Informe de Coliformes Nuevo[1]

BACTERIAS COLIFORMES. COLIFORMES TERMOTRÓFICOS24 de

agosto de 2010

PARTE EXPERIMENTAL

1. OBJETIVOS

Conocer los métodos oficiales para determinar cuantitativamente coliformes, coliformes termotróficos y E.coli.

Aplicar los criterios para seleccionar los diferentes métodos. Identificar las diferentes especies de coliformes

2. REACTIVOS

o Rojo de metiloo Reactivo de Kovacso Hidróxido de potasioo Creatinina

3. MATERIALES

o Tubos de pruebao Pipetas calibradaso Placas Petrio Contador de coloniaso Espátula de extensión (DRIGALSKY)o Estufao Bombilla

4. MÉTODOS

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4.1. MÉTODO DEL NÚMERO MÁS PROBABLE (NMP)Recomendado para el análisis de agua y alimentos

MUESTRA : Leche en polvo

a) Preparar y diluir la muestra (10 -1, 10-2 y 10-3) b) Pipetear 1ml de cada una de las diluciones del homogenizado de alimento en

tubos de caldo lauril sulfato triptosa, utilizando tres tubos por diluciónc) Incubar a 35-37°C por 24-48 horas.d) Después de 24 horas de incubación anotar los tubos que muestren producción de

gas.e) Transferir una asada de los tubos positivos a tubos conteniendo Caldo Lactosado

Verde Brillante Bilis (CLVBB) o Agar ENDO o EMBf) Incubar a 35-37°C por 24-48 horas..g) Confirmar la presencia de bacterias coliformes por:

Formación de gas en el caldo CLVBB Formación de colonias negras o centro negro en el agar EMB Formación de colonias rojas rodeadas de halo rojo en agar ENDO

4.2-NUMERACIÓN DE COLIFORMES TERMOTRÓFICOS

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MUESTRA : Leche en polvo

a) Preparar y diluir la muestra (10 -1, 10-2 y 10-3) b) Pipetear 1ml de cada una de las diluciones del homogenizado de alimento en tubos de

Caldo Lactosado Verde Brillante Bilis, utilizando tres tubos por diluciónc) Incubar a 35-37°C por 24-48 horas.d) Después de 24 horas de incubación anotar los tubos que muestren producción de gas.e) Transferir una asada de los tubos positivos al Agar VRBA o Agar ENDOf) Incubar a 35-37°C por 24-48 horas..g) Confirmar la presencia de bacterias coliformes por:

o Formación de gas en el caldo CLVBBo Formación de colonias rojo oscuro en Agar VRBA o Formación de colonias rojas rodeadas de halo rojo en agar ENDO

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4.2-NUMERACIÓN DE BACTERIAS COLIFORMES POR EL MÉTODO DE RECUENTO EN PLACA.

MUESTRA : Queso Fresco

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Dilución 10 -1 Dilución 10 -2 Dilución 10 -3


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a) Preparar las muestra del alimento y las diluciones correspondientes.b) Transferir 1 ml de la dilución de la muestra en placa de petri estérilc) Adicionar a cada placa 10-15 ml de agar Violeta Rojo Bilis Temperado a 44 –

46°C.d) Mezclar mediante movimientos de rotación. Dejar solidificar la mezcla de 5

a 10 minutos; luego distribuir un adicional de 3 a 4 ml cubriendo completamente la superficie.

e) Incubar durante 24 horas a 35 – 37°C. Únicamente las colonias rojo oscuro se considerarán como bacterias coliformes.

4.2- MÉTODO IMVC.

1. MATERIALES

1 Caldo Voges. Praskauer 1 Caldo Indol

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1 Caldo Rojo de metilo 1 Agar citrato 5 tubos de prueba 1 gradilla 2 asa de siembra

Fundamento

Prueba utilizada en microbiología para reconocer bacterias. Se compone de cuatro pruebas: Indol, Rojo de metilo, Voges-Proskauer y Citrato. El resultado de este test se expresa mediante cuatro símbolos de suma o resta (+ o -) según el resultado de cada prueba, siguiendo siempre el orden establecido por las iniciales del método.

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Siembra en el Agar


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RESULTADOS

INDOL : NEGATIVO

CITRATO : POSITIVO

ROJO DE METILO : POSITIVO

VOGES – PRASKAUER : NEGATIVO

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CONCLUSIONES

Viendo los resultados obtuvimos la siguiente conclusión; para que sea E. Coli debe cumplir con que el Indol sea positivo y rojo de metilo también, se necesita que Vogues sea negativo al igual que citrato. Según nuestros resultados el microorganismo analizado es Citrobacter. Este genero junto con Enterobacter, Klebsiella y Escherichia forma el grupo coliforme de bacterias entéricas. Son bacterias móviles, fermentadores variables de la lactosa, algunos son citrato positivos y otros negativos, algunas especies tienen antígenos somáticos O, flagelar H y de superficie K, lo que hace que den reacciones cruzadas con otras Enterobacteriaceae.

RESULTADOS

MÉTODO NMP

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MÉTODO COLIFORMES EN PLACA

PRUEBAS IMVC

RESULTADOS

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DILUCIÓN N° COLONIAS

10 -1 >150

10 -2 >150

10 -3 52

10 -4 16


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El número de colonias fueron mayores a 150 en las diluciones de 10 -1 y 10 -2, por lo cual no se consideraron en la determinación del recuento de colonias.

Las diluciones se encontraban en un rango menos de 150, por lo tanto son considerados para determinar el recuento de colonias.

Tenemos dos resultados: 52 000 y 160 000. Según procedimiento, hallamos el cociente entre ellos:

Q = 160 000 = 3,07 52 000

El cociente es mayor que 2, por lo tanto tomamos el menor número: 52 000. El método utilizado fue por INCORPORACIÓN, es así que el factor por el método sería 1, el cual será multiplicado por el resultado final.

RESULTADO: 52 x 10 3 UFC/mL alimento

REPORTE Nº 01

NUMERACIÓN DE BACTERIAS COLIFORMES POR EL MÉTODO DE RECUENTO EN PLACA

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DILUCIÓN N° COLONIAS x FACTOR DE DILUCIÓN

10 -3 52 52 000

10 -4 16 160 000


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MEDIO : Agar Violeta Rojo Bilis

TEMPERATURA DE INCUBACIÓN : 35-37° C

TIEMPO DE INCUBACIÓN : 24 horas

LECTURAS :

EXPRESIÓN DE RESULTADOS : 52 x 10 3 UFC/mL alimento

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DILUCIÓN N° COLONIAS10 -1 >15010 -2 >15010 -3 5210 -4 16


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REPORTE Nª02

NUMERACIÓN DE COLIFORMES, COLIFORMES TERMOTOLERANTES Y E.Coli

Técnica de los Tubos Múltiples De Fermentación o Método del Número Más Probable (NMP)

c Coliformes – Método N°1

Prueba PresuntivaMedio : Caldo Lactosado Verde Brillante Bilis 2% (CLVBB2%)

Temperatura y Tiempo de Incubación: 35-37°C / 24-48h

Prueba ConfirmativaMedio : Agar Violeta Cristal Rojo Neutro (VRBA)

Temperatura y Tiempo de Incubación: 35-37°C / 24h

c Coliformes Termotolerantes- Método N°2

Medio : Lactosado Verde Brillante Bilis

Temperatura y Tiempo de Incubación:35-37°C / 24-48h

c Diluciones Utilizadas: 10-1 (A,B,C);10-2 (a,b,c); 10-3 (a,b,c)

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Dilución

Prueba Presuntiva

Prueba Confirmativa Colonias

en Agar EMB

#de Cepas

ReaccionesE.

ColiObservaciones

24h 48h Coliform.Colif.

term.I M Vi C

A

+ +

24 48 24 48

B - -

C - -

a - -

b + +

c + +

a - -

b - -

c - -

CUESTIONARIO

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1.- ¿QUÉ INDICA LA PRESENCIA DE COLIFORMES, COLIFORMES TERMOTRÓFICOS Y E. coli EN UN ALIMENTO?

La presencia de organismos coliformes en cantidades elevadas, representa un importante hecho debido a:

E. coli es un germen cuyo hábitat natural es el tracto entérico del hombre y de los animales. Por ello, la presencia de este microorganismo en un alimento indica generalmente una contaminación directa o indirecta de origen fecal.

Cifras sustanciales de E. coli en un alimento sugiere una falta general de limpieza en el manejo del mismo y un almacenamiento inadecuado. La presencia de este microorganismo no constituye una connotación directa de la presencia de un microorganismo patógeno, sino que implica únicamente un cierto riesgo de que pudiera estar presente. En otras palabras, la presencia de E. coli en los alimentos no guarda siempre una estrecha correlación con la presencia de Salmonella o de otros microorganismos patógenos.

Adicionalmente la presencia de coliformes en los alimentos indica tratamiento inadecuado y/o contaminación posterior al tratamiento; mas frecuentemente a partir de las materias primas, equipos sucios o manejo no higiénico. Sugiere también la multiplicación microbiana que pudiera haber permitido el crecimiento de toda serie de microorganismos patógenos y toxigénicos.

2. ¿QUÉ ESPECIES CONFORMAN EL GRUPO COLIFORMES TERMOTRÓFICOS? ESCRIBA TODO O QUE SEPA DE ESTE GRUPO.

Descripción General

Las bacterias del grupo de los coliformes totales que son capaces de fermentar lactosa a 44-45 ºC se conocen como coliformes termotróficos o termotolerantes. En la mayoría de las aguas, el género predominante es Escherichia, pero algunos tipos de bacterias de los géneros Citrobacter, Klebsiella y Enterobacter también son termotolerantes. Escherichia coli se puede distinguir de los demás coliformes termotolerantes por su capacidad para producir indol a partir de triptófano o por la producción de la enzima β-glucuronidasa. E. coli está presente en concentraciones muy grandes en las heces humanas y animales, y raramente se encuentra en ausencia de contaminación fecal, aunque hay indicios de que

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puede crecer en suelos tropicales. Entre las especies de coliformes termotolerantes, además de E. coli, puede haber microorganismos ambientales.

Valor como indicadorSe considera que Escherichia coli es el índice de contaminación fecal más adecuado. En la mayoría de las circunstancias, las poblaciones de coliformes termotolerantes se componen predominantemente de E. coli; por lo tanto, este grupo se considera un índice de contaminación fecal aceptable, pero menos fiable que E. coli. Escherichia coli (o bien los coliformes termotolerantes) es el microorganismo de elección para los programas de monitoreo para la verificación, incluidos los de vigilancia de la calidad del agua de consumo. Estos microorganismos también se utilizan como indicadores de desinfección, pero los análisis son mucho más lentos y menos fiables que la medición directa de la concentración residual de desinfectante. Además, E. coli es mucho más sensible a la desinfección que los protozoos y virus entéricos.

Fuentes y prevalenciaHay grandes cantidades de Escherichia coli en las heces humanas y animales, en las aguas residuales y en el agua que ha estado expuesta recientemente a contaminación fecal. Es muy poco probable que la disponibilidad de nutrientes y la temperatura del agua en los sistemas de distribución de agua de consumo favorezcan la proliferación de estos microorganismos.

Aplicación en la prácticaLa concentración de Escherichia coli (o bien de coliformes termotolerantes) se mide, por lo general, en muestras de 100 ml de agua. Para ello existen diversos procedimientos relativamente sencillos basados en la producción de ácido y gas a partir de la lactosa o en la producción de la enzima β-glucuronidasa. Los procedimientos incluyen la filtración del agua con una membrana que después se incuba en medios selectivos a 44–45 °C; transcurridas 24 h, se realiza un recuento de colonias. Otros posibles métodos son los procedimientos de «número más probable», en los que se utilizan tubos de ensayo o placas de microvaloración y pruebas de P/A, algunas con volúmenes de agua mayores que 100 ml. Existen equipos de análisis para uso sobre el terreno.

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Relevancia de su presencia en el agua de consumoLa presencia de E. coli (o bien de coliformes termotolerantes) es un indicio de contaminación fecal reciente, por lo que tras su detección debería considerarse la toma de medidas adicionales, como la realización de muestreos adicionales y la investigación de las posibles fuentes de contaminación, como un tratamiento inadecuado o alteraciones de la integridad del sistema de distribución.

3.- ¿CÓMO ACTUAN LOS DIFERENTES COMPONENTES DEL CALDO LAURIL TRIPTOSA, CALDO LACTOSADO VERDE BRILLANTE BILIS 2 %, AGAR ROJO VIOLETA BILLIS EN LA NUMERACIÓN DEL GRUPO COLIAEROGENES?

Caldo Lauril Triptosado Medio para la detención de microorganismos coliformes en materiales de importancia sanitaria. Medio rico en nutrientes, que permite un rápido desarrollo de los microorganismos fermentadores de la lactosa, aún de los fermentadores lentos.

La triptosa es la fuente de nitrógeno, vitaminas, minerales y aminoácidos, la lactosa es el hidrato de carbono fermentable, las sales de fosfato proveen un sistema buffer, y el cloruro de sodio mantiene el balance osmóticoEs un medio selectivo, ya que el lauril sulfato de sodio inhibe el desarrollo de la flora acompañante. Por la fermentación de la lactosa, se produce ácido y gas, éste último se evidencia al utilizar las campanas Durham.

Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones Triptosa 20.0 Suspender 35,6 g del polvo en 1 litro de

agua destilada. Dejar reposar 5 minutos. Calentar a ebullición hasta la disolución total. Distribuir en tubos conteniendo tubos de fermentación. Esterilizar en autoclave durante 15 minutos a 121°C.

Lactosa 5.0 Cloruro de sodio 5.0 Lauril sulfato de sodio 0.1 Fosfato dipotásico 2.75 Fosfato monopotásico 2.75

pH final: 6.8 ± 0.2

Tabla: Resultados de siembra de microorganismos

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Microorganismos Crecimiento Producciónde gas

Enterobacter aerogenes Bueno a excelente +Escherichia coli ATCC 25922 Bueno a excelente +Salmonella typhimurium ATCC 14028

Bueno a excelente -

Staphylococcus aureus ATCC 25923

Inhibido Inhibido

Caldo Lactosado Verde brillante Bilis 2 % Este medio está recomendado para el recuento de coliformes totales y fecales, por la técnica del número más probable. En el medio de cultivo, la peptona aporta los nutrientes necesarios para el adecuado desarrollo bacteriano, la bilis y el verde brillante son los agentes selectivos que inhiben el desarrollo de bacterias Gram positivas y Gram negativas a excepción de coliformes, y la lactosa es el hidrato de carbono fermentable. Es una propiedad del grupo coliforme, la fermentación de la lactosa con producción de ácido y gas.

Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones Bilis de buey deshidratada 20.0 Suspender 40 g del polvo deshidratado

por litro de agua destilada. Disolver y distribuir 10 ml por tubo con campanita de Durham. Preparar además, el medio a doble concentración. Esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos.

Lactosa 10.0 Peptona 10.0 Verde brillante 0.0133

pH final: 7.2 ± 0.2


Microorganismos Crecimiento Gas Indol#Escherichia coli ATCC 25922 + +* +*Enterobacter spp. + + -*Klebsiella pneumoniae ATCC 700603 + +* -*Salmonella typhimurium ATCC 14028 + - -Bacterias no fermentadores de lactosa + - VariableStaphylococcus aureus ATCC 25923 - - -

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+* ó -* 10-25% de cepas negativas o positivas # a partir de Agua Triptona

Agar Rojo Violeta BillisEste es un medio selectivo para la investigación presuntiva y recuento de coliformes en alimentos y productos lácteos.En el medio de cultivo, la peptona y el extracto de levadura aportan los nutrientes necesarios para el crecimiento bacteriano,las sales biliares y el cristal violeta inhiben el desarrollo de la flora Gram positiva, la lactosa es el hidrato de carbono fermentable, y el rojo neutro es el indicador de pH.

Los coliformes son bacterias que fermentan la lactosa, acidifican el medio y producen un viraje del indicador de pH al color rojo intenso. Debido a esto, se observan como colonias de color rojo púrpura, de 1 a2 mm de diámetro, rodeadas, generalmente, de una zona rojiza de bilis precipitada.

Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones Extracto de levadura 3.0 Suspender 41,5 g del polvo por litro de

agua destilada. Reposar 5 minutos y mezclar, calentando a ebullición 1 o 2 minutos. Enfriar a 45°C y verter en placas. Una vez preparado debe usarse de inmediato. NO AUTOCLAVAR.

Peptona 7.0 Sales biliares 1.5 Lactosa 10.0 Cloruro de sodio 5.0 Agar 15.0 Rojo neutro 0.03 Cristal violeta 0.002pH final: 7.4 ± 0.2


Microorganismos ColoniasEnterobacterias fermentadoras de lactosa

Rojas, de 1 a 2 mm de diámetro, con halo de precipitación rojizo

Enterobacterias no fermentadoras de lactosa

Incoloras

Enterococcus spp. Rosadas como punta de alfiler (puntiformes)

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4- ¿CUÁL ES EL FUNDAMENTO DEL MÉTODO DEL NÚMERO MÁS PROBABLE (NMP)?

El método se basa en que las bacterias coliformes, fermentan la lactosa incubadas a 35 ± 1°C durante 24 a 48 horas, resultando una producción de ácido y gas el cual se manifiesta en las campanas de fermentación y el crecimiento también es verificado mediante la presencia de turbidez en el medio. Según el número de tubos con crecimiento positivo en cada grupo de dilución, se verifica el resultado según la tabla de NMP.

Este número es calculado a partir de la observación del crecimiento, tanto con la aparición de turbidez como con la formación de gas, en cultivos en caldo duplicados, inoculados con porciones de un ml de diluciones decimales de la muestra.

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BIBLIOGRAFÌA

Coliformes y E. coli, citado el 27 de agosto del 2010. Disponible en: http://tesis.uson.mx/digital/tesis/docs/14185/Resultado.pdf

SOLER L. J. Validación secundaria del método de número más probable y recuento en placa profunda para coliformes totales y fecales en muestras de alimentos basada en la norma ISO NTC 17025. Pontificia Universidad Javeriana, Facultad de Ciencias. Carrera de Microbiología Industrial. Bogotá, D.C. 30 Jun 2006.

Escherichia coli y bacterias coliformes termotolerantes. [Citado el 30 de Agosto del 2010]. Disponible en: http://www.bvsde.paho.org/CDGDWQ/docs_microbiologicos/Indicadores%20PDF/Ecoli_bacterias_termo.pdf

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