CURVA DE CALIBRACION POR

FOTOCOLORIMETRIA

JEIMER KALEB USUGA LONDOÑO

JUAN DAVID LOPEZ NOREÑA

¿QUE ES LA FOTOCOLORIMETRIA?Método que sirve para hallar concentraciones de diferentes

muestras coloreadas.Consiste en medir la intensidad de luz absorbida(A) o

transmitida(T) por una solución coloreada de compuestos.El fundamento de la fotocolorimetria se debe a la capacidad

de las moléculas para absorber radiaciones.La absorción de luz en un compuesto coloreado puede variar

debido: la longitud de onda(), concentración del compuesto, longitud de celda que contiene la muestra.

¿A QUE SE LLAMA LONGITUD DE ONDA()?La describe cuán larga es la onda; y corresponde a la

distancia existente entre dos crestas o dos valles consecutivos.

V=velocidad de propagación.

F=frecuencia de onda.

SUSTANCIAS COLOREADASUna sustancia es coloreada porque absorbe y transmite

radiación en la región visible del espectro electromagnético.

Cuando una molécula absorbe radiación u.v. o visible, lo que fundamentalmente ocurre es que se excitan los electrones de valencia.

¿QUE ES UNA ONDA?Se entiende por onda a aquella perturbación que transporta

energía, y que se propaga en el tiempo y espacio, la onda tiene una vibración de forma ondulada que se inicia en un punto y continúa hasta que choca con otro cuerpo.

Existen 3 tipos de ondas según el medio en que se propagan: las electromagnéticas, las mecánicas y la gravitacionales.

REGION VISIBLE DEL ESPECTROEs la región del espectro electromagnético que el ojo humano es

capaz de percibir. A la radiación electromagnética en este rango de longitudes de onda se le llama luz visible o simplemente luz.

El rango de las en las cuales la luz es visible es entre 400nm - 700nm

EL FOTOCOLORIMETRO

Es un instrumento usado en la química para determinar la concentración de sustancias disueltas en líquidos o sólidos mientras sean transparentes a la luz visible, ultravioleta o infrarroja, midiendo y comparando sus colores.

El aparato consta de un sistema lumínico para iluminar las muestras y se mide con un sistema electrónico la cantidad de luz que pasa.

Los colorímetros se basan en el principio de que la absorbancia de una sustancia es proporcional a su concentración, y es por eso que las sustancias más concentradas muestran una lectura más elevada de absorbancia.

ESPECTRO DE ABSORCIONEs el nombre de una grafica, la cual muestra la intensidad

de la energía absorbida por una molécula, a partir de diferentes longitudes de onda.

A partir de la grafica(espectro de absorción), se puede deducir la longitud de onda en la cual el compuesto absorbe la mayor o menor intensidad de energía.

Al saber estas características, facilita según sea el caso, la detección de una sustancia, ya sea para determinar su concentración o diferenciarla de otros compuestos.

LA ABSORCION DE ENERGIALa absorción es el fenómeno por el cual la energía de un fotón es tomada por otra partícula, como por ejemplo un átomo cuyos electrones de valencia efectúan una transición entre dos niveles de energía electrónica.

La cantidad de energía para lograr que los electrones de valencia sean excitados se dan por la formula:

ΔE = cantidad de energía (ergios).

v = frecuencia de la radiación (Hertz). h = constante de Planck. c = velocidad de la radiación en el vacío.

λ = longitud de onda de la radiación (cm.).

hchE

TRANSICIONES ELECTRONICAS Y LONGITUDES DE ONDACuando una molécula absorbe energía, sus electrones de

valencia al absorber un fotón de energía el electrón puede ocupar un orbital superior, los cuales se denominan “orbital antienlace.”

-<165nm:compuestos saturados. ->165 nm: compuestos insaturados. ->185nm y >270nm: compuestos con pares de electrones libres.

EJEMPLO DE TRANSICIONES ELECTRONICAS EN ALGUNOS GRUPOS FUNCIONALES

TRANSMITANCIALa transmitancia es una magnitud que expresa la

cantidad de energía que atraviesa un cuerpo en la unidad de tiempo.

La transmitancia óptica que se define como la fracción de luz incidente, a una longitud de onda especificada, que pasa a través de una muestra.

ABSORBANCIAMedida de la cantidad de luz absorbida por la

muestra.La absorbancia A de una muestra se define como:

LEY DE BEER La Ley de Beer es una ecuación que relaciona la absorción

 de luz con las propiedades del material atravesado.

Cuando un rayo de luz monocromática pasa a través de un medio absorbente se cumple que la absorbencia de este es directamente proporcional a la concentración de la muestra.

A = ϵ x c x l

A = Absorción (Intensidad de energía absorbida)C = Concentración de la muestra en mol/l l = Longitud de la celda ϵ = Coeficiente de extinción molar o absortividad molar.

La ley explica que hay una relación exponencial entre la transmisión de luz a través de una sustancia y la concentración de la sustancia, así como también entre la transmisión y la longitud del cuerpo que la luz atraviesa. Si conocemos  y α, la concentración de la sustancia puede ser deducida a partir de la cantidad de luz transmitida.

CONCENTRACION La concentración de una disolución es la proporción o relación que

hay entre la cantidad de soluto y la cantidad de disolvente, donde el soluto es la sustancia que se disuelve, el disolvente la sustancia que disuelve al soluto, y la disolución es el resultado de la mezcla homogénea de las dos anteriores. A menor proporción de soluto disuelto en el disolvente, menos concentrada está la disolución, y a mayor proporción más concentrada está.

USO DE LA LEY DE BEEREl uso o aplicación mas importante de la ley de Beer es la determinacion de concentraciones desconocidas de soluciones de sustancias que absorben en la región u.v- visible. Podemos calcular la concentración de una muestra problema, si las condiciones son iguales, definimos las siguientes formulas:

CURVA DE CALIBRACIONPara determinar concentraciones desconocidas mas precisas por

medio de la ley de beer, usualmente se prepara una curva de calibración a partir de una series de soluciones patrón, cuyas concentraciones sean próximas a la reales.

PRACTICA NO. 1

CURVA DE CALIBRACION POR FOTOCOLORIMETRIA

REACTIVOS Y PRODUCTOS Fotocolorímetro. Reactivo de Biuret. Solución de albúmina, (solución patrón, estándar de BSA (albúmina de

suero)). Solución salina al 0.9% Muestras problema: caseína, suero sanguíneo, gelatina (sin sabor).

DETERMINACION DEL ESPECTRO DE ABSORCION DE LA ALBUMINA

En un tubo de ensayo agregue 4 ml. de las solución de albúmina y 1 ml. del reactivo de biuret. Agite y espere 30 minutos para que se desarrolle el color.

Tome dos celdas del fotocolorímetro y agregue, en una, agua destilada que se empleará como blanco, y en otra, solución coloreada de la albúmina. Llénela solo hasta las 3/4 partes de su volumen.

Lleve al instrumento ( fotocolorímetro ) la celda que contiene el agua destilada, y ajuste la lectura de absorbancia en cero.

Lleve luego la celda con la solución coloreada y anote la absorbancia que indica el instrumento.

ESPECTRO DE ABSORCION(GRAFICA HIPOTETICA)

(nm) ABS

400 0.172

420 0.136

440 0.196

460 0.303

480 0.520

500 0.590

520 0.600

540 0.570

560 0.488

580 0.415

600 0.392

620 0.360

640 0.324

PREPARACION DE LA CURVA DE CALIBRACION DE LA ALBUMINA

Rotular diez tubos con las características especificadas.

Agregar a cada tubo 4 ml del reactivo de biuret.

Seleccionar en el fotocolorímetro la de mayor absorbancia y ajustar el “cero” de absorbancia con el “blanco”.

Calcular la concentración de la proteína en los tubos que tienen la solución patrón(c1v1=c2v2).

CURVA DE CALIBRACION DE LA ALBUMINA(HIPOTETICA)

VIDEO