Informe examen práctico

5/17/2018 Informe examen pr ctico - slidepdf.com

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INFORME EXAMEN PRÁCTICO

ANÁLISIS ALIMENTOS

Muestra A: Mermelada de ArándanosRecuento Enterococos fecales: Método de tubos múltiples (NMP:Número más probable)

Muestra:

- Recogida el Miércoles 30/5/2012 a las 08:30a.m por el profesor.

- Analizada el Miércoles 30/5/2012 a las 11:30a.m

Procedimiento:

Primero hacemos la dilución madre ya que la muestra es semi-sólida, pesando una parte demuestra y 9 partes de agua destilada (10-1) y 2 diluciones más, cogiendo 1mL de la (10-1) con 9mLde agua destilada (10-2) y otro mL de ésta con 9mL de agua destilada (10-3)

Hacemos una batería de 9 tubos de caldo Rothe, en los 3 primeros vertemos 1mL de la diluciónmadre(10-1), en los 3 siguientes 1mL de la dilución(10-2) y en los 3 últimos 1mL de la dilución(10-3).

Incubamos en la estufa de 37ºC durante 24h (deberían ser 48h pero lo pide el enunciado)Los tubos que presentan turbidez y sedimento blanco en el fondo del tubo se consideran

positivos, de estos tubos habría que confirmarlos inoculando por cada tubo positivo otro con caldoE.V.A e incubarlos otras 48h a 37ºC, y con los que saliesen positivos (poso color violeta)acudiríamos a la tabla de NMP.

Como no disponemos de tanto tiempo nos quedamos en la prueba presuntiva, es decir, con lostubos positivos vamos directamente a la tabla de NMP.

Condiciones de incubación:

Incubamos a 37ºC durante 24h.

Cálculos:

Preparación caldo Rothe:

90mL ·

Dilución madre: He pesado 7,7g de muestra y 9 veces más de agua destilada: 7,7g · 9 = 69,3g deagua.

34,7g

1000mL= 3,12g que pesamos del medio para preparar 90mL



Esquema del proceso:

1mL 1mL

Dilución madre (10-1) (10-2) (10-3)

Tabla NMP

Lectura de la prueba presuntiva:

Los 9 tubos son positivos (+)

Expresión de resultados:

> 2400 UFC/mL

Batería caldo Rothe

1mL

dión (10-1)

1mL

dión (10-3)

1mL

dión (10-2

)

Incubar 24h a 37ºC

DÍA 1

DÍA 2

DÍA 1

9mL9mL



Muestra B: Mosto

Investigación Coliformes totales:

Para la detección de Enterobacteriaceae lactosa-positivas (coliformes), se aprovechan ciertas

características que las diferencian de otras Enterobacteriaceae como, por ejemplo, su capacidad para fermentar la lactosa con producción de ácido y gas.

Muestra:

- Recogida el Miércoles 30/5/2012 a las 08:30a.m por el profesor.


Procedimiento:Como no nos piden recuento, en vez de hacer una batería de caldo Lactosado para NMP, he

inoculado un solo tubo de caldo Lactosado con campana Durham, con 1mL de muestra líquida.


37ºC durante 24h.

Esquema del proceso: 1mL

muestra Caldo Lactosadocon campana Durham

Aislar por estría en agar Endo

Observar morfología de las colonias

Incubar 24h a 37ºC

Incubar 24h a 37ºC

DÍA 1

DÍA 2

DÍA 3



Lectura de la prueba presuntiva:

La turbidez indica crecimiento de la bacteria inoculada con utilización de la lactosa como fuentede carbono

El gas en la campana de Durham indica fermentación de la lactosa con formación de gas a esatemperatura de 37 ºC.

En este caso sí hay turbidez pero no hay gas, por lo que la prueba presuntiva es Negativa (-)

Aislamiento sobre medio selectivo:

Aislo por estría en agar Endo, que es un medio específico para Coliformes totales, y después deincubar la placa a 37ºC durante 24h, se observan colonias verdes brillantes aisladas, que es lamorfología típica de Coliformes totales.


Presencia de Coliformes totales en la muestra B (mosto)

ANÁLISIS CEPA PROPIA: 1109 Cryptococcus sp

Aislamiento: Agotamiento por estría

Procedimiento:

Dividir la placa en 4 cuadrantes, cerca de la llama, con el asa de siembra cogemos el inóculo, enel primer cuadrante hacer una estría, quemamos el asa de siembra y arrastramos de la estría del

primer cuadrante hacia el segundo haciendo una nueva estría, y así con los otros dos cuadrantescomo se muestra en el dibujo.


Incubar 24h a 37ºC.




Incubar 24h a 37ºC.

Resultado:

No creció bien en Agar Nutritivo, pero he conseguido aislar 2 colonias.

Pruebas bioquímicas

INDOL

Fundamento:

Es una prueba bioquímica para la identificación bacteriana, con la que se determina si la bacteria posee una enzima (triptofanasa). El aminoácido triptófano, forma parte de las peptonas del medio.

La triptofanasa hidroliza el triptófano en indol y alanina. El indol se detecta empleando unreactivo específico (Reactivo de Kovacs).

Medio cultivo:

Agua de triptona.

Tipo siembra:

Inocular el medio con asa de siembra.


Incubar a 37 oC durante 24 horas

Reactivos:

Después de incubar, añadir unas gotas de reactivo de Kovacs resbalando por la pared del tubo,formando una capa en la superficie.

Resultados:

Un anillo rosa-rojizo en la superficie indica que se ha formado un complejo coloreado entre elindol y el p-dimetilamino benzaldehído, se consideraría (+) Positivo.

En este caso no ha cambiado de color, por tanto se considera (-) Negativo, lo que significa queNO posee triptofanasa (nuestra cepa es una levadura)



ROJO DE METILO

Fundamento:

Es una prueba bioquímica para la identificación bacteriana Detecta la fermentación ácido-mixta.

Se acumulan ácidos (acético, fórmico, etc.), relativamente fuertes y bajan el pH del medio hasta 4-5.Dicho cambio de pH se detecta añadiendo un indicador (rojo de metilo) al cultivo.

Medio cultivo:

Medio de Clark-Lubs.

Tipo siembra:



Incubar a 37 oC durante 24 horas.

Reactivos:

Indicador Rojo de metilo

Resultados:

El indicador es rojo a pH 4-5 y amarillo a pH>6, por lo tanto se considera (+) Positivo si elcultivo cambia de color a rojo, y (-) Negativo si no cambia de color

En este caso es Negativo, lo que significa que no hace fermentación ácido-mixta.

VOGES-PROSKAUER

Fundamento:

Es una prueba bioquímica para la identificación bacteriana, que detecta la fermentación butanodiólica. En esta fermentación se producen menor cantidad de ácidos que en la fermentaciónácido-mixta, y una gran cantidad de butanodiol.

Mediante un reactivo, (alfa-naftol y KOH al 40%), se detecta la presencia de un precursor del butanodiol, la acetoina, que en presencia de oxígeno se oxida a diacetilo. El diacetilo origina unacoloración roja al reaccionar con los restos guanidínicos de algunos aminoácidos de la peptona delmedio.

Medio cultivo:

Medio de Clark-Lubs.



Tipo siembra:




Reactivos:

Añadir unas gotas de alfa-naftol, agitar y añadir KOH al 40% agitar de nuevo.

Resultados:

La acetoína en contacto con el oxígeno y la potasa origina diacetilo. El alfa naftol incrementa lasensibilidad de la reacción. El diacetilo origina un compuesto de color rosado. La prueba será (+)

Positiva si en 20 minutos aparece una coloración roja.

En este caso no ha cambiado de color, por tanto se consideran (-)Negativos, lo que significa quemi cepa no hace la fermentación butanodiólica.

CITRATO

Fundamento:

Es una prueba bioquímica para la identificación bacteriana, en la que se determina si la bacteriaes capaz de utilizar el citrato como única fuente de carbono y energía.

El medio de Simmons es un medio sólido con citrato sódico y un indicador ácido-base (azul de bromotimol). En este caso se detecta la alcalinización del medio por el consumo del citrato.

Medio cultivo:

Medio de Citrato de Simmons en slant.

Tipo siembra:

Como es sólido se hace una estría con asa de siembra recta.


Incubar a 37 oC durante 24 horas

Reactivos:

Indicador ácido-base (azul de bromotimol)



Resultados:

Se detecta el crecimiento por alcalinización del cultivo. Es decir, es (+) Positivo si se pone decolor azul, y (-) Negativo si se queda verde.

En este caso no ha cambiado de color, Negativo (-), significa que este m.o no es capaz deusar el citrato como única fuente de carbono y energía

MANITOL- MOVILIDAD

Fundamento:

Es una prueba bioquímica para la identificación bacteriana, que detecta si las bacterias soncapaces de fermentar el manitol liberando productos ácidos que serán detectados gracias al

indicador rojo de fenol que cambiará a color amarillo.

También sirve para determinar si un organismo es móvil o inmóvil. Las bacterias tienenmovilidad por medio de sus flagelos que se encuentran principalmente entre los bacilos aunqueexisten algunas formas de cocos móviles.

Medio cultivo:

El medio es manitol- movilidad, agar recto, es semisólido.

Tipo siembra:

Por picadura con asa de siembra recta.



Reactivos:

Indicador rojo de fenol

Resultados:

Si el tubo cambia de color a amarillo es Manitol (+), significa que el m.o es capaz de fermentar elmanitol liberando productos ácidos, que hacen que el indicador cambie de color, si permanece rojoes Manitol (-) significa que no es capaz de fermentar el manitol.

En este caso no ha cambiado de color, es Manitol (-) no es capaz de fermentar el manitol yMovilidad (-) no se ha desplazado de la picadura



NITRATOS

Fundamento:

Determinar la capacidad de un microorganismo de reducir los nitratos a nitritos o gas nitrógeno

libre.

En esta prueba se detecta una respiración anaerobia: la que utiliza nitrato como aceptor final deelectrones. Los nitratos se reducen a nitritos y algunas bacterias reducen los nitritos a productosgaseosos ( N2 y N2O). Las enzimas responsables de ambas reducciones se denominan nitrato ynitrito reductasa, respectivamente.

La reducción de nitrato a nitrógeno gaseoso (N2) u oxido nitroso (N20) se denominadesnitrificacion.

Medio cultivo:

Caldo nitrato o agar nitrato.

Tipo siembra:

Introducimos una campana de Durham boca abajo en el medio de cultivo, para saber si producegas. Inoculamos el medio con asa de siembra curva.


De 24 a 72horas a 37ºC.

Reactivos:

Zinc y reactivo A-B (alfanalfilamina y ácido sulfanílico).

Resultados:

Añadimos 2 o 3 gotas del reactivo "A-B", si aparece coloración rojo cereza indica que es

positivo, es decir, el m.o reduce nitratos a nitritos, si no aparece coloración es un presunto negativo, para confirmarlo basta con añadir una punta de espátula de Zinc y si realmente es negativo setornara rojo.

La ausencia de nitritos puede tener un origen doble: no se formaron( quedan nitratos) o seformaron y se redujeron a gas( no quedan nitratos).

La reducción de nitritos hasta gas se detecta si hay burbuja de gas en la campana Durham.

En este caso es Negativo (-), no había gas en la campana de durham y se ha puesto rojo solodespués de añadir la punta de espátula de Zn, lo que significa que quedan nitratos, el m.o no ha

sido capaz de reducirlos a nitritos.



Tinción de Gram

Procedimiento:

1.Preparar frotis, secarlo al aire y fijalo con calor.2.Cubrir el frotis con reactivo de cristal violeta durante 1 minuto. Fig. (a)3.Lavar la preparación en una corriente suave de agua hasta eliminar el exceso de colorante(unos cinco segundos).4.Lavar el frotis con el mordiente lugol durante 1 minuto. Fig. (b)5.Repetir el lavado segundo o indicado no paso 3.6.Decolorar con alcohol-acetona durante 1min. Fig. (c)7.Lavar con abundante agua destilada.8.Cubrir con safranina durante 1min. Fig. (d)

9.Lavar con abundante agua destilada para eliminar el colorante de contraste.10.Secar la preparación al aire.11.Observar la preparación al microscopio.


Resultado:

Mi cepa es una levadura, la tinción de Gram es un método para la identificación bacteriana, por lo que no la diferencia de nada, aún así, las células se tiñen de azul, por lo tanto es Gram +

Cristal violeta → Lugol → Alcohol-acetona → Safranina



ANÁLISIS SUPERFICIES: Método del hisopo

Muestra:

- Recogida el Miércoles 30/5/2012 a las 11:30a.m con hisopo en uñas y manos propias.(Superficie aproximada 100cm2)


Medio cultivo:

- Agua de peptona

- Agar nutritivo

Procedimiento:

Mojar el hisopo en el agua de peptona, presionando ligeramente el tubo para escurrir el mediosobrante.

Pasar el hisopo mojado por las uñas y manos.Hacer una estría con el hisopo por la placa de AN.


Incubamos la placa a 37ºC durante 48h


Recuento

Incubar a 37ºC durante 48h

DÍA 1

DÍA 3

Agua de peptona

AN



Resultados:

He contado más de 300 colonias en la placa de AN, pero en realidad no se si son bacterias,hongos.... porque no he pedido medio específico para hongos y levaduras (CGA).


> 300UFC/mano

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