Fundamento de Viabilidad

7/25/2019 Fundamento de Viabilidad

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M.C.

Riva y D.

Ldpez

T F C W D F TOXICIDAD

N VlTRO

DF CONTAMINAN-

TEMAS DE DIVULGACION

UTlLlZAClON DE LAS PRUEBAS DE CITOTOXICIDAD IN VlTRO EN LA

VALORACION DE LOS EFECTOS DE LOS CONTAMINANTES AMBIENTALES.

0 1 Resumen

Este artculo pretende dar una visin general

sobre el tema y las tcnicas de toxicidad in vitro con

cultivos celulares, las consideraciones bsicas, las

ventajas y limitaciones, y destacar las posibilidades

que ofrecen este tipo de ensayos en la valoracin

del posible efecto nocivo de los productos qumicos

de uso humano o industrial en el medio ambiente.

M C Riva y

D.

Lbpez**

1 INTRODUCCION

Numerosos contaminantes quimicos de ori-

gen antropognico se introducen en los medios acu-

ticos continentales, estuarios y aguas marinas y su-

ponen un peligro potencial para los hbitats indge-

nas, as como una alteracin del equilibrio de los

ecosistemas acuticos.

A

pesar de que muchos de los compuestos

quimicos son estables, muchos otros son

Palabras clave: Citotoxicidadin vitro, cultivos celulares, efectos

susceptibles de sufrir transformaciones b iolgicas y

ambientales.

no biolgicas dando lugar a una gran variedad de

derivados. Tanto los compuestos qumicos como sus

derivados pueden acumularse en el agua y

0 2 Summary U SE O F /N V lTR O

sedimentos alcanzando niveles txicos. En la

CYTOTOX/C/TYASSAYS N THE EFFECT

determinacin de su toxicidad existe una necesidad

imperiosa de utilizar ensayos relativamente simples

O F

y rpidos para estimar el riesgo de compuestos

POLLUTANTS.

especficos, pape l que juega la toxicidad celular.

This article try to give a general review about

in vitro cytotoxicity assays with cultured cells; basic

considerations, advantages and limitations, and the

possibilities they offer in the effect valuation of

chemicals (of human or industrial use) in the

environment are presented in this paper.

Key words: In vitro, cytotoxicity assays, cultured cells,

environmental risks.

0 3 Rsum USAGE DES ESSAIS DE

CITOTO XICITE A L EVALUATION DES

EFFETS DES POLLUANTS SUR

LJENVIRONNEMENT

On pretend donner une vision gnrale sur

les techniques de toxicit in vitro avec cultures

cellulaires, les considrations basiques, les

avantages et limitations, et dtacher les possibilites

dans I valuation de I effet des produits chimiques

d usage humain et industriel, dans i environnement.

Mots clef: Cirotoxicite, In vitro, cultures cellulaires, effects

I environnement.

Dra. en C ienaas Biolbgicas,

a

Carmen Riva Juan. Investigadora de la

Universidad Politbcnica de Catalunya. Jefa del Laboratorio de Toxiwlog fa

Ambiental del INTEXTER UPC).

La toxicologia celular puede considerarse

como el conjunto de investigaciones cualitativas y

cuantitativas, sobre los efectos nocivos o respuestas

biolgicas no deseadas, que experimenta un cultivo

celular expuesto a un determinado compuesto

qumico, a fin de poder extrapolar los resultados a

nivel de organismo. Este tipo de pruebas pueden

tambin ser utilizadas como alternativa al uso de

animales en ensayos toxicolgicos.

A pesar de que

las pruebas in vivo no podrn ser substituidas por

completo, sta es una rama de la ciencia que avanza,

minimizando en la medida de lo posible la utilizacin

de organismos en los bioensayos.

Los numerosos estudios de este campo, han

permitido que hoy en da se pueda

viabilizar el cultivo

de una gran variedad de lneas celulares de

diferentes rganos y especies, sobre los que realizar

cualquier tipo de estudio de carcter biolgico,

bioqumico o molecular.

Algunas veces ha sido posible demostrar el

riesgo de un determinado producto qumico para el

hombre, pero slo de una manera asociativa causa-

efecto, sin poder entender sus motivos con el empleo

de pruebas con animales.A menudo estas carencias

pueden ser suplidas con la utilizacin de pruebas in

vitro que permiten una comprensin ms profunda

de las causas.

Licenaado en C iencias Bioldgicas Bioquimica). David L6pez R ibas.

Estudiante de Doctorado. Laboratorio de Toxicologia Ambiental del

INTEXTER U.P.C.).


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M C Rrva

y D

Lpez

TECNICAS DE TOXICIDAD N VlTRO DE CONTAMINANTES

abla

Eagle's Minimun Essetial Medium

Ejemplos de re lacin entre propiedades funcionales

Leibovitz's L-15 Medium

y tipo celular segn (E. Walum et al 1990)3)

Estos medios tienen una composicin qumi-

ca definida y una biolgica variable debido a que

necesitan la presencia de 10 -1 5s de suero fetal

T i ~ oe clula Caracterstica bovino como complemento nutritivo esencial. Ade-

hepatocitos actividad P 450

ms y dependiendo del tipo celular es necesaria la

pr. de albmina presencia de otros complementos como: DMSO,

gluconeognesis

cido oxalactico, mercaptoetanol, Hepes, triptosa

fosfato, etc.. En muchos casos la eleccin de me-

nef ronas

dios es obvia o recomendada por la fuente de ob-

tubo proximal microvellosidades prominentes

tencin de las clulas originales, pero en algunos

actividad fosfatasa alcalina

casos es una eleccin puramente emprica y expe-

tubo dista1 microvellosidades cortas rimental.

msculo cardaco contracciones espontneas

receptores B-adrenrgicos

msculo esqueltico receptores nicotinicos de la

2 5 Lneas celulares

acetilcolina

Cualquier tejido o clula no puede ser mante-

clulas endoteliales actividad fosfatasa alcalina

nida en condiciones in vitro debido a caractersticas

linfocitos inmunoglobulina fisiolgicas restrictivas. Se ha podido comprobar ex-

perimentalmente que existe una relacin inversa

Una vez establecido el cultivo se ha de tener

entre el grado de especializacin de la clula y la

en cuenta que las l neas celulares

f 10

son

viabilidad que presenta el cultivo, as por ejemplo

completamente estables geneticamente Por

1

que

es mucho ms factible el uso de clulas poco es-

hay que COmervar un stock- Las clulas pueden ser

pecificas como las embrionanas o tumorales que

congeladas en Presencia de anticongelantes

clulas con un alto grado de diferenciacin como

naturales como e l glicerol o d imetilsulfxido a un 5-

las nerviosas o renales. El empleo de clulas

1O%, para evitar la ormacin de cristales que puedan

tumorales es til en numerosas pruebas in vitro de-

afectar algunas estructuras. Se crean a lcuotas de

bido a su fac ilidad de desarrollar un cultivo, ya que

2-6x1

o6

cluiaS/mi, reducindose la temperatura han perdido la capacidad de control sobre el creci-

lentamente hasta aprOX. -90C y transfirindose a

miento, pero por contra se han de tener en cuenta

un recipiente de nitrgeno liquido O a Un congelador

consideraciones especiales como el hecho de que

de bajas temperaturas.

su condicin de transformadas puede afectar el ni-

vel de respuesta respecto a una clula normal. A

2 4 Medios de cultivo

continuacin se citan algunas de las clulas ms

utilizadas en ensayos de c itotoxicidad:

Coincidiendo con la diversidad de tipos

y

es-

tirpes celulares que pueden ser cultivadas existe

Clulas de mamferos:

tambin una gran variedad de medios, pero la ma-

3T3-L1 clulas embriognicas de ratn

yora de veces la diferencia estriba bsicamente en

BC L-DI clulas embriognicas humanas

un complemento, o como en el caso de clulas de

LS-929 fibroblastos de ratnLLC-RKI

peces marinos en una solucin salina para favore- LLC-RK1 clulas renales de rata

cer la correcta osmolaridad y evitar desrdenes

inicos. En su mayor parte estn compuestos por

Clulas de peces:

agua bidestilada en un 70-80%, una fuente de car-

RTGQ fibroblastos de trucha rainbow

bono, aminocidos, algn antibitico de proteccin

(arcoiris)

como estreptomicinao bencilpenicilina, ya que al ser

FHM

clulas epite liales de

fathead minnow

medios ricos en nutrientes son susceptibles de su-

BF-2

fibroblastos de agallas de sun fish

frir contaminacin por hongos o bacterias, y un tam-

BB fibroblastos de agallas pez gato

pn salino que generalmente es PBS (tampn

fosfato). A partir de esta base pueden hacerse las

variaciones necesarias para adaptarlo a la estirpe

celular en cultivo. Los medios ms utilizados son

2 6 Condiciones de cultivo

comunes y no presentan grandes variaciones entre

pH:

La mayora de clulas crecen a pH fisio-

clulas de peces y de mamferos4),entre e llos cabe

lgico

pero

veces el

ptimo

puede ser diferente,

citar los siguientes:

en cualquier caso es necesaria la presencia de un

tampn salino, generalmente bicarbonato sdico

Dulbecco's Modified Eagle

(pKa:6.1). Tambin puede ser necesaria la creacin


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M C Rrva y D bpez

TECNiCASDE TOXlClDAD N VlTRO DE CONTAMlNANlES

Desde los ltimos diez o quince aos se ha

ofrecen la posibilidad de valorar el efecto de un

producido un incremento en la aceptacin del uso

compuesto qumico sobre la biota de aguas

de cultivos celulares en pruebas de toxicidad, sobre

continentales y marinas. Los primeros trabajos

todo en el campo de la industria farmacutica, donde

realizados en este sentido con clulas de peces

es importante demostrar la inocuidad de un producto

fueron llevados a cabo por Pachlin y Perhumber en

de nueva formacin o en su defecto tener un

1968 y desde entonces los ensayos de citotoxicidad

profundo conocimiento de los posibles efectos

con este tipo de clulas han sido utilizados por otros

secundarios que pueda desarrollar. investigadores4)con el propsito de cubrir los

Existen diferentes proyectos internacionales

siguientes objetivos:

para e l desarrollo y el estudio de las tcnicas in vitro,

Crear un rango de medicin respecto a la

como el caso de la Scandinavian Society for Cell

toxicidad aguda de un determinado

Toxicology quien cre a finales de la dcada de los

compuesto.

ochenta el programa MElC (Multicenter Evaluation

Relacionar la citotoxicidad de una serie de

of In Vitro Citotoxicology), con la intencin de

agentes respecto a algunos de sus

profundizar tanto en el terreno terico como

parmetros f sico-qumicos.

experimental de estas tcnicas, y valorar una amplia Es tud iar la bio trans form ac in d e

variedad de productos nuevos y ya existentes. Otro determinadas toxinas mediante procesos

importante foco es el ERGAlT-FRAME (European metablicos.

Research Group for Alternatives in Toxicity Testing),

Valorar el efecto de la interaccin entre

el cual ha desarrollado ms de cincuenta protocolos combinaciones de diferentes compuestos.

para el estudio y valoracin de citotoxinas. El uso de

La relacin de similitud entre los valores ob-

los ensayos in vitro permite una v isin diferente de

tenidos en estudios in vitro con clulas de peces y

la toxicidad sugiriendo cuestiones nuevas sobre e l

los ensayos in vivo, ha sido establec ida para algu-

efecto de un agente (MEIC 1989) tales como:

nos compuestos analizados por varios autores

loJ1 .

La utilizacin de este tipo de clulas no conlleva gran-

Se puede predecir la concentracin letal

des consideraciones al efectuar cambios significati-

en sangre de aquellos agentes que

vos en los protocolos de trabajo, e igualmente sus

presentan una IC50 significativa?.

resultados son equiparables a los esperados en una

Se pueden combinar los resultados de

valoracin in vitro con clulas de mamfero.

ensayos citotoxicolgicos con parmetros

El amplio volumen de contaminantes genera-

toxicocinticos para predecir la dosis letal dos por el hombre que son eliminados a travs de

aguda humana?. ros es muy importante y afecta especialmente a los

La prediccin de la dosis letal humana con

paises con un alto grado de desarrollo; como ejem-

ensayos citotoxicolgicos es ms efectiva

plo baste mencionar el hecho de que se han podido

que la prediccin convencional con pruebas

identificar ms de 1000 derivados qumicos de ori-

con animales?.

gen industrial en el agua, biota y sedimentos de

Que combinacin de pruebas citolgicas

los Grandes Lagos (EEUU-Canad)

por la

es la mejor para establecer un criterio base?.

lntemationa l Joint Comisin (1983).

Los test LC50 con peces son relativamente

Las caractersticas de estas tcnicas hacen

costosos y de larga duracin, por eso se plante el

que haya un gran inters por parte de las industrias

desarrollo de tcnicas in vitro que sustituyeran par-

qumicas que desarrollan productos de uso d irecto

cialmente el uso de bioensayos, para valorar la cali-

por el hombre o productos que son susceptibles de dad de las aguas y establecer los lmites de presen-

ser eliminados a ros o aguas urbanas. En este lti-

cia de los contaminantes urbanos e industriales.

mo aspecto, existe cada vez ms una fuerte presin

tanto legal como sanitaria que favorecen la imposi-

cin de estas tcnicas en industrias como : l Far-

4

CONCLUSIONES

macutica (medicamentos, cosmticos, etc), l Tex-

Miles de productos qumicos se someten cada

ti1 (tensioactivos, colorantes, auxiliares, etc) e l Qu-

ao a rigurosas pruebas ordenadas a valorar su po-

mica (ferti l izantes, insecticidas, aerosoles,

tencial toxicidad. La inmensa mayora de ellas se

conservantes, etc).

realizan con animales: las reacciones que m uestran

ratas, conejos, ratones y peces ante los preparados

qumicos constituyen por ahora los mejores ensa-

3 1 tilizacin de cultivos de

yos disponibles para predecir los efectos que dichas

clulas

de

peces

sustancias ejercern sobre el organismo.

En la ltima dcada, el problema de las prue-

Los estudios con clulas de peces merecen

bas de toxicidad con animales adqu iri unos tintes

ser tratados especialmente ya que a pesar de ser

apremiantes y polmicas. Las sociedades protecto-

menos numerosos, tienen un gran inters en estudios

ras de animales denunciaron el sufrimiento de m i-

de ecotoxicidad e impacto ambiental. Estos ensayos

llones de estos y las industrias que fabrican produc-


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