que, al madurar, completan el

ciclo del hongo (Bledsoe 1992). Estas micorrizas no se encuentran rodeadas por un manto

fungoso denso, sino por una masa micelial laxa que se forma sobre la superficie de la raz a partir

de la cual se forman subterrneamente hifas y grandes zigosporas de color perla o bien

clamidosporas. Las endomicorrizas tienen una distribucin mundial, encontrndose desde los

ecosistemas rticos hasta los ecosistemas desrticos (Bledsoe, 1992).

Las endomicorrizas son la simbiosis predominante tanto en coberturas naturales como en

coberturas antrpicas. Igualmente se ha observado que el fenmeno de dominancia de algunas

especies es ms evidente en zonas con climas fros que en zonas de climas templados (Bhatia et

al., 1996)

Los hongos micorriticos arbusculares son todos miembros de la divisin Glomeromycota del

orden de los Glomales; la clasificacin actual contiene 2 subrdenes que son Glomineae y

Gigasporineae; dentro de los Glomineae se encuentras las familias Glomaceae (Glomus),

Acaulosporaceae (Acaulospora y Entrophospora), Archaeosporaceae (Archaeospora) y

Paraglomaceae (Paraglomus) y dentro del suborden Gigasporineae se encuentra la familia

Gigasporineae (Gigaspora y Scutellospora (INVAM, 2006) (Figura 1). El nmero de especies

http://www.scielo.sa.cr/scielo.php?pid=S0034-77441998000200004&script=sci_arttext#Richardson#Richardsonhttp://www.scielo.sa.cr/scielo.php?pid=S0034-77441998000200004&script=sci_arttext#Currah91#Currah91

dentro de los glomales actualmente es de 154 (INVAM, 2006).

Figura 1: Clasificacin de los HMA del orden Glomales (INVAM, 2006)

Importancia de las micorrizas

Las micorrizas al parecer mejoran el crecimiento de la planta al aumentar la superficie de

absorcin del sistema radial; al absorber selectivamente y al acumular ciertos nutrientes,

especialmente el fsforo; al solubilizar y hacer disponibles para la planta algunos minerales

normalmente insolubles; al permitir que las races alimentadoras funcionen durante ms tiempo; y

al hacer que las races alimentadoras sean ms resistentes a la infeccin que ocasionan algunos

hongos del suelo tales como Phytophthora, Pythium y Fusarium (Agrios, 2002).

Sin embargo, debe tenerse en cuenta que hay muchas asociaciones distintas que se establecen

entre el hongo y su hospedante y que cada combinacin puede tener efectos distintos sobre el

crecimiento de la planta. Algunos hongos micorriticos tienen un amplio rango de hospederos,

mientras que otros son ms especficos. As mismo, algunos de ellos benefician el mayor grado a

un determinado hospedante que otros hongos, y algunos hospederos sacan un mejor provecho al

asociarse con ciertos hongos micorriticos que con otros hospedantes. Los hongos micorrizales

necesitan tambin a un hospedante para poder crecer y reproducirse; en ausencia de

hospedantes, el hongo se mantiene en reposo en forma de esporas (Agrios, 2002).

Las micorrizas arbusculares estimulan el crecimiento, desarrollo y nutricin de las plantas,

especialmente en suelos de baja y moderada fertilidad los estudios llevados a cabo han puesto de

manifiesto que dichos efectos se deben a que la micorriza mejora sustancialmente la absorcin de

nutrientes y agua por la planta y que el principal nutriente implicado es el fsforo (Barea et al.,

2002).

Se sabe que la mayor parte de los suelos naturales tienen un bajo contenido en fosfato asimilable,

e incluso la mayora de los suelos arables productivos necesitan un aporte considerable de

fertilizante fosforado para mantener su fertilidad. En efecto, el 95-99% del fsforo de un suelo esta

integrado en compuestos orgnicos o inorgnicos insolubles. De otro lado, se conoce que el ritmo

de absorcin de los iones fosfato por la planta es superior al del desplazamiento de dichos iones

desde el suelo no rizosfrico hacia la raz. Ello condiciona que se forme una zona de agotamiento

del elemento en la rizsfera. Esta zona de agotamiento, que ha podido ser puesta de manifiesto

por autorradiografa, es la base que justifica que el PO4-3 sea el factor limitante del crecimiento de

las plantas en gran nmero de suelos. Efectivamente, el desplazamiento del in fosfato hacia la

raz tiene lugar por difusin; en su camino hacia la planta se fija fcilmente a arcillas y coloides del

suelo por medio de combinaciones insolubles con calcio, hierro o aluminio (Barea et al., 2002).

Los mecanismos propuestos para explicar la mayor capacidad de absorcin de fsforo por las

plantas estn basados en lo siguiente: (a) que la micorrizacin induzca cambios morfolgicos en la

planta; (b) que la micorrizacin induzca cambios fisiolgicos, lo que provocara un incremento de

la capacidad de la superficie de la raz de la planta para absorber fsforo; (c que la micorrizacin

proporcione una superficie de absorcin adicional (hifas del hongo), o ms eficaz; (d) que las hifas

o las races micorrizadas tengan capacidad para solubilizar fuentes de fsforo no disponibles para

races no infectadas y (e) que la raz micorrizada tenga ms longevidad que la que no lo esta

(Barea et al., 2002).

Clasificacin de HMA

La clasificacin puede estar basada tanto en la identificacin de una poblacin como en la

estructura para entender las relaciones filogenticas entre unidades taxonmicas (Bentivenga y

Morton, 1994). Todas las clasificaciones estn basadas en las mismas categoras taxonmicas

lineanas (por ejemplo especie, genero). Sin embargo las clases y las causas de diversidad son

menos universales y pueden existir grandes diferencias dentro de cada uno de los organismos.

Las esporas fueron el nico foco de atencin en el que se centraron los primeros estudios de

taxonoma de los HMA. Los cuales no fueron formalizados utilizando la nomenclatura tradicional

hasta 1974 (Gerdemann y Trappe, 1974). Pocas reas del mundo han sido extensivamente

muestreadas para especies silvestres de HMA y las investigaciones taxonmicas todava

incluyen unos componentes de exploracin y descripcin significativo (Morton, 1993).

Hasta ahora la espora ha sido la estructura ms importante usada para la identificacin. El

dimetro de las esporas de HMA en el suelo se encuentra en un rango de 50-600 m (Mosse et

al., 1981).

La primera aproximacin a la clasificacin de HMA fue hecha en los aos 1960s todas las

especies fueron puestas dentro del genero Endogone de los zigomicetos basndose en la

produccin de esporas muy grandes multinucleadas. Despus fueron agrupados los gneros

Acaulospora, Gigaspora, Glaziella, Modicella y Sclerocystis con Endogone en Endogonaceae,

Zygomycetes en ese tiempo se conocan unas pocas caractersticas, pero a medida que fueron

descritas nuevas especies, se descubrieron nuevos caracteres y la informacin base fue

ampliada. Glaziella y Modicella fueron transferidos a los Ascomycetes. Ames y Schneider (1979)

eligieron un nuevo genero, Entrophospora, y Walker y Sanders (1986) situaron a la especie

Gigaspora sensu lato (con paredes internas y un escudo de germinacin) a un nuevo genero

Scutellospora.

Entre 1982 y 1990, el nmero de HMA descrito se incremento marcadamente Trappe (1982), en

su clave sinptica para la familia Endogonaceae, describi 77 especies excluyendo Endogone, y

Hall (1984) en su clave dicotmica para Endogonaceae listo 67 especies, otra vez excluyendo a

Endogone. Luego, Schenck y Prez catalogaron 120 especies descritas (1987) y

subsecuentemente 147 especies (1990) en el gnero de hongos que producen asociaciones

micorrticas. Walker (1986) y otros (Berch y Koske, 1986; Morton, 1986; Spain et al, 1989)

definieron tipos de paredes fenotpicamente diferentes y separables, representados por

murogramas (Representacin grafica de tipos de paredes y sus posiciones relativas). Esta

clasificacin de HMA se basa en caractersticas morfolgicas de esporas (incluyendo murgrafos),

ya que los caracteres vegetativos de los hongos no varan mucho entre taxones y estn tambin

influenciadas por especies de hospederos vegetales.

Ciclo de vida de HMA

Las micorrizas arbusculares se originan a partir de hifas que proceden de los propgulos

existentes en el suelo (esporas maduras, fragmentos de raz micorrizados, o plantas micorrizadas

que crecen en vecindad). Cuando una hifa contacta con la superficie de una clula epidrmica de

la raz, forma un apresorio que originara seguidamente la hifa colonizadora que penetrara en

dicha clula o atravesara el espacio intercelular. En la zona externa del cortex de la raz forma

unas estructuras intracelulares tpicas que son los ovilllos; en la zona media las hifas crecen

normalmente de forma longitudinal en los espacios intercelulares; mientras que en la zona interna

las hifas penetran intercelularmente y forman los arbusculos por ramificacin dicotmica repetida,

a nivel de los cuales se produce el intercambio de nutrientes (Figura 2).

Figura 2. Ciclo de Vida de HMA (INVAM, 2006).

Tambin habra que destacar la formacin de vesculas en el cortex cuya funcin es el

almacenamiento de reservas lipidicas. Tras la colonizacin interna se produce la ramificacin y

desarrollo del micelio externo, que es clave en la captacin de nutrientes y da lugar a nuevos

puntos de colonizacin en la propia raz o en otras prximas. Sobre la red tridimensional de hifas

que constituye se forman las esporas, estructuras de resistencia que, al madurar completan el

ciclo del hongo (Figura 3).

Figura 3.

Estructura morfolgica de las micorrizas vesculo arbuscular (http://www.turipana.org.co/micorrizas.htm

corredor Gloria)

http://www.turipana.org.co/micorrizas.htmhttp://www.turipana.org.co/micorrizas.htm

Etapas del desarrollo de Hongos de Micorriza Arbuscular en sistemas suelo/planta

Los Hongos de Micorriza Arbuscular (HMA) son simbiontes biotrficos obligados con un ciclo de

vida dividido en dos etapas distintas. Por un lado, los estadios de reposo y reproductivo (esporas,

esporocarpos, y posiblemente tambin vesculas) son independientes de la planta. Por otra parte,

los estadios vegetativos estn involucrados en interacciones complejas con las plantas entre las

cuales se incluyen el reconocimiento, la colonizacin y el intercambio de nutrientes. Estas etapas

son representadas por el desarrollo de hifas externas en el suelo e hifas y espirales, arbusculos y

vesculas dentro de la raz.

Esporas de HMA

Las esporas son producidas rpidamente en presencia de una planta hospedera, de manera que

a los 4 a 6 meses son producidas miles de nuevas esporas del mismo tipo. Las esporas son

formadas en el micelio extraradical o agregadas en estructuras ms o menos bien definidas

llamadas esporocarpos. Aunque en algunas especies las caractersticas de los esporocarpos son

importantes, las caractersticas individuales de las esporas son las que principalmente se utilizan

para la identificacin. Las esporas difieren en forma, estructura, contenido citoplasmtico, color,

tamao, nmero de paredes va de germinacin, morfologa de esporas secundarias y presencia o

ausencia de esporocarpos (Mosse et al., 1981; Gerdemann y Trappe, 1974; Morton, 1990).

El fenotipo de la espora es el resultado de procesos de desarrollo completamente diferentes de

aquellos del talo, por lo que la espora es considerada ser autnoma en forma y funcin por

algunos investigadores. Sin embargo, el tubo germinal de la espora puede originarse a partir de

una red hifal filamentosa, arbusculos, vesculas o clulas accesorias (Morton et al., 1995b). El

compromiso de la hifa arbuscular altamente modificada en la colonizacin no es muy posible.

Morton (1993) considera que un individuo fungal es representado por una sola espora identificable

la cual consiste de una sola clula multinucleada. Esta clula puede dar origen a una nueva

colonia fungal con componentes del micelio dentro de una raz y en el suelo. Esta colonia

vegetativa eventualmente dar origen a nuevos individuos en forma de nuevas esporas.

Las esporas son clulas morfolgicamente especializadas las cuales no contribuyen directamente

ni soportan actividades del desarrollo de la micorriza e interacciones hospedero-hongo. La funcin

de la espora es llevar la informacin gentica a nuevos hbitats e iniciar nuevos individuos

espacialmente separados del organismo parental. En ausencia de informacin sobre el ciclo

nuclear o existencia de etapas sexuales no es posible determinar si las esporas representan

realmente nuevas generaciones de nuevos individuos. Sin embargo, existe una gran variabilidad

gentica entre las esporas dentro de una sola especie e incluso entre las que se originan de un

cultivo que parte de una sola espora (Lloyd-McGilp et al., 1996; Rosendahl y Taylor, 1997;

Sanders et al., 1995; Wyss y Bonfante, 1993; Zz et al., 1997). Esto complica los factores y

resalta la necesidad de investigaciones en el ciclo de vida y la gentica del hongo.

Germinacin de las esporas

La germinacin de esporas es una parte integral del ciclo de vida de los hongos de micorriza

arbuscular ya que representa la iniciacin de la etapa vegetativa del crecimiento. Los caracteres

de germinacin son importantes para la taxonoma ya que son utilizados para distinguir entre los

dos gneros de Gigasporinae, Gigaspora y Scutellospora. En Gigaspora la germinacin ocurre

directamente a travs de la pared celular mientras que en Scutellospora sta ocurre a partir de un

escudo de germinacin formado sobre o dentro de una capa de pared interna (Walter y Sanders,

1986).

La dormancia de esporas puede variar desde dos semanas hasta muchos meses en especies de

Acaulospora, G. intraradices y Gigaspora gigantea (Gazey et al., 1992; Tommerup. 1983). La

germinacin de esporas puede tambin estar influenciada por el pH, la humedad, los exudados de

la raz hospedera y otros factores (Tommerup, 1983; Hetrick, 1984; Hepper, 1984; Siquiera et al.,

1985). Por ejemplo, las esporas de Glomus mosseae germinan ms rpidamente cuando son

almacenadas a bajas temperaturas (Hepper y Smith, 1976). Muchas bacterias del suelo pueden

afectar la germinacin de esporas. Algunas pueden ser inhibidoras mientras otras promueven la

germinacin y formacin micorrizales (Fitter y Garbaye, 1994).

En presencia de factores de la raz hospedera, el crecimiento hifal a partir de esporas no es

todava bien comprendido. Originalmente se propuso que la falta de sntesis de DNA y

proliferacin nuclear podran ser la causa (Burggraaf y Beringer, 1989), pero las observaciones de

migracin nuclear y replicacin de DNA nuclear en la hifas creciendo a partir de esporas

(Bianciotto y Bonfante, 1993); Bcard y Pfeffer, 1993), han llevado al rechazo de sta hiptesis, y

otros mecanismos deben ser los responsables de la falta de crecimiento. Estos podran incluir

sistemas de transporte de membrana no efectivos tal que la habilidad de absorber nutrientes es

limitada (Smith y Smith, 1986).

Las esporas transportadas por el suelo de HMA son consideradas las estructuras reproductivas

ms importantes, pero sus nmeros en suelo estn a menudo poco relacionadas con la formacin

de micorrizas en raz (Abbott y Robson, 1984b; Ebbers et.al, 1987; McGee, 1989). Para algunas

especies, la produccin de esporas solo ocurre despus de que un nivel umbral de colonizacin

es alcanzado (Gazey et al., 1992). Adems la produccin de esporas es influenciada por muchos

factores incluyendo la planta hospedera y el tipo de suelo.

Solo se pueden hacer pocas generalizaciones tiles acerca de las condiciones que llevan a la

formacin de esporas a parte de la necesidad dejar pasar algunos meses desde la colonizacin

inicial del hospedero. En relacin a otros propgalos micorrticos de MA, las esporas son

consideradas generalmente como ms resistentes a condiciones adversas (Abbott y robson,

1982b) que otros fragmentos colonizados de raz o hifas y pueden actuar como estructuras de

supervivencia a largo plazo, con alguna capacidad para la dispersin por agua y por viento (Koske

y Gemma, 1990; Friese y Allen, 1991).

Colonizacin

El proceso y la taza de colonizacin determinan la efectividad de un HMA o una asociacin

micorrizal. La colonizacin puede originarse a partir de esporas, fragmentos de raz infectados o

hifas (Smith y read, 1997). La red hifal y los fragmentos de raz son dados a ser la fuente principal

por la cual las plantas son colonizadas (Smith y Walter, 1981; Jasper et al., 1992; Hepper, 1981).

Al mismo tiempo que la infeccin de esparce dentro de las clulas corticales de la raz hospedera,

un micelio de hifas extraradicales crece afuera, hacia el suelo. Las hifas extraradicales tienen un

papel importante en la adquisicin de nutrientes y forman una fuente de colonizacin secundaria a

lo largo de y entre las races (Harley y Smith, 1983; Smith y Gianiazzi-Pearson, 1988; Smith et al.,

1992).

Dentro de la corteza, las hifas crecen longitudinalmente entre las clulas e intracelularmente para

formar arbusculos. Utilizando a G. mosseae como modelo, Giovannetti et al., (1993) demostraron

que los primeros apresorios fueron formados dentro de las 36 horas siguientes al principio de la

interaccin con Ocimum basilicum y Helianthus annuus y los primeros arbusculos fueron formados

entre las 42 y las 48 horas despus de la inoculacin de H. annuus. Estas observaciones

concuerdan con observaciones anteriores (Cox y Sanders, 1974; Brundrett et al., 1985). Utilizando

un sistema de materas nodriza con Glomus intraradices y Lycopersicon esculentum, Rosewarne

et al., (1997) mostraron que despus de solo 4 das aproximadamente el 60% de la raz estaba

asociada con hifas y el pico de nmero de arbusculos ocurri 4 das despus de que el

crecimiento hifal lograra su mximo. Es asumido por parte de muchos investigadores que los

arbusculos son la interfase principal para la toma de azcares por parte del hongo y la

transferencia de iones desde el hongo a las clulas corticales de las races de las plantas

hospederas, aunque existen evidencias de la separacin espacial de las funciones de

transferencia de Carbono y Fsforo y esta disponible una interfase hifal y arbuscular. (Gianiazzi-

Pearson, 1991; Smith y Read, 1997).

Las vesculas, que son rganos de almacenamiento que contienen gran cantidad de lpidos y

muchos ncleos, son formadas por miembros de Glominaceae despus de que la unidad de

infeccin ha madurado. Las vesculas producidas por muchos HMA se considera que funcionan

como rganos de almacenamiento temporal. Sin embargo stas tienen a menudo paredes con

mltiples capas, como las esporas, y pueden funcionar como propgalos cuando estn aisladas

de la raz (Biermann y Linderman, 1983).

Poblaciones de HMA en ecosistemas naturales

Existe muy poca informacin acerca de HMA en ecosistemas naturales, sin embargo han surgido

evidencias de que la diversidad es mayor que la que se ha inferido a partir de estudios

morfolgicos de esporas. Las poblaciones en diferentes ecosistemas, sobre la base de conteo de

esporas, varan entre 5 y 25 especies diferentes. Este nmero depende de las especies

hospederas involucradas (tabla 2.1). El nmero de esporas no siempre esta bien correlacionado

con el grado de formacin micorrizal (Brundrett, 1991) y su porcentaje de germinacin vara en

diferentes tiempos del ao (Tommerup, 1983; Gemma et al., 1989)

La composicin de una especie de HMA puede ser explicada como una respuesta a los cambios

en la comunidad de plantas, ya que la naturaleza obligada de los simbiontes de HMA une el

crecimiento y la reproduccin tanto de la planta hospedera como del hongo a las condiciones del

suelo (Adelman y Morton, 1986; Hendrix et al., 1995; Sanders y Fitter, 1992a). En estudios de

campo, se ha mostrado que la secuencia de cosechas modifica la comunidad de HMA y la

composicin de especies. La predominancia de una sola especie de HMA para cada cosecha se

desarroll en secuencias continuas de maz y soya (Johnson et al., 1991), favoreciendo la

especies benficas para la cosecha y reduciendo la poblacin de especies de HMA menos

benficas (Johnson et al., 1992a).

Las prcticas de manejo tales como la labranza (Evans y Miller, 1988), tasa y mtodo de

aplicacin de fsforo, aplicacin de pesticidas o abonar con cal se ha demostrado que tambin

influencian la esporulacin y la colonizacin por HMA (Duke et al., 1994; Medeiros et al., 1994;

Ryan et al., 1994; Wang et al., 1993). En algunos casos la diversidad de la comunidad de HMA ha

sido incrementada en el manejo de sistemas que utilizan la rotacin de cultivos y entradas

reducidas de herbicidas (Douds et al., 1993).

Para estudiar la contribucin micorrizal a una comunidad de plantas de sucesin temprana en el

campo, Gange et al., (1990) utiliz un fungicida para reducir la colonizacin durante el primer ao

de establecimiento de las plantas en suelo raso. Una menor cantidad de especies de plantas se

establecieron en comunidades tratadas con fungicidas, soportando la idea de que los HMA

promueven la diversidad de especies de plantas (Helgason et al., 1998; Van der Heijden et al.,

1998). Los hongos micorrizales deben tambin afectar el patrn de diversidad de especies y la

abundancia relativa, una vez el estatus micorrizal de la comunidad de plantas ha sido restaurado

en un ecosistema previamente perturbado (Barea y Jeffries, 1995). El HMA puede reducir la

diversidad de plantas si la simbiosis representa un beneficio relativamente ms grande para la

especie dominante dentro de la comunidad Hetrick et al., 1994).

Cuando los ecosistemas son perturbados, por ejemplo por monocultivos o por utilizacin de

pesticidas, la dinmica de la comunidad es perturbada y se puede desarrollar un sesgo hacia

pocos e incluso un solo hongo dominante (Johnson et al., 1992a). Por ejemplo, en algunos

ambientes la labranza y el uso de fertilizantes ha llevado a que se encuentren menos especies de

HMA en el suelo (Hetrick y Bloom, 1983; Schenck y Kinloch, 1980) mientras que en otros el uso

agricultural debe promover una mayor diversidad (Abbott y Robson, 1977).

Aunque los estudios poblacionales de hongos micorrizales de MA estn basados en caracteres

morfolgicos de los cuerpos fructificantes, esporas, micelios vegetativos o estructuras simbiticas,

la aproximacin es todava limitada dado que los factores que influencian la esporulacin de una

especie individual son poco entendidos y no pueden ser extrapolados hasta la extensin de

colonizacin vegetativa de diferentes especies de plantas. Las poblaciones de esporas proveen

solo una indicacin relativa de la abundancia y la composicin de especies de poblaciones

fungales de MA. Sin embargo, los estudios moleculares de la diversidad de los hongos (Van

Tuinen et al., 1994) en ecosistemas naturales pueden ofrecer un mejor medio de identificacin

para informacin sobre poblaciones, especialmente cuando es difcil acumular un nmero

suficiente de caractersticas morfolgicas.

La ocurrencia de muchas especies de HMA en suelos o dentro de races sugiere, que la

competencia interespecfica es posible. La variacin en la produccin de esporas entre endfitos

coexistentes ha sido observada (Gemma et al., 1989) y una abundante produccin de esporas por

un HMA era usualmente correlacionada con niveles ms bajos de produccin de esporas por

otros. Esto puede deberse al antagonismo entre las especies. En experimentos de cultivo con

materas, donde muchos aislamientos de HMA son inoculados conjuntamente, se ha probado que

algunos son mejores competidores que otros (Wilson, 1984; Lpez-Aguillon y Mosse, 1987).

Planta hospedera y produccin de esporas

Casi el 90% de las especies de plantas vasculares hasta ahora examinadas pueden ser

colonizadas por HMA (Harley y Smith, 1983) y son normalmente micorrizales en el campo. La

especificidad del hospedero es aparentemente muy baja. Bajo condiciones experimentales un solo

aislamiento del hongo puede formar asociaciones con plantas hospederas taxonmicamente

diversas (Gerdemann, 1975; Smith y Read, 1997) y solo una especie de planta hospedera se

asocia con muchos aislamientos fungales, llevando a la visin ampliamente aceptada de que las

asociaciones micorrticas carecen de especificidad. Sin embargo hay algunas evidencias de que

existe un cierto grado de especificidad entre HMA y plantas, particularmente en ecosistemas

naturales (Rosendahl et al., 1994; Sanders y Fitter, 1992b; Smith y Read, 1997).

No hay duda de que las asociaciones incluyendo diferentes especies de plantas y hongos exhiben

una variabilidad funcional. Algunas plantas hospederas dan un mayor beneficio al HMA que otras,

lo cual es reflejado en las diferencias de cantidad de produccin de esporas. En la mayora de los

casos la formacin de esporas esta estrechamente relacionada con la longitud total de las races

micorrizales producidas por determinado hospedero (Giovannetti et al., 1988; Hetrick y Bloom,

1988; Howeler et al., 1987; Simpson y Daft, 1990; Gazey et al., 1992). De este modo, la

proporcin de diferentes especies en determinado lugar depender de la extensin a la cual

colonicen los sistemas radiculares de las plantas. Cualquier grado de especificidad o diferencia en

la efectividad ser entonces reflejado en las poblaciones de esporas.

Hay evidencias que soportan esta idea. En una investigacin de plantas perennes de 19 familias,

en un desierto del Sur de California, la mayora de las plantas eran hospederos potenciales para

hongos endomicorriticos y fue mostrado que la diversidad de estos hongos esta directamente

relacionada con la diversidad de plantas (Bethlenfalvay et al., 1984). De nuevo la situacin es

compleja ya que en algunos estudios de comunidades de plantas los datos han sido presentados

mostrando que toda la diversidad de hongos puede ser soportada por un gran nmero de

especies relacionadas (ie. en el mismo gnero o familia) mientras que especies de solo una planta

solo soportaban algunos de los hongos (Brundrett y Kendrick, 1988; Trappe et al., 1984). Ms

an, en un estudio de los hongos presentes en el bosque bluebell, Scutellospora, Acaulospora y

Glomus solo ocurran cuando la planta Hyacinthoides non-scripta estaba presente (Clapp et al.,

1995), otra vez, implicando algn nivel de especificidad del hospedero.

Este resultado confirma los estudios realizados por Molina et al. (1978), los cuales mostraban que

dos o ms especies pueden colonizar una planta individual. Los datos en esta rea no son

extensivos y por esto los mtodos que nos permiten comparar el grado de colonizacin de races

por especies individuales con produccin de esporas son esenciales para comprender a cabalidad

la competencia entre especies de hongos y las especificidad de las plantas hospederas.

Las asociaciones micorrizales son normalmente benficas, (mutualsticas) para las plantas

(Johnson et al., 1997; Smith y Read, 1977). Las micorrizas incrementan la tasa de crecimiento de

las plantas a travs de un incremento en la toma de nutrientes, especialmente Fsforo bajo

condiciones controladas (Fitter, 1989; Smith et al., 1994; Jackson et al., 1972), sin embargo, bajo

condiciones naturales, no hay suficiente evidencia que muestre los incrementos en el crecimiento

de las plantas debido a micorrizas (Fitter, 1989; Newsham et al., 1995a; West et al., 1993).

Las respuestas de bajo crecimiento podran estar asociadas con las diferencias en la efectividad

de las especies micorrizales (eg. Abbott y Robson, 1981a; Abbott y Robson, 1981b; Bevege y

bowen, 1975; Jakobsen et al., 1992).Por ejemplo, el pequeo endfito Glomus tenue no produce

una respuesta de crecimiento, an en suelo con baja fertilidad (Powell, 1979), G. intraradices y G.

City Beach WUM 16 incrementaron el crecimiento de la planta y la toma de fsforo, pero G.

etunicatum y G. mosseae no tuvieron efectos en el crecimiento de la planta ni en la toma de

Fsforo en diferentes niveles de compactacin del suelo (Nadian et al., 1998). La contribucin

relativa de las races en la toma total de fsforo vario ampliamente entre plantas colonizadas por

S. calospora, Glomus sp. y G. caledonium en cohombro (Pearson y Jakobsen, 1993). Entonces,

las diferencias entre los HMA de sus requerimientos aparentes de eficiencia de toma de carbono o

nutrientes deberan ser evaluados para HMA de especies colectadas en campo. Mas an, en esta

situacin, las sondas moleculares harn ms fcil la distincin de diferentes especies de hongos

que estn actualmente presentes en las races.

Los efectos de los HMA en plantas son dependientes de la planta hospedera y las condiciones

ambientales (Sieverding o Howeler, 1985; Smith y Read, 1997; Smith, 1993; Newsham et al.,

1995b). Los nmeros de esporas de HMA individuales en un ecosistema natural de sabana en

Colombia cambiaron como resultado de diferentes prcticas de manejo (Dodd et al., 1990). En los

suelos originales, doce tipos de esporas fueron identificadas y se observ que las poblaciones de

diferentes tipos de esporas cambiaron rpidamente bajo diferentes regimenes de cosecha. Por

ejemplo, las esporas de Glomus occultum y Acaulospora myriocarpa incrementaron en

subtransectos de sorgo, mientras que aquellos de Entrophospora colombiana, A. melleae y A.

morrowiae dominaron subtransectos donde cowpea (Vigna unguilata) creca tras un cultivo de

kudzu (Pueraria phaseoloides) (Dodd et al., 1990b). Este estudio soporta la idea de que diferentes

plantas hospederas pueden producir diferentes poblaciones de HMA en el suelo alrededor de un

sistema de races.

En franjas de terreno de minas naturalmente revegetadas muchos tipos diferentes de esporas

fueron encontradas y 13 stas fueron identificadas a nivel de especie (Kiernam et al., 1983). Cada

planta muestreada tenia entre una y ocho especies de micorrizas asociadas con ella. Mas

recientemente, un anlisis de poblaciones de esporas bajo una pradera natural de pasto alto

(Bentivenga y Hetrick, 1992) mostr la presencia de 14 especies de HMA, con esporas de Glomus

ambisporum como las dominantes numricamente.

No esta claro si las especie que se vuelve dominante con cada planta hospedera es tambin la

especie que fue ms benfica para este cultivo particular o para la estabilidad del suelo (Barea y

Jeffries, 1995). Desafortunadamente, no hay suficientes datos para entender completamente si las

plantas controlan la diversidad de los HMA para poder formar simbiosis benficas (Van der

Heijden et al., 1998).

Manihot esculenta (YUCA) y su relacin con los HMA

La yuca (Manihot esculenta Crantz), planta originaria de Amrica tropical, es un arbusto leoso

perenne, que pertenece a la familia Euphorbiaceae. Se cree que fue domesticada en Brasil, donde

existe el mayor nmero de especies Manihot y la mayor diversidad dentro de las diferentes

especies; sin embargo, existe poca evidencia arqueolgica que confirme este hecho (Arismendi,

2001).

Esta especie es de gran importancia socioeconmica para los agricultores y consumidores de

pocos recursos econmicos de pases tropicales, ya que es un producto bsico en su dieta

alimenticia y ocupa el cuarto lugar en importancia como fuente de energa, despus del arroz, el

maz y la caa de azcar (Arismendi, 2001) .

Como ya se haba mencionado la yuca (Manihot esculenta) tiene la capacidad para producirse

en suelos relativamente pobres la cual esta relacionada con alguna disposicin especial de la

planta para extraer nutrimentos del suelo; el rea de exploracin de las races, que puede llegar

hasta un metro de profundidad, lo cual puede ayudar a explicar su crecimiento en suelos

marginales. Sin embargo, observaciones microscpicas indican que la yuca tiene un sistema

radical bastante burdo, con races relativamente gruesas y pobremente ramificadas y los pelos

radicales pueden estar presentes pero no son abundantes (Arismendi, 2001).

Recientes investigaciones han demostrado que la adaptacin de la yuca a los suelos pobres esta

relacionada con la habilidad de la planta para formar micorrizas vesculo- arbusculares. En

muchas reas productoras de yuca, en Amrica Latina, el principal limitante del cultivo es la

deficiencia de fsforo. Se ha demostrado que la inoculacin con micorrizas mejora la capacidad de

absorber fsforo a partir de suelos y soluciones nutritivas con bajas concentraciones de ese

elemento (Arismendi, 2001).

Las micorrizas arbusculares en las plantas de yuca, aumentan la superficie de absorcin de las

races absorbentes y, con ello, la absorcin de iones en el suelo, particularmente el fsforo. Las

micorrizas que afectan las races de yuca y de muchos otros cultivos pertenecen al grupo de las

endomicorrizas vesculo-arbusculares. Sus hifas crecen entre y dentro de las clulas de la corteza

de las races, produciendo ramificaciones dentro de ella, llamadas arbusculos y vesculas. Las

hifas tambin crecen en el suelo, donde pueden extenderse hasta varios centmetros de la raz

(Howeler, 1983 citado por Cadavid, L, 2000).

Los gneros de hongos ms comunes y eficientes encontrados para el cultivo de la yuca son

Glomus, Entrophospora y Acaulospora en suelos de Colombia (Cadavid, L, 2000).

Aproximaciones moleculares al estudio de HMA

La mayora de las investigaciones moleculares en identificacin y deteccin de HMA a nivel de

especie y aislamiento han utilizado tcnicas basadas en PCR, las cuales permiten la

caracterizacin de cidos nucleicos a partir de pequeas cantidades de DNA fungal (White et al.,

1990). Un primer estudio de DNA fungal de MA util