/i AISLAMIENTO DE ACIDOS NUCLEICOS A PARTIR DE GELES DE

AGAROSA ' /

Guadalupe Yunuén I

M. C. Humberto Doctora J u l i e t t e Morlon-fitgot

U. N. A. M.

INSTITUTO DE INVESTIGAC;JONES , t BIOMEDICAS

1992

d ;j 3 8 p 3

AISLAMIENTO DE ACIDOS NUCLEICOS A PARTIR DE GELES DE AGAROSA

INTRODUCCION

Uno de los pasos limitantes dentro de las técnicas del DNA

recombinante, es la recuperación del DNA deseado después de haber

sido electroluido. Dentro de las diversas técnicas que existen

para recuperar el material genético se pueden mencionar las

siguientes:

a) Fijación de DNA a un soporte inerte

b) Electroelucidn

La fijación del DNA a un soporte inerte, consiste en que el

DNA sea extraido de la agarosa y adherido a un soporte inerte,

para su posterior recuperación por medio de gradientes de

concentración.

La segunda ha sido más ampliamente desarrollada, pués la

creación de soportes inertes eficaces para la fijación y

posterior elución del DNA ha sido lenta. La electroelución es una

tecnica que se basa en la migracidn del DNA por acción de un

campo eléctrico y su recuperación por medio de una barrera

ffsica, ya sea de una solucibn salina de alta concentración o

bien de una membrana semipermeable.

En la actualidad se han disenado diferentes aparatos para

electroeluir. Los cuales presentan diferencias en su manejo,

eficiencia de recuperaci611, tiempo 6ptimo de recuperacibn, y

cantidad del material genético recuperado, voltaje máximo de

trabajo y concentraci6n de soluciones amortiguadoras. Además,

las caracterfsticas propias del material genético (tamano,

estructura secundaria y concentraci6n) modifican las condiciones

6ptimas de electroeluci6n.

OBJETIVOS GENERALES

Determinar las condiciones 6ptimas de electroeluci6n para

moleculas de diferente peso molecular en la camara de

electroeluci6n Biometra.

OBJETIVOS ESPECIFICOS

- Determinar los tiempos 6ptimos de electroeluci6n de los plásmidos completos: pUC9, pGK12, pLP825, pSA3 y pJ07.

- Determinar los tiempos áptimos de electroelucibn de

fragmentos de DNA de diferente peso molecular.

Ambas condiciones se realizarán en la camara de

electroeluci6n Biometra.

METODOLOGIA UTILIZADA

Se obtuvieron los pldsmidos completos pUC9, pGK12, pLP825,

pSA3 y pJ07, segan la siguiente técnica:

1. Inocular 250ml del medio apropiado, con el antibiotic0

necesario en el caso de los pldsmidos que confieran resistencia a

alguno.

2. Cosechar y lavar dos veces con STE 1X (lavar con lOOml de

STE lX, centrifugar 10 min. a 6000 rpm).

3. Resuspender el botón en 20 ml de 25mM TRIS-C1-5OmM EDTA

pH 8, y lmg/ml de lizosima, adicionada justo antes de usarse,

incubar 5min. en hielo.

4 . Adicionar 4 0 ml. de 0.2N de NaOH - 1% SDS, agitar por

inversion e incubar en hielo 10 min.

5. Adicionar 30ml de acetato de potacio 5M - 3M de ácido

acético. Mezclar por inversión e incubar en hielo 10 min,

centrifugar 15 min a 10 O00 rpm y colectar el sobrenadante en un

frasco limpio.

6. Agregar al sobrenadante 0 .6 volumenes de isopropanol,

10- incubar a temperatura ambiente 2 min. y centrifugar 10 min a

O00 rpm, descartar el sobrenadante.

7. Disolver el bot6n en 5 ml de TE8 y agregar posteriormente

2.5 ml de de acetato de amonio '7.5M, incubar 20 minutos en hielo.

8 . Centrifigar 15 min a 10 O 0 0 rpm y colectar el

sobrenadante en un tubo limp:io, adicionando a este 15 ml de

etanol absoluto, mezclar e incubar 2 min a temperatura ambiente.

9 . Centrifugar 15 min a 10 O00 rpm, descartar el

sobrenadante, secar al vacfo durante 10 min, disolver el both en

750ul de TE8, pasar a un tubo Eppendorf de 1.5 ml y adicionar 15

u1 de masa lmg/ml e incubar 1 hora a 65 C.

10. Extraer tres veces con una mezcla de un 1 volumen de

fenol y un volumen de la mezcla cd cloroformo-alcohol isoamilico

24:1, una vez más con un volumen igual de cloroformo isoamilico y

una vez con ether.

11. Adicionar 1/10 volumenes de acetato de sodio 3M pH 5.2,

2.5 volumenes de etanol absoluto y precipitar toda la noche a

20c.

12. Centrifugar 15 min a 14000 rpm, desechar el sobrenadante

y resuspender el botón en 1 mñ de etanol al 70%, centrifugar

desechar el sobrenadante y secar el bot6n al vado durante 10

min.

13. Resuspender el botón en 100 a 1000 u1 de TE8,

dependiendo de la cantidad de DNA obtenido.

Una vez obtenidos los plásmidos a estudiar se, procedi6 a su identificación cualitativa haciendo una electroforesis en un gel

de agarosa al 0 . 8 % , tenido con bromuro de etidio. (Fig. 1)

Para obtener los fragmentos de DNA de diferente peso

molecular se trabajá con el fago Lambda cortado con las enzimas

de restricción EcoRI y HindIII, obteniendose fragmentos de peso

molecular variado. (Fig. 1)

Una vez selecionados los plásmidos completos asf como los

fragmentos de DNA de diferente peso molecular, se procedió a

recortar la zona del gel de electroforesis en que se encontró el

material genético deseado. Para los plásmidos completos se

seleccióno unicamente la region de la forma monom4rica y para los

fragmentos del fago Lambda se seleccionaron secuencias de

diferente peso molecular (Fig.1).

Electroeluci6n de ácidos nucleicos a partir de geles de

agarosa o acrilamida.

Soluciones:

Buffer de electroelucián TBE 0.5X

Buffer de alta concentraccl6n Acetato de sodio 3M

Procedimiento:

1. Llenar el aparato can el buffer de electroeluci6n

(capacidad total de la camara 4 4 0 mi) justo arriba de las tres

aberturas de cada celda dejando la válvula central abierta.

2. Asegurarse de que el buffer este en el mismo nivel para

todos los reservorios, cerrar la vdlvula central y asegurarse de

no tener burbujas de aire en los canales en l%ll.

3. Cortar las piezas de gel (tamano máximo 0.5 cm) y colocar

una muestra por cada celda.

4 . Con una micropipeta colocar en el fondo de los canales en

llvll 50 u1 de el buffer de alta concentraci6n.

5. Tapar la camara y electroluir a un voltaje de 100 V por

tiempos variables de 30 a 60 min.

6. Abrir la camara y la válvula central para poder quitar el

exceso de buffer, hasta dejar libres las celdas.

7 . Recuperar con cuidado el. material genético de los canales

en I1vt1 con la ayuda de una jeringa.

8 . El volumen recuperado, llevarlo a un volumen de 200 u1

de acetato de sodio 3M pH 5 y 2.5 volumenes de etanol.

9. Centrifugar 15 min a 14 O00 rpm, desechar el sobrenadante

y lavar el both con etanol al 7 0 % , centrifugar 15 min a 14,000

rpm desechar el sobrenadante y secar al vacfo.

10. Resuspender en 5 a 10 u1 dependiendo del DNA obtenido.

11. Hacer una electroforesis con del DNA obtenido y comparar

con la cantidad inicial.

ACTIVIDADES REALIZADAS

Las actividades realizadas fueron:

- Preparación de los plásmidos completos a utilizar,

mediante la técnica antes mencionada.

- Forma correcta de uso de la camara de electroeluci6n

Biometra.

- Electroeluci6n de plásmidos completos y fragmentos de

material genético de diferente peso molecular en la camara de

electroeluci6n Biometra.

- Electroelución a diferentes tiempos para determinar el

tiempo 6ptimo de electroeluci6n, para material genético de

diferente peso molecular.

- Cuantificar el material genético recuperado en un gel de

electroforesis de agarosa al 0 . 8 %

OBJETIVOS Y METAS ALCANZADAS

Al finalizar el presente trabajo se determinaron las

condiciones áptimas de electroelucián (tiempo) para fragmentos de

DNA de diferente peso molecular y algunos plásmidos completos en

la camara de electroelucián Biometra.

RESULTADOS Y DISCUSION

Los diferentes perfiles de los plásmidos utilizados se

muestran en la fig. 1 en cual se observa el marcador de peso

molecular utilizado asf como los diferentes vectores de clonaci6n

que fueron utilizados en el presente trabajo, los tamanos en Kpb

de los plásmidos se pueden observar en la tabla 1.

Despues de haber realizado diferentes tiempos de

electroeluci6n para el plásmido pUC9 se lleg6 a la conclusi6n de

que, a 20 min el rendimiento de recuperacián era muy bueno, a 30

min el rendimiento de recuperaci6n era superior al de 20 min, el

rendimiento de 45 min disminufa y el de 60 min era nulo. Por lo

que podemos decir que el tiempo 6ptimo de recuperaci6n para pUC9

es de 30 min; todo parece indicar que la barrera salina no es

lo suficientemente fuerte para impedir el paso del material y el

DNA de bajo peso molecular puede atravezar esta barrera salina

por un tiempo prolongado de flujo en un campo electric0 (Fig.2),

perdiendo asi el material genetic0 de bajo peso molecular.

De igual manera se realizaron los tiempos 6ptimos de

electroelucidn para los vectores pGK12 y pLP825 observandose que

el tiempo de recuperacibn 6ptimo variaba dependiendo del tamano

del fragmento de material genetic0 que se utilice, para el pGK12

el tiempo 6ptimo de recuperaci6n es de 40 min, a menor tiempo la

cantidad recuperada es minima y a mayor tiempo se comienza a peder el DNA. Sin embargo para el pLP825 el tiempo 6ptimo de

recuperaci6n es de 60 min, este vector es grande y por una

electroelucion mayor de 60 min el fragmento de agarosa comienza a

migrar hacia el canal en V dificultando asi la recuperaci6n del

material gen&ico.(Fig. 3)

Para l o s plasmidos de un peso molecular mayor a 10 Kpb el

rendimiento es nulo, aún cuando se disminuya el voltaje y se

prolonge el tiempo de exposicibn, tal es el caso de los plasmidos

pSA3 y pJ07. (Fig.4)

Para los fragamentos de DNA se observa que a menor tamano,

menor es el tiempo de electroelucibn.(Fig. 5)

En las tablas 1 y 2 podemos apreciar cual es el tiempo

6ptimo de recuperation para material genetic0 de diferente peso

molecular.

Tabla 1. Tamario y tiempo de electroeluci6n de plásmidos

completos en la camara de electroeluci6n Biometra.

plásmidos utilizados Kpb Rendimiento de recuperaci6n

completos 20' 30' 40' 60'

( min )

pJ07

pSA3

pLP825

pGK12

puc9

donde :

11.5 -

10.2 -

7 . 2 -

4 . 4 -

2 . 6 +

-

++

++ +

- +

- rendimiento nulo

+ bajo rendimeinto

++ buen rendimiento

Tabla 2. Tamartos de los frapentos de DNA utilizados y tiempo de recuperaci6n en electroeluci6n de la camara Biometra.

EcoRI + Hind111 Kpb Rendimiento de recuperaci6n fragmentos 20’ 30‘ 45’ 60’

( min )

1 4.2 + +++ ++ +

2 2 + +++ ++ +

3 1.9 + +++ ++ +

4 1.5 ++ +++ ++ +

5

6

- 0.831 +++ ++ +

- 0.564 +++ ++ +

- rendimiento nulo

+ bajo rendimeinto

++ rendimiento medio

+++ buen rendimiento.

+

J

Figura 1. Plásmidos utilizados en este trabajo. 1. Lambda/Eco RI +Hind 111; 2. pUC9 2.6 kpb; 3. pGK12, 4.4kpb; 4. pLP825, 7.2kpb; 5. pSA3, 10.2kpb; 6. pJ07, 11.5kpb.

Figura 2. Rendimientos de electroelución de pUC9 en la cdmara biometra. Carriles: 1. Lambda/Eco RI +Hind 111; 2. pUC9 control: 3. 20 minutos de electroelución : 4. 30 minutos de electroelución,' 5. 45 minutos de electroelución.

. .- I

Figura 3, Rendimiento de electroelucidn de los pltsmjdos pGK12 y pLP825. Carriles: 1, pGKl2 control: 2, 20. mfnutos de electroeluci8n; 3. 30 min de electroelucidn; 4, 45 min de electroelucifin; 5, 60 min de electroelucTÓn; 6. Lambda ECO

RI + Hind 1 1 1 ; 7. pLp825 control; 8. 2U minutos de electroe lución; 9. 45 minutos de electroeluci6n; 12. 60 minutos de electroeluci8n.

Figura 4. Rendimientos de electroelución para pSA3 y pJ07. Carriles: 1. Lambda Eco Ri + Hind 111; 2. pSA3 control; 2.1 al 2 .4 20, 30, 45 y 60 minutos de electroelución respectivamente; 3. pJ07 con - t ro l ; 3.1 al 3.4 20, 30, 45 y 60 minutos de electroelución res pe c t i v amen te .

- -

F i g u r a 5. Electroelución de los fragmentos de DNA del f a g o Lambda cortado con las enzimas de restricción Eco RI y - Hind 111.

CONCLUSIONES

- El tamalno del material genético es lo que realmente

determina cual será el tiempo necesario para que este sea

recuperado de un gel de agarosa en la camara de electroelucidn

Biometra.

- Un factor determinante es la cantidad de gel de agarosa

extra la cual retarda la migraci6n del material genético.

- La ventaja mayor del uso de a camara de electroeluci6n

Biometra es que concentra el material en un volumen menor al

uitlizado en la bolsas de diálisis, disminuyendo asf la

probabilidad de perdida de este.

- Las condiciones antes mencionadas solo son válidas para la camara de electroeluci6n Biometra.

RECOMENDACIONES

En muchas ocasiones al adquirir algún aparato y al momento

de leer las instrucciones de uso no viene especificado que podrfa

haber variaciones de uso, por lo que al utilizarla el rendimiento

es nulo o muy bajo, s610 realizando variantes en algunos puntos

nos podemos dar cuenta que la técnica que se esta utilizando no

es válida para todo, que hay sus exepciones y lo más importante

es poder encontrara cual o cuales son los puntos que nos permiten

utilizarla de la mejor forma para obtener mejor resultado en el

trabajo de laboratorio.

BIBLIOGRAFIA

- Manual de uso de la camara de electroeluci6n Biometra 1989.

- Molecular Cloning A laboratory manual

Maniatis, Fristch and Sambrock

1991