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IDENTIFICACION DE FIBRINOGENO Y FIBRINA

TM PATRICIA TOLEDO RODRIGUEZ

• El depósito de fibrinógeno puede iniciar la aterogénesis y puede contribuir al crecimiento de las plaquetas

• Muchas lesiones ateroscleróticas tienen grandes cantidades de fibrina en forma de trombos murales en la superficie de las placas, en capas dentro de la cápsula fibrosa

TEJIDO MUSCULAR

TM PATRICIA TOLEDO RODRIGUEZ

HISTOLOGIA NORMAL.

TEJIDO MUSCULAR LISO

TEJIDO ESTRIADO ESQUELETICO

TEJIDO MUSCULAR CARDIACO

T. Muscular Cardiaco

TUMORES MUSCULARES

TUMORES MUSCULARES

TUMORES MUSCULARES

SARCOMA

TENDON

HEMATOXILINA EOSINA

M . CARDIACO

HEMATOXILINA EOSINA

HEMATOXILINA EOSINA

HEMATOXILINA EOSINA

BIOPSIA MUSCULAR

• Hay dos tipos de biopsia de músculo:

1 Una biopsia por punción implica insertar una aguja dentro del músculo.

2 Una biopsia abierta implica hacer una pequeña incisión en la piel y dentro del músculo. Luego, se retira el tejido muscular.

BIOPSIA MUSCULAR

• Enfermedades del tejido conectivo y de los vasos sanguíneos (como la poliarteritis nodosa)

• Infecciones que afectan los músculos (como la triquinosis o la toxoplasmosis)

• Trastornos musculares como distrofia muscular o miopatía congénita

• Defectos metabólicos del músculo

• Una biopsia de músculo también se puede hacer para diferenciar entre trastornos nerviosos y musculares

• Atrofia (pérdida de masa muscular)

• Dermatomiositis

• Distrofia muscular de Duchenne

• Inflamación del músculo

• Distrofia muscular

• Cambios miopáticos (destrucción del músculo)

• Necrosis (muerte tisular) del músculo

• Vasculitis necrosante

• Daño muscular traumático

• Polimiositis

• Distrofia muscular de Becker

• Enfermedad de Charcot-Marie-Tooth (hereditaria)

• Disfunción del nervio peroneo común

• Fascitis eosinofílica

• Distrofia muscular fascioescapulohumeral

• (Landouze-Dejerine)

• Parálisis periódica familiar

DISTROFIA MUSCULAR

POLIMIOSITIS

GENERALIDADES DE TRICROMICOS

• Para identificar fibras colágenas principalmente.

• Utiliza colorante nuclear + 2 colorantes aniónicos + HPA

GENERALIDADES DE TRICROMICOS

• Los HPA tienen la capacidad de unirse a proteínas y aminiácidos pero no a Hidratos de Carbono, de manera que el HPA usado se une a la fibra colágena, de hecho algunos autores

denominan a los “HPA colorantes

aniónicos sin color”

TRICROMICO NUCLEAR ANIONICO

COLAGENO

ANIONICO

CITOPLASMA

HPA

T. VAN GIESON H. FERRICA FUCSINA ACIDA ACIDO PICRICO -TAMAÑO

T. AZAN DE HAINDENHEIN

AZOCARMIN AZUL DE ANILINA

ORANGE G PTA

T. MASSON H. FERRICA AZUL DE ANILINA

PONCEAU 2R O BIEBRICH SCARLETT

PTA Y PMA

T. MALLORY FUCSINA BASICA/H PTA

AZUL DE ANILINA

ORANGE G PTA

T. GOMORI H. DE GOMORI FAST GREEN CROMOTROPO 2R

PTA

HEMATOXILINA PTHA O HEMATOXILINA

FOSFOTUNGTICA DE MALLORY

Este método fue introducido por Mallory en el año 1900 para colorear selectivamente las estriaciones musculares, la fibrina y algunas estructuras del sistema nervioso central. A pesar de la antigüedad de la técnica aún no se ha descubierto el mecanismo químico de su funcionamiento, del cual resulta una tinción diferencial polícroma entre las dos estructuras.

HEMATOXILINA FOSFOTUNGTICA

DE MALLORY

• Consiste en la reacción entre la hemateínay el ácido fosfotúngstico, produciendo una solución ácida fuerte que contiene tanto iones azules (más estables) como rojos. El ácido fosfotungtico actúa como colorante ácido, interactúa con la fibrina y dado su pequeño tamaño queda atrapado por la malla de fibrina.

HEMATOXILINA FOSFOTUNGTICA DE

MALLORY

– 1 g de hematoxilina

– 20 g de ácido fosfotúngstico

– 1 litro de agua destilada

• Disolver la Hematoxilina en al agua destilada con ayuda de calor. Enfriar y agregar ácido fosfotungtico disuelto en agua destilada. Agregar 0,2 g de permanganato de potasio. El colorante puede ser utilizado de inmediato, pero ideal esperar 2 semanas


DE MALLORY

• Permanganato potásico 0,25%.

• Ácido oxálico 5%.


DE MALLORY

• PROCEDIMIENTO

• Desparafinar e hidratar.

• Oxidar con permanganato potásico 0,25%, 5 minutos.

• Lavar con agua destilada

• Aclarar con ácido oxálico hasta eliminar el color


DE MALLORY

• Teñir con hematoxilina ácida fosfotúngstica durante toda la noche a temperatura ambiente o 90 minutos a 60°c.

• Deshidratar rápido, aclarar y montar.

• Notas: la deshidratación debe ser rápida, ya que tanto el agua como el alcohol pueden eliminar la tinción.


DE MALLORY

• SI SE OPTA CON CALENTAR LA MEZCLA DE COLORANTES, ESTA NO PUEDE

VOLVER A SER USADA.


DE MALLORY

• Resultados

• Estriaciones musculares, fibras de neuroglía: azul oscuro.

• Fibrina: azul oscuro.

• Núcleos: azul.

• Mielina: azul claro.

• Colágeno, osteoide, cartílago, fibras elásticas: marrón oscuro/rojo.

• Citoplasmas: marrón rosáceo pálido.


DE MALLORY


DE MALLORY


DE MALLORY

MUSCULO CARDIADO


DE MALLORY

MUSCULO CARDIACO

TRICROMICO DE GOMORI

• Es un método idóneo para teñir fibrina, tejido muscular y citoplasmas, donde destaca esencialmente el condrioma como un fino granulado rojizo. Sin embargo, por su pH ácido, que se encuentra entre 2.5 y 2.7 (ligeramente por encima del óptimo para la tinción del colágeno), se presenta como una tinción incompleta y difusa del componente fibrilar más fino (membrana basal y finas fibras reticulares).


• Fundamento

• Esta técnica combina un colorante plasmático (cromotropo 2R) y un colorante de fibras conectivas (verde luz/azul de anilina) en una solución de ácido fosfotúngstico y ácido acético glacial. El tratamiento previo de las secciones con solución de Bouin caliente intensifica la tinción.


• El ácido fosfotúngstico favorece la coloración roja de músculo y citoplasmas. Las fibras de colágeno toman los iones de tungstato formando un complejo al que se une el verde luz. El baño de ácido acético hace los colores más trasparentes pero no altera el balance de color.


• Solución de Bouin: tras la fijación, se debe lavar la muestra en abundante alcohol de 70ºhasta la decoloración de la misma para asegurar la total eliminación del ácido pícrico. Una vez fijado se puede almacenar el tejido en etanol de 80º.


• Solución tricrómica:

– 0,6 g de cromotropo 2R.

– 0,3 g Verde luz

– 1 cc de ácido acético glacial.

– 100 cc de agua destilada.

– 0,8 g de ácido fosfotúngstico


• Solución verde luz (el verde luz puede ser sustituido por el azul de anilina):

– 5 g de verde luz.


– 2 cc de ácido acético.

• Solución acuosa de ácido acético al 0,5%.


• Solución diaria de hematoxilina férrica de Weigert:

• Solución matriz A:

– 1,0 g de hematoxilina de Weigert en 100 ml de etanol al 95%.

• Solución matriz B:

– 4,0 g de cloruro férrico al 29%.

– 95 ml de agua destilada.

– 1 ml de ácido clorhídrico concentrado.


• Se deben utilizar a partes iguales cada una de las soluciones matrices. La solución diaria de la hematoxilina de Weigert puede reutilizarse durante aproximadamente 2 semanas. La hematoxilina de Weigert puede ser sustituida por la hematoxilina de cromo de Gomori.

PROCEDIMIENTO

• Desparafinar e hidratar.

• Realizar mordentaje en líquido de Bouin durante 1 hora a 56 ºC o 24 horas a Tªambiente.

• Lavar en agua destilada hasta que desaparezca el color amarillo.

• Teñir con hematoxilina de Weigert (ver variantes) durante 10-13 minutos.

• Realizar un lavado prolongado con agua corriente.

• Teñir con la solución tricrómica durante 15 minutos.

• Diferenciar en la solución de ácido acético al 0,5% durante 15 s (se puede utilizar también ácido acético al 1%)

• Si las secciones son muy rojas, se diferenciarácon una solución de ácido acético al 1%, a la cual se le agregarán 0,7 gr de ácido fosfotungstico.

• Lavar en agua destilada.

• Teñir con la solución de verde luz durante 20 o 30 s (ver variantes).

• Deshidratar con alcoholes, aclarar con xileno y montar.

• Análisis de resultados

• Fibras musculares, fibrina y citoplasma: rojo.

• Colágeno, cartílago, mucinas y membrana basales: verde.

• Núcleos: azul negruzco.

• Variaciones aplicables

• La solución acuosa de ácido acético al 0,5% puede ser sustituida por una solución de ácido acético glacial al 1%.

• La solución de verde luz puede ser sustituida por azul de anilina; el colágeno, el cartílago, las mucinas y las membranas basales serán azules en vez de verdes.

• La hematoxilina férrica de Weigert puede ser sustituida por la hematoxilina cromo de Gomori, e incluso, se puede suprimir el paso de la coloración con hematoxilina; si se hace esto los núcleos quedarán igualmente teñidos de azul negruzco pero menos intenso que si se tiñe con hematoxilina.

• Posibles problemas

• El resultado de la tinción es demasiado

pálido

• Si el colágeno no se tiñe de azul pálido pero síen un tono rojo, reducir el tiempo en el aclarado ácido (paso 7).

La tinción es de un color

inesperado

• Si tiene un tono amarillento, comprobar si se ha utilizado fijador Bouin. En este caso, lavar las secciones hidratadas con agua corriente para eliminar el ácido pícrico residual. El balance de color es alterado por la acidez de la tinción. Si el resultado es muy rojo, comprobar que el pH sea 2 o menor. Si es necesario, acidificar con ácido clorhídrico (0,1 M). Si el balance de color es alterado por los tiempos prolongados de tinción, reducir los tiempos. El balance de color es alterado por la concentración del colorante

• Resultado inusual de la tinción

• Ciertas patologías alteran el colágeno (quemaduras) por lo que puede teñirse de rojo en vez de azul. Si las fibras de colágeno o la lámina basal aparecen difuminadas, incrementar la acidez del colorante añadiendo ácido clorhídrico al 1%.


METODO DE HEMATOXILINA DE

HEINDENHEIN

• Fijación: Formol, Bouin o cualquier otro

buen fijador citológico


HEINDENHEIN

• Soluciones:

• Alumbre Férrico al 5%

• Alumbre Férrico al 1 o 2 %

• Hematoxilina de Heindehein:

• 10 g de Hematoxilina, 100 ml de alcohol 95%, completar con 900 ml de agua destilada. Dejar madurar por 1 mes antes de usar.


HEINDENHEIN

• Desparafinar e hidratar hasta agua destilada.

• Mordentar en Alumbre Férrico al 5% recién preparada por 24 horas a T. ambiente

• Lavar en agua corriente

• Colorear con la Hematoxilina de Heindehein por 24 horas.

• Diferenciar en Alumbre Férrico al al 1-2% controlando al microscópio

• Deshidratar, aclarar y montar


HEINDENHEIN

• Resultados:

• Núcleos.: negros

• Estriaciones fibras musculares: negras

TRICROMICO DE MASSON

• Primero se tiñen los cortes con un colorante ácido tal como escarlata de Biebrich. Todos los elementos acidófilos del tejido tales como el citoplasma el músculo y el colágeno se unirán a los tintes ácidos. Los cortes entonces se tratan con ácido fosfotúngstico y/o fosfomolíbdico. Ya que el citoplasma es mucho menos permeable que el colágeno, los ácidos fosfotúngsticos y fosfomolíbdicos permiten que la escarlata de Biebrich difunda del colágeno pero no del citoplasma


• Los ácidos fosfotúngsticos y fosfomolíbdicos tienen numerosos grupos ácidos que probablemente actúen como medio de unión entre el colágeno y el azul de la anilina, que es el tinte del colágeno. Probablemente, el pH de la solución fosfotúngstico/fosfomolíbdico también aumente la coloración y ayude al colágeno en la difusión o el retiro de los colorantes

• Solución de hematoxilina férrica de Weigert.

• Solución de escarlata de Biebrich – fucsina ácida:

– 90 cc de escarlata de Biebrich al 1% en agua destilada

– 9 cc de fucsina ácida al 1% en solución acuosa.


• Solución acuosa de ácido fosfomolíbdico

• (utilizar ácido fosfotúngstico en la misma proporción, si se va a teñir con verde luz):

– 5 g de ácido fosfomolíbdico.


• Solución de azul de anilina:

– 2,5 g de azul de anilina.



• Solución de verde luz al 2% (alternativa al azul):

– 2 g de verde luz SF amarillento.


– 1 cc de ácido acético glacial

• Solución diferenciadora: solución acuosa de ácido acético glacial al 1%.

• Procedimiento

• Desparafinar e hidratar hasta el agua destilada de manera habitual.

• En material fijado en soluciones de formaldehído o alcohólicas se recomienda hacer un mordentaje previo con líquido de Bouin durante 1 hora a 56-60 ºC o toda la noche a temperatura ambiente.

• Enfriar y lavar en agua destilada hasta que desaparezca el color amarillo.

• Teñir con hematoxilina férrica durante 10 minutos. Lavar en agua corriente durante 10 minutos

• Lavar en agua destilada

• Teñir con la solución de escarlata-fucsina ácida durante 2-5 minutos.


• Tratar con la solución de ácido fosfomolíbdico-fosfotúngstico durante 10-15 minutos si se va a colorear con la solución de azul de anilina, o en la solución acuosa de ácido fosfotúngstico al 5% durante 15 minutos si se desea teñir con verde luz.

• Teñir con solución de azul de anilina 15 minutos o con solución de verde luz 5 minutos.


• Diferenciar en la solución de ácido acético al 1% durante 3-5 minutos.

• Deshidratar, aclarar y montar.

• Análisis de resultados

• Fibras de colágeno = Azul.

• Por tanto, el tejido conjuntivo se teñirá de dicho color.

• Estructuras oxidadas + Citoplasma = Rojo.

• Se teñirán de rojo la queratina, los glóbulos rojos y el tejido muscular.

• Núcleo celular = Lila, marrón


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