HUGO SOL

ESTUDIO SOBRE LA EXTRACCION Y ANALISIS DE TERPENOS A PARTIR DE CASCARA DE NARANJA

Or. Julio Flores R. M. en C. lcela D. Barcelo 11. M. en C. Hugo Solís Correa Ing. Jaime Varela Saucedo

hY!lA UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA GaSaab6ltadlarpo

UNIOAO AZCAPOTZALCO. División de Ciencias Bisicas e lngenieria Departamento de Ciencias Básicas

RESUMEN

\,

En los Últimos años el aceite esencial de naranja, en México, ha aumentado SU

demanda sobre todo en la industria referesquera y de alimentos. Una parte importante de este producto es importado.

En este proyecto se estudio la factibilidad de obtener aceite esencial de la cascara de naranja a partir de la cascara de las naranjas desechadas después de extraerles el jugo. Se probaron varios métodos para la extracción del aceite (arrastre de vapor, espreción y con solventes). También se probó la destilación fraccionada y la cromatografía en columna para desterpenar los aceites obtenidos, esta operación permite obtener aceite de una gran calidad. Los aceites obtenidos se analizaron por cromatografía gas-líquido utilizado dos fases estacionarias.

Los resultados mostraron que el método de extracción por arrastre de vapor produce la mayor cantidad de aceite, aunque el de mejor calidad es el obtenido con solventes. La desterpenación por cromatografía en columna elimina la mayor parte del D-Limsnéno produciendo un aceite mas refinado.

3

Este trabajo se realizó en el Laboratorio de Electroquímica y de Especiación de Metales Pesados del Area de Química del Departamento de Ciencias Básicas de la División de Ciencias Básicas e Ingeniería (CBI) de la Unidad Azcapotzalco de la Universidad Autonoma Metropolitana (UMA-A).

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INDICE

I. INTRODUCClbN AL ANÁLISIS DE LOS TERPENOS

II. ANTECEDENTES DEL METODO DE DESTERPENACIÓN Y ANALISIS DEL ACEITE ESENCIAL

11.1 DESTERPENACION DE LOS ACEITES 11.1.1 Destilación Fraccionada 11.1.2 Cromatografía en columna

11.3 SELECCION DE FASES LIQUIDAS PARA 11.2 ANALISIS POR CROMATOGRAFIA GAS-LIQUID0

CROMATOGRAFIA DE GASES EN CAPILARES DE VIDRIO PARA HIDROCARBUROS MONOTERPENICOS

111. PARTE EXPERIMENTAL

111.1 MATERIAL 111.1 .l Destilación Fraccionada 111.1.2 Cromatografía de adsorción 111.1.3 Cromatografía gas-liquido 111.1.4 Otros materiales

111.2 SUSTANCIAS Y REACTIVOS 111.3 SEPARACION DE HIDROCARBUROS

TERPENICOS (DESTERPENACION) 111.3.1 Destilación fraccionada 111.3.2 Cromatografía de adsorción

111.4.1 Determinación de las condiciones cromatográfcas 111.4.2 Selección de fases estacionadas

111.4 ANALISIS POR CROMATOGRAFIA GAS-LIQUID0

111.5 ANALISIS CUALITATIVO

IV. RESULTADOS Y DlSCUSióN

IV.l EXTRACCION Y DESTERPENACION DEL ACEITE DE CASCARA DE NARANJA

PAG 9

10

10 11 11 12

15

16

16 16 16 16 17 17

17 17 18 18 18 20 21

21

21

7

IV.2. ANALISIS CUALITATIVO IV.3 ANALISIS CUANTITATIVO

V. CONCLUSIONES

VI. REFERENCIAS BlBLlOGiRAFlCAS

VIL ANEXO1 I

I

22 24

28

30

33

I

I. INTRODUCCION AL ANALISIS DE LOS TERPENOS

Principales constituyentes Monoterpénos Aldehídos Citral Alcoholes libres Esteres

La cromatografía de gases se ha convertido en una técnica efectiva para el análisis de mezclas complejas de sustancias que tienen características químicas y físicas parecidas, como son los hidrocarburos monoterpénicos. La variación en los puntos de ebullición de los compuestos que pertenecen a estos grupos es tan pequeña como sus diferencias en polaridad (1).

(%) Monoterpénos (%I 89 - 91 D-limonéno 83-93

1.8 a- Pinéno 0.5 0.05 - 0.2 p- Pinéno 1 .o

0.9 Mi rceno 2.0 2.9 y- Terpinéno o. 1

Las fracciones monoterpénicas de los aceites esenciales frecuentemente consisten de mezclas complejas se caracterizan por un rango amplio de concentraciones de los componentes. Muchos de estos compuestos tienen una baja estabilidad debido a efectos térmicos y catalíticos. Esta desventaja origina que se formen nuevos compuestos los cuales, frecuentemente, tienen las mismas propiedades químicas de la mezcla y son isómeros difíciles de determinar e identificar.

Los análisis que se han desarrollado acerca de la composición del aceite esencial de naranja nos muestran que el principal compuesto presente es el D-limonéno. Kefford y Chandler (2) reportan la composición para el aceite de naranja de Valencia (Tabla 1).

I&hl Composición del aceite de cascara de naranja de Valencia (Kefford et al., 1982).

Para el aceite de naranja dulce, González Sicilia (3) reportó que el aceite de la naranja dulce esta compuesta principalmente por 6- Limonéno (90 - 97 %o>.

En un estudio realizado por De la Torre y Sardi (4) reportaron para el aceite esencial de naranja cimarga ó agria la composición siguiente indicada en la Tabla 2.

9

Tabla 7. Composición del aceite de naranja agria (De la Torre y Sardi, 1978).

Compuesto a- Pinéno

(%) 0.24

I B- Pinéno I 0.50 I D-Limonéno a- Feladréno

71 .O 0.35

Aldehído Decílico Citronelal _ _

I

Acetato de Citronelíto 1 3.28 1 4.9 2.7

I

a- TerDineol I 3.22 1 I

Acetato de Geranílo I 7 . 0 7 I

Geraniol I 5.0 1 I Citral I 0.60 I

La cromatografía gas-líquido es una arma poderosa para profundizar en el conocimiento de la composición de los aceites esenciales de los agrios y también lo es para la detección de adulteraciones en los mismos.

La adición de los terpénos de naranja dulce a la esencia de limón se denota por un aumento de la relación de áreas del D-limonéno y del a-Terpinéno, lo mismo si se añade aceite Ó terpénos de naranja dulce a la esencia de naranja amarga (5). Se advierte en la detección del Citronelal (que está en la naranja dulce y no en la amarga) y en la reducción del contenido de acetato de linalílo con respecto al linalol.

El empleo de la cromatografía gas-líquido es muy útil para seguir los diferentes pasos en la obtención de los aceites, así como para corregir anomalías de procesos y controlar la cantidad y calidad del producto final.

I I . ANTECEDENTES DEL METODO DE DESTERPENACION Y ANALISIS DEL ACEITE ESENCIAL

11.1 DESTERPENACION DE LOS ACEITES

Para efectuar el análisis por cromatografía gas-líquido es conveniente realizar una purificación parcial de los aceites esenciales extraídos de la materia prima. Los métodos más empleados para este propósito son los siguientes:

a) Destilación fraccionada b) Cromatografía en columna

La separación se realiza con el fin de identificar y analizar los terpénos presentes en el

.-

l a

aceite esencial extraído.

Industrialmente la desterpenación se emplea para la conservación del aceite esencial de naranja, dado que los hidrocarburos- terpénicos se oxidan y alteran el aroma característico del mismo (7). Esto se debe a la inestabilidad principalmente del Limonéno. AI removerlo junto con los demás hidrocarburos terpénicos se produce el aceite desterpenado.

11.1.1 Destilación Fraccionada (6)

Haro reportó que en este método es necesario tener conocimiento de la composición química, especialmente de los intervalos de ebullición de los terpénos, sesquiterpénos y compuestos oxigenados que existen en el aceite esencial.

El intervalo de ebullición de los terpénos varía generalmente de 150 a 18OOC a la presión atmosférica; el de los sesquiterpénos de 240 a 280OC. Los puntos de ebullición de la mayoría de los compuestos oxigenados (alcoholes, aldehídos, ésteres terpénicos, etc.) caen entre los de los terpénos y sesquiterpénos. Fenoles, fenol-ésteres y algunos aldehídos aromáticos forman una excepción además de los alcoholes y ésteres sesquiterpénicos, etc., cuyos puntos de ebullición son más altos que los de los sesq u iterpénos.

La destilación fraccionada es mejor que se lleve a cabo con vacío, para evitar lo más posible la descomposición de los compuestos con dobles ligaduras debido a las altas temperaturas. Además, el aceite cuando recibe un calentamiento intenso, adquiere un aroma ligeramente quemado.

11.1.2 Cromatografía en columna

Kirchner y Miller (8) obtuvieron un aceite desterpenado, sometiendo la esencia a una separación cromatográfica. Como adsorbente se utilizan: ácido silícico, alúmina, óxido de magnesio, hidrato de magnesio, hidrato de aluminio, bentonita, tierra fósil, etc. Como disolvente terpenófilo: hexano, sulfur0 de carbono, éter de petróleo, etc. , mientras que la elución de las sustancias oxigenadas se puede emplear acetato de etilo, éter etílico, acetona, alcohol etílico, etc.

Braverman y Grolomiansky (9), en 1957, modificaron convenientemente el proceso de Kirchner y Miller para separar aceites esenciales extraídos por expresión o solventes, pasando esencia pura a través de la columna cromatográfica hasta que empiezan a eluir los componentes oxigenados. La observación puede seguirse visiblemente por el comportamiento de los pigmentos naturales del aceite, cuando los terpénos pasan coloreados, los aldehídos ya no están siendo absorbidos en la columna cromatográfica.

En 1962 Radomir Lasztity (IO) empleó la columna con sílice gel activada 2.5 horas a 150OC. Los terpenos absorbidos son eluídos con éter de petróleo y los derivados de los

terpenos por EtOAc. El método cromatográfico da las mejores calidades del producto.

En 1962, S.R. El-Deeb (11) usó 100 mg de aceite de naranja para la cromatografía en columna, que era de 10 gr de ácido silícico o Al203 y petróleo ligero o éter como solvente. La afinidad de absorción hacia el ácido silícico (a la cual fue mayor que la afinidad hacia el Al2O3) decrece en el siguiente orden: alcoholes, ésteres, aldehídos, cetónas y fenoles, óxidos y peróxido e hidrocarburos. La afinidad hacia el Al203 decrece en el orden: alcoholes, cetónas, fenoles, aldehídos, ésteres, óxidos y peróxidos e hidrocarburos.

En 1964 A. Mehlitz (12) y colaboradores analizaron los terpenos por cromatografia en columna .

En este año, S.R. El-Deeb (13) separaron Citral de Limonéno en proporciones de (1:1), (1:9) y (9:l) usando columnas de ácido silícico y como eluentes éter de petróleo y éter, respectivamente.

En 1965 M.S. Karawya (14) reportó que cada par de Limonéno (I) óa- Pinéno, linalol (11) o Terpineol (Ill), y Geraniol o Herol (IV), dan valores similares de Rf: 0.93, 0.62 y 0.52, respectivamente. Cantidades variables de una mezcla de I, Meantranilato (V), linalilacetato (Vi), camfor (VIII), II y IV, y también mezcla de I, II, Ill y V pueden ser separados cuantitativamente en 10 g de ácido silícico en una columna. El análisis cuantitativo de los constituyentes de sólo 200 mg de cada uno de los aceites puede ser alcanzada. Los hidrocarburos fueron eluídos con éter de petróleo, usando 1% de éter etílico en éter de petróleo, los constituyentes fueron eluídos en la secuencia V, VI, Vlll con Ill, I I y IV, con bastante intervalo de efluente libre para asegurar la completa separación para cada aceite. Con más elución con éter, en el caso de la naranja dulce, los aldehídos fueron obtenidos con Rf de 0.53.

Un método de separación de mezclas naturales que contienen componentes oxigenados, en base a la cromatografía líquido-sólido, fue desarrollada por Radomir Lasztity ( IO) . La separación fué llevada a cabo en una columna de silica gel usando gradientes de elución de 2.5 a 50% de Et0 en pentano. El enriquecimiento de varios componentes en las primeras para una mejor cromatografía de gases, separación e identificación. La secuencia de elución da una información extra acerca del grupo funcional de los compuestos. La isomerización puede evitarse usando silica gel purificada y desactivada.

11.2 ANALISIS POR CROMATOGRAFIA GAS-LIQUID0

En 1956, en una comunicación presentada al I Congreso Internacional de Estudio e Investigación de las Esencias, Liberti y Cartoni (32) expusieron los principios de la cromatografía en fase vapor, señalándola como el método analítico ideal para la determinación cualitativa y cuantitativa de los constituyentes de los aceites esenciales.

12

En esa ocasión se expuso el cromatograma de la fracción terpénica de un aceite de limón y el cromatograma de un aceite de bergamota. Tales cromatogramas, obtenidos a 1 OOOC y a 132OC sobre una columna de celita-tricresilfosfato, presentaban una distribución limitada de los constituyentes. A ellos, sin embargo, es necesario atribuir una notable importancia histórica porque señaló en Italia el inicio de los estudios en cromatografía fase vapor para el conocimiento de los aceites de los agrios.

En 1962 S.R. El-Deeb (1 1) utilizó como soporte el Kieselguhr y como fase estacionaria se usó aceite de silicón D.C. 550, como gas acarreador Nitrógeno.

LOS hidrocarburos muestran los menores tiempos de retención. Las sustancias pueden ser separadas, identificadas y determinadas por este micrométodo. Cromatogramas mostrados de a-pinéno, p-ciméno, cinemaldehído, eugenol, aneto1 y Me sakilato.

El contenido total de hidrocarburos monoterpénicos fue determinado de los aeeites de cítricos. Se utilizó un estándar interno (C&Bu) en el aceite.

El total de los hidrocarburos monoterpénicos fue obtenido de los pesos de CgHgBU y aceites de cítricos usados, y de las áreas bajo los picos de los hidrocarburos terpénicos y CgHg Bu en el cromatograma. Los contenidos totales de hidrocarburos terpénicos, de a-pinéno, P-pinéno, sabinéno, mircéno, D-limonéno, a-terpineno y p-ciméno fueron determinados para aceites de naranja, limón, uva y pino, en 1962 por R.M. Tkeda (16).

S. Oretze (15) la usó en el análisis de aceites esenciales.

En 1962, B.V. Piguelevski (17) tambien trabajó con esto y reporta numerosas ilustraciones de cromatogramas. Esto muestra la aplicación de esta técnica al estudio de las materias primas para perfume, determinación de los componentes presentes en un aceite esencial y la identificación de aceite esencial de tipos similares. Numerosas aplicaciones son listadas, así como la necesidad de escoger cuidadosamente las condiciones de trabajo.

R.L. Kenney (18) nos reporta que los terpenos pueden separarse en una columna alcalina carbowax 20-M. El soporte es cromosorb-W sin isomerización de los terpenos en la columna. Sin embargo, cuando aplicamos la cromatografía gas-líquido de isómeros de bajo punto de ebullición durante los estudios, se oxida el Jimonéno, los picos correspondientes al 2,8-p-mentodien-l-ol desaparecen y son reemplazados por 2 picos de tiempo de retención más grande, más 3 pequeños. Con el sustrato no tratado cromosorb-W da un pico de cis-2,8-p-mentadien-I -01 sin aparente isomerización O reacción lateral.

En 1963, Angelo Di Gracomo (19) sometió a cromatografía en fase vapor las esencias de naranja dulce y agria, en carbowax-1500, con helio como gas acarreador y contenía:

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y a-pinéno, sabinéno, mircéno, D-limonéno, a-terpinéno y p-ciméno. Estu fué confirmado por I.R.

El alemán R.M. lkeda (29), en 1963, fraccionó por medios físicos el aceite obtenido por expresión. Los componentes puros fueron aislados por cromatografía de gases. Las 48 sustancias identificadas constituyen el 99.2% de la parte volátil, el resto está distribuido en más de 1 O0 compuestos. Terpenos y terpenoides suman el 93.3% del aceite.

En 1964, Armando Ricciardi (21) obtuvo mejor resolución, dando separaciones claras con tiempos de retención prácticos a 125-50OC en columnas de 2 m al 20% sobre celita. Parámetros de empaque y temperaturas de trabajo de 100-125-1 50-175OC fueron dadas como: a) tiempo de retención para el Limonéno, b) retención relativa con Limonéno como componente estándar, y c) resolución para mezclas críticas de -pinéno-comféno y p-ciméno-cineol.

En este mismo año, Giuseppe Rispoli (22) nos da una interpretación de los resuttados sobre el 10% destilado de aceite de naranja, el contenido de terpenos (en el análisis de aceites de cítricos) fué ligeramente afectado por la variación en las condiciones de procesamiento. Datos para los hidrocarburos terpénicos de aceite de limón y naranja están tabulados y cromatográmas de gases son reportados.

En 1964, con la ayuda de la cromatografía de gases, A. Mehiitz (12) identificó mircéno, y a-pinéno y p-ciméno con limonéno.

En 1965, A.T.A. Ricciardi (23) compararon dos fases de resolución [hexaisobutirato (i) y diciclohexilftalato] en la separación de terpenos ligeros. Usaron columnas'de 2 y 4 m de longitud y 114 de pulgada de diámetro, con Lin empaque de 20% de diciclohexilfialato en malla 50-80 de celita y 20% de I en 80-100 malla sobre celita. Nitrógeno fue el gas acarreador a un flujo de 30-50 ml/min. Una mezcla de estándares contiene a-pinéno, P -pinéno, camféno, mircéno, iimonéno, p-cimeno y cineol.

Los tiempos de retención relativos con limoneno como base y los factores de resoluci6n de acuerdo a Phillips, fueron grabados. Los parámetros de retención y resolución a varias temperaturas de trabajo muestran una mejor dispdsición del empaque de diciclohexilftalato.

En 1966, Pierre A. Muller (24) extrajo aceite esencial de naranja agria y lo analizó por cromatografia de gases. Fueron reportados los terpenos totales 14.17, alcoholes totales 73, alcoholes libres 55, y d-limoneno 5.25.

En 1967, G. Varmin (25) presentó los avances durante los últimos 3 años. Teoría y técnicas de los detectores, saportes, análisis cualitativos y cuantitativos. Las fases estacionarias más comunmente usadas están tabuladas como función de la estructura química de los compuestos involucrados: hidrocarburos, terpenos, alcoholes y

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derivados, compuestos carbonílicos y derivados ácidos, éteres, etc.

Bardyshev y colaboradores (26) probaron varios soportes en 1969. Los vapores de y - pineno, dipenteno y 3-careno fueron pasados a 16OOC a través de una columna 1000 x 4 mm, llena con una fase estacionaria de prueba, y entonces examinaron por cromatografia en vase vapor. Un estudio comparativo de las fases estacionarias más comunes muestra que la mínima isomerización (con separación aceptable) se obtiene con vidrio.

Los cambios con la temperatura de columna de los tiempos de retención en la identificación de componentes volátiles fue hecha en 1970 por Breckler, P.N. (27). Estos cambios se relacionan a la polaridad de las parejas entre el soluto y la fase estacionaria. Los tiempos de retención relativos ai linalol, usualmente pero no necesariamente, decrecen con el incremento de la temperatura. Los efectos de la temperatura en los tiempos de retención de aceite volátiles sobre 15% de dimetilpoiisilaxano, SE-30 dietilenglicol sucinato y polietilenglicol, carbowax 20-M/cromosorb-W columnas pueden usarse para determinar la clase de compuestos de los aceites volátiles. Un detector de ionización de flama y nitrógeno o helio como gas acarreador fueron usados.

En 1976 Heide R. (28) encontró los índices de retención de 22 alcoholes monoterpén icos acíclicos: nerol, geraniol, citronelal, determinados en Apiezón-L Y Carbowax 20-M como fase estacionarias.

Perez Zayas hizo un estudio en 1977 (29) y el contenido de aceite esencial en cítricos (naranja y limón) fue analizado por cromatografía y espectrofotometría. El D-Limoneno (1 38-86-3) fué el principal constituyente (92%) en el aceite de naranja.

En 1979 Udarov, B.G. (30) analizó mezclas de monoterpenos e hidrocarburos relacionados. Los tiempos relativos de retención de 27 monoterpenos e hidrocarburos relacionados fueron determinados a 7OoC en una columna de acero inoxidable capilar de 50 m con fase estacionaria de varias polaridades (escualeno, PFMS 4, silicón tricresil fosfato y polietilenglicol con PM 1500). El uso de 4 fases estacionarias diferentes permite la identificación de todos los componentes estudiados, excepto cis-pineno. La mejor separación fué obtenida con tricresil fosfato.

Prager, Manfred J. (31), en 1981, da un procedimiento para identificar y detectar adulteración de varios perfumes de naranja agria. Se usó una columna capilar carbowax 20-M a 6OoC de temperatura por 4 minutos, programación a 2OC/min hasta 2OO0C, Y 20OoC por 32 min.

11.3 SELECCION DE FASES LIQUIDAS PARA CROMATOGRAFIA DE GASES EN CAPILARES DE VIDRIO PARA HIDROCARBUROS MONOTERPENICOS

Este estudio se hizo en 1981 por Hiltunen, Raima (1) en columnas capilares de vidrio con fases líquidas de diferentes polaridades que fueron preparadas y probadas. D e 9

15

fases líquidas probadas (Apiezón-L, SE-30, OV-I 01, UCON 50, LB550X, Emulfar ON 870, Carbowax 20-M, FFAP, SP-1000 y Silar IOC), FFAP fué la más propia para la separación de hidrocarburos monoterpénicos de aceite de pino. Para mezclas de monoterpenos, las cuales contienen a- tujeno y/o tricicleno juntos con a-pineno, sólo columnas no polares y semipolares, como SE-30, OV-101 ó UCON-50, LB550X, se recomiendan. De las fases polares, Carbowax 20-M y FAAP son las más efectivas para p-mentad ienos.

En este trabajo se evaluaron las técnicas de extracción de aceite de cascara de naranja amarga y dulce utilizando el arrastre con vapor, la expresión y la utilización de solventes. También se probaron las técnicas de destilación fraccionada y cromatografía de adsorción para desterpenar los aceites extraídos; se analizaron por cromatografía de gases y se probaron varias fases estacionarias para la identificación y cuantificaciones de los terpenos presentes en los extractos.

111. PARTE EXPERIMENTAL 0

I 111.1 MATERIAL

111.1 .I Destilación Fraccionada

matraz balón fondo redondo de 50 y 100 mi columna vigreux refrigerante T de vidrio Termómetro de O-400°C Matraces erlenmeyer de 25 ml o frascos ambar vaso de precipitados de 50 ml adaptador de vacío por adsorción

columna cromatográfica 450 mm x 18 mm embudo de separación probeta matraces erlenmeyer de 250 ml y 25 mi rotavapor frascos ambar

111.1.3 Cromatografía gas-liquido

1 cromatógrafo PYE UNICAM modelo GCV 1 graficador PYE UNICAM modelo AR-55

111.1.2 Cromatografía de adsorción

16 . .

1 integrador VARiAN modelo CDS-111 2 matraces erlenmeyer de 25 ml 1 jeringa METROM de 10 I 1 cronómetro 1 encendedor de resistencia

111.1.4 Otros materiales

1 balanza analítica 1 bomba de vacío 1 bomba de agua 1 parrilla 1 estufa 1 tanque de nitrógeno de alta pureza 1 tanque de hidrógeno 1 tanque de aire 5 pipetas Pasteur

papel aluminio mangueras y tapones

111.2 SUSTANCIAS Y REACTIVOS

Eter de petróleo Hexano Acet o n a Metano1 Acetato de etilo Glicerina Kieselgel 60 Merck, malla (39-70 ASTM) 0.2-0.5 mm Lana de vidrio Extran

111.3 SEPARACION DE HIDROCARBUROS TERPENICOS (DESTERPENACION)

11.3.1 Destilación fraccionada

Se empleó el método reportado por Haro (6). El dispositivo empleado consiste en un aparato que consta de las siguientes partes: (a) matraz balón fondo redondo de 100 ml, en el cual se coloca el aceite esencial de naranja y se calienta mediante baño maría (b) a base de glicerina para tener un calentamiento suave y poder controlar la temperatura dentro del sistema, para que ésta sea uniforme; (c) columna vigreux de rectificación; (d)

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T de vidrio a la cual se encontraba conectado el refrigerante (e) y tenía insertado las fracciones; (9) adaptador de vacío; (h) matraz balón fondo redondo de 50 ml para recibir las fracciones. Todo el sistema se mantuvo a baja presión mediante la bomba de vacío (0.

Se tuvo especial cuidado en mantener el dispositivo completamente seco para evitar que hubiera arrastre de compuestos por el vapor formado.

Ls condiciones a las que se trabajó fueron: temperatura del baño maría: 198OC; vacío de 265 mm de Hg. Los terpenos destilaron a 147OC.

111.3.2 Cromatografía de adsorción

Este tipo de separación se llevó a cabo en una columna cromatográfica de vidrio de 18 x 450 mm y se probaron los pares de solventes reportados por Kirchner y Miller (8) hexano-acetona, y por Lasztity (1 O) éter de petróleo-acetato de etilo.

Se colocó en un embudo de separación el solvente terpenófilo (hexano, éter de petróleo) en una cantidad de 100 ml con los cuales se eluyeron los hidrocarburos terpénicos del aceite esencial de naranja a través de una columna de sílica gel. Esta columna se preparó de la siguiente manera: se colocó un poco de lana de vidrio y se llenó con el solvente terpenófilo, se mojó la sílica gel también con éste y se agregó poco a poco, golpeando suavemente la columna para un mejor acomodamiento de la sílica gel, hasta una altura de 10 cm. La fracción eluida se colectó en un matraz erlenmeyer y luego se evaporó el solvente empleando un rotavapor y baño maría como el mostrado en la fig.

Después de colectar la primera fracción se agregó un solvente polar (50 ml de acetona, metano1 o acetato de etilo) para la elución de los compuestos polares como 10s alcoholes, ésteres, aldehídos, cetonas, fenoles, así se recogió la segunda fracción, se evaporó y se guardaron cada una en frascos para evitar los efectos perjudiciales de los agentes físicos.

111.4 ANALISIS POR CROMATOGRAFIA GAS-LIQUID0

Para el análisis por cromatografía gas-líquido se empleó un cromatógrafo de gases (33) PYE UNICAM modelo GCV de doble columna, con detector de ionización de flama (27) (DIF) acoplado a un registrador PYE UNICAM modelo AR-55 y un integrador VARIAN AEROGRAPH modelo CDS-111.

111.4.1 Determinación de las condiciones cromatograficas

Estos se determinaron mediante experimentación excepto los flujos de nitrógeno e hidrógeno, que se encontraron reportados por Breckler y Betts (27). El flujo de aire se

18

ajustó a 170.45 ml/min para lograr una mejor resolución.

Temperatura de la columna Temperatura del detector Temperatura del invector

Se empleó una columna de vidrio de 2.1 m de largo por 4 mm de diámetro interior empacada con la fase estacionaria OV-101 al 5% en chromosorb W (33) malla 80/100. La fase se preparó de la manera siguiente: se añadió la fase estacionaria pesada (0.5 g) la cual se disolvió en 19 ml (33) de cloroformo, en seguida se le agregó el soporte sólido (chromosorb W). La cantidad de solvente (cloroformo) es suficiente para mojar el soporte sólido. Se permitió la evaporación espontánea con ligera aplicación de calor. Esta fase estacionaria (OV-101) se encontró reportada por Hiltunen y Raisanen (I), los cuales la utilizaron para la identificación de monoterpenos.

160 O C

240 OC 24OOC

La temperatura de inyección se estableció en 240OC. La de la columna se probó en un rango de 40 hasta 2OO0C, encontrando la óptima en 16OOC. La temperatura del detector depende del tipo que se empleó, pero las conecciones de la salida de la columna y el detector deben estar lo suficientemente calientes para evitar la condensación de la muestra y10 de la fase estacionaria. Para los DIF la temperatura debe mantenerse alta y se fijó en 240OC.

L - - Flujo del hidrogeno Fluio de aire

La sensibilidad del amplificador de ionización de flama se varió de 1024 x 10 2 hasta 1024 x 10 3, encontrándose que la mejor era la de 512 x 10 3. Los picos pequeños que no aparecieron en los cromatogramas fueron registrados por el integrador.

92.6 ml/mín 170.5 ml/mín

El volumen de inyección se escogió de 5 I de acuerdo con la sensibilidad establecida, éste se varió desde I I hasta 10 I.

Back off del DIF Velocidad de la carta de reaistro

La velocidad de la carta se seleccionó en 60 seg/cm para que la definición de los picos fuera buena. Las condiciones cromatográficas de trabajo se resumen en la Tabla 5.

60 sea/mín

TABLA 3, Condiciones de los parametros para el análisis por cromatografía gas- líquido.

I Paramétro I Valor 1

I Fluio de nitrógeno I60 ml/mín I I I Sensibilidad del DIF I512x103 I

19

111.4.2 Selección de fases estacionarias (33)

SE-30 ov-I o1 DEGS-SP Carbowax 1540

La elección de ésta depende de la composición de la muestra; es de esperar que se conozcan los tipos de componentes que se analizarán. La fase estacionaria (líquida) debe ser similar a los componentes de la mezcla, compuestos no polares separados con solventes no polares y polares con polares.

15 5 5

o. 1

Para los aceites esenciales de cítricos, los mejores separadores, según Haro (6), han sido los polietilenglicoles (carbowax), los glicoles polialquilénicos y sus diésteres alifáticos, los silicones, diversas ceras, etc.

Breckler y Betts (27) emplearon las fases estcionarias SE-30 (dimetil polisilaxano) que es no polar. La fase DEGS (succinato de dietilenglicol) que es poco polar y ia fase carbowax (polietilenglicol) que es polar. Se probaron las fases estacionarias que aparecen en la Tabla 6 para ver cual tenía mejor resolución.

T A B L A 4. Caracteristicas fisicoquímicas de las fases estaciainarias para el análisis cromatografíco.

Las columnas se empacaron con estas fases en chromosorb W (HMDS) (hexametildisilasano) malla 80/100 en los porcentajes indicados en la Tabla 7.

TABLA 5. Porcentajes de las fases utilizadas las columnas cromatográficas.

I Fase I (%) 1

Se encontró que las fases SE-30 y carbowax-OV-101 eran las más idoneas para el análisis

20

111.5 ANALISIS CUALITATIVO

Método de extracción

Arrastre de vapor Expresión

Se llevó a cabo la cromatografía gas-líquido para obtener los tiempos de retención absolutos de los estándares con los cuales se identificaron los compuestos contenidos en el aceite de naranja, por comparación con los tiempos de retención de los estándares que se obtuvieron.

Aceite Aceite Terpenos bruto bruto

(g/kg de (ml/kg de (mi) CN*) CN*) 42.94 50 40.44

16.60 20 15.59

Los estándares que se utilizaron son compuestos que se venden comercialmente, al obtener los cromatogramas se observó que no eran puros, por lo que se inyectaron en el cromatógrafo por triplicado para tener el promedio del pico mas grande, tanto en su tiempo de retención como en el porciento de área, también para observar la linearidad en la respuesta del DIF.

IV. RESULTADOS Y DISCUSION

IV.1 EXTRACCION Y DESTERPENACION DEL ACEITE DE CASCARA DE NARANJA

Los resultados de la extracción de aciete a partir de cascara de naranja se muestran en la Tabla 6.

Tabla 6. Resultados de la extracción y desterpenación por destilaccion fraccionada de aceite esencial de Naranja Dulce.

I I I

Soiventes 117.09 I20 116.17 * CN= Cascara de naranja.

desterpe 7' 94.2

93.9 0.80 -

94.6 10.71

Estos resultados muestran que la extracción del aceite de la cascara de naranja utilizando el metodo de arrestre de vapor es mas eficiente. Por los otros metodos se presentan perdidas muy importantes, tal vez sería interesante diseñar otro tipo de equipo para la extracción por espresión, esta técnica tiene la ventaja de efectuarse la extracción a temperatura ambiente lo que permite recuperar un aceite con sus caracteristicas naturales, sin sufrir modificaciones a causa de la temperatura.

21

En cuanto a la cantidad de terpenos se observa que los tres rnetodos producen un aceite con una proporción de terpenos equivalentes. Los resultados de la deterpenacion por detilación fraccionada muestran que el aceite obtenido por arrastre de vapor produce una menor cantidad de aceite desterpenado, probablemente durante el proceso de extracción del aceite, por efecto de la temperatura, una proprorción de compuestos polares alcoholes, adehídos, esteres, etc. se solubilizan en el agua caliente y de esta manera disminuye la cantidad de aceite desterpenado.

La desterpenación por destilación fraccionada se efectua a temperaturas elevadas lo que puede provocar una descomposición de ciertos terpenos, por esta razon se probó la desterpenación por croamtografía de adsorción utilizando diferentes sistema de solventes, en la Tabla 7 se presentan los resultados.

TABLA 7. Resultados de la desterpenación por cromatografía de adsorción del aceite de Naranja dulce extraido por arrastre de vapor.

1 : Hexano-Acetona; 2: Hexano-Metanol; 3: Eter de petróleo-Acetato de Etílo

Estos resultados muestran que la desterpenación utilizando como sistema de elución la mezcla Eter de petróleo-Acetato de etílo produce la mayor cantidad de aceite desterpenado con unamenor cantidad de perdidas.

IV.2. ANALISIS CUALITATIVO

La identificación de los terpenos presentes en el aceite bruto y desterpenado se realizó comparando los tiempos de retención relativos de los estándares (Anexo 1) con los de los compuestos prsentes en las muestrs.

En las tablas 8 y 9 se muestran los resultados.

COV = Carbowax 1540-OV-1 O 1 SE = SE-30

22

Tabla 8, Terpenos identificados en los aceites de cascara de naranja dulce extraida por diferentes métodos y analizadas por cromatografia gas-liquids utilizando diferentes fases.

Fases SE

Metodo de extracción Arrastre de vapor Expresión ' Solvente a- Pinéno a- Pinéno D- Limonéno D- Limonéno Aldehído decílico Terpineol

Linalol Aldehído decilico Terpineol

D- Limonéno Aldehído decílico Terpineol

cov I Citoneiai I Citroneioi

Citral Citroneioi Citronelol D-Limonéno D- Limonéno D- Limonéno

Estos resultados muestran que la fase SE presenta una mayor resolusión qu la COV. En cuanto al metodo de extracción observamos que por los tres metodos se extrae: D- Limonéno, Aldehído decílico y Terpinol, en la extracción con solvente no se identificó el a- Pinéno, por ultimo se observa diferencia en cuanto a la extracción de alcoholes y aldehídos terpénicos.

Fases SE

cov

El aceite de cascara de naranja amarga , extraído por arrastre de vapor presenta una composición similar al de naranja dulce (Tabla 9).

Arrastre de vapor a- Pinéno D- Limonéno Terpineol Citronelol Citral D-Limonéno

Tabla 9, Terpenos identificados en los aceites de cascara de naranja amarga extraídos por arrastre de vapor y analizadas por cromatografía gas-liquido utilizando como fases SE y COV.

I Citroneiai 1

23

Tabla I O , Terpenos identificados en el aceite desterpenado de cascara de naranja utilizando'las fases SE y COV.

FASES DESTl LAC1 ON FRACCIONADA

Destilado Residuo Dest ¡lado Residuo CROMATOGRAFIA DE ADSORCION

Hexano Metano1 Hexano Acetona Eter de Petróleo Acetats de etílo

jldehído lecilico SE COV

<

X

a- Pinéno SE COV --

X

X

X

X

N-imonéno

SE COV

K X X X X X X X

X X

X

X X X

Terpineol

SE COV

X

X

Xronelol

SE COV

X X

X

X

IV.3 ANALISIS CUANTITATIVO

La precisión con la cual las muestras pueden ser analizadas es uno de los factores que han llevado al rápido desarrollo de la cromatografía de gases en el campo del análisis instrumental.

En el análisis cuantitativo existen varios factores de igual importancia: introducción exacta de la muestra, parámetros de operación constante, exactitud al medir el área de los picos, factores de sensibilidad de cada compuesto, linealidad de los detectores y columnas que dan picos bien resueltos.

El procedimiento que se utilizó para la cuantificación fue el de normalización interna (33).

Los resultados se muestran en las tablas 1 1, para cada una de las fases estacionarias con que se analizaron.

24

Tabla 11, Resultados de la cuantificación (en %) de terpenos en aceite de naranja agria y dulce utilizando extraidos por arrastre de vapor, expresión y con solventes; y de aceite desterpenado por destilación fraccionada y cromatografia de adsorción utilizando la fase SE.

r-Pinéno

2.79

2.44 2.04

Citral D- Terpineol Limonéno

77.9 0.49

82.46 0.22 81.82 0.39 82.72 0.39

Uitronelol

3.19

D.66 1.5

Al de h ído decíiico

0.26 0.28 1.7

5.9

4.04

Linalol

1.78

Arrastre de vapor

Dulce

Arrastre de vapor Expresión Solventes Destergenación -

Destilación Fraccionada

Destilado Residuo Destilado Residuo

Cromatograf ía de Adsorción

Hexano Metano1 Eter de petróleo Acetato de Etílo

0.22

1.8

5.27

12.65

Citronelal

0.72

1.42

25

Tabla 12. Resultados del análisis cualitativo de aceite de naranja dulce extraido por Arrastre de vapor, Expresión y con Solventes; y del aceite desterpenado por destilación fraccionada y por cromatografía de adsorción utilizando como fase cov.

Extracto Arrastre de vapor Expresión Solventes Desterpenación por Destilación Fraccionada

Destilado Residuo Destilado Residuo Desterpenación por Cromatografía de Adsorción

Eter de Petróleo Acetato de Etilo Hexano Acetona

D- Limonéno 99.5 101.8 91.1

112.96 57.45 111.5 63.75

107.7 14.4 111.5

Citronelol 2.5 1.78

18.6

17.2

El primer punto es la desterpenación para el análisis del aceite esencial de naranja o de cualquier otro cítrico. De las Tablas 10 se observó que el mejor tipo de desterpenación para el análisis, es el que emplea la cromatografía por adsorción, ya que remueve la mayor cantidad de terpenos 96.8% contra 94.2% de la destilación fraccionada, aunque esta Última es mas aconsejable industrialmente, por ser mas flexible en cuanto al control de las cantidades de terpenos en el aceite esencial.

En la Tabla 11 se observa que dentro de la cromatografía por adsorción el mejor eluyente terpenófilo es el hexano, y para la elución del aceite desterpenado, el acetato de etilo.

No fué posible emplear la técnica de Braverman y Golomiansky (9) para la desterpenación del aceite esencial extraído por arrastre de vapor, dado que tiene pocos pigmentos y no sería posible determinar el momento en que dejan de eluirse los terpenos y comienzan a eluir los aldehídos.

Los aceites esenciales extraídos por diferentes métodos se compararon en base al análisis que se realizó por cromatografía gas-líquido. En la Tabla 20 se observa que se

26

tienen casi los mismos compuestos por los tres métodos de extracción: arrastre de vapor, expresión y por solventes.

Los compuestos que difieren según el método utilizado son:

- Citral, identificado solamente en el aceite extraído por arrastre de vapor.

- Linalol, identificado sólo en la extracción por agotamiento con solventes.

- a-Pinéno, fué identificado en las extracciones por arrastre de vapor y expresión.

El Citronelal es un compuesto que no se encontró en el aceite extraído por arrastre de vapor, analizado con la fase estacionaria SE-30, pero al analizarlo con la fase estacionaria CARBOWAX 1540-OV-1 O1 se logró identificar.

Kefford (2) reporta para el análisis esencial de naranja dulce de Valencia las siguientes composiciones:

D-Limonéno 83 a 93 % a-Pinéno 0.5 % Citral 0.05 a 9.2%

de los compuestos identificados en las muestras de naranja dulce analizadas se obtuvieron las siguientes composiciones:

D-Limonéno 82.50% a-Pinéno 2.43% Citral O. 197%

AI comparar el cromatograma del aceite de naranja amarga (49) con el del aceite de naranja dulce (27) se observó que hay dos compuestos no identificados (por falta de estándares) que varían notablemente. El pico A disminuye en 0.5134% con respecto al de naranja amarga, mientras que el pico B aumenta en 1.3366% con respecto al de naranja amarga.

Para el aceite de naranja amarga, De la Torre y Sardi (4) reportan la composición siguiente:

D-Limonéno 71 .OO% a-Pinéno 0.24% Citral 0.60% Citron e i o I 2.7 O YO Terpineol 3.22%

27

En las muestras de naranja amarga del Sureste de México, la composición determinada fué la siguiente:

D-Limonéno 77.9% a-Pinéno 2.79% Citral 0.21 % Citroneloi O. 193% Terpineol 0.50%

Ahora bien, haciendo la comparación entre el aceite de naranja dulce y el de naranja agria (Tabla 11) se observó que sólo difieren en un compuesto que es e¡ Aldehído decílico contenido en la naranja dulce y no en la naranja amarga, o tal vez se encuentre pero en cantidades muy pequeñas.

V. CONCLUSIONES

En el presente estudio, que se compone de dos partes: extracción del aceite esencial de naranja y análisis del mismo, se estableció la rutina a seguir para el análisis de cualquier aceite esencial de cítricos, la cual contiene los siguientes pasos:

Extracción del aceite mediante una destilación por arrastre de vapor, ya que presenta ventajas para el análisis tales como:

rapidez en la obtención de la muestra de aceite. pureza del aceite cantidad suficiente de aceite para poder concentrarlo (desterpenación) y asi efectuar una mejor identificación de los compuestos que se encuentran en proporciones menores.

Desterpenación del aceite mediante cromatografía por adsorción, utilizando como eluyentes hexano (terpenófilo) y acetato de etilo para eiuir el aceite desterpenado (alcoholes, ésteres, aldehídos, cetónas, etc.).

Análisis cromatográfico con las condiciones establecidas para obtener una buena resolución de los picos de los compuestos que forman el aceite. Estas condiciones son: Temperatura de la columna 16OOC Temperatura del detector 24OoC, Temperatura del inyector 24OoC, Flujo de nitrógeno 60.0 mi/min, Flujo de hidrógeno 92.6 ml/min, Flujo de aire 170.5 ml/min, Sensibilidad del amplificador del DIF 512 x 103 y Velocidad de la carta del registrador 60 seg/cm y utilizando una fase estacionaria SE-30.

Introducción de los datos obtenidos mediante el integrador o algún otro tipo de medición del área, O h de área, tiempo de retención de cada pico, a los programas de computadora para obtener el análisis cuantitativo y cualitativo del aceite

empleado como muestra.

La rutina anterior nos permitió determinar que para obtener una mejor cantidad de citral debe usarse el método de arrastre de vapor, en tanto para obtener mayor cantidad de linalol sería necesario realizar la extracción por agotamiento con solventes (acetato de etifo o cloroformo), aunque la purificación será muy problemática debido a la gran cantidad de compuestos que se extraen.

La recuperación de los Monoterpénos realizada por cromatografia por adsorción se realizó con el fin exclusivo para su análisis. Industrialmente el método de destilación fraccionada es más aconsejable dado que se adquiere un control sobre la cantidad de Monoterpénos requeridos en el aceite esencial, aunque nunca podrán eliminarse completamente.

La naranja amarga o agria del Sureste de México (Yucatán, Quintana Roo y Campeche) puede emplearse en la recuperación de los monoterpenosa-Pinéno y D-Limonéno, que son los identificados mediante el análisis, y cuyas cantidades son apreciables con respecto a algunos otros compuestos también identificados, como citral, citronelol y terpineol.

La naranja dulce que llega al D.F. tiene un alto contenido de citral con respecto a lo reportado para la naranja de Valencia. Este compuesto contribuye a elevar la calidad de un aceite esencial desterpenado por ser muy aromático, de olor agradable.

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VI. REFERENCIAS BlBLlOGRAFlCAS

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Compuesto

E -~ COV ISE cov

Tiempo de retención Tiempo de retención absoluto (min) relativo

S

,Acetato de Geranílo 6.05 2.05 2.45 2.97 Linalol 3.1 7 1.02 1.28 1.48

1 .o0 2.45

3.57 2.36 5.1 7 _ _

I erpineol I _

a- Pinéno 1.63 0.57 0.6 - . - -

83

6 0.83

79 2.01 12.75 2.91 I Citral

Citronelol Alcohol decílico - . - .

73 1.76 11.51 2.55 1 66 1.93 11.89 3.80 I

33