Ficha club revista Reuma 03-15

7/21/2019 Ficha club revista Reuma 03-15

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Presenta: Luis Valderrama.

Caracas, marzo de 2015.

UNIVERI!"! CEN#R"L !E VENE$UEL"%"CUL#"! !E &E!ICIN"

C'&II(N !E E#U!I' !E P'#)R"!'CUR' !E EPECI"LI$"CI(N EN REU&"#'L')*"

+'PI#"L UNIVERI#"RI' !E C"R"C"



!"#' !EL E#U!I'

Centro de iotecnolo-a &/dica de andon-, Laor3ara iotecnolo-a de !ro-as del &inisterio de alud,Clae de En4ermedades Raras e Inusuales, +os3ital de andon-, 6inan, Cina.

"3o7ado 3or la %undaci8n Nacional de Ciencia Natural %undaci8n de Ciencia Natural de la Proincia de Pro-rama Nacional de Inesti-aci8n Elemental de Cinde Inesti-aci8n de Ciencia 7 #ecnolo-a de an-on.

Primera 3ulicaci8n: 01/12/14. doi:10.9;;<=reum.1>0



IN#R'!UCCI(N

La "R es una en4ermedad autoinmune sist/mica carac

in4lamaci8n cr8nica de la sinoial e i3er3lasia de lossinoiales. Esta in4lamaci8n 3uede erosionar el cartlad7acente, causando 3osterior destrucci8n de las articul

El 3roceso destructio 3uede ser mediado en 3arte 3oti3o 4irolasto ?%L@ de la memrana sinoialA en un mde inmunode4iciencia cominada seera 3ueden unirsenormal e inadirlo.



IN#R'!UCCI(N

Los %L son =u-adores 3otentes en la 3ato-/nesis de

am3liamente considerados a-resios 7 3roli4eratios, cartla-oA 3oseen caractersticas similares a las trans4ormadas, tales como: crecimiento inde3endienteinsensiilidad a la a3o3tosis, 7 3roli4eraci8n aumentada.

Los %L cultiados e3resan -randes cantidades de 3ro3ueden de-radar com3onentes de la matriz etracelucol-eno. Una 4amilia de 3roteinasas e3resada 3or lmetalo3roteinasa de matriz ?&&P@.



IN#R'!UCCI(N

Los %L e3resan &&P 1, 2, 9, ;, 7 10, 7 ellas se corcon inasi8nA son 3recursoras inactias Due deen ser 3

3or 3ro3rotenas conertasas ?PC@, las cuales las se33roducir 3rotenas iol8-icamente actias.

+asta la 4eca, ; PC an sido identi4icadas:

• PC1<PC9.• PC2.

• Proproteína convertasa subtilisina/Kexina tipo 6 (

• PC>.

• PC5<PCF.



IN#R'!UCCI(N La 4urina muestra altos nieles de e3resi8n en la

3acientes con "R 7 3uede 3rote-er contra la en4ermedad

La PCHF desem3ea un 3a3el im3ortante en la 3rom3ro-resi8n de los tumores de 3r8stata a un estado a-resi

El te=ido tumoral 7 la sinoial en "R com3arten cainclu7endo la an-io-/nesis etrema, de3osici8n de 4ir3roli4eraci8n celular desordenada 7 alta actiidad coa-u



IN#R'!UCCI(N "s, la PCHF =ue-a un 3a3el im3ortante en la "R Due di4

4urina.

Una ariante de PCHF 4ue 4uertemente asociada con la dolor en '" de rodilla, o4reciendo al-unas ideas sore3resencia del mismo dao estructural, al-unosdesarrollaron dolor cr8nico 7 otros estuieron 3rote-idos

Estudios en ratones sin PCHF tami/n im3licaron a ladolor. in emar-o, el 3a3el 3ara esta 3rotena en "R are3ortado.



IN#R'!UCCI(N En este estudio, se analiz8 cuantitatiamente la e3res

en te=idos sinoiales de 3acientes con "R 7 en indiidtanto a niel de transcri3ci8n como traducci8n.

Los casos 7 controles tami/n se -enoti3aron 3ara G1 3de un solo nucle8tido ?NP@ de PCHF 3ara identi4icar lade ariantes -en/ticas a la "R.

La disminuci8n en la e3resi8n ?JnocJdoKn@ de PCHF 4irolastos sinoiales de "R ?R"%@ aislados 3ara identien la 3roli4eraci8n, mi-raci8n, ca3acidad de inasi8n 7 3ciclo celular.



'6E#IV'

La 3ro3rotena conertasa sutilisina<Jein?PCHF@ es una 3roteinasa im3licada en la a3roteoltica de arias 3rotenas 3recurinolucrada en la re-ulaci8n de la madura3rotenas.

Evaluar el efecto de la PCSK6 en los fibrobsinoviales de AR.



La e3resi8n de PCHF 4ue detectada en el te=ido sinoial de 10 "R, 10 controles con '" 7 10 controles con E" usando ester

cuantitatia en tiem3o real. e realiz8 -enoti3i4icaci8n de FG 3olimor4ismos de nucle8tidos

utilizando microarre-los en un estudio de casos 7 controles Du3acientes con "R 7 1F0 controles sanos.

El -enoti3ado de otros > NP se realiz8 utilizando el ensa7o #aDcontroles sanos 7 1.151 3acientes con "R.

%irolastos sinoiales de "R ?R"%@ cultiados 4ueron trans4ect3eDueo de inter4erencia ?si"RN@ contra PCHF 3ara estudiar c3roli4eraci8n, inasi8n, ca3acidad de mi-raci8n, secreci8n din4lamatorias, ciclo celular, 7 3er4iles de e3resi8n de los R"%.

P"CIEN#E M &#'!'



Participantes !uestras

e reco-ieron te=idos sinoiales durante ciru-as de reem3lazo3acientes con "R, '", 7 E". Las muestras sinoiales 4ueron dite=idos conectios 7 almacenadas inmediatamente a O0C asta su

#odos los 3acientes con "R ?n Q 10@, '" ?n Q 10@, 7 E" ?n Q 10@, reude clasi4icaci8n del "CR.

Una se-unda coorte de 3acientes con "R ?n Q 2FG@ 7 controles ?seleccionados 3ara el -enoti3ado con la 3lata4orma Illumina.

Para el ensa7o de sonda #aD&an, se seleccion8 otra coorte de "-ru3o control ?n Q 1.05F@.

&"#ERI"LE M &#'!'



Participantes !uestras (continuaci"n)

Los casos 7 controles 4ueron em3are=ados 3or edad 7 rea se-undos no tenan istoria 4amiliar de "R.

&uestras de san-re 3eri4/rica se otuieron de todos los 3artici3an

Las caractersticas demo-r4icas se 3resentan en una tala com3le

Los 3artici3antes 3roe7eron su consentimiento in4ormado 3or esc

El Comit/ tico de la "cademia de Ciencias &edicinales de anestudio.

&"#ERI"LE M &#'!'



Extracci"n del A#$ %en"!ico

El "!N -en8mico 4ue etrado de leucocitos de san-re 3eri4/rica utHit de "!N de 'me-a. La concentraci8n de "!N 4ue medida.

Selecci"n de S$P

Ensa7os de Illumina )olden )ate se realizaron en el -enoti3o decontra PCHF en 2FG 3acientes con "R 7 1F0 controles.

Un total de ;F NPs sirieron como candidatos 7 4ueron 3resent3ara el diseo de un 3unta=e de ealuaci8n. La erramienta 4iltr83ara su 3lata4orma, tales como inserciones<deleciones, NPs triO 77 NPs Due no 4ueron localizados de manera Bnica.

FG NPs con 3untuaci8n de diseo de 1 4ueron seleccionados, aardel cromosoma, 7 curiendo com3letamente el -en PCHF.

&"#ERI"LE M &#'!'



&enotipificaci"n utili'ando !icroarre%los

La -enoti3i4icaci8n se realiz8 a tra/s de microarre-los VeraCode

Illumina. e utiliz8 un lector ead3ress usando el Hit de ensa7total de 500 n- de la muestra de "!N 4ueron utilizados 3or ensa7o7 selecci8n de -enoti3o se realizaron utilizando el so4tKare eadt

&enotipificaci"n utili'ando el ensao de S$P a*an

Para los 2; NPs no incluidos en la 3lata4orma Illumina, se estim83oder de la muestra necesario 3ara su 3osterior anlisis. 8lo > etiDueta reunieron los criterios 7 4ueron -enoti3ados utilizandosonda #aD&an en una coorte de 3acientes con 1.151 indiiduos controles.

&"#ERI"LE M &#'!'



&enotipificaci"n utili'ando el ensao de S$P a*an (continuaci"n

Los ensa7os se realizaron en el Instrumento Li-tC7cler >0. La

llearon a cao en un olumen total de 10 Sl utilizando el si-uienam3li4icaci8n: desnaturalizaci8n a ;5C durante 10 min, lue-desnaturalizaci8n a ;5C durante 10 se-, se-uido de recocido a min, 7 etensi8n a G2C durante 1 se-.

e otuo la seal de 4luorescencia en el 3rocedimiento de etensi e determin8 el -enoti3o de cada muestra midiendo la 4luor

es3ec4ica mediante el so4tKare ! 2.9 3ara discriminaci8n al/lica

&uestras du3licadas 7 controles ne-atios se inclu7eron 3araeactitud del -enoti3ado.

&"#ERI"LE M &#'!'



Cultivo e identificaci"n de los fibroblastos sinoviales.

El te=ido sinoial de "R 4ue 4inamente 3icado e incuado con cola-

m-<ml@ en el medio de Ea-le modi4icado 3or !ulecco ?!&E&@ durincuadora a 9GC 7 5T de C'2.

El te=ido se trat8 con 0,25T de tri3sina en u44er 4os4ato salino ?P

Las c/lulas se 4iltraron 7 se cultiaron durante la noce en !&E&

con 10T de suero oino 4etal, as como 3enicilina ?100 UI<ml@ 7 ?100 -<ml@.

Los R"% 4ueron utilizados 4ueron ne-atios 3ara la e3resi8n de C7 C!5F e identi4icados 3or anlisis de citometra de 4lu=o.

&"#ERI"LE M &#'!'



+n,ibici"n de expresi"n de PCSK6 !ediante siAR$

Como PCHF tiene diersas ariantes, se alinearon todas las tranconse-uir una secuencia consenso 7 esta se utiliz8 como 3lantilla 3si"RN contra PCHF.

Los R"% cultiados 4ueron trans4ectados con si"RN a 1F0 nmreactio de trans4ecci8n de +iPer%ect. Las c/lulas se reco-ieron 3a

> des3u/s de la trans4ecci8n. Un si"RN ne-atio 4ue usado como control ne-atioA la trans4ecci8

reactio se utiliz8 3ara el -ru3o de simulaci8n ?&ocJ@.

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PCR cuantitativa en tie!po real (-RPCR)

El "RN total se etra=o de las c/lulas cultiadas 7 del te=ido uma"RN #otal 7 la transcri3ci8n inersa se realiz8 usando el eDui3o ReR#OPCR.

La R#OPCR se realiz8 utilizando el Li-tC7cler >0 con el si-uien

am3li4icaci8n: desnaturalizaci8n a ;5C durante 10 min, lue-desnaturalizaci8n a ;5C durante 10 s, se-uido de recocido a F0C7 etensi8n a G2C durante 1 s.

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PCR cuantitativa en tie!po real (-RPCR) (continuaci"n)

Un m/todo de ciclo com3aratio se utiliz8 3ara analizar la e3rem"RN. Los ceadores 3ara R#OPCR tami/n 4ueron diseados desecuencia consenso.

Curas de caliraci8n, curas de disociaci8n, 7 mi-raci8n de 3rodu

-eles de acrilamida se realizaron en todas las PCRs 3araes3eci4icidad de los 3roductos.

&"#ERI"LE M &#'!'



estern 0lot

Las muestras de te=ido de 3acientes con "R, '" 7 E" 7 las c/lu

omo-eneizaron en tam38n de lisis de radioinmuno3reci3itaci8n co3roteasa 3ara etraer las 3rotenas.

La 3re3araci8n se centri4u-8 7 la concentraci8n de 3rotena se midde ensa7o de 3rotenas ioORad. 25 - de 3rotena total 4ueron 4electro4oresis, 7 lue-o sometidos a inmunotrans4erencia con anticu

es3ec4icos: "ntiOPCHF umano, antiO)"P!+ umano, antiO&&PantiO32GHIP1. !es3u/s de laada, la memrana se incu8 con csecundario.

La detecci8n se realiz8 utilizando un Jit ECL de Duimioluminiscen4ue escaneada 7 analizada con el so4tKare martVieK.

&"#ERI"LE M &#'!'



Ensao de proliferaci"n celular

Los R"% se semraron en 3lacas de cultio de ;F 3ocillos 7 se cu

Los cultios 4ueron tratados con si"RN contra PCHF ?1F0 nmol<l@. !es3u/s de la incuaci8n durante 2> , > o G2 , 20 l de rom

?>,5OdimetiltiazolO2Oil@O2,5Odi4eniltetrazolW a 5 m-<ml 3re3aradaadieron a cada 3ocillo, 7 los cultios se incuaron durante > incuadora.

La soluci8n de &## se elimin8 7 se aadireron 150 l de sul48ido etraer los 3roductos &##O4ormazn.

La asorancia se midi8 en tri3licado a >;0 nm con un es3ectro4ot8

&"#ERI"LE M &#'!'



Ensao de invasi"n celular !ediciones de !i%raci"n

Los R"% se semraron a una densidad de 9X10 c/lulas<3ocillo 7

9GC con 1F0 nmol<l de si"RN durante en la cmara su3er#ransKell. La cmara in4erior se llen8 con 20T de % en !&E& dura

Las c/lulas no inadidas se retiraron con iso3osA las c/lulas inacon )iemsa. El nBmero de c/lulas Due inadieron 4ue cuanti4icadoazar a ma-ni4icaci8n 100. El 3romedio de los cam3os 4ue calculado

Un ensa7o de Ycuraci8n de eridaZ se realiz8 3ara 3roar lami-raci8n de los R"%. Las c/lulas se semraron en 3lacas de cultiaron a 9GC. Las 3lacas se ras3aron linealmente en mBlti3lelas c/lulas se trataron con 1F0 nmol<l de si"RN contra PCHF o con2> , el nBmero de c/lulas Due mi-r8 a la lnea 4ue calculado.

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>



An1lisis de !icroarre%los

Los 3er4iles de e3resi8n -/nica 4ueron analizados en los R"

JnocJdoKn de PCHF en un Ci3 )/nico 3ara )enes +umanos. Locomo &ocJ se utilizaron como control.

*edici"n de +2345 +23 $78 !ediante E2+SA

Los R"% 4ueron tratados con 1F0 nmol<l de si"RN durante 2> cultio se reco-i8 7 centri4u-8.

!es3u/s de 9 laados con P, los anticuer3os contra ILO1[, ILO1\4ueron a3licados a la 3laca de incuaci8n durante la noce.

La 3laca se la8, loDue8, trat8 con anticuer3o antiOI-) de cone=o teida 7 la asorancia a >50 nm se midi8 con un lector de 3lacasms el reactio de trans4ecci8n 4ueron utilizados como control.

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An1lisis del ciclo celular

Las c/lulas se semraron en 3lacas de cultio de F 3ocillos a 1 X 10

7 4ueron tratadas con si"RN. !es3u/s de eliminar el medio de cultio, las c/lulas 4ueron

tri3sinizaci8n a las 2> , laadas dos eces con P en4riado condurante la noce con etanol 4ro al G0T.

"ntes del anlisis, las c/lulas 4i=adas se en=ua-aron, resus3endie

tieron durante 90 min a 9GC con 1 ml de soluci8n de 7oduro dem-<ml Due contena 10 m-<ml de "RNasa durante 90 min a 9GC.

Las c/lulas 4ueron detectadas con un cit8metro de 4lu=o Coulteanaliz8 el contenido de "!N 3or el so4tKare EP'92.

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+n!unofluorescencia

Las c/lulas cultiadas se 4i=aron con 3ara4ormaldedo al >T dura

3ermeailizaron con 0,9T de #riton O100 durante 10 min. e utiliz8 suero de cara 3ara el loDueo durante 1 a tem3eratur

c/lulas 4ueron incuadas con anticuer3os 3rimarios contra 32G anoce.

!es3u/s de laarse con P 9 eces, las c/lulas se incuaron

secundarios con=u-ados a "lea %luor > durante 1 . Las c/lulas 4ueron montadas con reactio ProLon- )old "nti4ade c

10 min. Las muestras se analizaron con un microsco3io de 4luoresce

&"#ERI"LE M &#'!'



An1lisis estadístico

Los datos de -enoti3ado de marcadores de NP 4ueron ealuados

si-ni4icatia con el eDuilirio de +ard7Oeiner-. Los clculoutilizando el so4tKare PlinJ 1.0G. La correcci8n de on4erroni secom3araciones mBlti3les.

#odos los resultados 4ueron con4irmados en al menos 9inde3endientes. " ece3ci8n de datos de -enoti3os, los otroe3resan como media ] !.

&Blti3les com3araciones se realizaron utilizando "N'V" de 1 a. #estadsticos se realizaron con el 3ro-rama P 1G.0.

Los alores de 3 ^0,05 4ueron considerados estadsticamente si-ni4i

&"#ERI"LE M &#'!'



REUL#"!'



La e3resi8n de m"RN 7 3rotena de PCHF 4ue si-ni4icatien los te=idos sinoiales de los 3acientes con "R Due en control. Un NP, rs02;G;G, se asoci8 si-ni4icatiamente0,011@.

El JnocJdoKn de PCHF mediante si"RN redu=o si-ni4ic3roli4eraci8n, inasi8n, 7 la mi-raci8n de R"%. Estos cam

3arecen estar relacionados con la secreci8n de #N%O[, arrla e3resi8n alterada de diersas 3rotenas inclu7eim3licadas en la an-io-/nesis, i3oia, 3roli4eraci8n e in4l

REUL#"!'

C'NCLUI(N



La PCHF est aumentada en el te=ido sinoial de 3acientiene una e4ecto -en/tico sore el ries-o de la en4ermed

La iniici8n de PCHF 3uede desem3ear un 3a3el 3rodesarrollo de la "R.

C'NCLUI(N

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