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MICOLOGIA GUÍA DE PROCESAMIENTO DE MATERIALES

CLÍNICOS DOCENTES: ALICIA LUQUE

MARISA BIASOLI

MARÍA ELENA TOSELLO

SUSANA AMIGOT

SILVANA RAMADÁN

LUCÍA BULACIO

MAXIMILIANO SORTINO

CARLOS GÓMEZ

MIRTA TARTABINI

HERNÁN DALMASO

EDUARDO CODINO

VIRGINIA PODESTÁ

PAULA FUNES

-AÑO 2018

Centro de Referencia de Micología

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La realización de análisis micológicos comprende la obtención del material clínico y su procesamiento, su observación microscópica (a través de examen directo o coloración según corresponda), la siembra en los medios de cultivo, tiempo y temperaturas adecuados y la identificación del microorganismo (cuando los cultivos son positivos).

Se detallan los elementos necesarios para la realización de los análisis, las muestras clínicas más frecuentes, las normas de bioseguridad de trabajo en el laboratorio y finalmente la descripción del procesamiento de los distintos materiales.

ELEMENTOS NECESARIOS PARA LA REALIZACIÓN DE ANALISIS MICOLÓGICOS Obtención y procesamiento de muestras Hisopos Bisturí Pinza Portaobjetos Tubos con solución fisiológica estéril Gasa Papel de filtro Perlas de vidrio Tubos de centrífuga Pipetas Jeringa Aguja Manipulación de muestras y cultivos Ansa Gancho Hilo Pinza Líquidos de montaje para exámenes directos Hidróxido de potasio 20% Tinta Parker pura Azul de lactofenol (Gueguen) Tinta china diluida al medio con formaldehido Azul de metileno Lugol (conservar al abrigo de la luz) Glicerol Soluciones para realizar coloraciones: May Grünwald Giemsa May Grünwald Agua estabilizada Giemsa Giemsa prologando Metanol Giemsa Agua estabilizada Ziehl Neelsen Fucsina fenicada Alcohol clorhídrico Azul de metileno Azul de toluidina

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Kinyoun Carbol fucsina Acido sulfúrico 1% Azul de metileno Medios de cultivo Agar Sabouraud Glucosa (ASG) Agar Sabouraud Glucosa Cloromicetina (ASCl) Mycosel Lactrimel Agar Sangre-Cerebro-Corazón con antibiótico (ASCC) Dixon modificado Agar V8 MATERIALES CLÍNICOS La calidad del diagnóstico de las micosis depende de la calidad y cantidad del material

recogido del paciente, de las condiciones de envío, conservación, transporte y procesamiento y de la pericia del micólogo. Las muestras deben ser representativas, abundantes, libres de contaminantes, exógenos o endógenos, y de sustancias que inhiban o alteren la viabilidad de los hongos.

Según su procedencia los materiales clínicos pueden clasificarse como: Recogidos por el paciente.

Orina

Esputo

Materia fecal Remitidos por médicos.

Biopsia

Lavado Bronquioalveolar (BAL)

Aspirados traqueales

Aspirados gástricos

Líquidos de punción

Líquido Cefalorraquídeo (LCR)

Hemocultivo (HC)

Médula ósea (PAMO)

Punta de catéter

Orina por Punción Suprapúbica (PSP)

Otras Obtenidos por bioquímicos

Escamas de piel y uñas

Flujo Vaginal (FV)

Secreción uretral

Hisopados de mucosas

Suero para serología

Escarificaciones

Cuando las muestras son recogidas por médicos o pacientes es importante informarles cuales son las condiciones adecuadas de recolección, almacenamiento y transporte.

NORMAS DE BIOSEGURIDAD PARA EL TRABAJO EN LABORATORIO

No consumir alimentos ni bebidas.

No fumar ni masticar chicle.

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No aplicarse cosméticos.

No manipular lentes de contacto.

Utilizar guardapolvos y guantes todo el tiempo. No tocar elementos de uso común con las manos enguantadas.

Utilizar barbijos y gafas protectoras cuando se procesen materiales que así lo requieran.

Todo material corto-punzante (agujas, bisturíes, etc) deben descartarse en recipientes colocados a tal fin.

Las muestras y cultivos desechados se evacuarán en recipientes impermeables en bolsas de color rojo.

Los tubos y portaobjetos que estuvieron en contacto con material infeccioso se descartan sumergiéndolos en solución de hipoclorito.

Las zonas de trabajo se limpiarán con un desinfectante apropiado después de cada período de trabajo.

Todos los procedimientos deben realizarse de forma tal de evitar la generación de aerosoles.

Durante las manipulaciones microbiológicas se desprenden partículas y gotas por lo que es aconsejable lavarse las manos con frecuencia y no tocarse la boca ni los ojos.

Nunca pipetear con la boca.

Utilizar material plástico en lugar de vidrio siempre que sea posible: tubos, pipetas Pasteur, etc.

Cuando se utilice material de vidrio observar que no esté rajado o agrietado

Ante la rotura de recipientes de vidrio conteniendo muestras: agregar hipoclorito y dejar actuar 30 minutos, recoger con algodón evitando los cortes y colocar los fragmentos en recipiente de plástico.

En caso de rotura de líquidos patogénicos: se debe absorber con algodón, papel o tela, que será descartado como residuo patogénico.

En caso de accidentes corto-punzantes: favorecer el sangrado de la herida y lavar con solución de yodo-povidona al 5% por no menos de 10 minutos.

En caso de salpicaduras en mucosas: lavar con abundante agua corriente por no menos de 20 minutos.

En caso de salpicaduras en piel: lavar con yodo-povidona al 5% por los menos por 20 minutos.

Muestras de sangre, esputo, pus, exudados, secreciones o líquidos de drenaje y/o punción, asi como los aislados de diferentes materiales clínicos DEBEN ser procesados en CSB II para evitar riesgos innecesarios.

No oler cultivos con desarrollo fúngico. DESCRIPCIÓN DEL PROCESAMIENTO DE LOS DISTINTOS MATERIALES

PIEL: PIEL LISA, PEQUEÑOS Y GRANDES PLIEGUES Y FANERAS (UÑAS Y PELOS) Indicaciones al paciente:

Se debe suspender toda medicación antifúngica como cremas, pomadas y soluciones 15 días antes de la extracción de la muestra.

Se debe suspender toda medicación antifúngica oral 1 mes antes de la extracción de la muestra.

Se debe suspender la colocación de cremas cosméticas o talco 3 dias antes de la extracción de la muestra.

Se debe higienizar la zona de la lesión por lo menos 3 horas antes de la

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extracción de la muestra solo con agua y jabón.

El dia de la toma de la muestra debe usar calzado cerrado y medias.

Cuando el material a estudiar es uña, no deberá cortarlas por lo menos 10 dias antes de la extracción de la muestra.

DE NO CUMPLIR CON LAS CONDICIONES ANTERIORES NO SE PODRA REALIZAR EL

EXAMEN SOLICITADO Obtención de la muestra: La obtención de la muestra a examinar se realiza de diferente manera según la zona

afectada. En general deben prepararse pares de portaobjetos esterilizados a la llama y un bisturí estéril. Después que los portaobjetos están fríos, se coloca uno de ellos, con la cara flameada mirando hacia arriba e inmediatamente por debajo de la lesión. Las escamas obtenidas se juntan en el centro del portaobjetos y se coloca encima la cara flameada del segundo portaobjetos a modo de emparedado. Se los envuelve con un papel en el cual se escribe el nombre del paciente y el lugar de donde fue obtenido el material.

Las escamas de lesiones en piel lampiña deben obtenerse del borde de la misma, cuando se sospecha de pitiriasis se recomienda realizar además la técnica de cinta scotch (ver más abajo). La extracción de muestras del cuero cabelludo se efectúa arrancando pelos con la pinza de depilar y luego raspando la superficie cutánea para desprender escamas.

En las onicomicosis subungueales debe pasarse el bisturí por el espacio subungueal, donde se acumula la hiperqueratosis; en la onicomicosis blanca superficial se raspa la tabla externa de la uña y en las leuconiquias proximales profundas debe procurarse la obtención de una muestra que abarque el mayor espesor posible de la tabla ungueal.

Examen directo:

KOH al 20% y calor.

Tinta Parker en KOH al 20% y calor.

Gueguén Observaciones: si el Examen directo: de uñas resultara negativo, se aconseja dejar el

preparado hasta 48 horas en cámara húmeda con una gota de agua glicerinada al 50% por el reborde del cubreobjeto.

Cultivos:

Medios de cultivo Temperatura Tiempo

1 tubo de ASG 1 tubos de Lactrimel 1 tubo de Mycosel 1 tubo de Agar V8

28ºC

2 semanas

PARA EL DIAGNÓSTICO DE PITIRIASIS: Técnica de cinta scotch Se aplica un fragmento de cinta de 10 cm sobre la lesión y se presiona raspando con el

borde lateral de la uña, la superficie de la cinta que cubre la zona afectada para que se adhieran las escamas. La cinta se retira y se aplica sobre una lámina porta-objetos limpia, rebatiendo los extremos hacia abajo para que no se despegue. Es conveniente tomar dos o tres improntas y montarlas individualmente. Para la observación microscópica se despega uno de los extremos, se coloca una gota de Gueguen o Azul de Metileno y se vuelve a colocar la cinta.

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Examen directo de escamas obtenidas por raspado:

KOH al 20% y calor

Gueguén

Tinta Parker en KOH al 20% y calor Cultivos:

Medios de cultivo Temperatura Tiempo

1 tubo de ASG con el agregado de 2-3 gotas de aceite de oliva estéril

1 tubo de Dixon modificado

32ºC 2 semanas

Observaciones: si el Examen directo: de uñas resultara negativo, se aconseja dejar el

preparado hasta 48 horas en cámara húmeda con una gota de agua glicerinada al 50% por el reborde del cubreobjeto.

FLUJO VAGINAL Indicaciones al paciente:

Suspender toda medicación antibiótica y/o antifúngica, local o sistémica, 10 días antes de la extracción.

No tener relaciones sexuales por lo menos 3 días antes de la extracción de la muestra.

Se debe realizar una higiene de la zona genital la noche anterior a la extracción, sin ducha vaginal.

Utilizar ropa interior limpia. Obtención de la muestra: Se recolecta con 2 hisopos previa colocación de espéculo, con el que se debe realizar − Dos Frotis sobre portaobjetos (1er hisopo) − 2 suspensiones en solución fisiológica estéril (2do hisopo) − Colocar hisopo en medio de medio de transporte (2do hisopo) Estos materiales son utilizados: − Para análisis micológico: una suspensión en solución fisiológica − Para análisis bacteriológico: frotis, la otra suspensión y el medio de Stuart Examen directo:

En fresco (mantener a 37ºC para la búsqueda de Trichomonas vaginalis)

Gueguen

En caso de marcada reacción inflamatoria agregar 1 gota de KOH (favorece observación de elementos fúngicos

Cultivos:

Medios de cultivo Temperatura Tiempo

1 tubo de ASG 1 tubo de ASCl

28ºC 1 semana

SECRECIÓN URETRAL (O HISOPADO DEL SURCO BALANOPREPUCIAL) Indicaciones al paciente:

Higienizarse por lo menos 5 a 7 horas antes de la toma de muestra.

No colocarse pomadas ni tomar ningún antifúngico. Obtención de la muestra:

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Recolección con hisopo en solución fisiológica estéril Examen directo:

En fresco (mantener a 37ºC para la búsqueda de Trichomonas vaginalis)

Gueguen Cultivos:

Medios de cultivo Temperatura Tiempo

1 tubo de ASG 1 tubo de ASCl

28ºC 1 semana

OTRAS MUCOSAS Y SECRECIONES Obtención de la muestra: Hisopado de boca y exudado faringeo Cepillar los dientes e higienizar la boca con agua hervida y enfriada, previo a la toma de

muestra. Realizar la toma de muestra por hisopado; colocar el hisopo en un tubo con medio de

transporte o que contenga solución fisiológica estéril y conservar en heladera como máximo 24h.

Examen directo:

En fresco

Gueguen Cultivos:

Medios de cultivo Temperatura Tiempo

1 tubo de ASG 1 tubo de ASCl

28ºC 1 semana

MUESTRAS RINOSINUSALES:

MUESTRAS ÓTICAS: Deben efectuarse bajo visión directa con otoscopio y el material se extrae con una

cucharita o cureta o hisopos humedecidos en solución fisiológica. EXUDADO CONJUNTIVAL: Con un hisopo estéril, de algodón o alginato humedecido en solución salina estéril frotar

la zona lesionada suavemente e introducirlo en medio de transporte. Repetir la toma de muestra en el ojo contralateral con otro hisopo. Si se dispone de medios de cultivo es preferible inocularlos en el momento de la toma de muestra

RASPADO CORNEAL: Este procedimiento debe realizarla el oftalmólogo, preferentemente inocular en el

medio de cultivo en el sitio de toma de muestra, en el momento de la misma. ORINA POR CHORRO MEDIO Y ORINA POR PUNCIÓN SUPRAPÚBICA Indicaciones: al paciente:

Orina (micción espontanea) Se recoge la primera orina de la mañana por la técnica del chorro medio. Se recoge en un recipiente estéril, de boca ancha, tapa de rosca y de preferencia de plástico. Una vez recogida la muestra llevar inmediatamente al laboratorio (de lo contrario conservar en heladera hasta 12 horas).

Hombres: Higienizar la zona genital (retraer el prepucio) con jabón sin antisépticos, enjuagar con abundante agua y NO secar. En el momento de la micción retraer el prepucio e iniciar la micción descartando el primer chorro, recolectar el chorro medio en recipiente estéril. Continuar orinando fuera del recipiente. Tapar inmediatamente.

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Mujeres: Colocarse un tampón vaginal. Higienizar zona genital con agua y jabón, enjuagar con abundante agua. NO secar. Orinar un chorro fuera del frasco colector estéril, recolectar el chorro medio, continuar orinando fuera del frasco.

Niños: realizar higiene previa con abundante agua y jabón, enjuagar con abundante agua. Recolectar el chorro medio de la orina en el frasco colector, descartando la primera y última porción de orina.

En neonatos y lactantes la toma de la muestra se realiza “al acecho”.

Orina (por punción). Conservar en la jeringa con la que se tomo la muestra no trasvasar a otro recipiente y tapar con obturador. Conservar en heladera como máximo 24hs.

Orina (de sonda). Tomar con sonda nueva por punción de la misma, nunca de la bolsa colectora. Conservar en la jeringa con la que se tomo la muestra no trasvasar a otro recipiente y tapar con obturador. La muestra debe ser obtenida por punción proximal de la sonda, previa asepsia de la misma con yodo-povidona. La muestra más recomendada en estos casos es la punción suprapúbica.

Procesamiento de las muestras:- Orina por chorro medio y orina por punción suprapúbica:

Centrifugar la muestra para realizar el examen directo y cultivos con el sedimento.

Examen directo:

En fresco (registrar el número de leucocitos por campo en 400X)

Gueguen Cultivos :

Medios de cultivo Temperatura Tiempo

1 tubo de ASG 1 tubo de ASCl

28ºC 1 semana

-Interpretación de los resultados: Algunos investigadores señalan que un recuento de ≥ 5 Leucocitos/campo en 400X se

correlaciona con probable funguria (ese recuento de leucocitos se correlacionaría con una presencia de ≥105 UFC de levadura/ml de orina).

Observaciones: En muestras de orina obtenidas por punción de sonda o por técnica del

chorro medio se recomienda solicitar una nueva muestra en caso de Cultivo (+) para levaduras y ED (-) con o sin leucocitos.

En punción suprapúbica, cualquier hallazgo es significativo

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BIOPSIAS, ESPUTO, LAVADO BRONQUIAL, ASPIRADOS TRAQUEALES, ASPIRADOS GÁSTRICOS, LÍQUIDOS DE PUNCIÓN, ULCERAS, ESCARIFICACIÓN DE LESIONES CUTÁNEAS (PÁPULAS, NÓDULOS)

Indicaciones: Biopsias y lavado bronquio alveolar

Estos materiales los extrae médico. Se deben recoger en recipientes estériles suspendidos en solución fisiológica y nunca en formol. Siempre agregar solución fisiológica estéril (nunca formol) en cantidad suficiente para que cubra la muestra (esto evita la deshidratación de la muestra) no llenar todo el recipiente.

Remitirlo enseguida al laboratorio, en caso contrario guardar en la heladera hasta 24 hs

Esputo

Debe recogerse de tos profunda, a primera hora de la mañana (poco después de levantarse). La muestra no debe contener saliva.

Antes de recoger la muestra, cepillar los dientes sin dentífrico y enjuagar la boca con agua hervida y enfriada, y en lo posible con bicarbonato (una cucharadita de té en un frasco de agua).El paciente debe estar en ayunas, debe realizar higiene bucal con cepillado de dientes, en forma habitual al levantarse, luego enjuagarse la boca con bicarbonato o agua y expectorar dentro del frasco; debe indicársele que el frasco se destapará solo en el momento de colocar la expectoración en su interior y se cerrará rápidamente.

Utilizar un recipiente estéril, de cierre hermético, y rotulado con nombre y apellido del paciente.

Una vez recogido el material enviar inmediatamente al laboratorio (de lo contrario conservar en heladera hasta 24 hs.

Secreciones bronquiales (BAL o aspirados)

Recoger en recipiente estéril con tapa a rosca.

Deben procesarse antes de las 2 horas de lo contrario, mantener refrigerada hasta 24 hs.

Otros líquidos de punción (Líquido pleural, pericárdico, ascítico, sinovial):

Remitir al laboratorio la jeringa con la que se realizó la punción tapada con obturador.

Enviar rápidamente al laboratorio, de no procesarse en el día puede ser almacenada a temperatura ambiente hasta su procesamiento, el cual debe ser en lo posible, dentro de las 24 hs.

Secreciones de heridas

Recolectar la secreción con bisturí estéril o ansa.

Procesar la muestra inmediatamente. Obtención de las muestras:

Escarificación: Se obtiene la muestra por raspado de lesión cutánea hasta sangrado. Con el material obtenido se realizan frotis La siembra se realiza inoculando directamente el material extraído en los medios de cultivos, de no ser posible recolectar el material en solución fisiológica. Este proceso es muy doloroso para el paciente por lo que se puede tratar la zona con anestésicos locales, previo acuerdo con el médico solicitante de la práctica.

Úlceras: previo a la extracción limpiar la lesión con gasa estéril. Utilizar bisturí descartable para tomar la muestra. Realizar extendidos, resuspender el material en solución fisiológica estéril y centrifugar.

Fístulas: Previo a la toma de muestra se debe higienizar la zona afectada con solución fisiológica estéril. Comprimir suavemente la zona para favorecer el drenaje del

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material purulento. Recoger en solución fisiológica estéril o inocularlo directamente en los medios de cultivos. En el caso de escaso o nulo drenaje de material tomar la muestra con hisopo estéril descartando el material superficial y penetrando hacia la zona más profunda para la recolección. Si la recolección es aún dificultosa se debe solicitar la biopsia de la zona fistulosa. Otra opción es colocar en la fístula una mecha de gasa estéril durante 24 hs.

Secreciones oculares: Limpiar con solución fisiológica estéril y posteriormente recolectar, por hisopado, en solución fisiológica estéril el material drenado. Las muestras obtenidas por raspado de cornea o por aspiración del humor vitreo, recolectadas por el oftalmólogo, deben ser remitidas inmediatamente al laboratorio para su procesamiento.

Secreciones óticas: Limpiar con solución fisiológica estéril. Recolectar con hisopo el material del conducto auditivo externo, lo más profundo posible y sin tocar las paredes del canal auricular, en solución fisiológica.

Secreciones de senos paranasales: Se recomienda la toma de muestra por aspirado del material de los senos paranasales. En caso de no poder aspirar el material hisopar las fosas nasales.

Preparación de las muestras:

Líquidos diluidos: se deben concentrar por centrifugación

Materiales sólidos o viscosos: triturar o disgregar de la forma más conveniente (con mortero, perlas de vidrio, bisturí, tijeras, etc.)

Examen macroscópico de la muestra Examen directo:

En fresco o con KOH al 20% (materiales densos) se recomienda dejando con agua glicerinada por 48 hs

Gueguen

Con tinta china (si se sospecha criptococosis, en esputos de HIV) Coloraciones:

May Grünwald Giemsa o Giemsa prologando (según el material)

Ziehl Neelsen

Kinyoun (búsqueda de antinomicetales) Cultivos:

Medios de cultivo Temperatura Tiempo

1 tubo de ASG 1 tubo de ASCl 1 tubo de Mycosel

28ºC 4 semanas

1 tubo de ASG 2 tubos de ASCC

37ºC

LÍQUIDO CEFALORRAQUÍDEO Preparación de la muestra: Colocar el LCR en un recipiente estéril pequeño, no usar frascos de urocultivo. Conservar

a Tº ambiente como máximo 24hs. Recolectar de manera estéril y centrifugar a 1000 rpm por 15 minutos, el análisis micológico se realiza con el sedimento. Reservar el sobrenadante para la prueba de aglutinación de antígeno por partículas de látex.

Examen directo:

En fresco

Gueguen

Con tinta china Cultivos:

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Medios de cultivo Temperatura Tiempo

1 tubo de ASG 1 tubo de ASCl

28ºC 4 semanas 1 tubo de ASG

1 tubos de ASCC 37ºC

MATERIA FECAL - con recuento de colonias Indicaciones al paciente:

Para realizar este análisis no se debe realizar ninguna dieta previa.

Recoger una deposición espontánea de materia fecal en un recipiente estéril, de cierre hermético y rotulado con el nombre y apellido del paciente.

Una vez recogida la muestra llevar inmediatamente al laboratorio (de lo contrario conservar en heladera hasta 12 horas).

Preparación de la muestra: Hacer una suspensión concentrada de materia fecal en solución fisiológica (tomando

una muestra representativa). Filtrar a través de doble capa de gasa y llevar al doble de volumen con ácido cítrico al 10%. Dejar en reposo 24 hs en la heladera. Centrifugar, descartar el sobrenadante y del sedimento sembrar, por agotamiento en superficie, con ansa calibrada, en placa.

Ejemplo de siembra por agotamiento en superficie para realizar el recuento de colonias de levaduras de

materia fecal.

Examen directo: A partir del filtrado de la misma.

En fresco o con lugol.

Gueguen Cultivos:

Medios de cultivo Temperatura Tiempo

1 placa de ASG 1 placa de ASCl

28ºC 1 semana

Realizar el recuento de colonias y la identificación de las levaduras e informar el número

de colonias por gramo de heces (Valor de referencia: hasta 5000 colonias de levaduras/g de materia fecal)

- en neonatos Preparación de la muestra: Hisopado anal

Una vez realizado el hisopado colocar el hisopo en un recipiente estéril.

Colocar el hisopo en un tubo con medio de transporte de Stuart o que contenga fisiológica estéril y conservar en heladera como máximo 24hs.

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No se realiza el procedimiento descripto para recuento de colonias Examen directo:

En fresco

Gueguen Cultivos:

Medios de cultivo Temperatura Tiempo

1 tubo de ASG 1 tubo de ASCl

28ºC 1 semana

HEMOCULTIVO Y MÉDULA ÓSEA Hemocultivo

El procesamiento dependerá de la muestra que nos llegue al laboratorio, a saber: - Frascos con medio de cultivo enriquecido para realizar repiques. - Frascos con medio de cultivo enriquecido aeróbico que son colocados

directamente en el Hemocultivador automatizado (Bactec) - Tubos con muestra para realizar método del lisis y centrifugación.

La manipulación de muestras de hemocultivo deben realizarse siempre bajo cabina de seguridad biológica.

Inocular en el frasco el volumen de sangre que corresponda (10% de volumen de sangre respecto al volumen de medio de cultivo).

En los frascos de BACTEC™ Myco/F Lytic respetar el volumen indicado (de 1 a 5 ml) en el mismo y no escribir sobre el código de barras.

Las muestras deben ser tomadas con 24 hs de separación cuando se considere necesario tomar más de una muestra.

Conservar a Tº ambiente, si no se procesa inmediatamente.

Colocar nombre y apellido del paciente; como así también día y hora de toma de muestra.

Medula ósea

Inocular en el frasco común o Bactec.

Realizar un frotis.

Conservar a Tº ambiente, si no se procesa inmediatamente.

Otra opción: Introducir el aspirado en un tubo estéril con solución de saponina (5% concentración final, o en tubo estéril con heparina).

1) MÉTODO: LISIS Y CENTRIFUGACIÓN Preparación de la muestra: Recolectar 10 ml de sangre en tubo de centrífuga con anticoagulante (heparina),

centrifugar 10 minutos a 3000 rpm, descartar el plasma y agregar saponina (igual volumen del paquete globular) e incubar a temperatura ambiente durante 1 hora. Centrifugar a 3000 rpm durante 10 min, descartar el sobrenadante y sembrar el sedimento.

Cultivos:

Medios de cultivo Temperatura Tiempo

1 tubo de ASG 28ºC 4 semanas

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1 tubo de Mycosel

1 tubo de ASG 1 tubos de ASCC

37ºC

1 tubo de Dixon o ASG + aceite 32ºC

2) MÉTODO: REPIQUE EN CALDO Preparación de la muestra: El volumen de sangre inoculado al frasco debe ser el 10 % del volumen del medio de

cultivo. Conservar el frasco de hemocultivo con la sangre a 28 ºC y se realizan repiques a las 24 hs y a la semana de extracción. Previamente observar el aspecto del sobrenadante sin agitar el frasco. Si el paciente es VIH + y/o se sospecha histoplasmosis realizar además un repique a los 15 días.

Cultivos:

Medios de cultivo Temperatura Tiempo

1 tubo de ASG 1 tubo de Mycosel

28ºC 4 semanas (contadas a partir del momento del repique)

1 tubo de ASG 1 tubos de ASCC

37ºC

1 tubo de Dixon o ASG + aceite 32ºC

Observaciones: En MO el médico deberá realizar un extendido antes de inocular la muestra de MO en el caldo, que se deberá teñir con MGG.

3) MÉTODO AUTOMATIZADO BACTEC™ Myco/F Lytic Las botellas de hemocultivos automatizadas poseen un caldo con el agregado de

saponina, que destruye glóbulos blancos y rojos aumentando la tasa de recuperación de hongos intracelulares como Histoplasma capsulatum.

En su base poseen una sustancia que la reaccionar con el CO2 producido por el desarrollo microbiológico origina fluorescencia, la cual es censada por el lector del autoanalizador que construye una curva con los cambios de fluorescencia. Por tal motivo es fundamental que desde el momento en que la botella es inoculada con la sangre del paciente, no pasen más de 18 hs para ser introducida en el autoanalizador, ya que una vez que la fase estacionaria de crecimiento es alcanzada, la fluorescencia emitida se vuelve constante lo cual no es interpretado como crecimiento para el instrumento. Pasadas las 18 hs de la inoculación en la botella el hemocultivo se procesa como en caldo.

El volumen del inoculo figura siempre en la etiqueta del frasco y no debe ser menor a 1 ml de sangre (baja sensibilidad) ni superior a 5 ml (se supera el anticoagulante). Deben ser conservadas siempre a temperatura ambiente hasta ser remitidas al laboratorio.

BD BACTEC Peds Plus/F o BD Bactec Plus Aerobic/F Las botellas de hemocultivos automatizadas poseen un caldo, En su base poseen una

sustancia que la reaccionar con el CO2 producido por el desarrollo microbiológico origina fluorescencia,

la cual es censada por el lector del autoanalizador que construye una curva con los cambios de

fluorescencia. Por tal motivo es fundamental que desde el momento en que la botella es inoculada con

la sangre del paciente, no pasen más de 18 hs para ser introducida en el autoanalizador, ya que una vez

que la fase estacionaria de crecimiento es alcanzada, la fluorescencia emitida se vuelve constante lo cual

no es interpretado como crecimiento para el instrumento. Pasadas las 18 hs de la inoculación en la

botella el hemocultivo se procesa como en caldo

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Respetar el volumen de sangre indicado por el fabricante

PUNTA DE CATÉTER Catéter intravascular

Una vez retirado el mismo cortar 5 cm de extremo distal y colocar en recipiente estéril.

Siempre agregar solución fisiológica estéril en cantidad suficiente para que cubra el catéter nunca llenar todo el recipiente y conservar en heladera como máximo 24 hs.

Retrocateter

Ídem para hemocultivo.

Debe llegar al laboratorio acompañado de 1 hemocultivo. Preparación de la muestra: Se recoge la punta de catéter en un tubo estéril y se coloca en 1 ml de solución filológica

estéril y se agita enérgicamente en un vortex durante 2-3 min. Centrifugar y sembrar el sedimento.

Cultivos:

Medios de cultivo Temperatura Tiempo

1 tubo de ASG 1 tubo de ASCl

28ºC 1 semana

AGLUTINACIÓN DE PARTÍCULAS DE LÁTEX PARA DETECTAR ANTÍGENO DE Cryptococcus

Fundamento: Este test de aglutinación es rápido y simple para la detección cualitativa y

semicuantitativa del antígeno del polisacárido capsular de Cryptococcus neoformans en LCR o suero.

Preparación de la muestra: LCR Recolectar de manera estéril y centrifugar 1000 rpm por 15 minutos. Para la prueba de

aglutinación se utiliza el sobrenadante. Si no se procesa inmediatamente, refrigerar a 4ºC o congelar

Suero La muestra se recoge sin sobrenadante. Si no se procesa inmediatamente, refrigerar a

4ºC o congelar Procesamiento Según indicaciones del equipo comercial

SEROLOGÍA. INMUNODIFUSIÓN DE OUTCHERLONY Fundamento Con esta técnica se detectan cualitativa y semicuantitativamente anticuerpos para

diagnóstico de Histoplasmosis, Paracoccidioidomicosis, Coccidioidomicosis, Candidiasis y Aspergilosis

Preparación de la muestra:

Extraer sangre sin anticoagulante

El paciente debe estar en ayunas

A todos los sueros que se utilizan en las pruebas serológicas se les agrega mertiolate de sodio (1/10.000) o azida sódica (1/1.000) como conservadores. Si no se usan de inmediato pueden guardarse en congelador (-20ºC) hasta el momento de su empleo.

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Procesamiento

Preparación de los portaobjetos:

Se diluye 1 ml de agar para inmunodifusión en 7 ml de agua destilada y se coloca en baño de agua a 70 ºC.

Se cubren los portaobjetos perfectamente limpios y desengrasados con alcohol con una película de esta preparación, se desparrama con el dedo para que quede rugoso y se deja secar en la estufa de 37 ºC hasta que se forme una capa seca y opaca.

Luego se agregan entre 2.5 y 2.8 ml de agar para inmunodifusión sin diluir por portaobjetos. Una vez solidificados se los colocan en cámara húmeda y se conservan en heladera hasta el momento de su uso. Pueden guardarse hasta una semana en estas condiciones.

Realización de la prueba: Con un sacabocados de 4 mm, se cortan el agar de acuerdo con un esquema de 6 hoyos

periféricos y uno central. Los cilindros de agar se retiran con aguja o espátula. Se deben llenar primero los pocillos correspondientes a sueros y antisueros y después

de 30 a 40 minutos de difusión se colocan los antígenos. Todas las cavidades se llenan hasta el borde.

Ejemplo de diseño de placa de inmunodifusión para la evaluación de la presencia de tres tipos de

anticuerpos diferentes. Se enfrenta al suero del paciente frente a tres antígenos y sus correspondientes antisueros controles.

La incubación se hace a temperatura ambiente, en cámara húmeda, durante 72 horas, pero es conveniente observar diariamente la reacción.

Finalizada la incubación, se procede a ver la existencia de bandas de precipitación que indican presencia de anticuerpos precipitantes en el suero estudiado. Es necesario colocar una fuente de iluminación debajo de la placa para la mejor visualización de los resultados. En casos de pruebas positivas se debe realizar una titulación, efectuando diluciones seriadas al doble y repitiendo la prueba.

Siempre se debe realizar una coloración final, sobre todo en casos de pruebas negativas (para confirmarlas), y en casos de titulaciones; se observa que bandas muy débiles se observan luego de esta maniobra.

Tecnica de coloración de bandas Lavado: Sumergir la placa por 24 horas en solución fisiológica cambiándola

frecuentemente. Colocar papel de filtro encima del gel y dejar secar a 37ºC. Sacar el papel.

Ag 2

Ac 1

Suero paciente

Ac 2

Ag 3

Ac 3

Ag 1

16

Coloración: Sumergir en colorante de 10 a 20 minutos Decoloración: Sumergir en solución decolorante el tiempo que sea necesario. Primero

con decolorante usado y luego con una parte del nuevo el cual es guardado para el primer paso de la coloración siguiente. Enjuagar con agua y dejar secar.

Determinación de susceptibilidad antifúngica por el método de microdilución en caldo

según E.DEF 7.1 y E.DEF 9.3 de European Committee on Antimicrobial Susceptibility

Testing (EUCAST)

Preparación del inóculo:

- Levaduras: Se parte de un cultivo de 24 h en Agar Sabouraud a 35ºC (48 h para

Cryptococcus), se tocan cinco colonias, se suspenden en 5 mL de solución fisiológica estéril, se

homogeneiza durante 15 segundos, y su turbidez se ajusta a 0,5 de la escala McFarland (equivalente a 1

x 106 a 5 x 106 UFC/mL). Ésta suspensión se diluye 1:10 en solución fisiológica estéril para obtener 1 x

105 a 5 x 105 UFC/mL.

- Hongos Filamentosos: Los hongos problema y los controles se cultivan durante 7 días a

35ºC en tubos de agar papa dextrosa para inducir la esporulación excepto Fusarium spp que se incuba a

35ºC durante 48-72 horas y luego a 28ºC hasta completar la semana. La colonia del hongo filamentoso

se cubre con 1-2 ml de agua destilada estéril y se raspa la superficie con la punta de una pipeta Pasteur

estéril. De esta forma se obtiene una suspensión turbia, formada por esporas y trozos de hifas, que se

transfiere a otro tubo estéril. Se espera un tiempo prudencial (3-5 minutos) para que las partículas más

densas se sedimenten. La parte superior de la suspensión homogénea se transfiere a otro tubo. Se

cuentan los conidios en cámara de Neubauer y se ajusta a 0,4 x 104 – 5 x 104 UFC/ml.

Preparación del medio de cultivo: Se utiliza RPMI 1640 (con L-glutamina, rojo fenol como

indicador de pH sin bicarbonato) suplementado con 2% de glucosa y como buffer, ácido 3-(N-morfolino)

propanesulfonico (MOPS) a 0.165 mol/L, pH 7.0. El medio de cultivo debe prepararse al doble de su

concentración (RPMI 2x).

Preparación de las soluciones madre: Se pesan los antifúngicos y se disuelven hasta alcanzar la

concentración adecuada. Se debe congelar a –70 °C hasta su utilización (máximo 6 meses), o a –40 °C

(máximo 2 meses).

Solvente Concentración

Fluconazol Agua 6,4 mg/mL

Anfotericina B, Itraconazol, Voriconazol, Posaconazol

Dimetilsulfóxido (DMSO) 1,6 mg/mL

Caspofungina Agua 1,6 mg/mL

Preparación de las soluciones de trabajo: Se colocan 20 µL de la solución madre en un tubo

eppendorf con 980 µL de RPMI 2x para obtener soluciones de:

- 32 µg/mL: Anfotericina B, Itraconazol, Voriconazol, Posaconazol

- 128 µg/mL: Fluconazol

Llenado de las microplacas: Se utilizan microplacas de 96 pocillos con 100 µL de RPMI 2x en

todos los pocillos de las columnas 2-12. Se colocan 200 µL de la solución de trabajo de cada uno de los

antifúngicos a evaluar en el pocillo de la columna 1. Se transfieren 100 µL a la columna 2, se

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homogeiniza y se transfieren 100 µL a la columna 3. Este proceso se repite hasta la columna 10,

descartando los últimos 100 µL.

La suspensión de inóculo se homogeiniza y se dispensan 100 µL en todos los pocillos de la

columnas 1-11. En la columna 12, se dispensan 100 µL de solución fisiológica estéril.

El diseño de las microplacas se puede hacer como sea necesario. En el laboratorio de CEREMIC

se utiliza el siguiente diseño para levaduras.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Anfotericina A 16 8 4 2 1 0,5 0,25 0,12 0,06 0,03 CC CE

Fluconazol B 64 32 16 8 4 2 1 0,5 0,25 0,12 CC CE

Itraconazol C 16 8 4 2 1 0,5 0,25 0,12 0,06 0,03 CC CE

Caspofungina D 16 8 4 2 1 0,5 0,25 0,12 0,06 0,03 CC CE

Anfotericina E 16 8 4 2 1 0,5 0,25 0,12 0,06 0,03 CC CE

Fluconazol F 64 32 16 8 4 2 1 0,5 0,25 0,12 CC CE

Itraconazol G 16 8 4 2 1 0,5 0,25 0,12 0,06 0,03 CC CE

Caspofungina H 16 8 4 2 1 0,5 0,25 0,12 0,06 0,03 CC CE

Concentraciones de los antifúngicos (μg/mL) Controles

- Columnas 1-10: soluciones de los antifúngicos en rango de concentraciones 16-

0,03 μg/mL (64-0,12 μg/mL para fluconazol)

- Columna 11: control de crecimiento (CC)

- Columna 12: control de esterilidad (CE)

Incubación: Se incuba, sin agitación, en atmósfera normal, a 35 ± 2 ºC

− durante 24-48 h para Candida spp.

− durante 48 h para Cryptococcus neoformans.

− durante 24 h para hongos filamentosos no tabicados

− durante 48 h para hongos filamentosos tabicados

Lectura de los resultados: En primer lugar se observan los controles debiéndose observar

crecimiento en CC y no observarlo en CE (que se utilizará como blanco de lectura). El contenido de los

pocillos se homogeiniza y se lee a 405 nm en lector de microplacas. Se calcula el % de inhibición

Interpretación de los resultados:

Levaduras

− Para Anfotericina B, se considera que la Concentración Inhibitoria Mínima (CIM) es

aquella que inhibe completamente el desarrollo fúngico (% inh = 0).

− Para el resto de los antifúngicos, la CIM es aquella que reduce a la mitad el desarrollo

respecto al control de crecimiento (% inh > 50).

Nota:

- En la práctica, si el lector de absorbancia lo permite, este cálculo se puede realizar

transfiriendo los datos a una planilla de cálculo.

- En caso que no se cuente con el mismo, se determina como:

% inh = 0 se determina la CIM como la menor concentración que arroja un valor de

absorbancia similar al CE

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% inh > 50 se determina la CIM como la menor concentración que arroja un valor de

absorbancia inferior a

Hongos filamentosos

− Para todos los antifúngicos, se considera que la CIM es aquella que visualmente inhibe

completamente el desarrollo fúngico.

Nota: para caspofungina se obsevan las malformaciones microscópicas del desarrollo fúngico, se

determina la Concentración Efectiva Mínima (CEM)

Control de calidad: Las cepas de control de calidad son evaluadas de la misma forma y se

incluyen siempre que se ensaye un aislado, se utilizan C. parapsilosis ATCC 22019 y C. krusei 6258, los

resultados obtenidos deben estar dentro del rango recomendado.

Microorganismo Antifúngico Rango CIM

24 h 48 h

C. parapsilosis ATCC 22019

Anfotericina B 0,25 – 2 0,5 - 4

Caspofungina 0,25 – 1 0,5 – 4

Fluconazol 0,5 – 4 1 – 4

Itraconazol 0,125 - 0,5 0,125 – 0,5

Posaconazol 0,06 - 0,25 0,06 – 0,25

Voriconazol 0.016 - 0.12 0,03 – 0,25

C. krusei ATCC 6258

Anfotericina B 0,5 – 2 1 - 4

Caspofungina 0.12 – 1 0,25 – 1

Fluconazol 8 – 64 16 – 64

Itraconazol 0,12 – 1 0,25 – 1

Posaconazol 0,06 - 0,5 0,125 - 1

Voriconazol 0,06 - 0,5 0,125 - 1