CHROMagar Candida medio se utiliza para el aislamiento e identificación de Candida especies, pero no diferenciar Candida albicans y Candida dubliniensis .

Esta diferenciación se puede lograr mediante el uso de agar Pal, que no se puede utilizar en el aislamiento primario. Hemos combinado ambos medios para obtener un medio nuevo que se puede utilizar para el aislamiento y la identificación de C.dubliniensis en cultivos primarios.

Candida dubliniensis y Candida albicans son dos especies de hongos que muestran características fenotípicas muy estrechas que hacen que la discriminación entre ellos difícil. La diferenciación de ambas especies se puede lograr mediante un número limitado de pruebas tanto fenotípicas y genotípicas .

Una serie de pruebas fenotípicas para diferenciar ambas Candida especies, incluyendo el crecimiento en 42 a 45 ° C chlamydospora producción en diferentes medios de comunicación, el desarrollo de colonias de color en medios diferenciales, tales como Candida CHROMagar medio

la asimilación diferencial de hidratos de carbono, y una reacción de inmunofluorescencia indirecta con un específico anti- C. dubliniensis suero , se han descrito anteriormente.

CHROMagar Candida medio es un medio ampliamente usado para la identificación de Candida spp. que se desarrollan colonias con colores distinguibles. Este medio permite la identificación presuntiva de C.albicans , Candida tropicalis , y Candida krusei .

Agar Pal fue desarrollado originalmente para la identificación de Cryptococcus neoformans y se ha utilizado para la diferenciación entre C. dubliniensis y C. albicans . En este medio, C. dubliniensis forma colonias rugosas y chlamydo esporas-, mientras que C. albicans muestra colonias lisas y no produce clamidospors.

En el presente estudio, hemos suplementado con Candida CHROMagar agar y agar Pal para mejorar la diferenciación de C. dubliniensis de C. albicans logrado con cada medio de cultivo individualmente.

11 cepas de referencia fueron utilizados como controles para este estudio, se obtuvieron de NCPF, Bristol, Reino Unido, Paises Bajos, Virginia y CECT, valencia, España e incluyo C.dubliniensis NCPF 3949, CBS 2747, CBS 8500, CBS 8501 y CECT 11473; C. albicans NCPF 3153;C. tropicalis NCPF 3111, Candida glabrata NCPF 3203, C. krusei ATCC 6258,Candida guilliermondii NCPF 3099, y Candida parapsilosis ATCC 22019.

Los restantes 131 cepas de levadura fueron aislados clinicos de oral, vaginal esputo, o de origen de sangre previamente aisladas en el laboratorio y se incluyo a 95 cepas de C.dubliniensis , 29 cepas de C. albicans, 2 cepas de C. krusei, 2 cepas de C.glabrata , 2 cepas de C. guilliermondii y 1 cepa de C. parapsilosis.

Los aislamientos clínicos fueron identificados por sus patrones de asimilación de carbohidratos en tiras ID 32C (bioMérieux, Marcy-l'Etoile, Francia), el crecimiento en 42 a 45 ° C, clamidosporas producción en agar caseína, y de inmunofluorescencia indirecta con un específico anti- C. dubliniensis suero.

La Identificación genotípica de C. dubliniensis y C. albicans aislamientos se realizó mediante PCR con cebadores específicos. Los cuatro genotipos de C. dubliniensis se determinaron de acuerdo con los métodos descritos previamente por Brena et al. y Gee et al, Algunos C. dubliniensis y C. albicans aislados fueron secuenciados para verificar su identidad.

PAL AGAR se preparó añadiendo 50 g de semillas de girasol sin sal en polvo a litros l de agua destilada, hervir durante 30 min, y filtrado a través de estopilla. Este extracto fue suplementado con creatinina (1 g), glucosa (1 g), y KH 2 PO 4 (1 g). Después de ajustar el pH a 5,5, agar (15 g / litro) se añadió, y la mezcla se sometió a autoclave a 110 ° C durante 20 min. El medio enfriado (45 a 55 ° C) se vertió en 90 mm de diámetro, cajas de Petri (25 ml / placa).

CHROMagar (París, Francia) Candida medio se preparó de acuerdo con las instrucciones del fabricante de la siguiente manera: 47,7 g del medio de polvo se dispersó lentamente en 1 litro de agua purificada y se llevó a ebullición por calentamiento repetido hasta la fusión completa de los granos de agar.

El medio se vierte en placas de Petri según lo descrito anteriormente. CHROMagar Candida medio suplementado con medio de Pal fue preparado mezclando volúmenes iguales de medio CHROMagar Candida preparada y agar Pal. Después de agitar bien, el medio se vertió en 90 mm de diámetro, cajas de Petri.

Las cepas se cultivaron simultáneamente en agar Pal, medio CHROMagar Candida y Candida CHROMagar medio suplementado con agar Pal. Inóculo de cepas de colección se obtuvo a partir de células cultivadas en agar Sabouraud durante 48 horas a 37 ° C. Las placas se incubaron a 30 ° C (agar de Pal y medio CHROMagar Candida suplementado con agar Pal) o 37 ° C (CHROMagar medio Candida), y características de las colonias se registraron después de 24, 48 y / o 72 h de incubación por dos observadores diferentes . La formación de clamidosporas fue detectada microscópicamente usando azul de algodón lactofenol

En la tabla 1 muestra color de la colonia y la morfología, así como la formación de clamidosporaspor C. albicans y C. dubliniensis aísla cuando cepas fueron cultivadas en diferentes medios.

96 de los 100 C. dubliniensis , formaron colonias rugosas en agar Pal, el 75% mostró una franja de hifas, y el 93% produjeron clamidosporas.

Por el contrario, todas C. albicans cepas forman colonias lisas sin margen de hifas y no produjo clamidosporas.

Los 3 C. krusei aislados y una C. parapsilosis aislar formadas colonias rugosas.

58 de los 100 C. dubliniensis cepas crecieron tan oscuras colonias verdes en medio CHROMagar Candida, y el restante 42% creció más ligeros como colonias verdes.

13 de los 30 (43,3%) C. albicans aislados forman colonias de color verde claro, y el restante 56,6% forman colonias de color verde oscuro y verde.

96 de los 100 C. dubliniensis aislamientos crecieron como colonias rugosas en medio CHROMagar Candida suplementado con agar Pal, 75 aislamientos formado franja de hifas, y 93 clamidosporas producidas.

96 aislamientos crecieron colonias verdes azuladas como que eran fáciles de distinguir de C. albicans colonias. Por el contrario, C. albicans , formaron colonias lisas de color verde claro y no pudieron producir ya sea franja de hifas o clamidosporas.

La morfología de las colonias (áspero / suave) y los resultados de producción de clamidosporas C. dubliniensis y C. albicans aislamientos fueron las mismas para Pal agar y medio CHROMagar Candida suplementado con agar Pal.

Por el contrario, color de las colonias no era definitiva en medio CHROMagar Candida, como C.albicans y C. dubliniensis aislados mostraron las tres intensidades de color verde.Sin embargo, cuando este medio fue suplementado con agar Pal, C. albicans aísla apareció como luz colonias verdes, lisas, mientras que C. dubliniensis mostró una distinguible color verde azulado que fue acompañado en la mayoría de casos (96%) de la producción de colonias rugosas, haciendo diferenciación de ambas especies mucho más fácil.

En conclusión, CHROMagar Candida medio suplementado con agar Pal permite la diferenciación rápida y fácil entre C. albicans y C. dubliniensis sobre la base de sus características de colonias.

Cuando se utiliza como un medio de aislamiento primario, medio CHROMagar Candida suplementado con agar Pal permite la identificación de C. dubliniensis incluso en cultivos mixtos que contienen C. albicans , C.tropicalis , C. krusei , y / o C. glabrata .