UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA DE LA SELVA

MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS II

TEMA :

DETERMINACION DE COLIFORMES EN AGUA POR RECUENTO ESTANDAR

EN PLACA Y PLACAS EN PETRIFILM 3M.

DOCENTE :

ALCEDO ROMERO, MARGARITA

ALUMNOS:

SOLDEVILLA LA TORRE, Mario.

CICLO :

2011-I

Facultad De Ingeniería En

Industrias Alimentarías

INTRODUCCION

La definición generalmente aceptada para el término “coliformes” describe a estos

microorganismos como bacilos Gram negativos, no esporulados, aerobios o

anaerobios facultativos que fermentan la lactosa con producción de ácido y gas,

aunque algunos pueden ser fermentadores tardíos o no fermentadores, como

Citrobacter y Serratia, respectivamente.

La mayoría de los coliformes pueden encontrarse en la flora normal del tracto

digestivo del hombre o animales, por lo cual son expulsados especialmente en las

heces, por ejemplo Escherichia coli. Por esta razón, su presencia constante en la

materia fecal, los coliformes son el grupo más ampliamente utilizado en la

microbiología de alimentos como indicador de prácticas higiénicas inadecuadas.

Como los coliformes también pueden vivir en otros ambientes, se distingue entre

coliformes totales y coliformes fecales. Esta práctica se refiere a coliformes totales.

El uso de los coliformes como indicador sanitario puede aplicarse para:

La detección de prácticas sanitarias deficientes en el manejo y en la

fabricación de los alimentos.

La evaluación de la calidad microbiológica de un producto, aunque su

presencia no necesariamente implica un riesgo sanitario, cuando los

coliformes son de origen no-fecal.

Evaluación de la eficiencia de prácticas sanitarias e higiénicas en el equipo.

La calidad sanitaria del hielo y los distintos tipos de agua utilizados en las

diferentes áreas del procesamiento de alimentos.

Objetivos

Comprender y realizar adecuadamente la determinación de coliformes

totales en un alimento, mediante la cuenta en placas vertidas.

Interpretar los resultados obtenidos, de acuerdo con las normas aplicables.

FUNDAMENTO TEORICO

Debido a que un gran número de enfermedades son transmitidas por vía fecal-oral

utilizando como vehículo los alimentos y el agua, es necesario contar con

microorganismos que funcione como indicador de contaminación fecal. Estos

deben de ser constantes, abundantes y exclusivos de la materia fecal, deben tener

una sobrevivencia similar a la de los patógenos intestinales y debe de ser capaces

de desarrollarse extra intestinalmente.

El grupo coliforme es constante, abundante y casi exclusivo de la materia fecal, sin

embargo, las características de sobrevivencia y la capacidad para multiplicarse

fuera del intestino también se observan en aguas potables, por lo que el grupo

coliforme se utiliza como indicador de contaminación fecal en agua; conforme

mayor sea el número de coliformes en agua, mayor será la probabilidad de estar

frente a una contaminación reciente.

Cuando los coliformes llegan a los alimentos, no sólo sobreviven, sino que se

multiplican, por lo que en los alimentos el grupo coliforme adquiere un significado

distinto al que recibe en el agua. En productos alimenticios que han recibido un

tratamiento térmico (pasteurización, horneado, cocción, etc.), se utilizan como

indicadores de malas prácticas sanitarias.

Los microorganismos coliformes constituyen un grupo heterogéneo con hábitat

primordialmente intestinal para la mayoría de las especies que involucra. El grupo

de bacterias coliformes totales comprende todos los bacilos Gramnegativos

aerobios o anaerobios facultativos, no esporulados, que fermentan la lactosa con

producción de gas en un lapso máximo de 48 h. a 35°C ± 1ºC. Este grupo esta

conformado por 4 géneros principalmente: Enterobacter, Escherichia, Citrobacter y

Klebsiella.

El grupo de coliformes fecales, está constituido por bacterias Gram-negativas

capaces de fermentar la lactosa con producción de gas a las 48 h. de incubación a

44.5 ± 0.1°C. Este grupo no incluye una especie determinada, sin embargo la más

prominente es Escherichia coli. La demostración y el recuento de organismos

coliformes, puede realizarse mediante el empleo de medios de cultivo líquidos y

sólidos con características selectivas y diferenciales.

Los coliformes resisten la presencia de bilis en el medio de cultivo; cuando se

desarrollan en ABRV, el ácido producido por la fermentación de la lactosa,

ocasiona el vire del indicador rojo neutro y la precipitación de las sales biliares por

lo que las colonias son color rojo oscuro y generalmente están rodeadas de un

halo de sales biliares precipitadas, de color rojo claro o rosa.

NOTAS

Cuando se utiliza el medio de agar bilis rojo violeta (ABRV) para la cuenta en

placa de coliformes, debe considerarse lo siguiente:

Si el alimento contiene mono o disacáridos en altas concentraciones, éstos

pueden ser fermentados por otro grupo de microorganismos, generando

colonias semejantes a las de coliformes.

El medio no debe esterilizarse ni sobrecalentarse por lo que se debe utilizar

antes de 3 h. a partir de su preparación; en cuanto se disuelva el agar se

debe colocar en baño de agua a 45 °C para mantenerlo fundido, hasta el

momento de utilizarlo.

Debe ponerse una sobre capa de medio una vez que las placas vertidas

han solidificado, para favorecer las condiciones de microaerobiosis, más

adecuadas para los coliformes.

El sobrecalentamiento del medio y las variaciones en las condiciones de

incubación, especialmente la incubación prolongada, pueden ocasionar la

formación de colonias rojas de cocos Gram positivos.

El rango estadístico para tener confiabilidad en el aspecto cuantitativo (de

sensibilidad del método) es de 15 a 150 UFC por placa.

El tiempo transcurrido desde el momento en que la muestra se incorpora al

diluyente hasta que finalmente se vierten los medios de cultivo en las cajas

clonas muestras de diluciones, no debe exceder de 20 minutos.

Bacteria Coliforme

Incluyen E. Coli y otras bacterias que se asemejan morfológica y fisiológicamente.

Estos M.O. con frecuencia difieren entre si en características pequeñas. Las

bacterias coliforme suelen encontrarse en el aparto intestinal del hombre y animal.

E. Coli, rara vez se encuentra fuera del intestino

Las bacterias coliformes son bacilos cortos, gram negativos que fermentan la

lactosa y forman ácido y gas. Son anaeróbios facultativos, se multiplican a mayor

rapidez a temperatura entre 30 y 37 ºC, crecen a grandes abundancias en medios

corrientes, como caldo y agar.

La colonia de E. Coli en agar E.M.B (eosina y azul de metileno) tienen 2 a 4 mm

de diámetro, un centro grande de color oscuro e incluso negro, y tienen brillo verde

metálico cuando se observan con luz refleja.

Se han creado otras pruebas para diferenciar tipos de bacterias coliformes, suelen

emplearse 4 y se han juntado sus iníciales en la palabra nemotécnica IMViC

(Indol, Rojo Metilo (R.M.), Borges – Proskauer (V:P) y utilizada de citrato.

La reacción de IMViC de algunas bacterias coliformes como E. Coli ++ - -, significa

que el M:O: produce Indol y es positivo al rojo metilo y negativo al V.P.

Se considera que todas las bacterias coliformes, tienen importancia en el H2O

desde el punto de vista sanitario aunque muchos autores han tratado de

diferenciar el tipo fecal (E. Coli) y el no fecal (A: aurogenes).

PLACAS 3M PETRIFILM

Las placas 3M Petrifilm MR para Recuento Total de Coliformes constituyen un

sistema listo para usarse que contiene los elementos nutritivos del medio bilis rojo

violeta (VRB), un agente gelificante y un indicador químico. Las placas Petrifilm

MR para Recuento Total de Coliformes son útiles para la enumeración de

bacterias coliformes en muestras diversas de productos alimenticios ó para llevar

un control del medio ambiente de procesamiento. La película superior atrapa el

gas producido por la fermentación de la lactosa.

La AOAC Internacional y el Manual de Análisis Bacteriológico (BAM) de la

FDA de los Estados Unidos definen a los coliformes como colonias de

bastoncillos gram-negativos que producen ácido y gas durante la fermentación

metabólica de la lactosa. La producción de gas es usada para diferenciar a los

coliformes de los no-coliformes. El gas atrapado alrededor de las colonias rojas

confirma la presencia de coliformes en la Placa Petrifiim de Alta Sensibilidad para

Recuento de Coliformes.

La producción de ácido causa que el indicador de pH oscurezca el gel a un color

más rosado en el fondo.

Las placas Petrifilm contienen los nutrientes del Violeta Rojo Bilis (VRB)

modificado, un agente gelificante soluble en agua fría y un indicador de tetrazolio

que facilita la enumeración de colonias. El film superior atrapa el gas producido

por la fermentación de la lactosa por los coliformes.

La ISO define los coliformes por su capacidad de crecer en medios específicos y

selectivos. El método ISO 4832, que enumera los coliformes por la técnica del

recuento de colonias, define los coliformes por el tamaño de las colonias y la

producción de ácido en el Agar VRB con lactosa (VRBL). En las placas Petrifilm,

estos coliformes productores de ácido se muestran como colonias rojas con o sin

gas (ver Círculo 1). El método ISO 4831, que enumera los coliformes por el

método del Número Más Probable (NMP), define los coliformes por su capacidad

de crecer y producir gas a partir de la lactosa en un caldo selectivo. En las placas

Petrifilm, estos coliformes se muestran como colonias rojas asociadas a gas (ver

Círculo 2).

La AOAC INTERNATIONAL y la FDA (Food and Drug Administration) / BAM

definen los coliformes como bacilos Gram negativos que producen ácido y gas a

partir de la lactosa durante la fermentación metabólica. Las colonias de coliformes

que crecen en las placas Petrifilm producen ácido que provoca que el indicador de

pH oscurezca el color del gel; el gas atrapado alrededor de las colonias indica

coliformes (ver Círculo 2).

ANÁLISIS SANITARIO DEL H2O

El diagnostico de las colonias coliformes en la muestra de H2O se basa en la

capacidad de dicho M:O: para producir gas a partir de la lactosa.

Filtración:

Es un medio eficaz de eliminar M.O. y otras sustancias de suspensión del H2O.

Cloración:

Es el método más eficaz de hacer potable el H2O. La cantidad de cloro que se

agrega depende del grado de contaminación del abasto hídrico y su contenido de

sustancias orgánicas. El cloro mata la mayor parte delas bacterias no

esporágenas. El H2O clorada, en consecuencia no siempre es estéril, pero suele

brindar seguridad para consumo por el ser humano.

Recuento de Coliformes en Filtro de Membranas (Método):

Se hace pasar parte de la muestra por una membrana de filtración de acetatos de

celulosa con poros y diámetro tal capte la bacteria, en tanto que permita el paso

libre del H2O.

La membrana de filtración se coloca asépticamente en una caja de Petri en un

cojincillo absorbente saturado con una sal nutritiva P. Ej., caldo M. Endo, se

incuba a 24 ºC durante 24 horas. Después se examina la membrana con

microscopio de poca potencia y se cuentan las colonias verdes violáceos con

resplandor metálico, si considera que son bacterias coliformes.

H2O potable:

Sea limpia, fresca, sin olores o sabores desagradables o que causen rechazo de

quien lo consume y sin sustancias químicas o M.O. nocivos.

Ventajas del uso de Filtro de membrana para las H2O:

1. Rapidez en la obtención de resultados

2. Ahorro de manos de obra, medios, materiales de vidrios, y coste de los

materiales si el filtro se lava y se vuelve a utilizar.

3. Pueden exponerse los organismos a medio de enriquecimiento muy

fácilmente durante un corto tiempo y a una temperatura conveniente.

Inconvenientes de Uso:

1. No hay indicación de formación de gas (algunas H2O tienen gran cantidad

de organismos fermentadores de la lactosa sin producción de gas capaces

de crecer en el medio).

2. La filtración por membrana es inadecuada para H2O con mucha turbidez y

bajos recuentos, porque el filtro llega a obturarse antes de que pase agua

suficiente.

3. Cantidades grandes de organismos no coliformes capaces de crecer en el

medio pueden interferir en el crecimiento de los coliformes.

MATERIAL Y EQUIPO

Incubadora con termostato que evite variaciones mayores de ± 1.0ºC,

provista con termómetro calibrado.

Contador de colonias de campo oscuro, con luz adecuada, placa de cristal

cuadrículada y lente amplificador.

Utensilios estériles para tomar muestras.

Pipetas bacteriológicas de 10 mL, estériles, con algodón en el extremo

superior (las necesarias de acuerdo con el número de diluciones).

Pipetas bacteriológicas de 1 mL, estériles, con algodón en el extremo

superior (las necesarias de acuerdo con el número de diluciones).

4 a 8 cajas Petri estériles, de 15 x 100 mm.

Placas petrifilm 3M.

PROCEDIMIENTO

Para el REP

1. Pesar la muestra y preparar las diluciones como lo establece la técnica de

Preparación y Dilución de Muestras de Alimentos para su Análisis Microbiológico.

Recordar que el rango de sensibilidad del método es de 30 a 300 colonias por

placa.

2. Distribuir las cajas estériles en la mesa de trabajo de manera que la inoculación

y la adición de medio de cultivo se puedan realizar cómoda y libremente. Marcar

las bases de las cajas con los datos pertinentes antes de colocar el inoculo.

3. Inocular por duplicado, 1.0 mL de la dilución correspondiente en cada caja,

mediante pipeta estéril y verter de 18.0 a 20.0 mL del medio ABRV fundido y

mantenido a 45 ± 1.0°C en baño de agua. El tiempo transcurrido entre la

preparación de la dilución primaria y el momento en que se vierte el medio de

cultivo, no debe exceder de 20 minutos.

4. Mezclar cuidadosamente el inoculo con el medio, mediante seis movimientos de

derecha a izquierda, seis movimientos en el sentido de las manecillas del reloj,

seis movimientos en el sentido contrario al de las manecillas del reloj y seis de

atrás para adelante, sobre una superficie lisa y nivelada. Permitir que la mezcla

solidifique dejando las cajas Petri sobre una superficie horizontal fría. No permitir

que se mojen las tapas de las cajas.

5. En cuanto el medio solidifique, agregar a cada caja, un sobre capa de 4 ó 5

mL del mismo medio fundido y mantenido a 45 °C, no permitir que se mojen las

tapas de las cajas. La sobre capa de agar se coloca para favorecer el crecimiento

de los coliformes, que son facultativos. Dejar que solidifique.

6. Solidificado el medio invertir las placas y colocarlas en la incubadora a 35°C,

durante 24 ± 2 h.

7. Después de este periodo, contar las colonias con el contador de colonias.

Seleccionar las placas que contengan entre 30 y 300 colonias. Las colonias típicas

son de color rojo oscuro, generalmente se encuentran rodeadas de un halo de

precipitación debido a las sales biliares, el cual es de color rojo claro o rosa, la

morfología colonial es semejante a lentes biconvexos con un diámetro de 0.5 a 2.0

mm.

8. Si hay desarrollo extendido o un número de colonias superior al del rango de

sensibilidad del método.

Para las placas de petrifilm 3M

1. Colocar la placa Petrifilm en una superficie plana. Levantar el film superior. Con

una pipeta colocada de forma perpendicular a la placa Petrifilm, colocar 1 ml. De

la muestra en el centro del film inferior.

2. Bajar el film superior con cuidado evitando introducir burbujas de aire. No

dejarlo caer.

3. Con la cara lisa hacia abajo, colocar el aplicador en el film superior sobre el

inoculo. Con cuidado, ejercer una presión sobre el aplicador para repartir el

inoculo sobre el área circular antes de que se forme el gel. No girar ni deslizar el

aplicador. Levantar el aplicador.

Esperar al menos un minuto a que solidifique el gel. Con la cara lisa hacia abajo,

colocar el aplicador en el film superior sobre el inoculo. Con cuidado, ejercer una

presión sobre el aplicador para repartir el inoculo sobre el área circular antes de

que se forme el gel. No girar ni deslizar el aplicador. Levantar el aplicador. Esperar

al menos un minuto a que solidifique el gel.

4. Incubar las placas cara arriba en pilas de hasta 20 placas. El tiempo e

incubación varía según el método.

5. Las placas Petrifilm pueden leerse con un contador de colonias estándar u otra

lente de aumento iluminada. Para leer los resultados, consultar la Guía de

Interpretación. Tener en cuenta el rango de contaje de 15-150 colonias.

6. Las colonias pueden aislarse para una posterior identificación. Levantar el film

superior y seleccionar la colonia del gel.

CÁLCULOS Y EXPRESIÓN DE RESULTADOS

Para seleccionar cajas y reportar, seguir las indicaciones de la práctica Cuenta de

Bacterias en Placa.

Reportar como se indica a continuación, con dos cifras significativas y potencias

de 10. Coliformes totales en placas de agar bilis rojo violeta, incubadas por 24 +

2h a 35 ºC.

UFC= numerode colonias(factor de dilucion ) x (inversadel inoculo)

Datos del REP (Cuadro 1).

Diluciones A B

10-1 2 8

10-2 0 1

10-3 0 0

promedio=(8+2 )2

=5

UFC= numerode colonias(factor de dilucion ) x (inversadel inoculo)

=5 x10 x1=50 /ml

Datos de los petrifilm 3M (Cuadro 2).

Petrifilm A B

10-2 0 0

10-3 0 0

Las burbujas de fondo son una característica del gel y no resultado del crecimiento

de coliformes. Las burbujas de fondo son pequeñas o puntiformes y no tienen una

colonia asociada.

CONCLUSION

El cuadro 1, observamos que el crecimiento o formación de colonias es de

5 colonias por ml, como esta fuera del rango de 30-300 colonias, no

podemos rechazar o afirmar que el agua evaluado este exentos o no de

una contaminación directa de coliformes ya que esta cifra solo se puede

tomar como un estimado.

En el cuadro 2, observamos que no hubo crecimiento en las placas de

petrifilm y esto se pudo a ver dado que la muestra de agua tomada para el

análisis era el agua que se utiliza en el equipo de destilación, donde el agua

pasa por un proceso de ebullición donde la temperatura se eleva a 80°C

aproximadamente y debido a esto se ve que el crecimiento es cero ya que

solo se tomo 1ml de muestra.

En cuadro 1, se observa que el crecimiento es bajo, debido a que el agua

usada para el análisis había pasado por un proceso de ebullición y esto

podría explicar porque es bajo el índice de crecimiento de coliformes y

también nos da a entender que la temperatura durante la ebullición del

agua ha sido la adecuada.

BIBILIOGRAFIA

http://www.monografias.com/trabajos15/analisis-agua/analisis-agua.shtml.

http://depa.pquim.unam.mx/amyd/archivero/TecnicBasicas-Colif-tot-fecales-

Ecoli-NMP_6529.pdf.

http://www.distribucionesbiotecnologicas.com.mx/files/

guia_petrifilm_alta_sensibilidad_coliformes.pdf.

http://multimedia.3m.com/mws/mediawebserver?

mwsId=66666UuZjcFSLXTtMxMy4xT6EVuQEcuZgVs6EVs6E666666--

&fn=PCC%20Interp%20Guide_sp.pdf.

http://solutions.3m.com.mx/3MContentRetrievalAPI/BlobServlet?

locale=es_MX&lmd=1242969456000&assetId=1180613376490&assetType

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