IMPREGNACIONES ARGENTICAS -...

IMPREGNACIONES ARGENTICAS

TM PATRICIA TOLEDO RODRIGUEZ

Qué son?

Solución salina de sal metálica y la precipitación

del metal (plata, oro o cromo) reducida

fibras reticulares y otros elementos

determinados de los tejidos.

la reducción de la solución es debida en

parte a la acción propia del tejido y a la

de sustancias reductoras utilizadas en

cada técnica o a agentes físicos como la

luz.

• El metal forma un compuesto metal-orgánico

para sensibilizar el tejido y luego la plata

reemplaza ese metal. La plata amoniacal es la

que impregna las fibras reticulares. Ese metal

sensibilizante puede:

• nitrato de uranilo (Técnica de Wilder)

• nitrato de plata diluida (Técnica de Gridley)

• aluminio férrico (Técnica de Gomori)

Recomendaciones

• Portaobjetos: éstos deben ser silanizados,

pues las soluciones de plata suelen ser

alcalinas lo que favorece el desprendimiento

de los cortes.

• No utilizar pinzas metálicas (tipo pato para

manipular las láminas), pues al contacto con

metal la plata se reduce.

• Usar reactivos pro análisis

• Usar agua destilada de buena calidad. La

calidad del agua se chequea agregando un

grano de plata al agua, si se vuelve lechosa

desecharla.

• Lavado de material de vidrio acucioso.

• Para la utilización de reactivos como el

amoníaco, hacerlo siempre bajo campana, no

pipetear ácidos ni bases fuertes.

• Para las soluciones amoniacales eliminar

INMEDIATAMENTE aquellas donde se ha

formado un cristal negro brillante.

• Mantener las soluciones de plata simples en

frascos ambar, bien tapados y rotulados a 4°c

• Evitar luz directa en soluciones y polvos de

plata.

• Eliminar soluciones de plata precipitadas

• La impregnación argéntica se basa en la

interacción de determinadas estructuras

del tejido con los iones Ag+ y la

capacidad de éstas estructuras de

formar puntos de nucleación de Ag°

metálica.

MECANISMOS

1.- Predominantemente físicos y físico –

químicos

mecanismo puro de impregnación

mecanismo electroestático iones de plata

cargados + = argirofilia

2.- Impregnación por mecanismos

histoquímicos.

PROTOCOLOS

• Impregnación argéntica en dos pasos

• Impregnación argéntica en un paso

Un Paso

• Nitrato de plata

• Reducción con hidroquinona brusca

• Las técnicas de Bodian para neurifibrillas y la

de Grimelius para argirofilia son

impregnaciones argénticas de un tiempo.

Dos pasos

• 1ra reducción Nitrato de plata a oxido de

plata.

• Impregnación del tejido con solución de

impregnación

• Reducción con formalina

Dos Pasos

1. Impregnación primaria:

Solución de nitrato de plata (plata amoniacal,

diamina de plata, proteinato de plata), la Ag

es captada por ciertos tejidos, donde se

forman puntos de nucleación de la plata.

Dos pasos

• 2.- Impregnación secundaria:

• Se coloca un agente reductor, puntos de

nucleación se genera Ag°

• Hidroquinona

• formalina

Pasos

• 1.- Mordentación: Bouin. Oxidación

• 2.- Blanqueamiento: ác. Oxálico, Metabisulfito

• 3.- Impregnación: de 1 / 2 tiempos

• 4.- Reducción: 1 tiempo hidroquinona

2 tiempos formalina

• 5.- Contraste: cloruro de oro

• Fijación: tiosulfato

Estructuras Argentafines

• La capacidad de algunas estructuras de

precipitar la plata metálica en un paso único

sin necesidad de agentes reductores externos

se denomina argentafinidad.

• Son argentafines la melanina y algunas células

endocrinas (granulaciones entero dromafines)

.

Argentafines

• El mecanismo preciso que desencadena esta

reacción no está del todo claro, pero parece

depender de la presencia de 5-

hidroxitriptamina la que es convertida a

terahidro-4-carbonila por el formol. Todas las

estructuras argentafines son argirófilas, pero

no al revés Se demuestran con tinciones como

Masson- Fontana.

Estructuras Argirofilas

• La capacidad de atraer iones plata e

impregnarse con plata metálica en los

protocolos se denomina argirofilia. Estos iones

plata atraídos al tejido son posteriomente

precipitados a plata metálica por reductores

externos (hidroquinona por ejemplo).

• Se demuestran en tinciónes de Bielchowsky,

Sevier-Munger y Grimelius

METODO DE GOMORI PARA

FIBRAS RETICULARES

Es una técnica de dos tiempos.

Oxidante: permanganato de potasio

Blanqueamiento: metabisulfito de potasio

Mordentador: alumbre férrico

Reductor: formol

Plata: plata amoniacal

Fijador: hiposulfito de sodio

• El permanganato oxida grupos HO de la fibra

reticular a CHO, y éstos son argirofilos a la

plata se fija la plata por ADORCION

.-


FIBRAS RETICULARES

• Permanganato de potasio 1% acuoso

• Metabisulfito de potasio 2% acuoso

• Alumbre férrico acuoso 2% (preparar antes de

usar)

• Formalina 10%

• Hiposulfito de sodio acuoso al 2%

.-


FIBRAS RETICULARES

• Plata amoniacal. Se toman 10 ml de nitrato de

plata al 10%, se añaden 2 ml de hidróxido de

potasio al 10%, se debe formar un precipitado

el que se disuelve agregando gota a gota

amoniaco puro, agitar permanentemente y

bajo campana; después de añade unas gotas

de nitrato de plata hasta que empiece a

formarse un nuevo precipitado, diluir al doble

con agua destilada.

Platas Amoniacales

• Las platas amoniacales se descompone

generando vapores altamente

explosivos. Tener extremo cuidado con el

manejo y eliminación de cristales de

plata generados.


FIBRAS RETICULARES

• PROTOCOLO

• Desparafinar e hidratar hasta agua destilada

• Oxidar durante 1 a 2 min con permanganato

• Lavar con agua corriente

• Blanquear con metabisulfito

• Lavar con abundante agua corriente

• Tratar con alumbre por 1 minuto

• Lavar con agua corriente 5 min


FIBRAS RETICULARES

• Lavar con agua destilada 2 veces

• Tratar por 1 minuto con plata amoniacal

• Lavar con agua destilada 10 segundos

• Reducir con formol


• Hiposulfito algunos segundos


• Deshidratar, aclarar y montar


FIBRAS RETICULARES

• RESULTADOS

• Fibras reticulares negras

• Fibras colágenas y fondo amarillo

METODO DE GORDON SWEET

PARA FIBRAS RETICULARES

• Impregnación argéntica en dos tiempos.

• Reductor: formol

• Blanqueamiento: acido oxálico

• Contraste: cloruro de oro.

• Plata: plata amoniacal

• Oxidante: permanganato

• Fijador: tiosulfato

• Mordentador: alumbre de hierro



• SOLUCIONES

• 1.- Baño argéntico de Wilder.

• -nitrato de plata 1% acuoso

• -hidróxido de sodio 3% acuoso

• Se toman 5 ml de nitrato de plata; añadir gota a gota

amoniaco puro hasta que desaparezca el precipitado

formado; agragar 5 ml de hidróxido (se forma un

nuevo precipitado) y volver a agregar amoniaco puro

gota a gota hasta disolver el precipitado, completar

hasta 50 ml con agua destilada.



• Cloruro de oro 0,02gra en 10 ml de agua

destilada.

• Acido oxálico 5% acuoso

• Alumbre de hierro 2% acuoso

• Tiosulfato de sodio 5% acuoso

• Mezclar 47,5 ml de permanganato de potasio

al 5% acuoso con 2,5 ml de ácido sulfúrico 3%

acuoso.

• Formalina 10%



• PROTOCOLO


• Oxidar por 5 min

• Lavar con agua destilada

• Blanquear por 1 min

• Lavar en tres cambios de agua destilada

• Tratar con mordiente por 30 min



• Lavar en dos cambios de agua destilada

• Solución de plata durante algunos segundos

• Lavar en agua destilada

• Reducir con Formalina 10 min

• Lavar en agua

• Cloruro de oro 5 min


• Fijar con hiposulfito

• Agua destilada, Deshidratar, aclarar y montar

• Si quedan débilmente teñidas, repetir desde 7



• RESULTADOS

• Fibras reticulares negras azuladas

• Resto sin teñir

Gordon Sweet

TECNICA DE MASSON FONTANA

PARA ARGENTAFINIDAD

Impregnación argéntica en dos tiempo.

El amoniaco realiza la primera reducción el nitrato de

plata a óxido diamino argéntico y el tejido la

segunda, precipitando la plata metálica sobre las

granulaciones con capacidad reductora.

•

• La principal dificultad de la técnica se

encuentra en la preparación de las soluciones,

dado que es importante encontrar el punto en

que la plata esta apunto de precipitar sin que

llegue en realidad a hacerlo.


PARA ARGENTAFINIDAD

• SOLUCIONES

• Solución de Fontana

• A 95 ml de nitrato de plata al 5%, añadir

hidróxido de amoniaco hasta obtener una

solución clara sin precipitados. Luego añadir

gota a gota los restantes 5 ml de nitrato de

plata al 5% hasta que la solución se torne

ligeramente turbia. Dejar reposar por 1 a 2

horas antes de usar.


PARA ARGENTAFINIDAD

• Cloruro de oro 1%, tomar 10 ml y completar

hasta 50 ml con agua destilada.

• Tiosulfato de sodio 5% acuoso

• Rojo nuclear rápido


PARA ARGENTAFINIDAD


• Incubar en solución de plata a 56°c por 1 hora

o bien 24 a 48 horas a temperatura ambiente

a la oscuridad. Los cortes toman un color

marrón claro.


• Cloruro de oro 5 min

• Lavar tres veces en agua destilada


PARA ARGENTAFINIDAD

• Tiosulfato 5 min

• Lavar

• Contraste 5 min

• Lavar

• Deshidratar, aclarar y montar.


PARA ARGENTAFINIDAD

• RESULTADOS

• Sustancias reductoras de plata negras

• Núcleos y fondo rosa

Masson –Fontana (Argentafin)

MF sobre teñida, inespecifica

TECNICA DE GRIMELIUS PARA

ARGIROFILIA

Impregnación argéntica de un tiempo

La reducción del nitrato de plata es con

hidroquinona.

Se recomienda post fijar las muestras en Bouin.


ARGIROFILIA

• SOLUCIONES

• Tampon acetato 0,1M pH 5,8 (ver guía de TH)

• Solución de impregnación.

• Nitrato de plata 0,5% en tampón acetato

• Solución reductora de Bodian.

• Sulfito de sodio anhidro 5g + hidroquinona 1+

en 100 ml de agua destilada


ARGIROFILIA

• Solución fijadora

Tiosulfato de sodio 2%


ARGIROFILIA

• Desparafinar e hidratar hasta en agua

destilada

• Lavar 4 veces en agua destilada

• Solución de impregnación por 3 horas a 60°c

• Solución reductora de Bodian por 5 min a

60°c. Debe aparecer color negro.

• Lava r en agua destilada

• Fijar por 30 segundos


ARGIROFILIA

• Solución de impregnacion 30 min a T.

ambiente

• Transferir a Solución Bodian por 5 minutos

(recién preparada)

• Lavar

• Fijar 20 segundos

• Lavar

• Deshidratar, aclarar y montar.

•


ARGIROFILIA

• RESULTADOS

Células argirófilas negro

Células alfa 2 de islotes de pancreáticos

negro

Grimelius

Tec. De Sevier

Siever

WS

OTRAS TECNICAS ARGENTICAS

Gross Bielschowsky

Tec. De Ramon y Cajal

Tec. De Rio Hortega

Grocott

Grocott

WS

Metenaminas de plata.

Glomerulo renal

TEJIDO NERVIOSO

TM PATRICIA TOLEDO RODRIGUEZ

TEJIDO NERVIOSO

Organización

• sistema nervioso central (SNC): cerebro y

médula espinal

• sistema nervioso periférico (SNP): nervios

craneales que surgen del encéfalo, nervios

raquídeos que surgen de la médula espinal y

ganglios relacionados.

• neuronas, que son las encargadas de las

funciones receptoras, integradoras y motoras

del sistema nervioso, y

• células de la neuroglía, que son las

encargadas de brindar sostén y nutrición a las

neuronas.

• Neuronas: Son las encargadas de la recepción

en la transmisión de los impulsos nerviosos

hacia el SNC y desde éste son las neuronas. La

mayor parte de las neuronas están

compuestas por tres partes definidas: un

cuerpo celular, múltiples dendritas y un solo

axón.

Células Neuroglia

• Su función es el sostén metabólico y mecánico

y la protección de las neuronas. Las células de

la neuroglia que residen exclusivamente en el

SNC son:

• Astrocitos

• Oligodendrocitos:

• Células de microglia

• Células ependimarias:

• Células de Shwann

Enfermedad de Parkinson

• Enfermedad neurodegenerativa que se

produce por la pérdida de neuronas en la

sustancia negra cerebral, lo que ocasiona

problemas de coordinación motora.

• En un laboratorio de neuropatología su

diagnóstico entraña cierta dificultad: se

emplean más bien en la diagnosis criterios

motrices y tomografía por emisión de

positrones como análisis de imagen.

Enfermedad Creutzfeldt- Jakob

• La nueva variante de la enfermedad de

Creutzfeldt-Jakob (nvCJD) es un mal

neurológico con formas genéticas hereditarias

y también contagiosas, producidas por una

proteína llamada prión (PrP) que se pliega de

forma anómala; dicha alteración en la

conformación de la estructura de la PrP

provoca la muerte neuronal y, por tanto la

destrucción de masa encefálica,

especialmente en el tálamo

Enfermedad Creutzfeldt- Jakob

• Más adelante, la enfermedad cursa con

proliferación glial. Ambos hechos

proporcionan un aspecto espongiforme a los

encéfalos afectados.

• Para su diagnóstico se emplean técnicas de

inmunohistoquímica con anticuerpos

monoclonales específicos, o, en casos graves,

simplemente tinciones de rutina. Se muestrea

mediante biopsia de la corteza, núcleos

basales o tálamo

• Los priones “sobreviven” en formalina.

• Resistentes a solventes orgánicos, calor,

enzimas, frio, autolisis.

• Sensibles a autoclave 121°c por 1 hora

• Enfermedad siempre se curso fatal

• Período de latencia de hasta 20 años

• Las muestras se fijan por 48 horas a 10 días, ,

luego formalina con fenol por 72 horas. Hasta

este punto el prion aun no esta inactivo.

• Solución de ácido fórmico por 48 horas y

luego 1 hora en hidróxido de sodio 2N y

después el histoprocesamiento normal.

Enfermedad de AlzaheimerEnfermedad neurodegenerativa que se

manifiesta como deterioro cognitivo y

trastornos conductuales. Se caracteriza en su

forma típica por una pérdida progresiva de la

memoria y de otras capacidades mentales, a

medida que las neuronas mueren y diferentes

zonas del cerebro se atrofian.

• Se diagnostica mediante pruebas

conductuales, electroencefalografía y

mediante procesamiento histológico de tejido

extraído en autopsia

Placas seniles en paciente con

Alzahimer. Plata

Alzheimer

• Técnica de PAS

modificada.

• Se evidencias

numerosas placas

seniles (PAS+)entre las

neurofibrillas

Alzheimer

• Detalle de una placa

senil “clásica”, teñida

con PAS modificado.

Alzheimer

• Técnina realizada en

MW. Muchas placas

seniles se observan.

• Tec. Bielschowsky

IDENTIFICACION DE TEJIDO

NERVIOSO

1. Coloraciones No argénticas:

Coloración para neuronas y gránulos de Nissl

Métodos de coloración para glia

Coloración para vainas de mielina

2. Coloraciones Argénticas:

Identificación de neurofibrillas

Para tejido nervioso en general

Coloración para neuronas y

gránulos de Nissl

• Los gránulos de Nissl son acúmuos de retículo

endoplasmico rugoso (ARN ribosómico y

mensajero) en el citoplasma de neuronas.

• Para identificarlos se utilizan colorantes

básicos de anilina (azul de metileno, azul de

toluidina, tionina, violeta de cresilo, etc).

• Estos colorantes se unen por un mecanismo

fisicoquímico a los ácidos nucleicos por

atracción electroestática.

TECNICA DE NISSL

SOLUCIONES

Tampón acetato pH 3,8 -4(ver guía de TH)

Solución de Violeta de cresilo 0,5 g en 100 ml de

tampón acetato pH 3,8 -4

T. De Nissl

PROCEDIMIENTO


• Violeta de cresilo por 10 min

• Lavar en tampón

• Deshidratar, aclarar y montar

T. De Nissl

RESULTADOS:

• Granos de Nissl y núcleos violeta

• Células nerviosas azul tenue

• Resto del tejido no se tiñe

Violeta de cresilo

TECNICA DE AZUL DE TOLUIDINA

PARA GRANULOS DE NISSL

• SOLUCIONES

Tampon ácido acético – acetato pH 4,2 (ver guía

TH)

Azul de toluidina 0,5% en tampón anterior

Solución acuosa de molibdato de amónico 4%

• PROCEDIMIENTO


• Azul de toluidina por 5 a 10 min

• Lavar en tampón

• Tratar por 10 min en molibdato

• Lavar en agua corriente por 10 min

• Deshidratar y montar en MEDIO ACUOSO

• RESULTADOS

Granulos de Nissl, nucléolo azul

violeta

Mucinas metacromacia rojo purpura

Nissl

Nissl

Nissl

TECNICA DE LUXOL FAST BLUE

METODO DE KLUVER BARRERA

• El Luxol es derivado de las ftalocianinas, es

insoluble en agua pero muy soluble en ciertos

disolventes orgánicos. Se postula la coloración

es debida a una atracción físico química d de

la colina y la función ácida sulfonada del

colorante luxol. Para otros autores, el luxol

tendría gran apetencia por los fosfolípidos y la

coloración sería por disolución.

Luxol y solvente

• Solvente Apetencia

• Etanol Fosfatidilserina y fosfadilcolina

• Isopropanol Todos los fosfolipidos

• Metanol No colorea

• Isobutanol Todos los fosfolípidos excepto

esfingomielina

• Cloroformo esfingomielina

•



• SOLUCIONES

Luxol Fast blue 0,1% en alcohol 96%, añadir

ácido acético glacial 10% 0,5 ml

Violeta de cresilo 0,1% en agua destilada, antes

de usar agregar 10 gotas de ácido acético

glacial al 10%

Carbonato de litio 0,5%

Alcohol etílico 70%



PROCEDIMIENTO

1.- Desparafinar e hidratar hasta alcohol 96%

2.- Solución de luxol 60°c toda la noche

3.- Eliminar exceso de colorante con alcohol

96%

4.- Pasar por agua destilada rápido

5.- Diferenciación rápida con Carbonato de litio



6.- Continuar diferenciación con alcohol 70%

7.- lavar agua destilada

8.- Terminar diferenciación con carbonato de

litio, continuar con varios cambios de alcohol

70% hasta que el azul verdoso de la

susutancia blanca contraste con el de la

sustancia gris.

9.- Aclarar rápidamente en agua destilada



10.- mantener la preparación en 10 in de Violeta

de cresilo. Filtrar y precalentar la solución de

violeta de cresilo.

11.- Deshidratar en varios cambios de alcohol de

96%

12.- Alcohol absoluto

13.- Xilol y montar



• RESULTADOS

Vainas de mielina azul o verde

azuladas

Neuronas y gránulos de Nissl violeta a

rosadas



Luxol fast blue

Corte de médula.

Luxol Fast Blue

Detalle imagen anterior, se ve claramente el detalle de la mielina

Luxol mal diferenciado

VIOLETA DE CRESILO + LUXOL

Nissl , núcleo celulares y mielina de violeta

Corteza Cerebral

Tec. De Ramon y Cajal

Santiago Ramon y Cajal

Rio Hortega

Técnica de Bodian

• Fibra nerviosa de negro

y cuerpo neuronal es un

“artefacto”, se ve

espacio.

Técnica de Bodian

• Cerebelo con técnica de

Bodian y contraste de

azul de anilina.

Cerebelo

Cel. De Purkinje

Técnica de Sevier Munger

• Cerebelo, se observan

celulas de Purkinje y

otras fibras en la

sección.

• Argirofilia.

Oligodendroglioma

Oligodendroglioma Rio

Hortega

Nitrato de plata de Holmes

• Fibra nerviosa negra y

cuerpo neuronal como

espacio artefactual.

Holmes + Luxol fast blue

Holmes + luxol fast bleu

Degeneracion de axones y vaina de mielina

Luxol Fast blue + PAS

Corteza cerebral

PTHA

Tinción de clelulas gliales y fibras purpura, cuerpos neuronales salmon

Técnica de Holzer

Se identifican células gliales con cristal violeta resistentes a decoloración, utiliza HPA

Técnica de Cajal

Astrocitos, cercanos a membrana basal de un capilar.

Tinción de mielina Weil

Seccion de médula espinal

Tincion de mielina de Weil

Detalle de imajgen anterior, se ve mielina y neuronas.

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