ABSORCIÓN

ABSORBANCIA También conocida como Densidad öptica (OD) la Absorbancia se define como la relación (logarítmica) entre la intensidad de la luz que incide sobre una muestra y la intensidad de esa misma luz que es transmitida a través de esa muestra. Cuando una luz de una longitud de onda determinada, seleccionada por un filtro, incide sobre una muestra, parte de esa luz es absorbida. La luz no absorbida pasa a través de la muestra y es recogida por un detector colocado en el otro lado del pocillo de la microplaca, frente a la fuente de luz.

Como la cantidad de luz absorbida por la muestra está en relación con su concentración (Ley de Lambert-Beer), la absorbancia se emplea para la cuantificación de ácidos nucleicos y proteinas así como en reacciones colorimétricas, como por ejemplo test de ELISA.

Cuando un haz de luz incide sobre un cuerpo traslúcido, una parte de esta luz es absorbida por el cuerpo, y el haz de luz restante atraviesa dicho cuerpo. A mayor cantidad de luz absorbida, mayor será la absorbancia del cuerpo, y menor cantidad de luz será transmitida por dicho cuerpo. Como se ve, la absorbancia y la transmitancia son dos aspectos del mismo fenómeno. La absorbancia, a una determinada longitud de onda lambda, se define como:

Donde I es la intensidad de la luz que pasa por la muestra (luz transmitida) y I0 es la intensidad de la luz incidente. La medida de la absorbancia de una solución es usada con mucha frecuencia en laboratorio clínico, para determinar la concentración de analitos tales como colesterol, glucosa, creatinina y triglicéridos en sangre. Cada uno de estos analitos se hace reaccionar químicamente con determinados compuestos, a fin de obtener una solución coloreada. A mayor intensidad de color, mayor será la absorbancia de la solución en una determinada longitud de onda. La absorbancia es entonces directamente proporcional a la concentración del analito en sangre. Para medir esta absorbancia, se hace incidir un haz de luz con determinada intensidad y longitud de onda, sobre la solución, y se mide la luz transmitida al otro lado de la cubeta que contiene dicha solución. Estas técnicas están comprendidas en el área de la espectrofotometría.

Cuando la absorbancia se calcula por unidad de longitud, por otra parte, se utiliza la idea de densidad óptica. Esta magnitud alude específicamente al nivel que absorbe un elemento óptico de acuerdo a la unidad de distancia.

La espectrofotometría indica que la absorbancia se calcula dividiendo la intensidad de la luz que atravesó una muestra por la intensidad de la luz que existía antes de ingresar a dicha muestra. En otras palabras: se relaciona la intensidad que sale o se transmite con la intensidad que ingresa o incidente.

SELECTORES DE LONGITUD DE ONDA

MONOCROMADORES

COMPONENTES DE LOS MONOCROMADORES

TIPOS DE INSTRUMENTOS ÓPTICOS

COMPONENTES DE LOS INSTRUMENTOS QUE SE EMPLEAN EN LA ESPECTROSCOPIA ÓPTICA

Fuentes de radiación Selectores de longitud de onda Detectores Procesadores de Señales y dispositivos de lecturas Cubetas

1. FUENTES DE RADIACIÓNEn los estudios espectroscópicos, la fuente

deberá generar un haz de radiación que tenga potencia suficiente y así facilitar la detección y la medición. Con voltaje de salida estable, es necesario utilizar una fuente regulada para la estabilidad requerida.

Son de dos tipos: Fuentes continuas Fuentes de Líneas.

FUENTES Fuentes continuas.- la radiación varía solo de manera gradual con la longitud de onda. Fuentes que emiten un continuo de longitudes de onda. Fuentes de líneas.- emiten un número restringido de bandas de radiación, abarca un margen reducido de longitudes de onda.

FUENTES CONTINUAS Fuentes Continuas de radiación Visible Una lámpara común de filamento de tungsteno proporciona un espectro continuo desde 320 a 2500 nm. Su intensidad varía con la cuarta de potencial del voltaje. Por esta razón generalmente necesita una fuente de voltaje estabilizada electrónicamente. Opera normalmente a 2900ºK.

LÁMPARA DE TUNGSTENO, VISIBLE

FUENTES CONTINUAS

Lámpara de tungsteno/halógeno contiene una cantidad de yodo dentro de la caja de cuarzo que aísla el filamento. El cuarzo permite que el filamento opera una temperatura de 3500 K con lo cual se producen intensidades mayores y aumenta el intervalo de la lámpara en la región ultravioleta. Su duración es más del doble que la de tungsteno.Tiene mayor intervalo de long. de onda, mayor intensidad y duración.

FUENTES CONTINUAS DE RADIACIÓN UV Lámparas de deuterio (de hidrógeno),

se utilizan para proporcionar una radiación continua en el intervalo de 160 a 380 nm.Estas fuentes son las más utilizadas en UV.

LÁMPARA DE DEUTERIO Consiste en un tubo cilíndrico con una ventana de cuarzo de la que sale la radiación. El tubo contiene deuterio a baja presión. La excitación se lleva acabo aplicando unos 40 V entre el electrodo calentado cubierto de óxido y un electrodo de metal. Para la intensidad constante, fuente de energía regulada.

FUENTES CONTINUAS DE RADIACIÓN IR. La Rad. IR se produce calentando

sólidos inertes. Globar.- consiste en una varilla de carburo de silicio de 5 por 50 nm. Emite una rad. En una región de 1 a 40 μm cuando se calienta eléctricamente a 1500 ºC aproximadamente

FUENTES CONTINUAS DE RADIACIÓN IR Emisor de Nernst es un cilindro de 2

por 20 nm formando óxidos de circonio y de itrio, emite rad. IR cuando se calienta a una temperatura elevada, por el paso de la corriente eléctrica. Las espirales de alambre de nicromo calentadas eléctricamente también sirven como fuente de Rad. IR.

2. SELECTORES DE LONG. DE ONDA

Normalmente los instrumentos espectroscópicos vienen equipados con uno o más dispositivos que restringen la radiación que se va a medir a una banda estrecha para que se absorba o emita por el analito. Estos dispositivos aumentan mucho la selectividad y sensibilidad de un instrumento. Además, para las mediciones de abs. , la banda estrecha aumenta la posibilidad de que el instru- mento responda linealmente con la concentra- ción del analito.

MONOCROMADORES Monocromador.-Mecanismo para identificar la radiación policromática en longitudes de onda que la componen Son de dos tipos, uno de ellos utiliza una red para dispersar la radiación en sus longitudes de onda individuales. El otro utiliza un prisma para este fín. Normalmente los equipos comerciales usan redes.

MONOCROMADOR DE RED.

MONOCROMADOR Ancho efectivo.- es el intervalo de longitudes de onda o frecuencias de un pico de Abs. o emisión a la mitad de la altura del pico.

ANCHO DE BANDA Va a depender de la calidad del elementodispersante de la anchura de la rendija y la distancia focal del monocromador. Un monocromador de alta calidad tendrá un ancho de banda efectiva en pocas décimas de nánometro, o en menos en la

visible y UV. ( 1 a 20 nm)

FILTROS Filtro de Absorción.- Medio colorido (por lo común un vidrio) que transmite una banda

relativamente estrecha del espectro visible banda efectiva de 5 a 20 nm. Filtro de interferencia.- Filtro óptico que proporciona anchos de banda estrechos gracias a la interferencia constructiva

450 nm ,T= 66%, ancho de banda efectivo 10 nm.

FILTROS

Ancho de banda paraFiltros de interferenciay filtros de absorción

3. DETECTORES Y TRANSDUCTORES Un detector es un dispositivo que indica la existencia de algún fenómeno físico. Ojo humano.

Un transductor es un tipo especial de detector que transforma señales como intensidad de luz, pH, masa y temperatura

en señales eléctricas que posteriormente se pueden ampliar, manipular y finalmen- te convertir en números proporcionales a la magnitud de la señal original.

El transductor ideal para la radiación electromagnética responde rápidamente a niveles bajos de energía radiante en una amplia región de longitudes de onda. Además

produce una señal eléctrica que se puede ampliar fácilmente y con un nivel de ruido re- lativamente bajo. Muchos detectores tienen una señal cte. cono- cida como corriente oscura. La corriente oscura es la que se produce en ausencia de luz.

TIPOS DE TRANSDUCTORES Detectores de fotones• 1) fototubos• 2) tubos fotomultiplicadores• 3) fotodiodos de silicio• 4) celdas fotovoltaicasDetectores Térmicos Par térmico, Bolómetros, Celdas neúmati- cas y celdas piroeléctricas.

TIPOS DE TRANSDUCTORES

Detectores de fotones.- responde a los fotones , se basan en la interacción de la radiación con la superficie reactiva para producir e¯ (emisión de fotones) promover e¯a estados de energía en los que puedan conducir electricidad (fotoconducción) solo UV y Visible e IR cercano tienen energía suficiente para producir estos procesos.

Detectores Térmicos.- responden al calor. Detector de IR que produce calor como consecuencia de la absorción de radiación.

En el IR los fotones carecen de energía suficiente para causar fotoemisión por lo que se utilizan detectores térmicos.

Sus características son inferiores a los de fotones.

DETECTORES DE FOTONES1.- Fototubos.- Un fototubo consiste en un cátodo semicilíndrico y un ánodo de alambre sellados al vacío dentro de una cubierta transparente. Cuando se aplica el potencial entre los electrodos , los fotoelectrones fluyen al ánodo produciendo corriente eléctrica. Estos tubos producen una corriente oscura ( se debe a los emisión de e¯ inducida térmicamente).

¯

2.- Tubos fotomultiplicadores (TFM) Tiene una construcción similar a la del fototubo, más

sensible. La superficie del cátodo similar a la del fototubo. Los e¯ emitidos son acelerados hacía el dínodo (marcado 1) que se mantiene a un potencial 90 V más positivo que el cátodo.

Cada uno de los fotoelectrones acelerados que chocan en el dínodo , produce unos e¯ más , acelerados al dínodo 2. cuyo voltaje es 90 V más que le dínodo 1 y se repite el proceso. Cada dínodo restante , origina 10 a la 6 y 10 a la 7 e¯, esta cascada de e¯ se recoge en el ánodo.

3.- Fotodiodos de silicio. El Si es semiconductor, Grupo IV A , 4 e¯ de valencia . Se aumenta su conductividad con un elemento del grupo III A o VA, del VA el As 4 de sus 5 e¯ forman enlaces covalentes con el As , dejan un e¯ libre que produce la conductividad del cristal- (tipo n).

Cuando el Si es recubierto con un elemento del grupo III A, como el Ga. Solo tiene 3 e¯Se forma un exceso de agujeros que aumenta la conductividad. (tipo p)pn .- + están en la región p (agujero) falta un e¯, - son los n (1 e¯).Un detector de silicio es más sensible que el fototubo pero menos sensible que el fotomultioplicador.

¯

4.- Celdas fotovoltaicas.-Una celda fotovoltaica (o fotocelda) es más simple, consiste en un electrodo plano de cobre o hierro sobre el que se deposita una capa de material semiconduc-

tor , como selenio u óxido de cobre(I) . La superficie externa del semiconductor se cubre con una fina película transparente de oro, plata o plomo que sirve como segundo electrodo colector. Detecta la visible, es sólido y de bajo costo, no necesita fuente externa pero no es muy sensible.

Detectores de calor.- consiste en una fina superficie ennegrecida que abs. La rad. IR y como consecuencia aumenta la temperatura. El aumento se transforma a señal eléctrica que posteriormente se amplia y se mide. Las mediciones en el IR son significativamente menos precisa que la UV- Visible.Algunos detectores térmicos.- par térmico, bolómetros, celdas neumáticas y celdas piroeléctricas.

4. PROCESADORES DE SEÑALES Y DISPOSITIVOS DE LECTURAS. El procesador de señales es un dispositivo

electrónico que amplifica a la señal eléctrica proveniente del detector; además puede alterar la señal de corriente directa (cd) a alterna (ca)(o ala inversa) , cambiarla de fase y filtrarla para eliminar los componentes no deseados. Puede decirse que el procesador también realiza operaciones matemáticas con las señales para diferenciarlas, integrarlas y convertirlas en log. Los modernos lectura digital, escalas , registradores, monitores de microcomputadoras

5. CUBETAS Los recipientes para la muestra, conocidoscomo celdas o cubetas, deben tener ventanasque sean transparentes en la región del espec-tro de interés.Las mejores celdas tienen ventanas que son -perpendiculares, para disminuir las pérdidas -por reflexión.

La calidad de los datos espectroscópicos de-pende en gran medida de la forma como se uti-lizan las celdas y su mantenimiento. Las mar-cas de huellas digitales, grasa u otros depósi-tos sobre las paredes alteran las característicasde transmisión de las celdas. Es necesario una limpieza minuciosa, no tocar las ventanas. Nosecarlas en horno o la flama, sufren daño físicose calibran con una solución de Absorción.

Limpieza y manejo de las celdas:

Las celdas se desgastan y se rayan con el usose deben de calibrar periódicamente una con – otra para detectar diferencias ópticas.

La limpieza más eficaz es limpiar las ventanascon papel para lentes humedecido con metanol éste se evapora y las ventanas quedan libres - de contaminantes.

Es mejor que papel seco, por los residuos.

CUBETAS

MÉTODOS DE TRABAJOLos cuatro métodos de operar en colorimetría o espectrofotometría se asemejan en que una muestra desconocida se compara con muestras conocidas o patrones, pero difieren en el modo de hacer esta comparación.

Método de compensación. Método de las series patrón.

MÉTODO DE COMPENSACIÓN La muestra desconocida, que debe contener el

reactivo necesario para el desarrollo del color, se coloca en un tubo o cilindro que tiene la base transparente. Una disolución patrón de la misma sustancia y con el color desarrollado de igual modo, se coloca en un segundo tubo o cilindro, idéntico al anterior. La profundidad (espesor, camino óptico) de la disolución patrón se fija en un valor conveniente y la profundidad de la disolución desconocida se varia hasta que la luz situada bajo los tubos se observe, mirando desde arriba, con idéntica intensidad (transmisión). En términos de la ley de Bouguer-Beer:

Al ser la misma sustancia la que está presente en los tubos que contienen la disolución patrón y la desconocida, la absortividad a es la misma para ambas.

Cuando las dos disoluciones tienen igual transmitancia, P1/P0, y de aquí que b1c1=b2c2. Las concentraciones son inversamente proporcionales a los caminos ópticos en el punto de equicoloración. Las transmitancias observadas son idénticas, porque hay el mismo número de partículas absorbentes en el camino óptico.

El método de compensación es el empleado en el colorímetro de Dubosc. La luz procedente de una fuente adecuada, tal como la luz solar difusa o de una lámpara de tungsteno, se refleja en los cilindros colorimétricos que contienen las disoluciones mediante un espejo. Los cilindros están montados de tal forma que se puedan mover verticalmente por un tornillo de cremallera. Los cilindros se elevan hasta que los émbolos se sumerjan bien la disolución. Uno de los cilindros se fija en una posición conveniente y el otro se sube o baja hasta que los colores en las dos mitades del ocular sean equiparables. El espesor de cada solución bajo el embolo se lee en la escala impresa en los acoplamientos de cilindro. Normalmente se halla un promedio de varias medidas para hacer los cálculos. La exactitud es del orden del 2 al 5%, aunque depende de muchos factores.

MÉTODO DE LAS SERIES PATRÓN Se prepara una serie de disoluciones patrón del constituyente

que se analiza; la concentración de una disolución difiere de la concentración siguiente en una cantidad adecuada. Se desarrolla el color en la muestra desconocida del mismo modo que en las disoluciones patrón y la desconocida se compara con las patrones. Esta comparación puede ser por uno de los dos métodos siguientes.

a) Comparación directa o de igualación. Se prepara la serie de disoluciones patrón en tubos largos y estrechos de idéntico diámetro y aforado para conseguir igual profundidad; la disolución desconocida se coloca en un tubo de iguales características. Se observan desde la parte superior los tubos colocados en una gradilla, mientras se ilumina por la parte inferior. Así se determina la disolución patrón que es semejante a la desconocida; esta, por tanto, contiene la misma cantidad del constituyente que se desea determinar que el patrón al que se asemeja. Los tubos empleados son normalmente los llamados tubos Nessler.

b) Comparación indirecta. En este método el <<color>> se mide como transmitancia o absorbancia en un aparato usando algún tipo de fototransformador en lugar del ojo. La medida es la lectura de un medidor o la posición de un registro grafico en una grafica. Cada serie de patrones se mide en tandas, y las lecturas, o alguna función con ella relacionada, se representa en función de la concentración obteniéndose así una curva de calibración. El problema, preparado de la misma forma que los patrones se mide también y la lectura del instrumento se convierte en concentración con auxilio de la curva de calibración. El método esta exento de los errores personales de comparación visual de color. Es posible obtener una exactitud del orden del 0.05% de error .relativo y , modificando la técnica, incluso hasta del 0.01% de error relativo.

Es posible calcular la concentración de una disolución desconocida mediante la medida de la transmitancia o de la absorbancia de una sola disolución patrón y del problema, haciendo uso de las leyes de la espectrofotometría. Conociendo la concentración de la disolución patrón, el camino óptico y la transmitancia o la absorbancia medida, se puede calcular la absortividad a mediante la relación – log T = A = abc. Los cálculos basados en varias medidas con disoluciones patrones son más seguros que los basados en una sola medida de una concentración conocida.

FOTOMETROSEn el colorímetro Duboscq los componentes son únicamente una fuente de energía radiante, cubetas para contener la disolución, prismas reflectantes y lentes para dirigir la luz transmitida hacia el ojo del observador, que se usa como receptor.

En los aparatos sencillos se utilizan filtros de vidrio o gelatina (Wrattan) para eliminar o disminuir la energía radiante de algunas longitudes de onda y dejar pasar las de otras regiones seleccionadas. En los espectrofotometros, el haz procedente de la fuente lumínica se dispersa en un espectro continuo al pasar a través de un prisma, o red de difracción. En estos instrumentos el haz que pasa a través del prima puede reflejarse y dar dispersiones adicionales. Para este propósito también puede utilizarse un prisma y una red de difracción. Los prismas y/o las redes de difracción, con sus accesorios, lentes, espejos y rendijas, se llaman monocromadores.

COMPONENTES ÓPTICOS DE UN ESPECTROFOTÓMETRO

INSTRUMENTOS COMERCIALES El modelo Bausch and Lomb Spectronic 20 utiliza una red de

difracción duplicada, un circuito eléctrico con un código de colores y tubos de ensayo especiales para las cubetas de absorción. Tiene lectura directa en transmitancias y absorbancias. El bajo costo y el estrecho paso de la banda espectral le hacen especialmente adecuado para aplicaciones analíticas en trabajos de rutina.

El espectofotometro Beckman Modelo B, es un aparato de precio medio que cubre la zona de longitudes de onda comprendidas entre 325 y 1.000 mµ. Es un aparato de lectura directa con varias posiciones de expansión de escala del selector de sensibilidad para medidas de disoluciones de gran absorbancia. Se pueden acomodar cubetas de absorción hasta de 10 cm de camino óptico.

El espectofotometro Beckman Modelo DU tiene óptica de cuarzo y cubre la zona de longitudes de onda de 200 a 2.000 mµ. Es un instrumento de cero, graduado para leer transmitancias o absorbancias. El Beckman Modelo DB tiene óptica de cuarzo. El haz de energía que procede del monocromador pasa alternativamente a través de la muestra y de la disolución de referencia por medio de un espejo vibrador, obteniéndose así un efecto de “doble haz simultaneo”, con lectura directa de en transmitancias o absorbancias. Esta provisto de conexiones para un accesorio de registro grafico.

Los espectrofotómetros de registro grafico mas caros son lo de Beckman, los modelos DK-1 y DK-2 y el Cary, modelo 14. Estos aparatos cubren las regiones del ultravioleta visible e infrarrojo próximo, con alto poder de resolución. Son aparatos de gran versatilidad para registro grafico de transmitancias y absorbancias, expansión de escala y velocidad variable de registro.

Los espectofotometros de infrarrojo de registro grafico (Perkin-Elmer, Baird, Berckman) con óptica de sal gema cubren la zona de longitudes de onda de 2 a 16 µ; las partes ópticas hechas con otros materiales se utilizan para otras regiones de longitudes de onda o para mayor poder de resolución. Están provistas de accesorios para análisis de gases, líquidos y disoluciones, y sólidos finamente dispersos. Los espectrofotómetros de infrarrojo encuentran amplia aplicación en la determinación de constituyentes de compuestos orgánicos (en algún grado también de compuestos inorgánicos). Se utilizan mucho estos aparatos en laboratorios de control e investigación para el análisis de compuestos orgánicos.

PUESTA A UN METODO ESPECTROFOTOMETICO

Gran cantidad de iones inorgánicos en disolución acuosa absorben suficiente energía radiante en la región del visible, lo que permite su determinación espectrofotométrica directa, incluso en muy bajas concentraciones.

Cuando se encuentra un sistema coloreado prometedor o un color producido en una reacción, es preciso una investigación para desarrollar una determinación espectrofotométrica adecuada del constituyente. Muchos de los factores a tener en cuenta se enumeran y se discuten brevemente a continuación.

1. Selección de la longitud de onda analítica. Se estudia en el espectrofotómetro al disolución del constituyente que se analiza, después de desarrollado el calor mediante un reactivo adecuado determinándose su espectro de absorción. Si no hay interferencias de los otros componentes de la muestra en disolución, se escoge la longitud de onda del máximo de absorción para medidas futuras.

2. Efecto del exceso de reactivo. Una cantidad fija del constituyente que se busca se trata con cantidades crecientes del reactivo que desarrolla el color. Se mide la absorbancia a la longitud de onda previamente seleccionada.

Si la reacción formadora de color es prácticamente completa cuando están presentes cantidades estequiometrias a los reactivos, la adicion de mas cantidad de reactivo dará lugar a pequeños incrementos de la absorbancia si es que la hace aumentar algo. Por otra parte, si la reacción es completa, la adicción de cantidades crecientes de exceso de reactivo desplazara el equilibrio hacia la formación de más especie coloreada y dara lugar a un aumento de la absorbancia.

3. Efecto del tiempo. Algunas reacciones de formación de color son muy rápidas, otras son muy lentas. Además, algunas especies coloreadas experimentan <<desvanecimientos>> debidos a la descomposición por la luz y/o por el calor, o, aparentemente, por reposo. Lo ideal es que la reacción de formación de color sea rápida, de tal forma que los resultados analíticos puedan obtenerse con rapidez.

4. Efecto del pH. En el caso ideal deberá existir un amplio margen de pH en el cual la absorbancia no variase, cuando el control de pH es muy critico, se deben utilizar disoluciones adecuadas de gran capacidad reguladora; o bien, se ajusta el pH de la solución al valor deseado mediante un pH metro.

5. Efecto de la temperatura. Se requieren a veces temperaturas elevadas para aceleraer la formación del producto coloreado; pero puede también aumentar la velocidad de decoloración. El control de la temperatura puede ser necesario no solo para el desarrollo del calor si no también durante la medida de la absorbancia; esto es muy importante cuando se utilizan disolventes orgánicos que tienen un elevado coeficiente de dilatación.

6. Conformidad con la ley de Beer. Una relación lineal entre concentración y absorbancia simplifica el procedimiento de calibración, así como los cálculos en el análisis; también da la seguridad de que las condiciones de análisis que se han establecido son satisfactorias.

7. Efecto de las sustancias extrañas. El reactivo formador de calor debería ser específico o muy selectivo para el constituyente que se analiza. Las sustancias extrañas no deberían impedir la reacción de formación del color, ni dar otro análogo (espectro de absorción). Se deben hacer pruebas siempre con las sustancias extrañas que estén presentes en la muestra a analizar.Otros factores a considerar son la estabilidad del reactivo formador de calor, la carencia del sistema a medir en precipitados o dispersiones colídales (en que es muy difícil de reproducir la distribución de tamaños de partícula) y selección del disolvente adecuado.

7. Precisión del método. Se deben hacer medidas de muestras repetidas para evaluar la precisión del método. La mejor forma de expresar la presicion es mediante la desviación típica.