Introduccion a tecnicas
55
Seminario Genética Técnicas de Biología Molecular
Transcript of Introduccion a tecnicas
Seminario Geneacutetica
Teacutecnicas de Biologiacutea Molecular
Contenidos
Extraccioacuten de ADN
Enzimas de restriccioacuten
PCR
Southern Blot
Secuenciacioacuten meacutetodo de Sanger y automaacutetica
1ordm Extraccioacuten de ADN
Se pueden tomar diferentes fuentes para extraer ADN humano
Sangre Saliva Semen hisopado vaginal restos de fluidos en ropa orina piel bulbo
piloso muestras biospsias de oacuterganostejidos material cadaveacuterico (ej huesos) etc
Se separa el ADN de otras
fases orgaacutenicas celulares
El ADN purificado refrigerado a 4 deg C puede conservarse por lo menos un maacuteximo de 3 antildeos
Aquellas muestras que necesitan mantenerse maacutes de 3 antildeos deberaacuten congelarse a -70 deg C
2ordm Almacenamiento
y conservacioacuten del ADN
Las teacutecnicas desarrolladas utilizan
bullFundamentos
Complementariedad de bases
Replicacioacuten del ADN
bullHerramientas
Elementos de virus y bacterias
(Ejemplo Transcriptasa Reversa Enzimas de Restriccioacuten Polimerasas etc)
Soacutelo veremos Teacutecnicas Directas
bullSouthern Blot
bullPCR
bullSecuenciacioacuten
Directa
Fundamentos
Complementariedad de bases
Replicacioacuten del ADN
SOUTHERN BLOT
Edwin Southern desarrolloacute esta teacutecnica en 1975
Sirve para detectar por Hibridacioacuten la presencia de una porcioacuten de ADN en una muestra
Fundamento COMPLEMENTARIEDAD DE BASES
Se disentildea una sonda con nucleoacutetidos marcados que sean complementarios al sector de ADN buscado
El sector de ADN buscado puede ser un gen o parte del mismo u otras zonas del genoma Se puede utilizar para el diagnoacutestico molecular de patologiacuteas geneacuteticas
Southern Blot
HIBRIDACIOacuteN
La doble hebra de ADN se forma por complementariedad SONDA-muestra (una de las hebras es la sonda en simple cadena y la otra es la muestra en simple cadena)
Los nucleoacutetidos de la sonda estaacute marcados P 32
(radiactivos) Si al revelar hay marcador radiactivo presente estaacute en la muestra analizada la secuencia complementaria a la sonda
Southern Blot
Para poder realizar Hibridacioacuten
en una muestra de ADN
se necesitan realizar
los siguientes pasos
Fragmentacioacuten del ADN y Separacioacuten
Inmovilizacioacuten- Desnaturalizacioacuten
Transferencia
Hibridacioacuten
Revelado
Enzimas de restriccioacuten
ENZIMAS DE RESTRICCION
Los fragmentos de restriccioacuten se pueden separar por tamantildeo mediante electroforesis en gel
Diferentes condiciones de hibridacioacuten permite mayor o menor estabilidad y especificidad
Pasos Previos a la Hibridacioacuten
separacioacuten de fragmentos
Extraccioacuten de ADN
Fragmentar el ADN en porciones maacutes pequentildeas
(Enzimas de restriccioacuten)
Separo los fragmentos realizando una corrida
electroforeacutetica usando como sustrato de
migracioacuten un gel (separacioacuten por tamantildeo)
Pasos Previos a la Hibridacioacuten
Inmovilizacioacuten de los fragmentos en soporte soacutelido
Desnaturalizacioacuten (SIMPLE CADENA)
Transferencia a soporte soacutelido (membrana de nylon nitrocelulosa) Por
capilaridad o por electroforesis pasan del gel a la membrana
Sacado de los bocetos de Edwin Southern
antes de la publicacioacuten de la teacutecnica
Pasos Hibridacioacuten
Se agrega la sonda sobre la membrana y se
incuba
Se lava para quitar el maacuteximo de hibridaciones
inespeciacuteficas
Se revela por autoradiografiacutea
Soacutelo veremos Teacutecnicas Directas
bullSouthern Blot
bullPCR
bullSecuenciacioacuten
PCR Reaccioacuten en cadena
de la polimerasa
Kerry Mullis en 1983 desarrolloacute esta teacutecnica
Amplificacioacuten de un gran nuacutemero de copias a
partir de un fragmento molde de ADN utilizando
una reaccioacuten enzimatica simple de polimerizacion
in vitro
PCR
ADN moldePCR
ADN resultante
Fundamento
REPLICACION DEL ADN
COMPLEMENTARIEDAD DE BASES
Herramientas
POLIMERASA BACTERIANA
Estrategia
Utilizar cambios de temperatura para
desnaturalizar y renaturalizar las hebras de
ADN complementario
PCR
1 Desnaturalizacioacuten 94degC - 96degC
2 Alineacioacuten temperatura variable
3 Extensioacuten 68 - 72degC
PCR la reaccioacuten se divide en 3 pasos
LOS 3 PASOS FORMAN 1 CICLO Y EL CICLO PUEDE
REPETIRSE VARIAS VECES
Necesitamos en este proceso controlar
la temperatura termociclador
Si repetimos el ciclo tendremos cuatro copias
Desnaturalizacioacuten
95degC
Hibridizacioacuten
50-60ordmC
Extensioacuten de la
cadena 75ordmC
Primer Ciclo
2do Ciclo95ordmC
50 - 60ordmC
75ordmC
Muacuteltiples ciclos daraacuten un incremento
exponencial en el nuacutemero de copias
iquestQueacute elementos son necesarios para la
polimerizacioacuten in Vitro
Extraccioacuten del ADN molde
Preparado de la MIX
1 Agua libre de nucleasas
2 1048698 Catioacuten divalente (MgCl2)
3 1048698 Desoxinucleoacutetidos (dNTPacutes)
4 1048698 Sol amortiguadora y sales (Buffer 10X)
5 1048698 Oligonucleoacutetidos (Primers)
6 1048698 Enzima termo-resistente (Ej Taq Polimerasa)
Para la polimerizacioacuten de ADN es necesario
Una polimerasa primers y nucleoacutetidos
Como se utiliza cambios de temperatura para
lograr la desnaturalizacioacuten y renaturalizacioacuten
de las hebras la enzima tiene que ser
resistente a cambios de temperatura
iquestQueacute elementos son necesarios para la
polimerizacioacuten in Vitro
Thermus aquaticus se
descubrioacute en el Parque
Yellowstone inicioacute el campo
de la biologiacutea de los
hipertermoacutefilos
Thermus aquaticus crece
a 70ordm grados (fuente de
la enzima taq polimerasa
usada en la PCR)
PCR
La taq polimerasa no es la uacutenica enzima usada en la
PCR Hay muchas maacutes
Ej PFU (enzima extraiacuteda de Pynococus Furioso)
PCR
TAQ PFU
No tiene actividad 3rsquo
exonucleasa Puede
copiar con errores
Tiene actividad 3rsquo
exonucleasa
Velocidad 2000
nucleoacutetidos min
Velocidad 500
nucleoacutetidos min
Complementariedad durante la hibridacioacuten
en la fase de alineamiento
Se unen zona donde la secuencia es
complementaria
Son disentildeados los primers esto permite
seleccionar que porcioacuten amplificar
PCR Primers
PCR
Ejemplos de utilizacioacuten PCR en diagnoacutestico
1 Colocando primers Fw diferentes (una para
secuencia normal y otra mutada) y mismo Rw
en el mismo tubo
2 Combinando la PCR con cortes con enzimas de
restriccioacuten (si se generase o perdiera algun sitio de
restriccioacuten por la misma mutacioacuten)
concepto Primers alelo especiacuteficos
El siguiente es el resultado en un gel de agarosa
En la calle (1) se sembroacute
el marcador de peso
molecular
En la calle (2) se sembroacute
una muestra conocida
para una mutacioacuten
homocigota
En la calle (3) se sembroacute
la muestra del paciente
El siguiente es el resultado en un gel de agarosa
En la calle (C1) muestra
conocida homocigota
gen mutado
En la calle (C2) muestra
conocida homocigota
gen normal
iquestQueacute resultados
dieron las
muestras 1 2 3 4
iquestQueacute elementos son necesarios para la
polimerizacioacuten in Vitro
Extraccioacuten del ADN molde
Preparado de la MIX
1 Agua libre de nucleasas
2 1048698 Catioacuten divalente (MgCl2)
3 1048698 Desoxinucleoacutetidos (dNTPacutes)
4 1048698 Sol amortiguadora y sales (Buffer 10X)
5 1048698 Oligonucleoacutetidos (Primers)
6 1048698 Enzima termo-resistente (Ej Taq Polimerasa)
Los iones de magnesio
estimulan a la enzima Taq Polimerasa
para que incorpore los dNTPacutes
Algunas aclaracioneshellip
Taq
Mg
Sol amortiguadora PCR
1048698 Mantiene el pH oacuteptimo para que la enzima actuacutee
1048698 Sales
Proporcionan la fuerza ioacutenica adecuada para una maacutexima actividad de la
enzima
Herramientas
POLIMERASA BACTERIANA que resista a los cambios Tordm
Estrategia
Utilizar cambios de temperatura para desnaturalizar y
renaturalizar las hebras de ADN complementario
PCR coacutemo ve el observador el proceso
MIX +
ADN
Soacutelo veremos Teacutecnicas Directas
bullSouthern Blot
bullPCR
bullSecuenciacioacuten
Secuenciacioacuten
Meacutetodo enzimaacutetico 1977
Frederick Sanger desarrolloacute esta teacutecnica
Meacutetodo de los terminadores de cadena o dideoxi
Fundamento
REPLICACION DEL ADN
COMPLEMENTARIEDAD DE BASES
Herramientas
Dideoxinucleotidos
Estrategia
Cuando se agrega un dideoxinucleotido
a la cadena en formacioacuten se
interrumpe la polimerizacioacuten
Secuenciacioacuten
H
P
O
OH
OH
HO
O
O
CH2
NH
N
N
N
Azuacutecar
Base
Fosfato
3rsquo
5rsquo
2rsquo
1rsquo4rsquo
Jeraacuterquico OH
del carbono 3
En la polimerizacioacuten
del ADN
H
P
O
OH
OH
HO
O
O
CH2
NH2
N
N N
N
Azuacutecar
Base
Fosfato
3rsquo
5rsquo
2rsquo
1rsquo4rsquo
H
2rsquo3rsquo-dideoxinucleoacutetido
monofosfato
H
P
O
OH
OH
HO
O
O
CH2
NH2
N
N N
N
Azuacutecar
Base
Fosfato
3rsquo
5rsquo
2rsquo
1rsquo4rsquo
deoxinucleotido
monofosfato
Secuenciacioacuten utiliza deoxinucleotidos
y dideoxinucleotidos
Cuando se incorpora un dideoxinucleoacutetido se
interrumpe la polimerizacioacuten
H
P
O
OH
OH
HO
O
O
CH2
NH2
N
N N
N
Azuacutecar
Base
Fosfato
3rsquo
5rsquo
2rsquo
1rsquo4rsquo
H
2rsquo3rsquo-dideoxinucleoacutetido
monofosfato
Se realizan 4 reacciones de siacutentesis (4 tubos
separados)
Se incluyen pequentildeas cantidades de
dideoxinucleotidos ddNTP que
compiten con los dNTP
En cada tubo se colocan
1 dNTP (4 tipos)
2 un solo tipo de ddNTP por tubo
3 primer o cebador marcado
4 ADN molde a secuenciar
5 Polimerasa
A ddNTP C ddNTP
G ddNTP T ddNTP
Los productos de las 4
reacciones cada una
conteniendo una pequentildea
cantidad de uno de los cuatro
dideoxinucleoacutetidos son
cargadas en el gel y sometidas
a electroforesis
Como la polimerizacioacuten es solo
en direccioacuten 5rsquo a 3rsquo los
fragmentos maacutes cortos estaraacuten
en 5rsquo y los maacutes largos que se
encontraraacuten en la direccioacuten 3rsquo
ddTTPddCTP ddGTPddATP
Lec
tura
5rsquo
a 3rsquo
des
de
la b
asa
al t
ope
Secuenciacioacuten Separacioacuten de fragmentos
Alternativa del meacutetodo Sanger
Se marca cebador con fluorescencia y se activa la reaccioacuten
Los productos se detectan durante electroforelectroforeacutesis al
pasar por un laacuteser que excita los fluorocromos y se detecta
fluorescencia emitida
Se realizan 4 reacciones de secuencia distintas
Se coloca el cebador marcado polimerasa dNTP y ddNTP
Al finalizar las cuatro reacciones se mezclan en uacutenico tubo
SECUENCIACION AUTOMATICA empleando
meacutetodo enzimaacutetico
hellip
Placa caliente
Pol
liacutequido
ATTGC A
Laser
Prisma
Detectores
-
+Ventana
Reaccioacuten
Secuencia
Capilar
iquestCoacutemo se ve el resultado
En el electroferograma se observa dos picos en
la posicioacuten 152 (C T)
A ndash A ndash T ndash G ndash G - T - C - C ndash A ndash N - T - T - G - G - C
A ndash A ndash T ndash G ndash G - T - C - T ndash A ndash N - T - T - G - G - C
Repeticiones en tandem
La variacioacuten en el nuacutemero de repeticiones de los
distintos mini y microsateacutelites es un polimorfismo
muy frecuente
Estos polimorfismos se generan por errores durante la
replicacioacuten
Dado que las repeticiones se encuentran en forma diploide
Cada uno de nosotros posee dos variantes para una repeticioacuten
determinada
VNTR (Nuacutemero variable de repeticiones en tandem) micro sateacutelites hipervariables
Obtencioacuten de DNA a partir de RNA
Rt-PCR Transcriptasareversa
Contenidos
Extraccioacuten de ADN
Enzimas de restriccioacuten
PCR
Southern Blot
Secuenciacioacuten meacutetodo de Sanger y automaacutetica
1ordm Extraccioacuten de ADN
Se pueden tomar diferentes fuentes para extraer ADN humano
Sangre Saliva Semen hisopado vaginal restos de fluidos en ropa orina piel bulbo
piloso muestras biospsias de oacuterganostejidos material cadaveacuterico (ej huesos) etc
Se separa el ADN de otras
fases orgaacutenicas celulares
El ADN purificado refrigerado a 4 deg C puede conservarse por lo menos un maacuteximo de 3 antildeos
Aquellas muestras que necesitan mantenerse maacutes de 3 antildeos deberaacuten congelarse a -70 deg C
2ordm Almacenamiento
y conservacioacuten del ADN
Las teacutecnicas desarrolladas utilizan
bullFundamentos
Complementariedad de bases
Replicacioacuten del ADN
bullHerramientas
Elementos de virus y bacterias
(Ejemplo Transcriptasa Reversa Enzimas de Restriccioacuten Polimerasas etc)
Soacutelo veremos Teacutecnicas Directas
bullSouthern Blot
bullPCR
bullSecuenciacioacuten
Directa
Fundamentos
Complementariedad de bases
Replicacioacuten del ADN
SOUTHERN BLOT
Edwin Southern desarrolloacute esta teacutecnica en 1975
Sirve para detectar por Hibridacioacuten la presencia de una porcioacuten de ADN en una muestra
Fundamento COMPLEMENTARIEDAD DE BASES
Se disentildea una sonda con nucleoacutetidos marcados que sean complementarios al sector de ADN buscado
El sector de ADN buscado puede ser un gen o parte del mismo u otras zonas del genoma Se puede utilizar para el diagnoacutestico molecular de patologiacuteas geneacuteticas
Southern Blot
HIBRIDACIOacuteN
La doble hebra de ADN se forma por complementariedad SONDA-muestra (una de las hebras es la sonda en simple cadena y la otra es la muestra en simple cadena)
Los nucleoacutetidos de la sonda estaacute marcados P 32
(radiactivos) Si al revelar hay marcador radiactivo presente estaacute en la muestra analizada la secuencia complementaria a la sonda
Southern Blot
Para poder realizar Hibridacioacuten
en una muestra de ADN
se necesitan realizar
los siguientes pasos
Fragmentacioacuten del ADN y Separacioacuten
Inmovilizacioacuten- Desnaturalizacioacuten
Transferencia
Hibridacioacuten
Revelado
Enzimas de restriccioacuten
ENZIMAS DE RESTRICCION
Los fragmentos de restriccioacuten se pueden separar por tamantildeo mediante electroforesis en gel
Diferentes condiciones de hibridacioacuten permite mayor o menor estabilidad y especificidad
Pasos Previos a la Hibridacioacuten
separacioacuten de fragmentos
Extraccioacuten de ADN
Fragmentar el ADN en porciones maacutes pequentildeas
(Enzimas de restriccioacuten)
Separo los fragmentos realizando una corrida
electroforeacutetica usando como sustrato de
migracioacuten un gel (separacioacuten por tamantildeo)
Pasos Previos a la Hibridacioacuten
Inmovilizacioacuten de los fragmentos en soporte soacutelido
Desnaturalizacioacuten (SIMPLE CADENA)
Transferencia a soporte soacutelido (membrana de nylon nitrocelulosa) Por
capilaridad o por electroforesis pasan del gel a la membrana
Sacado de los bocetos de Edwin Southern
antes de la publicacioacuten de la teacutecnica
Pasos Hibridacioacuten
Se agrega la sonda sobre la membrana y se
incuba
Se lava para quitar el maacuteximo de hibridaciones
inespeciacuteficas
Se revela por autoradiografiacutea
Soacutelo veremos Teacutecnicas Directas
bullSouthern Blot
bullPCR
bullSecuenciacioacuten
PCR Reaccioacuten en cadena
de la polimerasa
Kerry Mullis en 1983 desarrolloacute esta teacutecnica
Amplificacioacuten de un gran nuacutemero de copias a
partir de un fragmento molde de ADN utilizando
una reaccioacuten enzimatica simple de polimerizacion
in vitro
PCR
ADN moldePCR
ADN resultante
Fundamento
REPLICACION DEL ADN
COMPLEMENTARIEDAD DE BASES
Herramientas
POLIMERASA BACTERIANA
Estrategia
Utilizar cambios de temperatura para
desnaturalizar y renaturalizar las hebras de
ADN complementario
PCR
1 Desnaturalizacioacuten 94degC - 96degC
2 Alineacioacuten temperatura variable
3 Extensioacuten 68 - 72degC
PCR la reaccioacuten se divide en 3 pasos
LOS 3 PASOS FORMAN 1 CICLO Y EL CICLO PUEDE
REPETIRSE VARIAS VECES
Necesitamos en este proceso controlar
la temperatura termociclador
Si repetimos el ciclo tendremos cuatro copias
Desnaturalizacioacuten
95degC
Hibridizacioacuten
50-60ordmC
Extensioacuten de la
cadena 75ordmC
Primer Ciclo
2do Ciclo95ordmC
50 - 60ordmC
75ordmC
Muacuteltiples ciclos daraacuten un incremento
exponencial en el nuacutemero de copias
iquestQueacute elementos son necesarios para la
polimerizacioacuten in Vitro
Extraccioacuten del ADN molde
Preparado de la MIX
1 Agua libre de nucleasas
2 1048698 Catioacuten divalente (MgCl2)
3 1048698 Desoxinucleoacutetidos (dNTPacutes)
4 1048698 Sol amortiguadora y sales (Buffer 10X)
5 1048698 Oligonucleoacutetidos (Primers)
6 1048698 Enzima termo-resistente (Ej Taq Polimerasa)
Para la polimerizacioacuten de ADN es necesario
Una polimerasa primers y nucleoacutetidos
Como se utiliza cambios de temperatura para
lograr la desnaturalizacioacuten y renaturalizacioacuten
de las hebras la enzima tiene que ser
resistente a cambios de temperatura
iquestQueacute elementos son necesarios para la
polimerizacioacuten in Vitro
Thermus aquaticus se
descubrioacute en el Parque
Yellowstone inicioacute el campo
de la biologiacutea de los
hipertermoacutefilos
Thermus aquaticus crece
a 70ordm grados (fuente de
la enzima taq polimerasa
usada en la PCR)
PCR
La taq polimerasa no es la uacutenica enzima usada en la
PCR Hay muchas maacutes
Ej PFU (enzima extraiacuteda de Pynococus Furioso)
PCR
TAQ PFU
No tiene actividad 3rsquo
exonucleasa Puede
copiar con errores
Tiene actividad 3rsquo
exonucleasa
Velocidad 2000
nucleoacutetidos min
Velocidad 500
nucleoacutetidos min
Complementariedad durante la hibridacioacuten
en la fase de alineamiento
Se unen zona donde la secuencia es
complementaria
Son disentildeados los primers esto permite
seleccionar que porcioacuten amplificar
PCR Primers
PCR
Ejemplos de utilizacioacuten PCR en diagnoacutestico
1 Colocando primers Fw diferentes (una para
secuencia normal y otra mutada) y mismo Rw
en el mismo tubo
2 Combinando la PCR con cortes con enzimas de
restriccioacuten (si se generase o perdiera algun sitio de
restriccioacuten por la misma mutacioacuten)
concepto Primers alelo especiacuteficos
El siguiente es el resultado en un gel de agarosa
En la calle (1) se sembroacute
el marcador de peso
molecular
En la calle (2) se sembroacute
una muestra conocida
para una mutacioacuten
homocigota
En la calle (3) se sembroacute
la muestra del paciente
El siguiente es el resultado en un gel de agarosa
En la calle (C1) muestra
conocida homocigota
gen mutado
En la calle (C2) muestra
conocida homocigota
gen normal
iquestQueacute resultados
dieron las
muestras 1 2 3 4
iquestQueacute elementos son necesarios para la
polimerizacioacuten in Vitro
Extraccioacuten del ADN molde
Preparado de la MIX
1 Agua libre de nucleasas
2 1048698 Catioacuten divalente (MgCl2)
3 1048698 Desoxinucleoacutetidos (dNTPacutes)
4 1048698 Sol amortiguadora y sales (Buffer 10X)
5 1048698 Oligonucleoacutetidos (Primers)
6 1048698 Enzima termo-resistente (Ej Taq Polimerasa)
Los iones de magnesio
estimulan a la enzima Taq Polimerasa
para que incorpore los dNTPacutes
Algunas aclaracioneshellip
Taq
Mg
Sol amortiguadora PCR
1048698 Mantiene el pH oacuteptimo para que la enzima actuacutee
1048698 Sales
Proporcionan la fuerza ioacutenica adecuada para una maacutexima actividad de la
enzima
Herramientas
POLIMERASA BACTERIANA que resista a los cambios Tordm
Estrategia
Utilizar cambios de temperatura para desnaturalizar y
renaturalizar las hebras de ADN complementario
PCR coacutemo ve el observador el proceso
MIX +
ADN
Soacutelo veremos Teacutecnicas Directas
bullSouthern Blot
bullPCR
bullSecuenciacioacuten
Secuenciacioacuten
Meacutetodo enzimaacutetico 1977
Frederick Sanger desarrolloacute esta teacutecnica
Meacutetodo de los terminadores de cadena o dideoxi
Fundamento
REPLICACION DEL ADN
COMPLEMENTARIEDAD DE BASES
Herramientas
Dideoxinucleotidos
Estrategia
Cuando se agrega un dideoxinucleotido
a la cadena en formacioacuten se
interrumpe la polimerizacioacuten
Secuenciacioacuten
H
P
O
OH
OH
HO
O
O
CH2
NH
N
N
N
Azuacutecar
Base
Fosfato
3rsquo
5rsquo
2rsquo
1rsquo4rsquo
Jeraacuterquico OH
del carbono 3
En la polimerizacioacuten
del ADN
H
P
O
OH
OH
HO
O
O
CH2
NH2
N
N N
N
Azuacutecar
Base
Fosfato
3rsquo
5rsquo
2rsquo
1rsquo4rsquo
H
2rsquo3rsquo-dideoxinucleoacutetido
monofosfato
H
P
O
OH
OH
HO
O
O
CH2
NH2
N
N N
N
Azuacutecar
Base
Fosfato
3rsquo
5rsquo
2rsquo
1rsquo4rsquo
deoxinucleotido
monofosfato
Secuenciacioacuten utiliza deoxinucleotidos
y dideoxinucleotidos
Cuando se incorpora un dideoxinucleoacutetido se
interrumpe la polimerizacioacuten
H
P
O
OH
OH
HO
O
O
CH2
NH2
N
N N
N
Azuacutecar
Base
Fosfato
3rsquo
5rsquo
2rsquo
1rsquo4rsquo
H
2rsquo3rsquo-dideoxinucleoacutetido
monofosfato
Se realizan 4 reacciones de siacutentesis (4 tubos
separados)
Se incluyen pequentildeas cantidades de
dideoxinucleotidos ddNTP que
compiten con los dNTP
En cada tubo se colocan
1 dNTP (4 tipos)
2 un solo tipo de ddNTP por tubo
3 primer o cebador marcado
4 ADN molde a secuenciar
5 Polimerasa
A ddNTP C ddNTP
G ddNTP T ddNTP
Los productos de las 4
reacciones cada una
conteniendo una pequentildea
cantidad de uno de los cuatro
dideoxinucleoacutetidos son
cargadas en el gel y sometidas
a electroforesis
Como la polimerizacioacuten es solo
en direccioacuten 5rsquo a 3rsquo los
fragmentos maacutes cortos estaraacuten
en 5rsquo y los maacutes largos que se
encontraraacuten en la direccioacuten 3rsquo
ddTTPddCTP ddGTPddATP
Lec
tura
5rsquo
a 3rsquo
des
de
la b
asa
al t
ope
Secuenciacioacuten Separacioacuten de fragmentos
Alternativa del meacutetodo Sanger
Se marca cebador con fluorescencia y se activa la reaccioacuten
Los productos se detectan durante electroforelectroforeacutesis al
pasar por un laacuteser que excita los fluorocromos y se detecta
fluorescencia emitida
Se realizan 4 reacciones de secuencia distintas
Se coloca el cebador marcado polimerasa dNTP y ddNTP
Al finalizar las cuatro reacciones se mezclan en uacutenico tubo
SECUENCIACION AUTOMATICA empleando
meacutetodo enzimaacutetico
hellip
Placa caliente
Pol
liacutequido
ATTGC A
Laser
Prisma
Detectores
-
+Ventana
Reaccioacuten
Secuencia
Capilar
iquestCoacutemo se ve el resultado
En el electroferograma se observa dos picos en
la posicioacuten 152 (C T)
A ndash A ndash T ndash G ndash G - T - C - C ndash A ndash N - T - T - G - G - C
A ndash A ndash T ndash G ndash G - T - C - T ndash A ndash N - T - T - G - G - C
Repeticiones en tandem
La variacioacuten en el nuacutemero de repeticiones de los
distintos mini y microsateacutelites es un polimorfismo
muy frecuente
Estos polimorfismos se generan por errores durante la
replicacioacuten
Dado que las repeticiones se encuentran en forma diploide
Cada uno de nosotros posee dos variantes para una repeticioacuten
determinada
VNTR (Nuacutemero variable de repeticiones en tandem) micro sateacutelites hipervariables
Obtencioacuten de DNA a partir de RNA
Rt-PCR Transcriptasareversa
1ordm Extraccioacuten de ADN
Se pueden tomar diferentes fuentes para extraer ADN humano
Sangre Saliva Semen hisopado vaginal restos de fluidos en ropa orina piel bulbo
piloso muestras biospsias de oacuterganostejidos material cadaveacuterico (ej huesos) etc
Se separa el ADN de otras
fases orgaacutenicas celulares
El ADN purificado refrigerado a 4 deg C puede conservarse por lo menos un maacuteximo de 3 antildeos
Aquellas muestras que necesitan mantenerse maacutes de 3 antildeos deberaacuten congelarse a -70 deg C
2ordm Almacenamiento
y conservacioacuten del ADN
Las teacutecnicas desarrolladas utilizan
bullFundamentos
Complementariedad de bases
Replicacioacuten del ADN
bullHerramientas
Elementos de virus y bacterias
(Ejemplo Transcriptasa Reversa Enzimas de Restriccioacuten Polimerasas etc)
Soacutelo veremos Teacutecnicas Directas
bullSouthern Blot
bullPCR
bullSecuenciacioacuten
Directa
Fundamentos
Complementariedad de bases
Replicacioacuten del ADN
SOUTHERN BLOT
Edwin Southern desarrolloacute esta teacutecnica en 1975
Sirve para detectar por Hibridacioacuten la presencia de una porcioacuten de ADN en una muestra
Fundamento COMPLEMENTARIEDAD DE BASES
Se disentildea una sonda con nucleoacutetidos marcados que sean complementarios al sector de ADN buscado
El sector de ADN buscado puede ser un gen o parte del mismo u otras zonas del genoma Se puede utilizar para el diagnoacutestico molecular de patologiacuteas geneacuteticas
Southern Blot
HIBRIDACIOacuteN
La doble hebra de ADN se forma por complementariedad SONDA-muestra (una de las hebras es la sonda en simple cadena y la otra es la muestra en simple cadena)
Los nucleoacutetidos de la sonda estaacute marcados P 32
(radiactivos) Si al revelar hay marcador radiactivo presente estaacute en la muestra analizada la secuencia complementaria a la sonda
Southern Blot
Para poder realizar Hibridacioacuten
en una muestra de ADN
se necesitan realizar
los siguientes pasos
Fragmentacioacuten del ADN y Separacioacuten
Inmovilizacioacuten- Desnaturalizacioacuten
Transferencia
Hibridacioacuten
Revelado
Enzimas de restriccioacuten
ENZIMAS DE RESTRICCION
Los fragmentos de restriccioacuten se pueden separar por tamantildeo mediante electroforesis en gel
Diferentes condiciones de hibridacioacuten permite mayor o menor estabilidad y especificidad
Pasos Previos a la Hibridacioacuten
separacioacuten de fragmentos
Extraccioacuten de ADN
Fragmentar el ADN en porciones maacutes pequentildeas
(Enzimas de restriccioacuten)
Separo los fragmentos realizando una corrida
electroforeacutetica usando como sustrato de
migracioacuten un gel (separacioacuten por tamantildeo)
Pasos Previos a la Hibridacioacuten
Inmovilizacioacuten de los fragmentos en soporte soacutelido
Desnaturalizacioacuten (SIMPLE CADENA)
Transferencia a soporte soacutelido (membrana de nylon nitrocelulosa) Por
capilaridad o por electroforesis pasan del gel a la membrana
Sacado de los bocetos de Edwin Southern
antes de la publicacioacuten de la teacutecnica
Pasos Hibridacioacuten
Se agrega la sonda sobre la membrana y se
incuba
Se lava para quitar el maacuteximo de hibridaciones
inespeciacuteficas
Se revela por autoradiografiacutea
Soacutelo veremos Teacutecnicas Directas
bullSouthern Blot
bullPCR
bullSecuenciacioacuten
PCR Reaccioacuten en cadena
de la polimerasa
Kerry Mullis en 1983 desarrolloacute esta teacutecnica
Amplificacioacuten de un gran nuacutemero de copias a
partir de un fragmento molde de ADN utilizando
una reaccioacuten enzimatica simple de polimerizacion
in vitro
PCR
ADN moldePCR
ADN resultante
Fundamento
REPLICACION DEL ADN
COMPLEMENTARIEDAD DE BASES
Herramientas
POLIMERASA BACTERIANA
Estrategia
Utilizar cambios de temperatura para
desnaturalizar y renaturalizar las hebras de
ADN complementario
PCR
1 Desnaturalizacioacuten 94degC - 96degC
2 Alineacioacuten temperatura variable
3 Extensioacuten 68 - 72degC
PCR la reaccioacuten se divide en 3 pasos
LOS 3 PASOS FORMAN 1 CICLO Y EL CICLO PUEDE
REPETIRSE VARIAS VECES
Necesitamos en este proceso controlar
la temperatura termociclador
Si repetimos el ciclo tendremos cuatro copias
Desnaturalizacioacuten
95degC
Hibridizacioacuten
50-60ordmC
Extensioacuten de la
cadena 75ordmC
Primer Ciclo
2do Ciclo95ordmC
50 - 60ordmC
75ordmC
Muacuteltiples ciclos daraacuten un incremento
exponencial en el nuacutemero de copias
iquestQueacute elementos son necesarios para la
polimerizacioacuten in Vitro
Extraccioacuten del ADN molde
Preparado de la MIX
1 Agua libre de nucleasas
2 1048698 Catioacuten divalente (MgCl2)
3 1048698 Desoxinucleoacutetidos (dNTPacutes)
4 1048698 Sol amortiguadora y sales (Buffer 10X)
5 1048698 Oligonucleoacutetidos (Primers)
6 1048698 Enzima termo-resistente (Ej Taq Polimerasa)
Para la polimerizacioacuten de ADN es necesario
Una polimerasa primers y nucleoacutetidos
Como se utiliza cambios de temperatura para
lograr la desnaturalizacioacuten y renaturalizacioacuten
de las hebras la enzima tiene que ser
resistente a cambios de temperatura
iquestQueacute elementos son necesarios para la
polimerizacioacuten in Vitro
Thermus aquaticus se
descubrioacute en el Parque
Yellowstone inicioacute el campo
de la biologiacutea de los
hipertermoacutefilos
Thermus aquaticus crece
a 70ordm grados (fuente de
la enzima taq polimerasa
usada en la PCR)
PCR
La taq polimerasa no es la uacutenica enzima usada en la
PCR Hay muchas maacutes
Ej PFU (enzima extraiacuteda de Pynococus Furioso)
PCR
TAQ PFU
No tiene actividad 3rsquo
exonucleasa Puede
copiar con errores
Tiene actividad 3rsquo
exonucleasa
Velocidad 2000
nucleoacutetidos min
Velocidad 500
nucleoacutetidos min
Complementariedad durante la hibridacioacuten
en la fase de alineamiento
Se unen zona donde la secuencia es
complementaria
Son disentildeados los primers esto permite
seleccionar que porcioacuten amplificar
PCR Primers
PCR
Ejemplos de utilizacioacuten PCR en diagnoacutestico
1 Colocando primers Fw diferentes (una para
secuencia normal y otra mutada) y mismo Rw
en el mismo tubo
2 Combinando la PCR con cortes con enzimas de
restriccioacuten (si se generase o perdiera algun sitio de
restriccioacuten por la misma mutacioacuten)
concepto Primers alelo especiacuteficos
El siguiente es el resultado en un gel de agarosa
En la calle (1) se sembroacute
el marcador de peso
molecular
En la calle (2) se sembroacute
una muestra conocida
para una mutacioacuten
homocigota
En la calle (3) se sembroacute
la muestra del paciente
El siguiente es el resultado en un gel de agarosa
En la calle (C1) muestra
conocida homocigota
gen mutado
En la calle (C2) muestra
conocida homocigota
gen normal
iquestQueacute resultados
dieron las
muestras 1 2 3 4
iquestQueacute elementos son necesarios para la
polimerizacioacuten in Vitro
Extraccioacuten del ADN molde
Preparado de la MIX
1 Agua libre de nucleasas
2 1048698 Catioacuten divalente (MgCl2)
3 1048698 Desoxinucleoacutetidos (dNTPacutes)
4 1048698 Sol amortiguadora y sales (Buffer 10X)
5 1048698 Oligonucleoacutetidos (Primers)
6 1048698 Enzima termo-resistente (Ej Taq Polimerasa)
Los iones de magnesio
estimulan a la enzima Taq Polimerasa
para que incorpore los dNTPacutes
Algunas aclaracioneshellip
Taq
Mg
Sol amortiguadora PCR
1048698 Mantiene el pH oacuteptimo para que la enzima actuacutee
1048698 Sales
Proporcionan la fuerza ioacutenica adecuada para una maacutexima actividad de la
enzima
Herramientas
POLIMERASA BACTERIANA que resista a los cambios Tordm
Estrategia
Utilizar cambios de temperatura para desnaturalizar y
renaturalizar las hebras de ADN complementario
PCR coacutemo ve el observador el proceso
MIX +
ADN
Soacutelo veremos Teacutecnicas Directas
bullSouthern Blot
bullPCR
bullSecuenciacioacuten
Secuenciacioacuten
Meacutetodo enzimaacutetico 1977
Frederick Sanger desarrolloacute esta teacutecnica
Meacutetodo de los terminadores de cadena o dideoxi
Fundamento
REPLICACION DEL ADN
COMPLEMENTARIEDAD DE BASES
Herramientas
Dideoxinucleotidos
Estrategia
Cuando se agrega un dideoxinucleotido
a la cadena en formacioacuten se
interrumpe la polimerizacioacuten
Secuenciacioacuten
H
P
O
OH
OH
HO
O
O
CH2
NH
N
N
N
Azuacutecar
Base
Fosfato
3rsquo
5rsquo
2rsquo
1rsquo4rsquo
Jeraacuterquico OH
del carbono 3
En la polimerizacioacuten
del ADN
H
P
O
OH
OH
HO
O
O
CH2
NH2
N
N N
N
Azuacutecar
Base
Fosfato
3rsquo
5rsquo
2rsquo
1rsquo4rsquo
H
2rsquo3rsquo-dideoxinucleoacutetido
monofosfato
H
P
O
OH
OH
HO
O
O
CH2
NH2
N
N N
N
Azuacutecar
Base
Fosfato
3rsquo
5rsquo
2rsquo
1rsquo4rsquo
deoxinucleotido
monofosfato
Secuenciacioacuten utiliza deoxinucleotidos
y dideoxinucleotidos
Cuando se incorpora un dideoxinucleoacutetido se
interrumpe la polimerizacioacuten
H
P
O
OH
OH
HO
O
O
CH2
NH2
N
N N
N
Azuacutecar
Base
Fosfato
3rsquo
5rsquo
2rsquo
1rsquo4rsquo
H
2rsquo3rsquo-dideoxinucleoacutetido
monofosfato
Se realizan 4 reacciones de siacutentesis (4 tubos
separados)
Se incluyen pequentildeas cantidades de
dideoxinucleotidos ddNTP que
compiten con los dNTP
En cada tubo se colocan
1 dNTP (4 tipos)
2 un solo tipo de ddNTP por tubo
3 primer o cebador marcado
4 ADN molde a secuenciar
5 Polimerasa
A ddNTP C ddNTP
G ddNTP T ddNTP
Los productos de las 4
reacciones cada una
conteniendo una pequentildea
cantidad de uno de los cuatro
dideoxinucleoacutetidos son
cargadas en el gel y sometidas
a electroforesis
Como la polimerizacioacuten es solo
en direccioacuten 5rsquo a 3rsquo los
fragmentos maacutes cortos estaraacuten
en 5rsquo y los maacutes largos que se
encontraraacuten en la direccioacuten 3rsquo
ddTTPddCTP ddGTPddATP
Lec
tura
5rsquo
a 3rsquo
des
de
la b
asa
al t
ope
Secuenciacioacuten Separacioacuten de fragmentos
Alternativa del meacutetodo Sanger
Se marca cebador con fluorescencia y se activa la reaccioacuten
Los productos se detectan durante electroforelectroforeacutesis al
pasar por un laacuteser que excita los fluorocromos y se detecta
fluorescencia emitida
Se realizan 4 reacciones de secuencia distintas
Se coloca el cebador marcado polimerasa dNTP y ddNTP
Al finalizar las cuatro reacciones se mezclan en uacutenico tubo
SECUENCIACION AUTOMATICA empleando
meacutetodo enzimaacutetico
hellip
Placa caliente
Pol
liacutequido
ATTGC A
Laser
Prisma
Detectores
-
+Ventana
Reaccioacuten
Secuencia
Capilar
iquestCoacutemo se ve el resultado
En el electroferograma se observa dos picos en
la posicioacuten 152 (C T)
A ndash A ndash T ndash G ndash G - T - C - C ndash A ndash N - T - T - G - G - C
A ndash A ndash T ndash G ndash G - T - C - T ndash A ndash N - T - T - G - G - C
Repeticiones en tandem
La variacioacuten en el nuacutemero de repeticiones de los
distintos mini y microsateacutelites es un polimorfismo
muy frecuente
Estos polimorfismos se generan por errores durante la
replicacioacuten
Dado que las repeticiones se encuentran en forma diploide
Cada uno de nosotros posee dos variantes para una repeticioacuten
determinada
VNTR (Nuacutemero variable de repeticiones en tandem) micro sateacutelites hipervariables
Obtencioacuten de DNA a partir de RNA
Rt-PCR Transcriptasareversa
El ADN purificado refrigerado a 4 deg C puede conservarse por lo menos un maacuteximo de 3 antildeos
Aquellas muestras que necesitan mantenerse maacutes de 3 antildeos deberaacuten congelarse a -70 deg C
2ordm Almacenamiento
y conservacioacuten del ADN
Las teacutecnicas desarrolladas utilizan
bullFundamentos
Complementariedad de bases
Replicacioacuten del ADN
bullHerramientas
Elementos de virus y bacterias
(Ejemplo Transcriptasa Reversa Enzimas de Restriccioacuten Polimerasas etc)
Soacutelo veremos Teacutecnicas Directas
bullSouthern Blot
bullPCR
bullSecuenciacioacuten
Directa
Fundamentos
Complementariedad de bases
Replicacioacuten del ADN
SOUTHERN BLOT
Edwin Southern desarrolloacute esta teacutecnica en 1975
Sirve para detectar por Hibridacioacuten la presencia de una porcioacuten de ADN en una muestra
Fundamento COMPLEMENTARIEDAD DE BASES
Se disentildea una sonda con nucleoacutetidos marcados que sean complementarios al sector de ADN buscado
El sector de ADN buscado puede ser un gen o parte del mismo u otras zonas del genoma Se puede utilizar para el diagnoacutestico molecular de patologiacuteas geneacuteticas
Southern Blot
HIBRIDACIOacuteN
La doble hebra de ADN se forma por complementariedad SONDA-muestra (una de las hebras es la sonda en simple cadena y la otra es la muestra en simple cadena)
Los nucleoacutetidos de la sonda estaacute marcados P 32
(radiactivos) Si al revelar hay marcador radiactivo presente estaacute en la muestra analizada la secuencia complementaria a la sonda
Southern Blot
Para poder realizar Hibridacioacuten
en una muestra de ADN
se necesitan realizar
los siguientes pasos
Fragmentacioacuten del ADN y Separacioacuten
Inmovilizacioacuten- Desnaturalizacioacuten
Transferencia
Hibridacioacuten
Revelado
Enzimas de restriccioacuten
ENZIMAS DE RESTRICCION
Los fragmentos de restriccioacuten se pueden separar por tamantildeo mediante electroforesis en gel
Diferentes condiciones de hibridacioacuten permite mayor o menor estabilidad y especificidad
Pasos Previos a la Hibridacioacuten
separacioacuten de fragmentos
Extraccioacuten de ADN
Fragmentar el ADN en porciones maacutes pequentildeas
(Enzimas de restriccioacuten)
Separo los fragmentos realizando una corrida
electroforeacutetica usando como sustrato de
migracioacuten un gel (separacioacuten por tamantildeo)
Pasos Previos a la Hibridacioacuten
Inmovilizacioacuten de los fragmentos en soporte soacutelido
Desnaturalizacioacuten (SIMPLE CADENA)
Transferencia a soporte soacutelido (membrana de nylon nitrocelulosa) Por
capilaridad o por electroforesis pasan del gel a la membrana
Sacado de los bocetos de Edwin Southern
antes de la publicacioacuten de la teacutecnica
Pasos Hibridacioacuten
Se agrega la sonda sobre la membrana y se
incuba
Se lava para quitar el maacuteximo de hibridaciones
inespeciacuteficas
Se revela por autoradiografiacutea
Soacutelo veremos Teacutecnicas Directas
bullSouthern Blot
bullPCR
bullSecuenciacioacuten
PCR Reaccioacuten en cadena
de la polimerasa
Kerry Mullis en 1983 desarrolloacute esta teacutecnica
Amplificacioacuten de un gran nuacutemero de copias a
partir de un fragmento molde de ADN utilizando
una reaccioacuten enzimatica simple de polimerizacion
in vitro
PCR
ADN moldePCR
ADN resultante
Fundamento
REPLICACION DEL ADN
COMPLEMENTARIEDAD DE BASES
Herramientas
POLIMERASA BACTERIANA
Estrategia
Utilizar cambios de temperatura para
desnaturalizar y renaturalizar las hebras de
ADN complementario
PCR
1 Desnaturalizacioacuten 94degC - 96degC
2 Alineacioacuten temperatura variable
3 Extensioacuten 68 - 72degC
PCR la reaccioacuten se divide en 3 pasos
LOS 3 PASOS FORMAN 1 CICLO Y EL CICLO PUEDE
REPETIRSE VARIAS VECES
Necesitamos en este proceso controlar
la temperatura termociclador
Si repetimos el ciclo tendremos cuatro copias
Desnaturalizacioacuten
95degC
Hibridizacioacuten
50-60ordmC
Extensioacuten de la
cadena 75ordmC
Primer Ciclo
2do Ciclo95ordmC
50 - 60ordmC
75ordmC
Muacuteltiples ciclos daraacuten un incremento
exponencial en el nuacutemero de copias
iquestQueacute elementos son necesarios para la
polimerizacioacuten in Vitro
Extraccioacuten del ADN molde
Preparado de la MIX
1 Agua libre de nucleasas
2 1048698 Catioacuten divalente (MgCl2)
3 1048698 Desoxinucleoacutetidos (dNTPacutes)
4 1048698 Sol amortiguadora y sales (Buffer 10X)
5 1048698 Oligonucleoacutetidos (Primers)
6 1048698 Enzima termo-resistente (Ej Taq Polimerasa)
Para la polimerizacioacuten de ADN es necesario
Una polimerasa primers y nucleoacutetidos
Como se utiliza cambios de temperatura para
lograr la desnaturalizacioacuten y renaturalizacioacuten
de las hebras la enzima tiene que ser
resistente a cambios de temperatura
iquestQueacute elementos son necesarios para la
polimerizacioacuten in Vitro
Thermus aquaticus se
descubrioacute en el Parque
Yellowstone inicioacute el campo
de la biologiacutea de los
hipertermoacutefilos
Thermus aquaticus crece
a 70ordm grados (fuente de
la enzima taq polimerasa
usada en la PCR)
PCR
La taq polimerasa no es la uacutenica enzima usada en la
PCR Hay muchas maacutes
Ej PFU (enzima extraiacuteda de Pynococus Furioso)
PCR
TAQ PFU
No tiene actividad 3rsquo
exonucleasa Puede
copiar con errores
Tiene actividad 3rsquo
exonucleasa
Velocidad 2000
nucleoacutetidos min
Velocidad 500
nucleoacutetidos min
Complementariedad durante la hibridacioacuten
en la fase de alineamiento
Se unen zona donde la secuencia es
complementaria
Son disentildeados los primers esto permite
seleccionar que porcioacuten amplificar
PCR Primers
PCR
Ejemplos de utilizacioacuten PCR en diagnoacutestico
1 Colocando primers Fw diferentes (una para
secuencia normal y otra mutada) y mismo Rw
en el mismo tubo
2 Combinando la PCR con cortes con enzimas de
restriccioacuten (si se generase o perdiera algun sitio de
restriccioacuten por la misma mutacioacuten)
concepto Primers alelo especiacuteficos
El siguiente es el resultado en un gel de agarosa
En la calle (1) se sembroacute
el marcador de peso
molecular
En la calle (2) se sembroacute
una muestra conocida
para una mutacioacuten
homocigota
En la calle (3) se sembroacute
la muestra del paciente
El siguiente es el resultado en un gel de agarosa
En la calle (C1) muestra
conocida homocigota
gen mutado
En la calle (C2) muestra
conocida homocigota
gen normal
iquestQueacute resultados
dieron las
muestras 1 2 3 4
iquestQueacute elementos son necesarios para la
polimerizacioacuten in Vitro
Extraccioacuten del ADN molde
Preparado de la MIX
1 Agua libre de nucleasas
2 1048698 Catioacuten divalente (MgCl2)
3 1048698 Desoxinucleoacutetidos (dNTPacutes)
4 1048698 Sol amortiguadora y sales (Buffer 10X)
5 1048698 Oligonucleoacutetidos (Primers)
6 1048698 Enzima termo-resistente (Ej Taq Polimerasa)
Los iones de magnesio
estimulan a la enzima Taq Polimerasa
para que incorpore los dNTPacutes
Algunas aclaracioneshellip
Taq
Mg
Sol amortiguadora PCR
1048698 Mantiene el pH oacuteptimo para que la enzima actuacutee
1048698 Sales
Proporcionan la fuerza ioacutenica adecuada para una maacutexima actividad de la
enzima
Herramientas
POLIMERASA BACTERIANA que resista a los cambios Tordm
Estrategia
Utilizar cambios de temperatura para desnaturalizar y
renaturalizar las hebras de ADN complementario
PCR coacutemo ve el observador el proceso
MIX +
ADN
Soacutelo veremos Teacutecnicas Directas
bullSouthern Blot
bullPCR
bullSecuenciacioacuten
Secuenciacioacuten
Meacutetodo enzimaacutetico 1977
Frederick Sanger desarrolloacute esta teacutecnica
Meacutetodo de los terminadores de cadena o dideoxi
Fundamento
REPLICACION DEL ADN
COMPLEMENTARIEDAD DE BASES
Herramientas
Dideoxinucleotidos
Estrategia
Cuando se agrega un dideoxinucleotido
a la cadena en formacioacuten se
interrumpe la polimerizacioacuten
Secuenciacioacuten
H
P
O
OH
OH
HO
O
O
CH2
NH
N
N
N
Azuacutecar
Base
Fosfato
3rsquo
5rsquo
2rsquo
1rsquo4rsquo
Jeraacuterquico OH
del carbono 3
En la polimerizacioacuten
del ADN
H
P
O
OH
OH
HO
O
O
CH2
NH2
N
N N
N
Azuacutecar
Base
Fosfato
3rsquo
5rsquo
2rsquo
1rsquo4rsquo
H
2rsquo3rsquo-dideoxinucleoacutetido
monofosfato
H
P
O
OH
OH
HO
O
O
CH2
NH2
N
N N
N
Azuacutecar
Base
Fosfato
3rsquo
5rsquo
2rsquo
1rsquo4rsquo
deoxinucleotido
monofosfato
Secuenciacioacuten utiliza deoxinucleotidos
y dideoxinucleotidos
Cuando se incorpora un dideoxinucleoacutetido se
interrumpe la polimerizacioacuten
H
P
O
OH
OH
HO
O
O
CH2
NH2
N
N N
N
Azuacutecar
Base
Fosfato
3rsquo
5rsquo
2rsquo
1rsquo4rsquo
H
2rsquo3rsquo-dideoxinucleoacutetido
monofosfato
Se realizan 4 reacciones de siacutentesis (4 tubos
separados)
Se incluyen pequentildeas cantidades de
dideoxinucleotidos ddNTP que
compiten con los dNTP
En cada tubo se colocan
1 dNTP (4 tipos)
2 un solo tipo de ddNTP por tubo
3 primer o cebador marcado
4 ADN molde a secuenciar
5 Polimerasa
A ddNTP C ddNTP
G ddNTP T ddNTP
Los productos de las 4
reacciones cada una
conteniendo una pequentildea
cantidad de uno de los cuatro
dideoxinucleoacutetidos son
cargadas en el gel y sometidas
a electroforesis
Como la polimerizacioacuten es solo
en direccioacuten 5rsquo a 3rsquo los
fragmentos maacutes cortos estaraacuten
en 5rsquo y los maacutes largos que se
encontraraacuten en la direccioacuten 3rsquo
ddTTPddCTP ddGTPddATP
Lec
tura
5rsquo
a 3rsquo
des
de
la b
asa
al t
ope
Secuenciacioacuten Separacioacuten de fragmentos
Alternativa del meacutetodo Sanger
Se marca cebador con fluorescencia y se activa la reaccioacuten
Los productos se detectan durante electroforelectroforeacutesis al
pasar por un laacuteser que excita los fluorocromos y se detecta
fluorescencia emitida
Se realizan 4 reacciones de secuencia distintas
Se coloca el cebador marcado polimerasa dNTP y ddNTP
Al finalizar las cuatro reacciones se mezclan en uacutenico tubo
SECUENCIACION AUTOMATICA empleando
meacutetodo enzimaacutetico
hellip
Placa caliente
Pol
liacutequido
ATTGC A
Laser
Prisma
Detectores
-
+Ventana
Reaccioacuten
Secuencia
Capilar
iquestCoacutemo se ve el resultado
En el electroferograma se observa dos picos en
la posicioacuten 152 (C T)
A ndash A ndash T ndash G ndash G - T - C - C ndash A ndash N - T - T - G - G - C
A ndash A ndash T ndash G ndash G - T - C - T ndash A ndash N - T - T - G - G - C
Repeticiones en tandem
La variacioacuten en el nuacutemero de repeticiones de los
distintos mini y microsateacutelites es un polimorfismo
muy frecuente
Estos polimorfismos se generan por errores durante la
replicacioacuten
Dado que las repeticiones se encuentran en forma diploide
Cada uno de nosotros posee dos variantes para una repeticioacuten
determinada
VNTR (Nuacutemero variable de repeticiones en tandem) micro sateacutelites hipervariables
Obtencioacuten de DNA a partir de RNA
Rt-PCR Transcriptasareversa
Las teacutecnicas desarrolladas utilizan
bullFundamentos
Complementariedad de bases
Replicacioacuten del ADN
bullHerramientas
Elementos de virus y bacterias
(Ejemplo Transcriptasa Reversa Enzimas de Restriccioacuten Polimerasas etc)
Soacutelo veremos Teacutecnicas Directas
bullSouthern Blot
bullPCR
bullSecuenciacioacuten
Directa
Fundamentos
Complementariedad de bases
Replicacioacuten del ADN
SOUTHERN BLOT
Edwin Southern desarrolloacute esta teacutecnica en 1975
Sirve para detectar por Hibridacioacuten la presencia de una porcioacuten de ADN en una muestra
Fundamento COMPLEMENTARIEDAD DE BASES
Se disentildea una sonda con nucleoacutetidos marcados que sean complementarios al sector de ADN buscado
El sector de ADN buscado puede ser un gen o parte del mismo u otras zonas del genoma Se puede utilizar para el diagnoacutestico molecular de patologiacuteas geneacuteticas
Southern Blot
HIBRIDACIOacuteN
La doble hebra de ADN se forma por complementariedad SONDA-muestra (una de las hebras es la sonda en simple cadena y la otra es la muestra en simple cadena)
Los nucleoacutetidos de la sonda estaacute marcados P 32
(radiactivos) Si al revelar hay marcador radiactivo presente estaacute en la muestra analizada la secuencia complementaria a la sonda
Southern Blot
Para poder realizar Hibridacioacuten
en una muestra de ADN
se necesitan realizar
los siguientes pasos
Fragmentacioacuten del ADN y Separacioacuten
Inmovilizacioacuten- Desnaturalizacioacuten
Transferencia
Hibridacioacuten
Revelado
Enzimas de restriccioacuten
ENZIMAS DE RESTRICCION
Los fragmentos de restriccioacuten se pueden separar por tamantildeo mediante electroforesis en gel
Diferentes condiciones de hibridacioacuten permite mayor o menor estabilidad y especificidad
Pasos Previos a la Hibridacioacuten
separacioacuten de fragmentos
Extraccioacuten de ADN
Fragmentar el ADN en porciones maacutes pequentildeas
(Enzimas de restriccioacuten)
Separo los fragmentos realizando una corrida
electroforeacutetica usando como sustrato de
migracioacuten un gel (separacioacuten por tamantildeo)
Pasos Previos a la Hibridacioacuten
Inmovilizacioacuten de los fragmentos en soporte soacutelido
Desnaturalizacioacuten (SIMPLE CADENA)
Transferencia a soporte soacutelido (membrana de nylon nitrocelulosa) Por
capilaridad o por electroforesis pasan del gel a la membrana
Sacado de los bocetos de Edwin Southern
antes de la publicacioacuten de la teacutecnica
Pasos Hibridacioacuten
Se agrega la sonda sobre la membrana y se
incuba
Se lava para quitar el maacuteximo de hibridaciones
inespeciacuteficas
Se revela por autoradiografiacutea
Soacutelo veremos Teacutecnicas Directas
bullSouthern Blot
bullPCR
bullSecuenciacioacuten
PCR Reaccioacuten en cadena
de la polimerasa
Kerry Mullis en 1983 desarrolloacute esta teacutecnica
Amplificacioacuten de un gran nuacutemero de copias a
partir de un fragmento molde de ADN utilizando
una reaccioacuten enzimatica simple de polimerizacion
in vitro
PCR
ADN moldePCR
ADN resultante
Fundamento
REPLICACION DEL ADN
COMPLEMENTARIEDAD DE BASES
Herramientas
POLIMERASA BACTERIANA
Estrategia
Utilizar cambios de temperatura para
desnaturalizar y renaturalizar las hebras de
ADN complementario
PCR
1 Desnaturalizacioacuten 94degC - 96degC
2 Alineacioacuten temperatura variable
3 Extensioacuten 68 - 72degC
PCR la reaccioacuten se divide en 3 pasos
LOS 3 PASOS FORMAN 1 CICLO Y EL CICLO PUEDE
REPETIRSE VARIAS VECES
Necesitamos en este proceso controlar
la temperatura termociclador
Si repetimos el ciclo tendremos cuatro copias
Desnaturalizacioacuten
95degC
Hibridizacioacuten
50-60ordmC
Extensioacuten de la
cadena 75ordmC
Primer Ciclo
2do Ciclo95ordmC
50 - 60ordmC
75ordmC
Muacuteltiples ciclos daraacuten un incremento
exponencial en el nuacutemero de copias
iquestQueacute elementos son necesarios para la
polimerizacioacuten in Vitro
Extraccioacuten del ADN molde
Preparado de la MIX
1 Agua libre de nucleasas
2 1048698 Catioacuten divalente (MgCl2)
3 1048698 Desoxinucleoacutetidos (dNTPacutes)
4 1048698 Sol amortiguadora y sales (Buffer 10X)
5 1048698 Oligonucleoacutetidos (Primers)
6 1048698 Enzima termo-resistente (Ej Taq Polimerasa)
Para la polimerizacioacuten de ADN es necesario
Una polimerasa primers y nucleoacutetidos
Como se utiliza cambios de temperatura para
lograr la desnaturalizacioacuten y renaturalizacioacuten
de las hebras la enzima tiene que ser
resistente a cambios de temperatura
iquestQueacute elementos son necesarios para la
polimerizacioacuten in Vitro
Thermus aquaticus se
descubrioacute en el Parque
Yellowstone inicioacute el campo
de la biologiacutea de los
hipertermoacutefilos
Thermus aquaticus crece
a 70ordm grados (fuente de
la enzima taq polimerasa
usada en la PCR)
PCR
La taq polimerasa no es la uacutenica enzima usada en la
PCR Hay muchas maacutes
Ej PFU (enzima extraiacuteda de Pynococus Furioso)
PCR
TAQ PFU
No tiene actividad 3rsquo
exonucleasa Puede
copiar con errores
Tiene actividad 3rsquo
exonucleasa
Velocidad 2000
nucleoacutetidos min
Velocidad 500
nucleoacutetidos min
Complementariedad durante la hibridacioacuten
en la fase de alineamiento
Se unen zona donde la secuencia es
complementaria
Son disentildeados los primers esto permite
seleccionar que porcioacuten amplificar
PCR Primers
PCR
Ejemplos de utilizacioacuten PCR en diagnoacutestico
1 Colocando primers Fw diferentes (una para
secuencia normal y otra mutada) y mismo Rw
en el mismo tubo
2 Combinando la PCR con cortes con enzimas de
restriccioacuten (si se generase o perdiera algun sitio de
restriccioacuten por la misma mutacioacuten)
concepto Primers alelo especiacuteficos
El siguiente es el resultado en un gel de agarosa
En la calle (1) se sembroacute
el marcador de peso
molecular
En la calle (2) se sembroacute
una muestra conocida
para una mutacioacuten
homocigota
En la calle (3) se sembroacute
la muestra del paciente
El siguiente es el resultado en un gel de agarosa
En la calle (C1) muestra
conocida homocigota
gen mutado
En la calle (C2) muestra
conocida homocigota
gen normal
iquestQueacute resultados
dieron las
muestras 1 2 3 4
iquestQueacute elementos son necesarios para la
polimerizacioacuten in Vitro
Extraccioacuten del ADN molde
Preparado de la MIX
1 Agua libre de nucleasas
2 1048698 Catioacuten divalente (MgCl2)
3 1048698 Desoxinucleoacutetidos (dNTPacutes)
4 1048698 Sol amortiguadora y sales (Buffer 10X)
5 1048698 Oligonucleoacutetidos (Primers)
6 1048698 Enzima termo-resistente (Ej Taq Polimerasa)
Los iones de magnesio
estimulan a la enzima Taq Polimerasa
para que incorpore los dNTPacutes
Algunas aclaracioneshellip
Taq
Mg
Sol amortiguadora PCR
1048698 Mantiene el pH oacuteptimo para que la enzima actuacutee
1048698 Sales
Proporcionan la fuerza ioacutenica adecuada para una maacutexima actividad de la
enzima
Herramientas
POLIMERASA BACTERIANA que resista a los cambios Tordm
Estrategia
Utilizar cambios de temperatura para desnaturalizar y
renaturalizar las hebras de ADN complementario
PCR coacutemo ve el observador el proceso
MIX +
ADN
Soacutelo veremos Teacutecnicas Directas
bullSouthern Blot
bullPCR
bullSecuenciacioacuten
Secuenciacioacuten
Meacutetodo enzimaacutetico 1977
Frederick Sanger desarrolloacute esta teacutecnica
Meacutetodo de los terminadores de cadena o dideoxi
Fundamento
REPLICACION DEL ADN
COMPLEMENTARIEDAD DE BASES
Herramientas
Dideoxinucleotidos
Estrategia
Cuando se agrega un dideoxinucleotido
a la cadena en formacioacuten se
interrumpe la polimerizacioacuten
Secuenciacioacuten
H
P
O
OH
OH
HO
O
O
CH2
NH
N
N
N
Azuacutecar
Base
Fosfato
3rsquo
5rsquo
2rsquo
1rsquo4rsquo
Jeraacuterquico OH
del carbono 3
En la polimerizacioacuten
del ADN
H
P
O
OH
OH
HO
O
O
CH2
NH2
N
N N
N
Azuacutecar
Base
Fosfato
3rsquo
5rsquo
2rsquo
1rsquo4rsquo
H
2rsquo3rsquo-dideoxinucleoacutetido
monofosfato
H
P
O
OH
OH
HO
O
O
CH2
NH2
N
N N
N
Azuacutecar
Base
Fosfato
3rsquo
5rsquo
2rsquo
1rsquo4rsquo
deoxinucleotido
monofosfato
Secuenciacioacuten utiliza deoxinucleotidos
y dideoxinucleotidos
Cuando se incorpora un dideoxinucleoacutetido se
interrumpe la polimerizacioacuten
H
P
O
OH
OH
HO
O
O
CH2
NH2
N
N N
N
Azuacutecar
Base
Fosfato
3rsquo
5rsquo
2rsquo
1rsquo4rsquo
H
2rsquo3rsquo-dideoxinucleoacutetido
monofosfato
Se realizan 4 reacciones de siacutentesis (4 tubos
separados)
Se incluyen pequentildeas cantidades de
dideoxinucleotidos ddNTP que
compiten con los dNTP
En cada tubo se colocan
1 dNTP (4 tipos)
2 un solo tipo de ddNTP por tubo
3 primer o cebador marcado
4 ADN molde a secuenciar
5 Polimerasa
A ddNTP C ddNTP
G ddNTP T ddNTP
Los productos de las 4
reacciones cada una
conteniendo una pequentildea
cantidad de uno de los cuatro
dideoxinucleoacutetidos son
cargadas en el gel y sometidas
a electroforesis
Como la polimerizacioacuten es solo
en direccioacuten 5rsquo a 3rsquo los
fragmentos maacutes cortos estaraacuten
en 5rsquo y los maacutes largos que se
encontraraacuten en la direccioacuten 3rsquo
ddTTPddCTP ddGTPddATP
Lec
tura
5rsquo
a 3rsquo
des
de
la b
asa
al t
ope
Secuenciacioacuten Separacioacuten de fragmentos
Alternativa del meacutetodo Sanger
Se marca cebador con fluorescencia y se activa la reaccioacuten
Los productos se detectan durante electroforelectroforeacutesis al
pasar por un laacuteser que excita los fluorocromos y se detecta
fluorescencia emitida
Se realizan 4 reacciones de secuencia distintas
Se coloca el cebador marcado polimerasa dNTP y ddNTP
Al finalizar las cuatro reacciones se mezclan en uacutenico tubo
SECUENCIACION AUTOMATICA empleando
meacutetodo enzimaacutetico
hellip
Placa caliente
Pol
liacutequido
ATTGC A
Laser
Prisma
Detectores
-
+Ventana
Reaccioacuten
Secuencia
Capilar
iquestCoacutemo se ve el resultado
En el electroferograma se observa dos picos en
la posicioacuten 152 (C T)
A ndash A ndash T ndash G ndash G - T - C - C ndash A ndash N - T - T - G - G - C
A ndash A ndash T ndash G ndash G - T - C - T ndash A ndash N - T - T - G - G - C
Repeticiones en tandem
La variacioacuten en el nuacutemero de repeticiones de los
distintos mini y microsateacutelites es un polimorfismo
muy frecuente
Estos polimorfismos se generan por errores durante la
replicacioacuten
Dado que las repeticiones se encuentran en forma diploide
Cada uno de nosotros posee dos variantes para una repeticioacuten
determinada
VNTR (Nuacutemero variable de repeticiones en tandem) micro sateacutelites hipervariables
Obtencioacuten de DNA a partir de RNA
Rt-PCR Transcriptasareversa
Soacutelo veremos Teacutecnicas Directas
bullSouthern Blot
bullPCR
bullSecuenciacioacuten
Directa
Fundamentos
Complementariedad de bases
Replicacioacuten del ADN
SOUTHERN BLOT
Edwin Southern desarrolloacute esta teacutecnica en 1975
Sirve para detectar por Hibridacioacuten la presencia de una porcioacuten de ADN en una muestra
Fundamento COMPLEMENTARIEDAD DE BASES
Se disentildea una sonda con nucleoacutetidos marcados que sean complementarios al sector de ADN buscado
El sector de ADN buscado puede ser un gen o parte del mismo u otras zonas del genoma Se puede utilizar para el diagnoacutestico molecular de patologiacuteas geneacuteticas
Southern Blot
HIBRIDACIOacuteN
La doble hebra de ADN se forma por complementariedad SONDA-muestra (una de las hebras es la sonda en simple cadena y la otra es la muestra en simple cadena)
Los nucleoacutetidos de la sonda estaacute marcados P 32
(radiactivos) Si al revelar hay marcador radiactivo presente estaacute en la muestra analizada la secuencia complementaria a la sonda
Southern Blot
Para poder realizar Hibridacioacuten
en una muestra de ADN
se necesitan realizar
los siguientes pasos
Fragmentacioacuten del ADN y Separacioacuten
Inmovilizacioacuten- Desnaturalizacioacuten
Transferencia
Hibridacioacuten
Revelado
Enzimas de restriccioacuten
ENZIMAS DE RESTRICCION
Los fragmentos de restriccioacuten se pueden separar por tamantildeo mediante electroforesis en gel
Diferentes condiciones de hibridacioacuten permite mayor o menor estabilidad y especificidad
Pasos Previos a la Hibridacioacuten
separacioacuten de fragmentos
Extraccioacuten de ADN
Fragmentar el ADN en porciones maacutes pequentildeas
(Enzimas de restriccioacuten)
Separo los fragmentos realizando una corrida
electroforeacutetica usando como sustrato de
migracioacuten un gel (separacioacuten por tamantildeo)
Pasos Previos a la Hibridacioacuten
Inmovilizacioacuten de los fragmentos en soporte soacutelido
Desnaturalizacioacuten (SIMPLE CADENA)
Transferencia a soporte soacutelido (membrana de nylon nitrocelulosa) Por
capilaridad o por electroforesis pasan del gel a la membrana
Sacado de los bocetos de Edwin Southern
antes de la publicacioacuten de la teacutecnica
Pasos Hibridacioacuten
Se agrega la sonda sobre la membrana y se
incuba
Se lava para quitar el maacuteximo de hibridaciones
inespeciacuteficas
Se revela por autoradiografiacutea
Soacutelo veremos Teacutecnicas Directas
bullSouthern Blot
bullPCR
bullSecuenciacioacuten
PCR Reaccioacuten en cadena
de la polimerasa
Kerry Mullis en 1983 desarrolloacute esta teacutecnica
Amplificacioacuten de un gran nuacutemero de copias a
partir de un fragmento molde de ADN utilizando
una reaccioacuten enzimatica simple de polimerizacion
in vitro
PCR
ADN moldePCR
ADN resultante
Fundamento
REPLICACION DEL ADN
COMPLEMENTARIEDAD DE BASES
Herramientas
POLIMERASA BACTERIANA
Estrategia
Utilizar cambios de temperatura para
desnaturalizar y renaturalizar las hebras de
ADN complementario
PCR
1 Desnaturalizacioacuten 94degC - 96degC
2 Alineacioacuten temperatura variable
3 Extensioacuten 68 - 72degC
PCR la reaccioacuten se divide en 3 pasos
LOS 3 PASOS FORMAN 1 CICLO Y EL CICLO PUEDE
REPETIRSE VARIAS VECES
Necesitamos en este proceso controlar
la temperatura termociclador
Si repetimos el ciclo tendremos cuatro copias
Desnaturalizacioacuten
95degC
Hibridizacioacuten
50-60ordmC
Extensioacuten de la
cadena 75ordmC
Primer Ciclo
2do Ciclo95ordmC
50 - 60ordmC
75ordmC
Muacuteltiples ciclos daraacuten un incremento
exponencial en el nuacutemero de copias
iquestQueacute elementos son necesarios para la
polimerizacioacuten in Vitro
Extraccioacuten del ADN molde
Preparado de la MIX
1 Agua libre de nucleasas
2 1048698 Catioacuten divalente (MgCl2)
3 1048698 Desoxinucleoacutetidos (dNTPacutes)
4 1048698 Sol amortiguadora y sales (Buffer 10X)
5 1048698 Oligonucleoacutetidos (Primers)
6 1048698 Enzima termo-resistente (Ej Taq Polimerasa)
Para la polimerizacioacuten de ADN es necesario
Una polimerasa primers y nucleoacutetidos
Como se utiliza cambios de temperatura para
lograr la desnaturalizacioacuten y renaturalizacioacuten
de las hebras la enzima tiene que ser
resistente a cambios de temperatura
iquestQueacute elementos son necesarios para la
polimerizacioacuten in Vitro
Thermus aquaticus se
descubrioacute en el Parque
Yellowstone inicioacute el campo
de la biologiacutea de los
hipertermoacutefilos
Thermus aquaticus crece
a 70ordm grados (fuente de
la enzima taq polimerasa
usada en la PCR)
PCR
La taq polimerasa no es la uacutenica enzima usada en la
PCR Hay muchas maacutes
Ej PFU (enzima extraiacuteda de Pynococus Furioso)
PCR
TAQ PFU
No tiene actividad 3rsquo
exonucleasa Puede
copiar con errores
Tiene actividad 3rsquo
exonucleasa
Velocidad 2000
nucleoacutetidos min
Velocidad 500
nucleoacutetidos min
Complementariedad durante la hibridacioacuten
en la fase de alineamiento
Se unen zona donde la secuencia es
complementaria
Son disentildeados los primers esto permite
seleccionar que porcioacuten amplificar
PCR Primers
PCR
Ejemplos de utilizacioacuten PCR en diagnoacutestico
1 Colocando primers Fw diferentes (una para
secuencia normal y otra mutada) y mismo Rw
en el mismo tubo
2 Combinando la PCR con cortes con enzimas de
restriccioacuten (si se generase o perdiera algun sitio de
restriccioacuten por la misma mutacioacuten)
concepto Primers alelo especiacuteficos
El siguiente es el resultado en un gel de agarosa
En la calle (1) se sembroacute
el marcador de peso
molecular
En la calle (2) se sembroacute
una muestra conocida
para una mutacioacuten
homocigota
En la calle (3) se sembroacute
la muestra del paciente
El siguiente es el resultado en un gel de agarosa
En la calle (C1) muestra
conocida homocigota
gen mutado
En la calle (C2) muestra
conocida homocigota
gen normal
iquestQueacute resultados
dieron las
muestras 1 2 3 4
iquestQueacute elementos son necesarios para la
polimerizacioacuten in Vitro
Extraccioacuten del ADN molde
Preparado de la MIX
1 Agua libre de nucleasas
2 1048698 Catioacuten divalente (MgCl2)
3 1048698 Desoxinucleoacutetidos (dNTPacutes)
4 1048698 Sol amortiguadora y sales (Buffer 10X)
5 1048698 Oligonucleoacutetidos (Primers)
6 1048698 Enzima termo-resistente (Ej Taq Polimerasa)
Los iones de magnesio
estimulan a la enzima Taq Polimerasa
para que incorpore los dNTPacutes
Algunas aclaracioneshellip
Taq
Mg
Sol amortiguadora PCR
1048698 Mantiene el pH oacuteptimo para que la enzima actuacutee
1048698 Sales
Proporcionan la fuerza ioacutenica adecuada para una maacutexima actividad de la
enzima
Herramientas
POLIMERASA BACTERIANA que resista a los cambios Tordm
Estrategia
Utilizar cambios de temperatura para desnaturalizar y
renaturalizar las hebras de ADN complementario
PCR coacutemo ve el observador el proceso
MIX +
ADN
Soacutelo veremos Teacutecnicas Directas
bullSouthern Blot
bullPCR
bullSecuenciacioacuten
Secuenciacioacuten
Meacutetodo enzimaacutetico 1977
Frederick Sanger desarrolloacute esta teacutecnica
Meacutetodo de los terminadores de cadena o dideoxi
Fundamento
REPLICACION DEL ADN
COMPLEMENTARIEDAD DE BASES
Herramientas
Dideoxinucleotidos
Estrategia
Cuando se agrega un dideoxinucleotido
a la cadena en formacioacuten se
interrumpe la polimerizacioacuten
Secuenciacioacuten
H
P
O
OH
OH
HO
O
O
CH2
NH
N
N
N
Azuacutecar
Base
Fosfato
3rsquo
5rsquo
2rsquo
1rsquo4rsquo
Jeraacuterquico OH
del carbono 3
En la polimerizacioacuten
del ADN
H
P
O
OH
OH
HO
O
O
CH2
NH2
N
N N
N
Azuacutecar
Base
Fosfato
3rsquo
5rsquo
2rsquo
1rsquo4rsquo
H
2rsquo3rsquo-dideoxinucleoacutetido
monofosfato
H
P
O
OH
OH
HO
O
O
CH2
NH2
N
N N
N
Azuacutecar
Base
Fosfato
3rsquo
5rsquo
2rsquo
1rsquo4rsquo
deoxinucleotido
monofosfato
Secuenciacioacuten utiliza deoxinucleotidos
y dideoxinucleotidos
Cuando se incorpora un dideoxinucleoacutetido se
interrumpe la polimerizacioacuten
H
P
O
OH
OH
HO
O
O
CH2
NH2
N
N N
N
Azuacutecar
Base
Fosfato
3rsquo
5rsquo
2rsquo
1rsquo4rsquo
H
2rsquo3rsquo-dideoxinucleoacutetido
monofosfato
Se realizan 4 reacciones de siacutentesis (4 tubos
separados)
Se incluyen pequentildeas cantidades de
dideoxinucleotidos ddNTP que
compiten con los dNTP
En cada tubo se colocan
1 dNTP (4 tipos)
2 un solo tipo de ddNTP por tubo
3 primer o cebador marcado
4 ADN molde a secuenciar
5 Polimerasa
A ddNTP C ddNTP
G ddNTP T ddNTP
Los productos de las 4
reacciones cada una
conteniendo una pequentildea
cantidad de uno de los cuatro
dideoxinucleoacutetidos son
cargadas en el gel y sometidas
a electroforesis
Como la polimerizacioacuten es solo
en direccioacuten 5rsquo a 3rsquo los
fragmentos maacutes cortos estaraacuten
en 5rsquo y los maacutes largos que se
encontraraacuten en la direccioacuten 3rsquo
ddTTPddCTP ddGTPddATP
Lec
tura
5rsquo
a 3rsquo
des
de
la b
asa
al t
ope
Secuenciacioacuten Separacioacuten de fragmentos
Alternativa del meacutetodo Sanger
Se marca cebador con fluorescencia y se activa la reaccioacuten
Los productos se detectan durante electroforelectroforeacutesis al
pasar por un laacuteser que excita los fluorocromos y se detecta
fluorescencia emitida
Se realizan 4 reacciones de secuencia distintas
Se coloca el cebador marcado polimerasa dNTP y ddNTP
Al finalizar las cuatro reacciones se mezclan en uacutenico tubo
SECUENCIACION AUTOMATICA empleando
meacutetodo enzimaacutetico
hellip
Placa caliente
Pol
liacutequido
ATTGC A
Laser
Prisma
Detectores
-
+Ventana
Reaccioacuten
Secuencia
Capilar
iquestCoacutemo se ve el resultado
En el electroferograma se observa dos picos en
la posicioacuten 152 (C T)
A ndash A ndash T ndash G ndash G - T - C - C ndash A ndash N - T - T - G - G - C
A ndash A ndash T ndash G ndash G - T - C - T ndash A ndash N - T - T - G - G - C
Repeticiones en tandem
La variacioacuten en el nuacutemero de repeticiones de los
distintos mini y microsateacutelites es un polimorfismo
muy frecuente
Estos polimorfismos se generan por errores durante la
replicacioacuten
Dado que las repeticiones se encuentran en forma diploide
Cada uno de nosotros posee dos variantes para una repeticioacuten
determinada
VNTR (Nuacutemero variable de repeticiones en tandem) micro sateacutelites hipervariables
Obtencioacuten de DNA a partir de RNA
Rt-PCR Transcriptasareversa
SOUTHERN BLOT
Edwin Southern desarrolloacute esta teacutecnica en 1975
Sirve para detectar por Hibridacioacuten la presencia de una porcioacuten de ADN en una muestra
Fundamento COMPLEMENTARIEDAD DE BASES
Se disentildea una sonda con nucleoacutetidos marcados que sean complementarios al sector de ADN buscado
El sector de ADN buscado puede ser un gen o parte del mismo u otras zonas del genoma Se puede utilizar para el diagnoacutestico molecular de patologiacuteas geneacuteticas
Southern Blot
HIBRIDACIOacuteN
La doble hebra de ADN se forma por complementariedad SONDA-muestra (una de las hebras es la sonda en simple cadena y la otra es la muestra en simple cadena)
Los nucleoacutetidos de la sonda estaacute marcados P 32
(radiactivos) Si al revelar hay marcador radiactivo presente estaacute en la muestra analizada la secuencia complementaria a la sonda
Southern Blot
Para poder realizar Hibridacioacuten
en una muestra de ADN
se necesitan realizar
los siguientes pasos
Fragmentacioacuten del ADN y Separacioacuten
Inmovilizacioacuten- Desnaturalizacioacuten
Transferencia
Hibridacioacuten
Revelado
Enzimas de restriccioacuten
ENZIMAS DE RESTRICCION
Los fragmentos de restriccioacuten se pueden separar por tamantildeo mediante electroforesis en gel
Diferentes condiciones de hibridacioacuten permite mayor o menor estabilidad y especificidad
Pasos Previos a la Hibridacioacuten
separacioacuten de fragmentos
Extraccioacuten de ADN
Fragmentar el ADN en porciones maacutes pequentildeas
(Enzimas de restriccioacuten)
Separo los fragmentos realizando una corrida
electroforeacutetica usando como sustrato de
migracioacuten un gel (separacioacuten por tamantildeo)
Pasos Previos a la Hibridacioacuten
Inmovilizacioacuten de los fragmentos en soporte soacutelido
Desnaturalizacioacuten (SIMPLE CADENA)
Transferencia a soporte soacutelido (membrana de nylon nitrocelulosa) Por
capilaridad o por electroforesis pasan del gel a la membrana
Sacado de los bocetos de Edwin Southern
antes de la publicacioacuten de la teacutecnica
Pasos Hibridacioacuten
Se agrega la sonda sobre la membrana y se
incuba
Se lava para quitar el maacuteximo de hibridaciones
inespeciacuteficas
Se revela por autoradiografiacutea
Soacutelo veremos Teacutecnicas Directas
bullSouthern Blot
bullPCR
bullSecuenciacioacuten
PCR Reaccioacuten en cadena
de la polimerasa
Kerry Mullis en 1983 desarrolloacute esta teacutecnica
Amplificacioacuten de un gran nuacutemero de copias a
partir de un fragmento molde de ADN utilizando
una reaccioacuten enzimatica simple de polimerizacion
in vitro
PCR
ADN moldePCR
ADN resultante
Fundamento
REPLICACION DEL ADN
COMPLEMENTARIEDAD DE BASES
Herramientas
POLIMERASA BACTERIANA
Estrategia
Utilizar cambios de temperatura para
desnaturalizar y renaturalizar las hebras de
ADN complementario
PCR
1 Desnaturalizacioacuten 94degC - 96degC
2 Alineacioacuten temperatura variable
3 Extensioacuten 68 - 72degC
PCR la reaccioacuten se divide en 3 pasos
LOS 3 PASOS FORMAN 1 CICLO Y EL CICLO PUEDE
REPETIRSE VARIAS VECES
Necesitamos en este proceso controlar
la temperatura termociclador
Si repetimos el ciclo tendremos cuatro copias
Desnaturalizacioacuten
95degC
Hibridizacioacuten
50-60ordmC
Extensioacuten de la
cadena 75ordmC
Primer Ciclo
2do Ciclo95ordmC
50 - 60ordmC
75ordmC
Muacuteltiples ciclos daraacuten un incremento
exponencial en el nuacutemero de copias
iquestQueacute elementos son necesarios para la
polimerizacioacuten in Vitro
Extraccioacuten del ADN molde
Preparado de la MIX
1 Agua libre de nucleasas
2 1048698 Catioacuten divalente (MgCl2)
3 1048698 Desoxinucleoacutetidos (dNTPacutes)
4 1048698 Sol amortiguadora y sales (Buffer 10X)
5 1048698 Oligonucleoacutetidos (Primers)
6 1048698 Enzima termo-resistente (Ej Taq Polimerasa)
Para la polimerizacioacuten de ADN es necesario
Una polimerasa primers y nucleoacutetidos
Como se utiliza cambios de temperatura para
lograr la desnaturalizacioacuten y renaturalizacioacuten
de las hebras la enzima tiene que ser
resistente a cambios de temperatura
iquestQueacute elementos son necesarios para la
polimerizacioacuten in Vitro
Thermus aquaticus se
descubrioacute en el Parque
Yellowstone inicioacute el campo
de la biologiacutea de los
hipertermoacutefilos
Thermus aquaticus crece
a 70ordm grados (fuente de
la enzima taq polimerasa
usada en la PCR)
PCR
La taq polimerasa no es la uacutenica enzima usada en la
PCR Hay muchas maacutes
Ej PFU (enzima extraiacuteda de Pynococus Furioso)
PCR
TAQ PFU
No tiene actividad 3rsquo
exonucleasa Puede
copiar con errores
Tiene actividad 3rsquo
exonucleasa
Velocidad 2000
nucleoacutetidos min
Velocidad 500
nucleoacutetidos min
Complementariedad durante la hibridacioacuten
en la fase de alineamiento
Se unen zona donde la secuencia es
complementaria
Son disentildeados los primers esto permite
seleccionar que porcioacuten amplificar
PCR Primers
PCR
Ejemplos de utilizacioacuten PCR en diagnoacutestico
1 Colocando primers Fw diferentes (una para
secuencia normal y otra mutada) y mismo Rw
en el mismo tubo
2 Combinando la PCR con cortes con enzimas de
restriccioacuten (si se generase o perdiera algun sitio de
restriccioacuten por la misma mutacioacuten)
concepto Primers alelo especiacuteficos
El siguiente es el resultado en un gel de agarosa
En la calle (1) se sembroacute
el marcador de peso
molecular
En la calle (2) se sembroacute
una muestra conocida
para una mutacioacuten
homocigota
En la calle (3) se sembroacute
la muestra del paciente
El siguiente es el resultado en un gel de agarosa
En la calle (C1) muestra
conocida homocigota
gen mutado
En la calle (C2) muestra
conocida homocigota
gen normal
iquestQueacute resultados
dieron las
muestras 1 2 3 4
iquestQueacute elementos son necesarios para la
polimerizacioacuten in Vitro
Extraccioacuten del ADN molde
Preparado de la MIX
1 Agua libre de nucleasas
2 1048698 Catioacuten divalente (MgCl2)
3 1048698 Desoxinucleoacutetidos (dNTPacutes)
4 1048698 Sol amortiguadora y sales (Buffer 10X)
5 1048698 Oligonucleoacutetidos (Primers)
6 1048698 Enzima termo-resistente (Ej Taq Polimerasa)
Los iones de magnesio
estimulan a la enzima Taq Polimerasa
para que incorpore los dNTPacutes
Algunas aclaracioneshellip
Taq
Mg
Sol amortiguadora PCR
1048698 Mantiene el pH oacuteptimo para que la enzima actuacutee
1048698 Sales
Proporcionan la fuerza ioacutenica adecuada para una maacutexima actividad de la
enzima
Herramientas
POLIMERASA BACTERIANA que resista a los cambios Tordm
Estrategia
Utilizar cambios de temperatura para desnaturalizar y
renaturalizar las hebras de ADN complementario
PCR coacutemo ve el observador el proceso
MIX +
ADN
Soacutelo veremos Teacutecnicas Directas
bullSouthern Blot
bullPCR
bullSecuenciacioacuten
Secuenciacioacuten
Meacutetodo enzimaacutetico 1977
Frederick Sanger desarrolloacute esta teacutecnica
Meacutetodo de los terminadores de cadena o dideoxi
Fundamento
REPLICACION DEL ADN
COMPLEMENTARIEDAD DE BASES
Herramientas
Dideoxinucleotidos
Estrategia
Cuando se agrega un dideoxinucleotido
a la cadena en formacioacuten se
interrumpe la polimerizacioacuten
Secuenciacioacuten
H
P
O
OH
OH
HO
O
O
CH2
NH
N
N
N
Azuacutecar
Base
Fosfato
3rsquo
5rsquo
2rsquo
1rsquo4rsquo
Jeraacuterquico OH
del carbono 3
En la polimerizacioacuten
del ADN
H
P
O
OH
OH
HO
O
O
CH2
NH2
N
N N
N
Azuacutecar
Base
Fosfato
3rsquo
5rsquo
2rsquo
1rsquo4rsquo
H
2rsquo3rsquo-dideoxinucleoacutetido
monofosfato
H
P
O
OH
OH
HO
O
O
CH2
NH2
N
N N
N
Azuacutecar
Base
Fosfato
3rsquo
5rsquo
2rsquo
1rsquo4rsquo
deoxinucleotido
monofosfato
Secuenciacioacuten utiliza deoxinucleotidos
y dideoxinucleotidos
Cuando se incorpora un dideoxinucleoacutetido se
interrumpe la polimerizacioacuten
H
P
O
OH
OH
HO
O
O
CH2
NH2
N
N N
N
Azuacutecar
Base
Fosfato
3rsquo
5rsquo
2rsquo
1rsquo4rsquo
H
2rsquo3rsquo-dideoxinucleoacutetido
monofosfato
Se realizan 4 reacciones de siacutentesis (4 tubos
separados)
Se incluyen pequentildeas cantidades de
dideoxinucleotidos ddNTP que
compiten con los dNTP
En cada tubo se colocan
1 dNTP (4 tipos)
2 un solo tipo de ddNTP por tubo
3 primer o cebador marcado
4 ADN molde a secuenciar
5 Polimerasa
A ddNTP C ddNTP
G ddNTP T ddNTP
Los productos de las 4
reacciones cada una
conteniendo una pequentildea
cantidad de uno de los cuatro
dideoxinucleoacutetidos son
cargadas en el gel y sometidas
a electroforesis
Como la polimerizacioacuten es solo
en direccioacuten 5rsquo a 3rsquo los
fragmentos maacutes cortos estaraacuten
en 5rsquo y los maacutes largos que se
encontraraacuten en la direccioacuten 3rsquo
ddTTPddCTP ddGTPddATP
Lec
tura
5rsquo
a 3rsquo
des
de
la b
asa
al t
ope
Secuenciacioacuten Separacioacuten de fragmentos
Alternativa del meacutetodo Sanger
Se marca cebador con fluorescencia y se activa la reaccioacuten
Los productos se detectan durante electroforelectroforeacutesis al
pasar por un laacuteser que excita los fluorocromos y se detecta
fluorescencia emitida
Se realizan 4 reacciones de secuencia distintas
Se coloca el cebador marcado polimerasa dNTP y ddNTP
Al finalizar las cuatro reacciones se mezclan en uacutenico tubo
SECUENCIACION AUTOMATICA empleando
meacutetodo enzimaacutetico
hellip
Placa caliente
Pol
liacutequido
ATTGC A
Laser
Prisma
Detectores
-
+Ventana
Reaccioacuten
Secuencia
Capilar
iquestCoacutemo se ve el resultado
En el electroferograma se observa dos picos en
la posicioacuten 152 (C T)
A ndash A ndash T ndash G ndash G - T - C - C ndash A ndash N - T - T - G - G - C
A ndash A ndash T ndash G ndash G - T - C - T ndash A ndash N - T - T - G - G - C
Repeticiones en tandem
La variacioacuten en el nuacutemero de repeticiones de los
distintos mini y microsateacutelites es un polimorfismo
muy frecuente
Estos polimorfismos se generan por errores durante la
replicacioacuten
Dado que las repeticiones se encuentran en forma diploide
Cada uno de nosotros posee dos variantes para una repeticioacuten
determinada
VNTR (Nuacutemero variable de repeticiones en tandem) micro sateacutelites hipervariables
Obtencioacuten de DNA a partir de RNA
Rt-PCR Transcriptasareversa
Sirve para detectar por Hibridacioacuten la presencia de una porcioacuten de ADN en una muestra
Fundamento COMPLEMENTARIEDAD DE BASES
Se disentildea una sonda con nucleoacutetidos marcados que sean complementarios al sector de ADN buscado
El sector de ADN buscado puede ser un gen o parte del mismo u otras zonas del genoma Se puede utilizar para el diagnoacutestico molecular de patologiacuteas geneacuteticas
Southern Blot
HIBRIDACIOacuteN
La doble hebra de ADN se forma por complementariedad SONDA-muestra (una de las hebras es la sonda en simple cadena y la otra es la muestra en simple cadena)
Los nucleoacutetidos de la sonda estaacute marcados P 32
(radiactivos) Si al revelar hay marcador radiactivo presente estaacute en la muestra analizada la secuencia complementaria a la sonda
Southern Blot
Para poder realizar Hibridacioacuten
en una muestra de ADN
se necesitan realizar
los siguientes pasos
Fragmentacioacuten del ADN y Separacioacuten
Inmovilizacioacuten- Desnaturalizacioacuten
Transferencia
Hibridacioacuten
Revelado
Enzimas de restriccioacuten
ENZIMAS DE RESTRICCION
Los fragmentos de restriccioacuten se pueden separar por tamantildeo mediante electroforesis en gel
Diferentes condiciones de hibridacioacuten permite mayor o menor estabilidad y especificidad
Pasos Previos a la Hibridacioacuten
separacioacuten de fragmentos
Extraccioacuten de ADN
Fragmentar el ADN en porciones maacutes pequentildeas
(Enzimas de restriccioacuten)
Separo los fragmentos realizando una corrida
electroforeacutetica usando como sustrato de
migracioacuten un gel (separacioacuten por tamantildeo)
Pasos Previos a la Hibridacioacuten
Inmovilizacioacuten de los fragmentos en soporte soacutelido
Desnaturalizacioacuten (SIMPLE CADENA)
Transferencia a soporte soacutelido (membrana de nylon nitrocelulosa) Por
capilaridad o por electroforesis pasan del gel a la membrana
Sacado de los bocetos de Edwin Southern
antes de la publicacioacuten de la teacutecnica
Pasos Hibridacioacuten
Se agrega la sonda sobre la membrana y se
incuba
Se lava para quitar el maacuteximo de hibridaciones
inespeciacuteficas
Se revela por autoradiografiacutea
Soacutelo veremos Teacutecnicas Directas
bullSouthern Blot
bullPCR
bullSecuenciacioacuten
PCR Reaccioacuten en cadena
de la polimerasa
Kerry Mullis en 1983 desarrolloacute esta teacutecnica
Amplificacioacuten de un gran nuacutemero de copias a
partir de un fragmento molde de ADN utilizando
una reaccioacuten enzimatica simple de polimerizacion
in vitro
PCR
ADN moldePCR
ADN resultante
Fundamento
REPLICACION DEL ADN
COMPLEMENTARIEDAD DE BASES
Herramientas
POLIMERASA BACTERIANA
Estrategia
Utilizar cambios de temperatura para
desnaturalizar y renaturalizar las hebras de
ADN complementario
PCR
1 Desnaturalizacioacuten 94degC - 96degC
2 Alineacioacuten temperatura variable
3 Extensioacuten 68 - 72degC
PCR la reaccioacuten se divide en 3 pasos
LOS 3 PASOS FORMAN 1 CICLO Y EL CICLO PUEDE
REPETIRSE VARIAS VECES
Necesitamos en este proceso controlar
la temperatura termociclador
Si repetimos el ciclo tendremos cuatro copias
Desnaturalizacioacuten
95degC
Hibridizacioacuten
50-60ordmC
Extensioacuten de la
cadena 75ordmC
Primer Ciclo
2do Ciclo95ordmC
50 - 60ordmC
75ordmC
Muacuteltiples ciclos daraacuten un incremento
exponencial en el nuacutemero de copias
iquestQueacute elementos son necesarios para la
polimerizacioacuten in Vitro
Extraccioacuten del ADN molde
Preparado de la MIX
1 Agua libre de nucleasas
2 1048698 Catioacuten divalente (MgCl2)
3 1048698 Desoxinucleoacutetidos (dNTPacutes)
4 1048698 Sol amortiguadora y sales (Buffer 10X)
5 1048698 Oligonucleoacutetidos (Primers)
6 1048698 Enzima termo-resistente (Ej Taq Polimerasa)
Para la polimerizacioacuten de ADN es necesario
Una polimerasa primers y nucleoacutetidos
Como se utiliza cambios de temperatura para
lograr la desnaturalizacioacuten y renaturalizacioacuten
de las hebras la enzima tiene que ser
resistente a cambios de temperatura
iquestQueacute elementos son necesarios para la
polimerizacioacuten in Vitro
Thermus aquaticus se
descubrioacute en el Parque
Yellowstone inicioacute el campo
de la biologiacutea de los
hipertermoacutefilos
Thermus aquaticus crece
a 70ordm grados (fuente de
la enzima taq polimerasa
usada en la PCR)
PCR
La taq polimerasa no es la uacutenica enzima usada en la
PCR Hay muchas maacutes
Ej PFU (enzima extraiacuteda de Pynococus Furioso)
PCR
TAQ PFU
No tiene actividad 3rsquo
exonucleasa Puede
copiar con errores
Tiene actividad 3rsquo
exonucleasa
Velocidad 2000
nucleoacutetidos min
Velocidad 500
nucleoacutetidos min
Complementariedad durante la hibridacioacuten
en la fase de alineamiento
Se unen zona donde la secuencia es
complementaria
Son disentildeados los primers esto permite
seleccionar que porcioacuten amplificar
PCR Primers
PCR
Ejemplos de utilizacioacuten PCR en diagnoacutestico
1 Colocando primers Fw diferentes (una para
secuencia normal y otra mutada) y mismo Rw
en el mismo tubo
2 Combinando la PCR con cortes con enzimas de
restriccioacuten (si se generase o perdiera algun sitio de
restriccioacuten por la misma mutacioacuten)
concepto Primers alelo especiacuteficos
El siguiente es el resultado en un gel de agarosa
En la calle (1) se sembroacute
el marcador de peso
molecular
En la calle (2) se sembroacute
una muestra conocida
para una mutacioacuten
homocigota
En la calle (3) se sembroacute
la muestra del paciente
El siguiente es el resultado en un gel de agarosa
En la calle (C1) muestra
conocida homocigota
gen mutado
En la calle (C2) muestra
conocida homocigota
gen normal
iquestQueacute resultados
dieron las
muestras 1 2 3 4
iquestQueacute elementos son necesarios para la
polimerizacioacuten in Vitro
Extraccioacuten del ADN molde
Preparado de la MIX
1 Agua libre de nucleasas
2 1048698 Catioacuten divalente (MgCl2)
3 1048698 Desoxinucleoacutetidos (dNTPacutes)
4 1048698 Sol amortiguadora y sales (Buffer 10X)
5 1048698 Oligonucleoacutetidos (Primers)
6 1048698 Enzima termo-resistente (Ej Taq Polimerasa)
Los iones de magnesio
estimulan a la enzima Taq Polimerasa
para que incorpore los dNTPacutes
Algunas aclaracioneshellip
Taq
Mg
Sol amortiguadora PCR
1048698 Mantiene el pH oacuteptimo para que la enzima actuacutee
1048698 Sales
Proporcionan la fuerza ioacutenica adecuada para una maacutexima actividad de la
enzima
Herramientas
POLIMERASA BACTERIANA que resista a los cambios Tordm
Estrategia
Utilizar cambios de temperatura para desnaturalizar y
renaturalizar las hebras de ADN complementario
PCR coacutemo ve el observador el proceso
MIX +
ADN
Soacutelo veremos Teacutecnicas Directas
bullSouthern Blot
bullPCR
bullSecuenciacioacuten
Secuenciacioacuten
Meacutetodo enzimaacutetico 1977
Frederick Sanger desarrolloacute esta teacutecnica
Meacutetodo de los terminadores de cadena o dideoxi
Fundamento
REPLICACION DEL ADN
COMPLEMENTARIEDAD DE BASES
Herramientas
Dideoxinucleotidos
Estrategia
Cuando se agrega un dideoxinucleotido
a la cadena en formacioacuten se
interrumpe la polimerizacioacuten
Secuenciacioacuten
H
P
O
OH
OH
HO
O
O
CH2
NH
N
N
N
Azuacutecar
Base
Fosfato
3rsquo
5rsquo
2rsquo
1rsquo4rsquo
Jeraacuterquico OH
del carbono 3
En la polimerizacioacuten
del ADN
H
P
O
OH
OH
HO
O
O
CH2
NH2
N
N N
N
Azuacutecar
Base
Fosfato
3rsquo
5rsquo
2rsquo
1rsquo4rsquo
H
2rsquo3rsquo-dideoxinucleoacutetido
monofosfato
H
P
O
OH
OH
HO
O
O
CH2
NH2
N
N N
N
Azuacutecar
Base
Fosfato
3rsquo
5rsquo
2rsquo
1rsquo4rsquo
deoxinucleotido
monofosfato
Secuenciacioacuten utiliza deoxinucleotidos
y dideoxinucleotidos
Cuando se incorpora un dideoxinucleoacutetido se
interrumpe la polimerizacioacuten
H
P
O
OH
OH
HO
O
O
CH2
NH2
N
N N
N
Azuacutecar
Base
Fosfato
3rsquo
5rsquo
2rsquo
1rsquo4rsquo
H
2rsquo3rsquo-dideoxinucleoacutetido
monofosfato
Se realizan 4 reacciones de siacutentesis (4 tubos
separados)
Se incluyen pequentildeas cantidades de
dideoxinucleotidos ddNTP que
compiten con los dNTP
En cada tubo se colocan
1 dNTP (4 tipos)
2 un solo tipo de ddNTP por tubo
3 primer o cebador marcado
4 ADN molde a secuenciar
5 Polimerasa
A ddNTP C ddNTP
G ddNTP T ddNTP
Los productos de las 4
reacciones cada una
conteniendo una pequentildea
cantidad de uno de los cuatro
dideoxinucleoacutetidos son
cargadas en el gel y sometidas
a electroforesis
Como la polimerizacioacuten es solo
en direccioacuten 5rsquo a 3rsquo los
fragmentos maacutes cortos estaraacuten
en 5rsquo y los maacutes largos que se
encontraraacuten en la direccioacuten 3rsquo
ddTTPddCTP ddGTPddATP
Lec
tura
5rsquo
a 3rsquo
des
de
la b
asa
al t
ope
Secuenciacioacuten Separacioacuten de fragmentos
Alternativa del meacutetodo Sanger
Se marca cebador con fluorescencia y se activa la reaccioacuten
Los productos se detectan durante electroforelectroforeacutesis al
pasar por un laacuteser que excita los fluorocromos y se detecta
fluorescencia emitida
Se realizan 4 reacciones de secuencia distintas
Se coloca el cebador marcado polimerasa dNTP y ddNTP
Al finalizar las cuatro reacciones se mezclan en uacutenico tubo
SECUENCIACION AUTOMATICA empleando
meacutetodo enzimaacutetico
hellip
Placa caliente
Pol
liacutequido
ATTGC A
Laser
Prisma
Detectores
-
+Ventana
Reaccioacuten
Secuencia
Capilar
iquestCoacutemo se ve el resultado
En el electroferograma se observa dos picos en
la posicioacuten 152 (C T)
A ndash A ndash T ndash G ndash G - T - C - C ndash A ndash N - T - T - G - G - C
A ndash A ndash T ndash G ndash G - T - C - T ndash A ndash N - T - T - G - G - C
Repeticiones en tandem
La variacioacuten en el nuacutemero de repeticiones de los
distintos mini y microsateacutelites es un polimorfismo
muy frecuente
Estos polimorfismos se generan por errores durante la
replicacioacuten
Dado que las repeticiones se encuentran en forma diploide
Cada uno de nosotros posee dos variantes para una repeticioacuten
determinada
VNTR (Nuacutemero variable de repeticiones en tandem) micro sateacutelites hipervariables
Obtencioacuten de DNA a partir de RNA
Rt-PCR Transcriptasareversa
HIBRIDACIOacuteN
La doble hebra de ADN se forma por complementariedad SONDA-muestra (una de las hebras es la sonda en simple cadena y la otra es la muestra en simple cadena)
Los nucleoacutetidos de la sonda estaacute marcados P 32
(radiactivos) Si al revelar hay marcador radiactivo presente estaacute en la muestra analizada la secuencia complementaria a la sonda
Southern Blot
Para poder realizar Hibridacioacuten
en una muestra de ADN
se necesitan realizar
los siguientes pasos
Fragmentacioacuten del ADN y Separacioacuten
Inmovilizacioacuten- Desnaturalizacioacuten
Transferencia
Hibridacioacuten
Revelado
Enzimas de restriccioacuten
ENZIMAS DE RESTRICCION
Los fragmentos de restriccioacuten se pueden separar por tamantildeo mediante electroforesis en gel
Diferentes condiciones de hibridacioacuten permite mayor o menor estabilidad y especificidad
Pasos Previos a la Hibridacioacuten
separacioacuten de fragmentos
Extraccioacuten de ADN
Fragmentar el ADN en porciones maacutes pequentildeas
(Enzimas de restriccioacuten)
Separo los fragmentos realizando una corrida
electroforeacutetica usando como sustrato de
migracioacuten un gel (separacioacuten por tamantildeo)
Pasos Previos a la Hibridacioacuten
Inmovilizacioacuten de los fragmentos en soporte soacutelido
Desnaturalizacioacuten (SIMPLE CADENA)
Transferencia a soporte soacutelido (membrana de nylon nitrocelulosa) Por
capilaridad o por electroforesis pasan del gel a la membrana
Sacado de los bocetos de Edwin Southern
antes de la publicacioacuten de la teacutecnica
Pasos Hibridacioacuten
Se agrega la sonda sobre la membrana y se
incuba
Se lava para quitar el maacuteximo de hibridaciones
inespeciacuteficas
Se revela por autoradiografiacutea
Soacutelo veremos Teacutecnicas Directas
bullSouthern Blot
bullPCR
bullSecuenciacioacuten
PCR Reaccioacuten en cadena
de la polimerasa
Kerry Mullis en 1983 desarrolloacute esta teacutecnica
Amplificacioacuten de un gran nuacutemero de copias a
partir de un fragmento molde de ADN utilizando
una reaccioacuten enzimatica simple de polimerizacion
in vitro
PCR
ADN moldePCR
ADN resultante
Fundamento
REPLICACION DEL ADN
COMPLEMENTARIEDAD DE BASES
Herramientas
POLIMERASA BACTERIANA
Estrategia
Utilizar cambios de temperatura para
desnaturalizar y renaturalizar las hebras de
ADN complementario
PCR
1 Desnaturalizacioacuten 94degC - 96degC
2 Alineacioacuten temperatura variable
3 Extensioacuten 68 - 72degC
PCR la reaccioacuten se divide en 3 pasos
LOS 3 PASOS FORMAN 1 CICLO Y EL CICLO PUEDE
REPETIRSE VARIAS VECES
Necesitamos en este proceso controlar
la temperatura termociclador
Si repetimos el ciclo tendremos cuatro copias
Desnaturalizacioacuten
95degC
Hibridizacioacuten
50-60ordmC
Extensioacuten de la
cadena 75ordmC
Primer Ciclo
2do Ciclo95ordmC
50 - 60ordmC
75ordmC
Muacuteltiples ciclos daraacuten un incremento
exponencial en el nuacutemero de copias
iquestQueacute elementos son necesarios para la
polimerizacioacuten in Vitro
Extraccioacuten del ADN molde
Preparado de la MIX
1 Agua libre de nucleasas
2 1048698 Catioacuten divalente (MgCl2)
3 1048698 Desoxinucleoacutetidos (dNTPacutes)
4 1048698 Sol amortiguadora y sales (Buffer 10X)
5 1048698 Oligonucleoacutetidos (Primers)
6 1048698 Enzima termo-resistente (Ej Taq Polimerasa)
Para la polimerizacioacuten de ADN es necesario
Una polimerasa primers y nucleoacutetidos
Como se utiliza cambios de temperatura para
lograr la desnaturalizacioacuten y renaturalizacioacuten
de las hebras la enzima tiene que ser
resistente a cambios de temperatura
iquestQueacute elementos son necesarios para la
polimerizacioacuten in Vitro
Thermus aquaticus se
descubrioacute en el Parque
Yellowstone inicioacute el campo
de la biologiacutea de los
hipertermoacutefilos
Thermus aquaticus crece
a 70ordm grados (fuente de
la enzima taq polimerasa
usada en la PCR)
PCR
La taq polimerasa no es la uacutenica enzima usada en la
PCR Hay muchas maacutes
Ej PFU (enzima extraiacuteda de Pynococus Furioso)
PCR
TAQ PFU
No tiene actividad 3rsquo
exonucleasa Puede
copiar con errores
Tiene actividad 3rsquo
exonucleasa
Velocidad 2000
nucleoacutetidos min
Velocidad 500
nucleoacutetidos min
Complementariedad durante la hibridacioacuten
en la fase de alineamiento
Se unen zona donde la secuencia es
complementaria
Son disentildeados los primers esto permite
seleccionar que porcioacuten amplificar
PCR Primers
PCR
Ejemplos de utilizacioacuten PCR en diagnoacutestico
1 Colocando primers Fw diferentes (una para
secuencia normal y otra mutada) y mismo Rw
en el mismo tubo
2 Combinando la PCR con cortes con enzimas de
restriccioacuten (si se generase o perdiera algun sitio de
restriccioacuten por la misma mutacioacuten)
concepto Primers alelo especiacuteficos
El siguiente es el resultado en un gel de agarosa
En la calle (1) se sembroacute
el marcador de peso
molecular
En la calle (2) se sembroacute
una muestra conocida
para una mutacioacuten
homocigota
En la calle (3) se sembroacute
la muestra del paciente
El siguiente es el resultado en un gel de agarosa
En la calle (C1) muestra
conocida homocigota
gen mutado
En la calle (C2) muestra
conocida homocigota
gen normal
iquestQueacute resultados
dieron las
muestras 1 2 3 4
iquestQueacute elementos son necesarios para la
polimerizacioacuten in Vitro
Extraccioacuten del ADN molde
Preparado de la MIX
1 Agua libre de nucleasas
2 1048698 Catioacuten divalente (MgCl2)
3 1048698 Desoxinucleoacutetidos (dNTPacutes)
4 1048698 Sol amortiguadora y sales (Buffer 10X)
5 1048698 Oligonucleoacutetidos (Primers)
6 1048698 Enzima termo-resistente (Ej Taq Polimerasa)
Los iones de magnesio
estimulan a la enzima Taq Polimerasa
para que incorpore los dNTPacutes
Algunas aclaracioneshellip
Taq
Mg
Sol amortiguadora PCR
1048698 Mantiene el pH oacuteptimo para que la enzima actuacutee
1048698 Sales
Proporcionan la fuerza ioacutenica adecuada para una maacutexima actividad de la
enzima
Herramientas
POLIMERASA BACTERIANA que resista a los cambios Tordm
Estrategia
Utilizar cambios de temperatura para desnaturalizar y
renaturalizar las hebras de ADN complementario
PCR coacutemo ve el observador el proceso
MIX +
ADN
Soacutelo veremos Teacutecnicas Directas
bullSouthern Blot
bullPCR
bullSecuenciacioacuten
Secuenciacioacuten
Meacutetodo enzimaacutetico 1977
Frederick Sanger desarrolloacute esta teacutecnica
Meacutetodo de los terminadores de cadena o dideoxi
Fundamento
REPLICACION DEL ADN
COMPLEMENTARIEDAD DE BASES
Herramientas
Dideoxinucleotidos
Estrategia
Cuando se agrega un dideoxinucleotido
a la cadena en formacioacuten se
interrumpe la polimerizacioacuten
Secuenciacioacuten
H
P
O
OH
OH
HO
O
O
CH2
NH
N
N
N
Azuacutecar
Base
Fosfato
3rsquo
5rsquo
2rsquo
1rsquo4rsquo
Jeraacuterquico OH
del carbono 3
En la polimerizacioacuten
del ADN
H
P
O
OH
OH
HO
O
O
CH2
NH2
N
N N
N
Azuacutecar
Base
Fosfato
3rsquo
5rsquo
2rsquo
1rsquo4rsquo
H
2rsquo3rsquo-dideoxinucleoacutetido
monofosfato
H
P
O
OH
OH
HO
O
O
CH2
NH2
N
N N
N
Azuacutecar
Base
Fosfato
3rsquo
5rsquo
2rsquo
1rsquo4rsquo
deoxinucleotido
monofosfato
Secuenciacioacuten utiliza deoxinucleotidos
y dideoxinucleotidos
Cuando se incorpora un dideoxinucleoacutetido se
interrumpe la polimerizacioacuten
H
P
O
OH
OH
HO
O
O
CH2
NH2
N
N N
N
Azuacutecar
Base
Fosfato
3rsquo
5rsquo
2rsquo
1rsquo4rsquo
H
2rsquo3rsquo-dideoxinucleoacutetido
monofosfato
Se realizan 4 reacciones de siacutentesis (4 tubos
separados)
Se incluyen pequentildeas cantidades de
dideoxinucleotidos ddNTP que
compiten con los dNTP
En cada tubo se colocan
1 dNTP (4 tipos)
2 un solo tipo de ddNTP por tubo
3 primer o cebador marcado
4 ADN molde a secuenciar
5 Polimerasa
A ddNTP C ddNTP
G ddNTP T ddNTP
Los productos de las 4
reacciones cada una
conteniendo una pequentildea
cantidad de uno de los cuatro
dideoxinucleoacutetidos son
cargadas en el gel y sometidas
a electroforesis
Como la polimerizacioacuten es solo
en direccioacuten 5rsquo a 3rsquo los
fragmentos maacutes cortos estaraacuten
en 5rsquo y los maacutes largos que se
encontraraacuten en la direccioacuten 3rsquo
ddTTPddCTP ddGTPddATP
Lec
tura
5rsquo
a 3rsquo
des
de
la b
asa
al t
ope
Secuenciacioacuten Separacioacuten de fragmentos
Alternativa del meacutetodo Sanger
Se marca cebador con fluorescencia y se activa la reaccioacuten
Los productos se detectan durante electroforelectroforeacutesis al
pasar por un laacuteser que excita los fluorocromos y se detecta
fluorescencia emitida
Se realizan 4 reacciones de secuencia distintas
Se coloca el cebador marcado polimerasa dNTP y ddNTP
Al finalizar las cuatro reacciones se mezclan en uacutenico tubo
SECUENCIACION AUTOMATICA empleando
meacutetodo enzimaacutetico
hellip
Placa caliente
Pol
liacutequido
ATTGC A
Laser
Prisma
Detectores
-
+Ventana
Reaccioacuten
Secuencia
Capilar
iquestCoacutemo se ve el resultado
En el electroferograma se observa dos picos en
la posicioacuten 152 (C T)
A ndash A ndash T ndash G ndash G - T - C - C ndash A ndash N - T - T - G - G - C
A ndash A ndash T ndash G ndash G - T - C - T ndash A ndash N - T - T - G - G - C
Repeticiones en tandem
La variacioacuten en el nuacutemero de repeticiones de los
distintos mini y microsateacutelites es un polimorfismo
muy frecuente
Estos polimorfismos se generan por errores durante la
replicacioacuten
Dado que las repeticiones se encuentran en forma diploide
Cada uno de nosotros posee dos variantes para una repeticioacuten
determinada
VNTR (Nuacutemero variable de repeticiones en tandem) micro sateacutelites hipervariables
Obtencioacuten de DNA a partir de RNA
Rt-PCR Transcriptasareversa
Para poder realizar Hibridacioacuten
en una muestra de ADN
se necesitan realizar
los siguientes pasos
Fragmentacioacuten del ADN y Separacioacuten
Inmovilizacioacuten- Desnaturalizacioacuten
Transferencia
Hibridacioacuten
Revelado
Enzimas de restriccioacuten
ENZIMAS DE RESTRICCION
Los fragmentos de restriccioacuten se pueden separar por tamantildeo mediante electroforesis en gel
Diferentes condiciones de hibridacioacuten permite mayor o menor estabilidad y especificidad
Pasos Previos a la Hibridacioacuten
separacioacuten de fragmentos
Extraccioacuten de ADN
Fragmentar el ADN en porciones maacutes pequentildeas
(Enzimas de restriccioacuten)
Separo los fragmentos realizando una corrida
electroforeacutetica usando como sustrato de
migracioacuten un gel (separacioacuten por tamantildeo)
Pasos Previos a la Hibridacioacuten
Inmovilizacioacuten de los fragmentos en soporte soacutelido
Desnaturalizacioacuten (SIMPLE CADENA)
Transferencia a soporte soacutelido (membrana de nylon nitrocelulosa) Por
capilaridad o por electroforesis pasan del gel a la membrana
Sacado de los bocetos de Edwin Southern
antes de la publicacioacuten de la teacutecnica
Pasos Hibridacioacuten
Se agrega la sonda sobre la membrana y se
incuba
Se lava para quitar el maacuteximo de hibridaciones
inespeciacuteficas
Se revela por autoradiografiacutea
Soacutelo veremos Teacutecnicas Directas
bullSouthern Blot
bullPCR
bullSecuenciacioacuten
PCR Reaccioacuten en cadena
de la polimerasa
Kerry Mullis en 1983 desarrolloacute esta teacutecnica
Amplificacioacuten de un gran nuacutemero de copias a
partir de un fragmento molde de ADN utilizando
una reaccioacuten enzimatica simple de polimerizacion
in vitro
PCR
ADN moldePCR
ADN resultante
Fundamento
REPLICACION DEL ADN
COMPLEMENTARIEDAD DE BASES
Herramientas
POLIMERASA BACTERIANA
Estrategia
Utilizar cambios de temperatura para
desnaturalizar y renaturalizar las hebras de
ADN complementario
PCR
1 Desnaturalizacioacuten 94degC - 96degC
2 Alineacioacuten temperatura variable
3 Extensioacuten 68 - 72degC
PCR la reaccioacuten se divide en 3 pasos
LOS 3 PASOS FORMAN 1 CICLO Y EL CICLO PUEDE
REPETIRSE VARIAS VECES
Necesitamos en este proceso controlar
la temperatura termociclador
Si repetimos el ciclo tendremos cuatro copias
Desnaturalizacioacuten
95degC
Hibridizacioacuten
50-60ordmC
Extensioacuten de la
cadena 75ordmC
Primer Ciclo
2do Ciclo95ordmC
50 - 60ordmC
75ordmC
Muacuteltiples ciclos daraacuten un incremento
exponencial en el nuacutemero de copias
iquestQueacute elementos son necesarios para la
polimerizacioacuten in Vitro
Extraccioacuten del ADN molde
Preparado de la MIX
1 Agua libre de nucleasas
2 1048698 Catioacuten divalente (MgCl2)
3 1048698 Desoxinucleoacutetidos (dNTPacutes)
4 1048698 Sol amortiguadora y sales (Buffer 10X)
5 1048698 Oligonucleoacutetidos (Primers)
6 1048698 Enzima termo-resistente (Ej Taq Polimerasa)
Para la polimerizacioacuten de ADN es necesario
Una polimerasa primers y nucleoacutetidos
Como se utiliza cambios de temperatura para
lograr la desnaturalizacioacuten y renaturalizacioacuten
de las hebras la enzima tiene que ser
resistente a cambios de temperatura
iquestQueacute elementos son necesarios para la
polimerizacioacuten in Vitro
Thermus aquaticus se
descubrioacute en el Parque
Yellowstone inicioacute el campo
de la biologiacutea de los
hipertermoacutefilos
Thermus aquaticus crece
a 70ordm grados (fuente de
la enzima taq polimerasa
usada en la PCR)
PCR
La taq polimerasa no es la uacutenica enzima usada en la
PCR Hay muchas maacutes
Ej PFU (enzima extraiacuteda de Pynococus Furioso)
PCR
TAQ PFU
No tiene actividad 3rsquo
exonucleasa Puede
copiar con errores
Tiene actividad 3rsquo
exonucleasa
Velocidad 2000
nucleoacutetidos min
Velocidad 500
nucleoacutetidos min
Complementariedad durante la hibridacioacuten
en la fase de alineamiento
Se unen zona donde la secuencia es
complementaria
Son disentildeados los primers esto permite
seleccionar que porcioacuten amplificar
PCR Primers
PCR
Ejemplos de utilizacioacuten PCR en diagnoacutestico
1 Colocando primers Fw diferentes (una para
secuencia normal y otra mutada) y mismo Rw
en el mismo tubo
2 Combinando la PCR con cortes con enzimas de
restriccioacuten (si se generase o perdiera algun sitio de
restriccioacuten por la misma mutacioacuten)
concepto Primers alelo especiacuteficos
El siguiente es el resultado en un gel de agarosa
En la calle (1) se sembroacute
el marcador de peso
molecular
En la calle (2) se sembroacute
una muestra conocida
para una mutacioacuten
homocigota
En la calle (3) se sembroacute
la muestra del paciente
El siguiente es el resultado en un gel de agarosa
En la calle (C1) muestra
conocida homocigota
gen mutado
En la calle (C2) muestra
conocida homocigota
gen normal
iquestQueacute resultados
dieron las
muestras 1 2 3 4
iquestQueacute elementos son necesarios para la
polimerizacioacuten in Vitro
Extraccioacuten del ADN molde
Preparado de la MIX
1 Agua libre de nucleasas
2 1048698 Catioacuten divalente (MgCl2)
3 1048698 Desoxinucleoacutetidos (dNTPacutes)
4 1048698 Sol amortiguadora y sales (Buffer 10X)
5 1048698 Oligonucleoacutetidos (Primers)
6 1048698 Enzima termo-resistente (Ej Taq Polimerasa)
Los iones de magnesio
estimulan a la enzima Taq Polimerasa
para que incorpore los dNTPacutes
Algunas aclaracioneshellip
Taq
Mg
Sol amortiguadora PCR
1048698 Mantiene el pH oacuteptimo para que la enzima actuacutee
1048698 Sales
Proporcionan la fuerza ioacutenica adecuada para una maacutexima actividad de la
enzima
Herramientas
POLIMERASA BACTERIANA que resista a los cambios Tordm
Estrategia
Utilizar cambios de temperatura para desnaturalizar y
renaturalizar las hebras de ADN complementario
PCR coacutemo ve el observador el proceso
MIX +
ADN
Soacutelo veremos Teacutecnicas Directas
bullSouthern Blot
bullPCR
bullSecuenciacioacuten
Secuenciacioacuten
Meacutetodo enzimaacutetico 1977
Frederick Sanger desarrolloacute esta teacutecnica
Meacutetodo de los terminadores de cadena o dideoxi
Fundamento
REPLICACION DEL ADN
COMPLEMENTARIEDAD DE BASES
Herramientas
Dideoxinucleotidos
Estrategia
Cuando se agrega un dideoxinucleotido
a la cadena en formacioacuten se
interrumpe la polimerizacioacuten
Secuenciacioacuten
H
P
O
OH
OH
HO
O
O
CH2
NH
N
N
N
Azuacutecar
Base
Fosfato
3rsquo
5rsquo
2rsquo
1rsquo4rsquo
Jeraacuterquico OH
del carbono 3
En la polimerizacioacuten
del ADN
H
P
O
OH
OH
HO
O
O
CH2
NH2
N
N N
N
Azuacutecar
Base
Fosfato
3rsquo
5rsquo
2rsquo
1rsquo4rsquo
H
2rsquo3rsquo-dideoxinucleoacutetido
monofosfato
H
P
O
OH
OH
HO
O
O
CH2
NH2
N
N N
N
Azuacutecar
Base
Fosfato
3rsquo
5rsquo
2rsquo
1rsquo4rsquo
deoxinucleotido
monofosfato
Secuenciacioacuten utiliza deoxinucleotidos
y dideoxinucleotidos
Cuando se incorpora un dideoxinucleoacutetido se
interrumpe la polimerizacioacuten
H
P
O
OH
OH
HO
O
O
CH2
NH2
N
N N
N
Azuacutecar
Base
Fosfato
3rsquo
5rsquo
2rsquo
1rsquo4rsquo
H
2rsquo3rsquo-dideoxinucleoacutetido
monofosfato
Se realizan 4 reacciones de siacutentesis (4 tubos
separados)
Se incluyen pequentildeas cantidades de
dideoxinucleotidos ddNTP que
compiten con los dNTP
En cada tubo se colocan
1 dNTP (4 tipos)
2 un solo tipo de ddNTP por tubo
3 primer o cebador marcado
4 ADN molde a secuenciar
5 Polimerasa
A ddNTP C ddNTP
G ddNTP T ddNTP
Los productos de las 4
reacciones cada una
conteniendo una pequentildea
cantidad de uno de los cuatro
dideoxinucleoacutetidos son
cargadas en el gel y sometidas
a electroforesis
Como la polimerizacioacuten es solo
en direccioacuten 5rsquo a 3rsquo los
fragmentos maacutes cortos estaraacuten
en 5rsquo y los maacutes largos que se
encontraraacuten en la direccioacuten 3rsquo
ddTTPddCTP ddGTPddATP
Lec
tura
5rsquo
a 3rsquo
des
de
la b
asa
al t
ope
Secuenciacioacuten Separacioacuten de fragmentos
Alternativa del meacutetodo Sanger
Se marca cebador con fluorescencia y se activa la reaccioacuten
Los productos se detectan durante electroforelectroforeacutesis al
pasar por un laacuteser que excita los fluorocromos y se detecta
fluorescencia emitida
Se realizan 4 reacciones de secuencia distintas
Se coloca el cebador marcado polimerasa dNTP y ddNTP
Al finalizar las cuatro reacciones se mezclan en uacutenico tubo
SECUENCIACION AUTOMATICA empleando
meacutetodo enzimaacutetico
hellip
Placa caliente
Pol
liacutequido
ATTGC A
Laser
Prisma
Detectores
-
+Ventana
Reaccioacuten
Secuencia
Capilar
iquestCoacutemo se ve el resultado
En el electroferograma se observa dos picos en
la posicioacuten 152 (C T)
A ndash A ndash T ndash G ndash G - T - C - C ndash A ndash N - T - T - G - G - C
A ndash A ndash T ndash G ndash G - T - C - T ndash A ndash N - T - T - G - G - C
Repeticiones en tandem
La variacioacuten en el nuacutemero de repeticiones de los
distintos mini y microsateacutelites es un polimorfismo
muy frecuente
Estos polimorfismos se generan por errores durante la
replicacioacuten
Dado que las repeticiones se encuentran en forma diploide
Cada uno de nosotros posee dos variantes para una repeticioacuten
determinada
VNTR (Nuacutemero variable de repeticiones en tandem) micro sateacutelites hipervariables
Obtencioacuten de DNA a partir de RNA
Rt-PCR Transcriptasareversa
Fragmentacioacuten del ADN y Separacioacuten
Inmovilizacioacuten- Desnaturalizacioacuten
Transferencia
Hibridacioacuten
Revelado
Enzimas de restriccioacuten
ENZIMAS DE RESTRICCION
Los fragmentos de restriccioacuten se pueden separar por tamantildeo mediante electroforesis en gel
Diferentes condiciones de hibridacioacuten permite mayor o menor estabilidad y especificidad
Pasos Previos a la Hibridacioacuten
separacioacuten de fragmentos
Extraccioacuten de ADN
Fragmentar el ADN en porciones maacutes pequentildeas
(Enzimas de restriccioacuten)
Separo los fragmentos realizando una corrida
electroforeacutetica usando como sustrato de
migracioacuten un gel (separacioacuten por tamantildeo)
Pasos Previos a la Hibridacioacuten
Inmovilizacioacuten de los fragmentos en soporte soacutelido
Desnaturalizacioacuten (SIMPLE CADENA)
Transferencia a soporte soacutelido (membrana de nylon nitrocelulosa) Por
capilaridad o por electroforesis pasan del gel a la membrana
Sacado de los bocetos de Edwin Southern
antes de la publicacioacuten de la teacutecnica
Pasos Hibridacioacuten
Se agrega la sonda sobre la membrana y se
incuba
Se lava para quitar el maacuteximo de hibridaciones
inespeciacuteficas
Se revela por autoradiografiacutea
Soacutelo veremos Teacutecnicas Directas
bullSouthern Blot
bullPCR
bullSecuenciacioacuten
PCR Reaccioacuten en cadena
de la polimerasa
Kerry Mullis en 1983 desarrolloacute esta teacutecnica
Amplificacioacuten de un gran nuacutemero de copias a
partir de un fragmento molde de ADN utilizando
una reaccioacuten enzimatica simple de polimerizacion
in vitro
PCR
ADN moldePCR
ADN resultante
Fundamento
REPLICACION DEL ADN
COMPLEMENTARIEDAD DE BASES
Herramientas
POLIMERASA BACTERIANA
Estrategia
Utilizar cambios de temperatura para
desnaturalizar y renaturalizar las hebras de
ADN complementario
PCR
1 Desnaturalizacioacuten 94degC - 96degC
2 Alineacioacuten temperatura variable
3 Extensioacuten 68 - 72degC
PCR la reaccioacuten se divide en 3 pasos
LOS 3 PASOS FORMAN 1 CICLO Y EL CICLO PUEDE
REPETIRSE VARIAS VECES
Necesitamos en este proceso controlar
la temperatura termociclador
Si repetimos el ciclo tendremos cuatro copias
Desnaturalizacioacuten
95degC
Hibridizacioacuten
50-60ordmC
Extensioacuten de la
cadena 75ordmC
Primer Ciclo
2do Ciclo95ordmC
50 - 60ordmC
75ordmC
Muacuteltiples ciclos daraacuten un incremento
exponencial en el nuacutemero de copias
iquestQueacute elementos son necesarios para la
polimerizacioacuten in Vitro
Extraccioacuten del ADN molde
Preparado de la MIX
1 Agua libre de nucleasas
2 1048698 Catioacuten divalente (MgCl2)
3 1048698 Desoxinucleoacutetidos (dNTPacutes)
4 1048698 Sol amortiguadora y sales (Buffer 10X)
5 1048698 Oligonucleoacutetidos (Primers)
6 1048698 Enzima termo-resistente (Ej Taq Polimerasa)
Para la polimerizacioacuten de ADN es necesario
Una polimerasa primers y nucleoacutetidos
Como se utiliza cambios de temperatura para
lograr la desnaturalizacioacuten y renaturalizacioacuten
de las hebras la enzima tiene que ser
resistente a cambios de temperatura
iquestQueacute elementos son necesarios para la
polimerizacioacuten in Vitro
Thermus aquaticus se
descubrioacute en el Parque
Yellowstone inicioacute el campo
de la biologiacutea de los
hipertermoacutefilos
Thermus aquaticus crece
a 70ordm grados (fuente de
la enzima taq polimerasa
usada en la PCR)
PCR
La taq polimerasa no es la uacutenica enzima usada en la
PCR Hay muchas maacutes
Ej PFU (enzima extraiacuteda de Pynococus Furioso)
PCR
TAQ PFU
No tiene actividad 3rsquo
exonucleasa Puede
copiar con errores
Tiene actividad 3rsquo
exonucleasa
Velocidad 2000
nucleoacutetidos min
Velocidad 500
nucleoacutetidos min
Complementariedad durante la hibridacioacuten
en la fase de alineamiento
Se unen zona donde la secuencia es
complementaria
Son disentildeados los primers esto permite
seleccionar que porcioacuten amplificar
PCR Primers
PCR
Ejemplos de utilizacioacuten PCR en diagnoacutestico
1 Colocando primers Fw diferentes (una para
secuencia normal y otra mutada) y mismo Rw
en el mismo tubo
2 Combinando la PCR con cortes con enzimas de
restriccioacuten (si se generase o perdiera algun sitio de
restriccioacuten por la misma mutacioacuten)
concepto Primers alelo especiacuteficos
El siguiente es el resultado en un gel de agarosa
En la calle (1) se sembroacute
el marcador de peso
molecular
En la calle (2) se sembroacute
una muestra conocida
para una mutacioacuten
homocigota
En la calle (3) se sembroacute
la muestra del paciente
El siguiente es el resultado en un gel de agarosa
En la calle (C1) muestra
conocida homocigota
gen mutado
En la calle (C2) muestra
conocida homocigota
gen normal
iquestQueacute resultados
dieron las
muestras 1 2 3 4
iquestQueacute elementos son necesarios para la
polimerizacioacuten in Vitro
Extraccioacuten del ADN molde
Preparado de la MIX
1 Agua libre de nucleasas
2 1048698 Catioacuten divalente (MgCl2)
3 1048698 Desoxinucleoacutetidos (dNTPacutes)
4 1048698 Sol amortiguadora y sales (Buffer 10X)
5 1048698 Oligonucleoacutetidos (Primers)
6 1048698 Enzima termo-resistente (Ej Taq Polimerasa)
Los iones de magnesio
estimulan a la enzima Taq Polimerasa
para que incorpore los dNTPacutes
Algunas aclaracioneshellip
Taq
Mg
Sol amortiguadora PCR
1048698 Mantiene el pH oacuteptimo para que la enzima actuacutee
1048698 Sales
Proporcionan la fuerza ioacutenica adecuada para una maacutexima actividad de la
enzima
Herramientas
POLIMERASA BACTERIANA que resista a los cambios Tordm
Estrategia
Utilizar cambios de temperatura para desnaturalizar y
renaturalizar las hebras de ADN complementario
PCR coacutemo ve el observador el proceso
MIX +
ADN
Soacutelo veremos Teacutecnicas Directas
bullSouthern Blot
bullPCR
bullSecuenciacioacuten
Secuenciacioacuten
Meacutetodo enzimaacutetico 1977
Frederick Sanger desarrolloacute esta teacutecnica
Meacutetodo de los terminadores de cadena o dideoxi
Fundamento
REPLICACION DEL ADN
COMPLEMENTARIEDAD DE BASES
Herramientas
Dideoxinucleotidos
Estrategia
Cuando se agrega un dideoxinucleotido
a la cadena en formacioacuten se
interrumpe la polimerizacioacuten
Secuenciacioacuten
H
P
O
OH
OH
HO
O
O
CH2
NH
N
N
N
Azuacutecar
Base
Fosfato
3rsquo
5rsquo
2rsquo
1rsquo4rsquo
Jeraacuterquico OH
del carbono 3
En la polimerizacioacuten
del ADN
H
P
O
OH
OH
HO
O
O
CH2
NH2
N
N N
N
Azuacutecar
Base
Fosfato
3rsquo
5rsquo
2rsquo
1rsquo4rsquo
H
2rsquo3rsquo-dideoxinucleoacutetido
monofosfato
H
P
O
OH
OH
HO
O
O
CH2
NH2
N
N N
N
Azuacutecar
Base
Fosfato
3rsquo
5rsquo
2rsquo
1rsquo4rsquo
deoxinucleotido
monofosfato
Secuenciacioacuten utiliza deoxinucleotidos
y dideoxinucleotidos
Cuando se incorpora un dideoxinucleoacutetido se
interrumpe la polimerizacioacuten
H
P
O
OH
OH
HO
O
O
CH2
NH2
N
N N
N
Azuacutecar
Base
Fosfato
3rsquo
5rsquo
2rsquo
1rsquo4rsquo
H
2rsquo3rsquo-dideoxinucleoacutetido
monofosfato
Se realizan 4 reacciones de siacutentesis (4 tubos
separados)
Se incluyen pequentildeas cantidades de
dideoxinucleotidos ddNTP que
compiten con los dNTP
En cada tubo se colocan
1 dNTP (4 tipos)
2 un solo tipo de ddNTP por tubo
3 primer o cebador marcado
4 ADN molde a secuenciar
5 Polimerasa
A ddNTP C ddNTP
G ddNTP T ddNTP
Los productos de las 4
reacciones cada una
conteniendo una pequentildea
cantidad de uno de los cuatro
dideoxinucleoacutetidos son
cargadas en el gel y sometidas
a electroforesis
Como la polimerizacioacuten es solo
en direccioacuten 5rsquo a 3rsquo los
fragmentos maacutes cortos estaraacuten
en 5rsquo y los maacutes largos que se
encontraraacuten en la direccioacuten 3rsquo
ddTTPddCTP ddGTPddATP
Lec
tura
5rsquo
a 3rsquo
des
de
la b
asa
al t
ope
Secuenciacioacuten Separacioacuten de fragmentos
Alternativa del meacutetodo Sanger
Se marca cebador con fluorescencia y se activa la reaccioacuten
Los productos se detectan durante electroforelectroforeacutesis al
pasar por un laacuteser que excita los fluorocromos y se detecta
fluorescencia emitida
Se realizan 4 reacciones de secuencia distintas
Se coloca el cebador marcado polimerasa dNTP y ddNTP
Al finalizar las cuatro reacciones se mezclan en uacutenico tubo
SECUENCIACION AUTOMATICA empleando
meacutetodo enzimaacutetico
hellip
Placa caliente
Pol
liacutequido
ATTGC A
Laser
Prisma
Detectores
-
+Ventana
Reaccioacuten
Secuencia
Capilar
iquestCoacutemo se ve el resultado
En el electroferograma se observa dos picos en
la posicioacuten 152 (C T)
A ndash A ndash T ndash G ndash G - T - C - C ndash A ndash N - T - T - G - G - C
A ndash A ndash T ndash G ndash G - T - C - T ndash A ndash N - T - T - G - G - C
Repeticiones en tandem
La variacioacuten en el nuacutemero de repeticiones de los
distintos mini y microsateacutelites es un polimorfismo
muy frecuente
Estos polimorfismos se generan por errores durante la
replicacioacuten
Dado que las repeticiones se encuentran en forma diploide
Cada uno de nosotros posee dos variantes para una repeticioacuten
determinada
VNTR (Nuacutemero variable de repeticiones en tandem) micro sateacutelites hipervariables
Obtencioacuten de DNA a partir de RNA
Rt-PCR Transcriptasareversa
Enzimas de restriccioacuten
ENZIMAS DE RESTRICCION
Los fragmentos de restriccioacuten se pueden separar por tamantildeo mediante electroforesis en gel
Diferentes condiciones de hibridacioacuten permite mayor o menor estabilidad y especificidad
Pasos Previos a la Hibridacioacuten
separacioacuten de fragmentos
Extraccioacuten de ADN
Fragmentar el ADN en porciones maacutes pequentildeas
(Enzimas de restriccioacuten)
Separo los fragmentos realizando una corrida
electroforeacutetica usando como sustrato de
migracioacuten un gel (separacioacuten por tamantildeo)
Pasos Previos a la Hibridacioacuten
Inmovilizacioacuten de los fragmentos en soporte soacutelido
Desnaturalizacioacuten (SIMPLE CADENA)
Transferencia a soporte soacutelido (membrana de nylon nitrocelulosa) Por
capilaridad o por electroforesis pasan del gel a la membrana
Sacado de los bocetos de Edwin Southern
antes de la publicacioacuten de la teacutecnica
Pasos Hibridacioacuten
Se agrega la sonda sobre la membrana y se
incuba
Se lava para quitar el maacuteximo de hibridaciones
inespeciacuteficas
Se revela por autoradiografiacutea
Soacutelo veremos Teacutecnicas Directas
bullSouthern Blot
bullPCR
bullSecuenciacioacuten
PCR Reaccioacuten en cadena
de la polimerasa
Kerry Mullis en 1983 desarrolloacute esta teacutecnica
Amplificacioacuten de un gran nuacutemero de copias a
partir de un fragmento molde de ADN utilizando
una reaccioacuten enzimatica simple de polimerizacion
in vitro
PCR
ADN moldePCR
ADN resultante
Fundamento
REPLICACION DEL ADN
COMPLEMENTARIEDAD DE BASES
Herramientas
POLIMERASA BACTERIANA
Estrategia
Utilizar cambios de temperatura para
desnaturalizar y renaturalizar las hebras de
ADN complementario
PCR
1 Desnaturalizacioacuten 94degC - 96degC
2 Alineacioacuten temperatura variable
3 Extensioacuten 68 - 72degC
PCR la reaccioacuten se divide en 3 pasos
LOS 3 PASOS FORMAN 1 CICLO Y EL CICLO PUEDE
REPETIRSE VARIAS VECES
Necesitamos en este proceso controlar
la temperatura termociclador
Si repetimos el ciclo tendremos cuatro copias
Desnaturalizacioacuten
95degC
Hibridizacioacuten
50-60ordmC
Extensioacuten de la
cadena 75ordmC
Primer Ciclo
2do Ciclo95ordmC
50 - 60ordmC
75ordmC
Muacuteltiples ciclos daraacuten un incremento
exponencial en el nuacutemero de copias
iquestQueacute elementos son necesarios para la
polimerizacioacuten in Vitro
Extraccioacuten del ADN molde
Preparado de la MIX
1 Agua libre de nucleasas
2 1048698 Catioacuten divalente (MgCl2)
3 1048698 Desoxinucleoacutetidos (dNTPacutes)
4 1048698 Sol amortiguadora y sales (Buffer 10X)
5 1048698 Oligonucleoacutetidos (Primers)
6 1048698 Enzima termo-resistente (Ej Taq Polimerasa)
Para la polimerizacioacuten de ADN es necesario
Una polimerasa primers y nucleoacutetidos
Como se utiliza cambios de temperatura para
lograr la desnaturalizacioacuten y renaturalizacioacuten
de las hebras la enzima tiene que ser
resistente a cambios de temperatura
iquestQueacute elementos son necesarios para la
polimerizacioacuten in Vitro
Thermus aquaticus se
descubrioacute en el Parque
Yellowstone inicioacute el campo
de la biologiacutea de los
hipertermoacutefilos
Thermus aquaticus crece
a 70ordm grados (fuente de
la enzima taq polimerasa
usada en la PCR)
PCR
La taq polimerasa no es la uacutenica enzima usada en la
PCR Hay muchas maacutes
Ej PFU (enzima extraiacuteda de Pynococus Furioso)
PCR
TAQ PFU
No tiene actividad 3rsquo
exonucleasa Puede
copiar con errores
Tiene actividad 3rsquo
exonucleasa
Velocidad 2000
nucleoacutetidos min
Velocidad 500
nucleoacutetidos min
Complementariedad durante la hibridacioacuten
en la fase de alineamiento
Se unen zona donde la secuencia es
complementaria
Son disentildeados los primers esto permite
seleccionar que porcioacuten amplificar
PCR Primers
PCR
Ejemplos de utilizacioacuten PCR en diagnoacutestico
1 Colocando primers Fw diferentes (una para
secuencia normal y otra mutada) y mismo Rw
en el mismo tubo
2 Combinando la PCR con cortes con enzimas de
restriccioacuten (si se generase o perdiera algun sitio de
restriccioacuten por la misma mutacioacuten)
concepto Primers alelo especiacuteficos
El siguiente es el resultado en un gel de agarosa
En la calle (1) se sembroacute
el marcador de peso
molecular
En la calle (2) se sembroacute
una muestra conocida
para una mutacioacuten
homocigota
En la calle (3) se sembroacute
la muestra del paciente
El siguiente es el resultado en un gel de agarosa
En la calle (C1) muestra
conocida homocigota
gen mutado
En la calle (C2) muestra
conocida homocigota
gen normal
iquestQueacute resultados
dieron las
muestras 1 2 3 4
iquestQueacute elementos son necesarios para la
polimerizacioacuten in Vitro
Extraccioacuten del ADN molde
Preparado de la MIX
1 Agua libre de nucleasas
2 1048698 Catioacuten divalente (MgCl2)
3 1048698 Desoxinucleoacutetidos (dNTPacutes)
4 1048698 Sol amortiguadora y sales (Buffer 10X)
5 1048698 Oligonucleoacutetidos (Primers)
6 1048698 Enzima termo-resistente (Ej Taq Polimerasa)
Los iones de magnesio
estimulan a la enzima Taq Polimerasa
para que incorpore los dNTPacutes
Algunas aclaracioneshellip
Taq
Mg
Sol amortiguadora PCR
1048698 Mantiene el pH oacuteptimo para que la enzima actuacutee
1048698 Sales
Proporcionan la fuerza ioacutenica adecuada para una maacutexima actividad de la
enzima
Herramientas
POLIMERASA BACTERIANA que resista a los cambios Tordm
Estrategia
Utilizar cambios de temperatura para desnaturalizar y
renaturalizar las hebras de ADN complementario
PCR coacutemo ve el observador el proceso
MIX +
ADN
Soacutelo veremos Teacutecnicas Directas
bullSouthern Blot
bullPCR
bullSecuenciacioacuten
Secuenciacioacuten
Meacutetodo enzimaacutetico 1977
Frederick Sanger desarrolloacute esta teacutecnica
Meacutetodo de los terminadores de cadena o dideoxi
Fundamento
REPLICACION DEL ADN
COMPLEMENTARIEDAD DE BASES
Herramientas
Dideoxinucleotidos
Estrategia
Cuando se agrega un dideoxinucleotido
a la cadena en formacioacuten se
interrumpe la polimerizacioacuten
Secuenciacioacuten
H
P
O
OH
OH
HO
O
O
CH2
NH
N
N
N
Azuacutecar
Base
Fosfato
3rsquo
5rsquo
2rsquo
1rsquo4rsquo
Jeraacuterquico OH
del carbono 3
En la polimerizacioacuten
del ADN
H
P
O
OH
OH
HO
O
O
CH2
NH2
N
N N
N
Azuacutecar
Base
Fosfato
3rsquo
5rsquo
2rsquo
1rsquo4rsquo
H
2rsquo3rsquo-dideoxinucleoacutetido
monofosfato
H
P
O
OH
OH
HO
O
O
CH2
NH2
N
N N
N
Azuacutecar
Base
Fosfato
3rsquo
5rsquo
2rsquo
1rsquo4rsquo
deoxinucleotido
monofosfato
Secuenciacioacuten utiliza deoxinucleotidos
y dideoxinucleotidos
Cuando se incorpora un dideoxinucleoacutetido se
interrumpe la polimerizacioacuten
H
P
O
OH
OH
HO
O
O
CH2
NH2
N
N N
N
Azuacutecar
Base
Fosfato
3rsquo
5rsquo
2rsquo
1rsquo4rsquo
H
2rsquo3rsquo-dideoxinucleoacutetido
monofosfato
Se realizan 4 reacciones de siacutentesis (4 tubos
separados)
Se incluyen pequentildeas cantidades de
dideoxinucleotidos ddNTP que
compiten con los dNTP
En cada tubo se colocan
1 dNTP (4 tipos)
2 un solo tipo de ddNTP por tubo
3 primer o cebador marcado
4 ADN molde a secuenciar
5 Polimerasa
A ddNTP C ddNTP
G ddNTP T ddNTP
Los productos de las 4
reacciones cada una
conteniendo una pequentildea
cantidad de uno de los cuatro
dideoxinucleoacutetidos son
cargadas en el gel y sometidas
a electroforesis
Como la polimerizacioacuten es solo
en direccioacuten 5rsquo a 3rsquo los
fragmentos maacutes cortos estaraacuten
en 5rsquo y los maacutes largos que se
encontraraacuten en la direccioacuten 3rsquo
ddTTPddCTP ddGTPddATP
Lec
tura
5rsquo
a 3rsquo
des
de
la b
asa
al t
ope
Secuenciacioacuten Separacioacuten de fragmentos
Alternativa del meacutetodo Sanger
Se marca cebador con fluorescencia y se activa la reaccioacuten
Los productos se detectan durante electroforelectroforeacutesis al
pasar por un laacuteser que excita los fluorocromos y se detecta
fluorescencia emitida
Se realizan 4 reacciones de secuencia distintas
Se coloca el cebador marcado polimerasa dNTP y ddNTP
Al finalizar las cuatro reacciones se mezclan en uacutenico tubo
SECUENCIACION AUTOMATICA empleando
meacutetodo enzimaacutetico
hellip
Placa caliente
Pol
liacutequido
ATTGC A
Laser
Prisma
Detectores
-
+Ventana
Reaccioacuten
Secuencia
Capilar
iquestCoacutemo se ve el resultado
En el electroferograma se observa dos picos en
la posicioacuten 152 (C T)
A ndash A ndash T ndash G ndash G - T - C - C ndash A ndash N - T - T - G - G - C
A ndash A ndash T ndash G ndash G - T - C - T ndash A ndash N - T - T - G - G - C
Repeticiones en tandem
La variacioacuten en el nuacutemero de repeticiones de los
distintos mini y microsateacutelites es un polimorfismo
muy frecuente
Estos polimorfismos se generan por errores durante la
replicacioacuten
Dado que las repeticiones se encuentran en forma diploide
Cada uno de nosotros posee dos variantes para una repeticioacuten
determinada
VNTR (Nuacutemero variable de repeticiones en tandem) micro sateacutelites hipervariables
Obtencioacuten de DNA a partir de RNA
Rt-PCR Transcriptasareversa
ENZIMAS DE RESTRICCION
Los fragmentos de restriccioacuten se pueden separar por tamantildeo mediante electroforesis en gel
Diferentes condiciones de hibridacioacuten permite mayor o menor estabilidad y especificidad
Pasos Previos a la Hibridacioacuten
separacioacuten de fragmentos
Extraccioacuten de ADN
Fragmentar el ADN en porciones maacutes pequentildeas
(Enzimas de restriccioacuten)
Separo los fragmentos realizando una corrida
electroforeacutetica usando como sustrato de
migracioacuten un gel (separacioacuten por tamantildeo)
Pasos Previos a la Hibridacioacuten
Inmovilizacioacuten de los fragmentos en soporte soacutelido
Desnaturalizacioacuten (SIMPLE CADENA)
Transferencia a soporte soacutelido (membrana de nylon nitrocelulosa) Por
capilaridad o por electroforesis pasan del gel a la membrana
Sacado de los bocetos de Edwin Southern
antes de la publicacioacuten de la teacutecnica
Pasos Hibridacioacuten
Se agrega la sonda sobre la membrana y se
incuba
Se lava para quitar el maacuteximo de hibridaciones
inespeciacuteficas
Se revela por autoradiografiacutea
Soacutelo veremos Teacutecnicas Directas
bullSouthern Blot
bullPCR
bullSecuenciacioacuten
PCR Reaccioacuten en cadena
de la polimerasa
Kerry Mullis en 1983 desarrolloacute esta teacutecnica
Amplificacioacuten de un gran nuacutemero de copias a
partir de un fragmento molde de ADN utilizando
una reaccioacuten enzimatica simple de polimerizacion
in vitro
PCR
ADN moldePCR
ADN resultante
Fundamento
REPLICACION DEL ADN
COMPLEMENTARIEDAD DE BASES
Herramientas
POLIMERASA BACTERIANA
Estrategia
Utilizar cambios de temperatura para
desnaturalizar y renaturalizar las hebras de
ADN complementario
PCR
1 Desnaturalizacioacuten 94degC - 96degC
2 Alineacioacuten temperatura variable
3 Extensioacuten 68 - 72degC
PCR la reaccioacuten se divide en 3 pasos
LOS 3 PASOS FORMAN 1 CICLO Y EL CICLO PUEDE
REPETIRSE VARIAS VECES
Necesitamos en este proceso controlar
la temperatura termociclador
Si repetimos el ciclo tendremos cuatro copias
Desnaturalizacioacuten
95degC
Hibridizacioacuten
50-60ordmC
Extensioacuten de la
cadena 75ordmC
Primer Ciclo
2do Ciclo95ordmC
50 - 60ordmC
75ordmC
Muacuteltiples ciclos daraacuten un incremento
exponencial en el nuacutemero de copias
iquestQueacute elementos son necesarios para la
polimerizacioacuten in Vitro
Extraccioacuten del ADN molde
Preparado de la MIX
1 Agua libre de nucleasas
2 1048698 Catioacuten divalente (MgCl2)
3 1048698 Desoxinucleoacutetidos (dNTPacutes)
4 1048698 Sol amortiguadora y sales (Buffer 10X)
5 1048698 Oligonucleoacutetidos (Primers)
6 1048698 Enzima termo-resistente (Ej Taq Polimerasa)
Para la polimerizacioacuten de ADN es necesario
Una polimerasa primers y nucleoacutetidos
Como se utiliza cambios de temperatura para
lograr la desnaturalizacioacuten y renaturalizacioacuten
de las hebras la enzima tiene que ser
resistente a cambios de temperatura
iquestQueacute elementos son necesarios para la
polimerizacioacuten in Vitro
Thermus aquaticus se
descubrioacute en el Parque
Yellowstone inicioacute el campo
de la biologiacutea de los
hipertermoacutefilos
Thermus aquaticus crece
a 70ordm grados (fuente de
la enzima taq polimerasa
usada en la PCR)
PCR
La taq polimerasa no es la uacutenica enzima usada en la
PCR Hay muchas maacutes
Ej PFU (enzima extraiacuteda de Pynococus Furioso)
PCR
TAQ PFU
No tiene actividad 3rsquo
exonucleasa Puede
copiar con errores
Tiene actividad 3rsquo
exonucleasa
Velocidad 2000
nucleoacutetidos min
Velocidad 500
nucleoacutetidos min
Complementariedad durante la hibridacioacuten
en la fase de alineamiento
Se unen zona donde la secuencia es
complementaria
Son disentildeados los primers esto permite
seleccionar que porcioacuten amplificar
PCR Primers
PCR
Ejemplos de utilizacioacuten PCR en diagnoacutestico
1 Colocando primers Fw diferentes (una para
secuencia normal y otra mutada) y mismo Rw
en el mismo tubo
2 Combinando la PCR con cortes con enzimas de
restriccioacuten (si se generase o perdiera algun sitio de
restriccioacuten por la misma mutacioacuten)
concepto Primers alelo especiacuteficos
El siguiente es el resultado en un gel de agarosa
En la calle (1) se sembroacute
el marcador de peso
molecular
En la calle (2) se sembroacute
una muestra conocida
para una mutacioacuten
homocigota
En la calle (3) se sembroacute
la muestra del paciente
El siguiente es el resultado en un gel de agarosa
En la calle (C1) muestra
conocida homocigota
gen mutado
En la calle (C2) muestra
conocida homocigota
gen normal
iquestQueacute resultados
dieron las
muestras 1 2 3 4
iquestQueacute elementos son necesarios para la
polimerizacioacuten in Vitro
Extraccioacuten del ADN molde
Preparado de la MIX
1 Agua libre de nucleasas
2 1048698 Catioacuten divalente (MgCl2)
3 1048698 Desoxinucleoacutetidos (dNTPacutes)
4 1048698 Sol amortiguadora y sales (Buffer 10X)
5 1048698 Oligonucleoacutetidos (Primers)
6 1048698 Enzima termo-resistente (Ej Taq Polimerasa)
Los iones de magnesio
estimulan a la enzima Taq Polimerasa
para que incorpore los dNTPacutes
Algunas aclaracioneshellip
Taq
Mg
Sol amortiguadora PCR
1048698 Mantiene el pH oacuteptimo para que la enzima actuacutee
1048698 Sales
Proporcionan la fuerza ioacutenica adecuada para una maacutexima actividad de la
enzima
Herramientas
POLIMERASA BACTERIANA que resista a los cambios Tordm
Estrategia
Utilizar cambios de temperatura para desnaturalizar y
renaturalizar las hebras de ADN complementario
PCR coacutemo ve el observador el proceso
MIX +
ADN
Soacutelo veremos Teacutecnicas Directas
bullSouthern Blot
bullPCR
bullSecuenciacioacuten
Secuenciacioacuten
Meacutetodo enzimaacutetico 1977
Frederick Sanger desarrolloacute esta teacutecnica
Meacutetodo de los terminadores de cadena o dideoxi
Fundamento
REPLICACION DEL ADN
COMPLEMENTARIEDAD DE BASES
Herramientas
Dideoxinucleotidos
Estrategia
Cuando se agrega un dideoxinucleotido
a la cadena en formacioacuten se
interrumpe la polimerizacioacuten
Secuenciacioacuten
H
P
O
OH
OH
HO
O
O
CH2
NH
N
N
N
Azuacutecar
Base
Fosfato
3rsquo
5rsquo
2rsquo
1rsquo4rsquo
Jeraacuterquico OH
del carbono 3
En la polimerizacioacuten
del ADN
H
P
O
OH
OH
HO
O
O
CH2
NH2
N
N N
N
Azuacutecar
Base
Fosfato
3rsquo
5rsquo
2rsquo
1rsquo4rsquo
H
2rsquo3rsquo-dideoxinucleoacutetido
monofosfato
H
P
O
OH
OH
HO
O
O
CH2
NH2
N
N N
N
Azuacutecar
Base
Fosfato
3rsquo
5rsquo
2rsquo
1rsquo4rsquo
deoxinucleotido
monofosfato
Secuenciacioacuten utiliza deoxinucleotidos
y dideoxinucleotidos
Cuando se incorpora un dideoxinucleoacutetido se
interrumpe la polimerizacioacuten
H
P
O
OH
OH
HO
O
O
CH2
NH2
N
N N
N
Azuacutecar
Base
Fosfato
3rsquo
5rsquo
2rsquo
1rsquo4rsquo
H
2rsquo3rsquo-dideoxinucleoacutetido
monofosfato
Se realizan 4 reacciones de siacutentesis (4 tubos
separados)
Se incluyen pequentildeas cantidades de
dideoxinucleotidos ddNTP que
compiten con los dNTP
En cada tubo se colocan
1 dNTP (4 tipos)
2 un solo tipo de ddNTP por tubo
3 primer o cebador marcado
4 ADN molde a secuenciar
5 Polimerasa
A ddNTP C ddNTP
G ddNTP T ddNTP
Los productos de las 4
reacciones cada una
conteniendo una pequentildea
cantidad de uno de los cuatro
dideoxinucleoacutetidos son
cargadas en el gel y sometidas
a electroforesis
Como la polimerizacioacuten es solo
en direccioacuten 5rsquo a 3rsquo los
fragmentos maacutes cortos estaraacuten
en 5rsquo y los maacutes largos que se
encontraraacuten en la direccioacuten 3rsquo
ddTTPddCTP ddGTPddATP
Lec
tura
5rsquo
a 3rsquo
des
de
la b
asa
al t
ope
Secuenciacioacuten Separacioacuten de fragmentos
Alternativa del meacutetodo Sanger
Se marca cebador con fluorescencia y se activa la reaccioacuten
Los productos se detectan durante electroforelectroforeacutesis al
pasar por un laacuteser que excita los fluorocromos y se detecta
fluorescencia emitida
Se realizan 4 reacciones de secuencia distintas
Se coloca el cebador marcado polimerasa dNTP y ddNTP
Al finalizar las cuatro reacciones se mezclan en uacutenico tubo
SECUENCIACION AUTOMATICA empleando
meacutetodo enzimaacutetico
hellip
Placa caliente
Pol
liacutequido
ATTGC A
Laser
Prisma
Detectores
-
+Ventana
Reaccioacuten
Secuencia
Capilar
iquestCoacutemo se ve el resultado
En el electroferograma se observa dos picos en
la posicioacuten 152 (C T)
A ndash A ndash T ndash G ndash G - T - C - C ndash A ndash N - T - T - G - G - C
A ndash A ndash T ndash G ndash G - T - C - T ndash A ndash N - T - T - G - G - C
Repeticiones en tandem
La variacioacuten en el nuacutemero de repeticiones de los
distintos mini y microsateacutelites es un polimorfismo
muy frecuente
Estos polimorfismos se generan por errores durante la
replicacioacuten
Dado que las repeticiones se encuentran en forma diploide
Cada uno de nosotros posee dos variantes para una repeticioacuten
determinada
VNTR (Nuacutemero variable de repeticiones en tandem) micro sateacutelites hipervariables
Obtencioacuten de DNA a partir de RNA
Rt-PCR Transcriptasareversa
Los fragmentos de restriccioacuten se pueden separar por tamantildeo mediante electroforesis en gel
Diferentes condiciones de hibridacioacuten permite mayor o menor estabilidad y especificidad
Pasos Previos a la Hibridacioacuten
separacioacuten de fragmentos
Extraccioacuten de ADN
Fragmentar el ADN en porciones maacutes pequentildeas
(Enzimas de restriccioacuten)
Separo los fragmentos realizando una corrida
electroforeacutetica usando como sustrato de
migracioacuten un gel (separacioacuten por tamantildeo)
Pasos Previos a la Hibridacioacuten
Inmovilizacioacuten de los fragmentos en soporte soacutelido
Desnaturalizacioacuten (SIMPLE CADENA)
Transferencia a soporte soacutelido (membrana de nylon nitrocelulosa) Por
capilaridad o por electroforesis pasan del gel a la membrana
Sacado de los bocetos de Edwin Southern
antes de la publicacioacuten de la teacutecnica
Pasos Hibridacioacuten
Se agrega la sonda sobre la membrana y se
incuba
Se lava para quitar el maacuteximo de hibridaciones
inespeciacuteficas
Se revela por autoradiografiacutea
Soacutelo veremos Teacutecnicas Directas
bullSouthern Blot
bullPCR
bullSecuenciacioacuten
PCR Reaccioacuten en cadena
de la polimerasa
Kerry Mullis en 1983 desarrolloacute esta teacutecnica
Amplificacioacuten de un gran nuacutemero de copias a
partir de un fragmento molde de ADN utilizando
una reaccioacuten enzimatica simple de polimerizacion
in vitro
PCR
ADN moldePCR
ADN resultante
Fundamento
REPLICACION DEL ADN
COMPLEMENTARIEDAD DE BASES
Herramientas
POLIMERASA BACTERIANA
Estrategia
Utilizar cambios de temperatura para
desnaturalizar y renaturalizar las hebras de
ADN complementario
PCR
1 Desnaturalizacioacuten 94degC - 96degC
2 Alineacioacuten temperatura variable
3 Extensioacuten 68 - 72degC
PCR la reaccioacuten se divide en 3 pasos
LOS 3 PASOS FORMAN 1 CICLO Y EL CICLO PUEDE
REPETIRSE VARIAS VECES
Necesitamos en este proceso controlar
la temperatura termociclador
Si repetimos el ciclo tendremos cuatro copias
Desnaturalizacioacuten
95degC
Hibridizacioacuten
50-60ordmC
Extensioacuten de la
cadena 75ordmC
Primer Ciclo
2do Ciclo95ordmC
50 - 60ordmC
75ordmC
Muacuteltiples ciclos daraacuten un incremento
exponencial en el nuacutemero de copias
iquestQueacute elementos son necesarios para la
polimerizacioacuten in Vitro
Extraccioacuten del ADN molde
Preparado de la MIX
1 Agua libre de nucleasas
2 1048698 Catioacuten divalente (MgCl2)
3 1048698 Desoxinucleoacutetidos (dNTPacutes)
4 1048698 Sol amortiguadora y sales (Buffer 10X)
5 1048698 Oligonucleoacutetidos (Primers)
6 1048698 Enzima termo-resistente (Ej Taq Polimerasa)
Para la polimerizacioacuten de ADN es necesario
Una polimerasa primers y nucleoacutetidos
Como se utiliza cambios de temperatura para
lograr la desnaturalizacioacuten y renaturalizacioacuten
de las hebras la enzima tiene que ser
resistente a cambios de temperatura
iquestQueacute elementos son necesarios para la
polimerizacioacuten in Vitro
Thermus aquaticus se
descubrioacute en el Parque
Yellowstone inicioacute el campo
de la biologiacutea de los
hipertermoacutefilos
Thermus aquaticus crece
a 70ordm grados (fuente de
la enzima taq polimerasa
usada en la PCR)
PCR
La taq polimerasa no es la uacutenica enzima usada en la
PCR Hay muchas maacutes
Ej PFU (enzima extraiacuteda de Pynococus Furioso)
PCR
TAQ PFU
No tiene actividad 3rsquo
exonucleasa Puede
copiar con errores
Tiene actividad 3rsquo
exonucleasa
Velocidad 2000
nucleoacutetidos min
Velocidad 500
nucleoacutetidos min
Complementariedad durante la hibridacioacuten
en la fase de alineamiento
Se unen zona donde la secuencia es
complementaria
Son disentildeados los primers esto permite
seleccionar que porcioacuten amplificar
PCR Primers
PCR
Ejemplos de utilizacioacuten PCR en diagnoacutestico
1 Colocando primers Fw diferentes (una para
secuencia normal y otra mutada) y mismo Rw
en el mismo tubo
2 Combinando la PCR con cortes con enzimas de
restriccioacuten (si se generase o perdiera algun sitio de
restriccioacuten por la misma mutacioacuten)
concepto Primers alelo especiacuteficos
El siguiente es el resultado en un gel de agarosa
En la calle (1) se sembroacute
el marcador de peso
molecular
En la calle (2) se sembroacute
una muestra conocida
para una mutacioacuten
homocigota
En la calle (3) se sembroacute
la muestra del paciente
El siguiente es el resultado en un gel de agarosa
En la calle (C1) muestra
conocida homocigota
gen mutado
En la calle (C2) muestra
conocida homocigota
gen normal
iquestQueacute resultados
dieron las
muestras 1 2 3 4
iquestQueacute elementos son necesarios para la
polimerizacioacuten in Vitro
Extraccioacuten del ADN molde
Preparado de la MIX
1 Agua libre de nucleasas
2 1048698 Catioacuten divalente (MgCl2)
3 1048698 Desoxinucleoacutetidos (dNTPacutes)
4 1048698 Sol amortiguadora y sales (Buffer 10X)
5 1048698 Oligonucleoacutetidos (Primers)
6 1048698 Enzima termo-resistente (Ej Taq Polimerasa)
Los iones de magnesio
estimulan a la enzima Taq Polimerasa
para que incorpore los dNTPacutes
Algunas aclaracioneshellip
Taq
Mg
Sol amortiguadora PCR
1048698 Mantiene el pH oacuteptimo para que la enzima actuacutee
1048698 Sales
Proporcionan la fuerza ioacutenica adecuada para una maacutexima actividad de la
enzima
Herramientas
POLIMERASA BACTERIANA que resista a los cambios Tordm
Estrategia
Utilizar cambios de temperatura para desnaturalizar y
renaturalizar las hebras de ADN complementario
PCR coacutemo ve el observador el proceso
MIX +
ADN
Soacutelo veremos Teacutecnicas Directas
bullSouthern Blot
bullPCR
bullSecuenciacioacuten
Secuenciacioacuten
Meacutetodo enzimaacutetico 1977
Frederick Sanger desarrolloacute esta teacutecnica
Meacutetodo de los terminadores de cadena o dideoxi
Fundamento
REPLICACION DEL ADN
COMPLEMENTARIEDAD DE BASES
Herramientas
Dideoxinucleotidos
Estrategia
Cuando se agrega un dideoxinucleotido
a la cadena en formacioacuten se
interrumpe la polimerizacioacuten
Secuenciacioacuten
H
P
O
OH
OH
HO
O
O
CH2
NH
N
N
N
Azuacutecar
Base
Fosfato
3rsquo
5rsquo
2rsquo
1rsquo4rsquo
Jeraacuterquico OH
del carbono 3
En la polimerizacioacuten
del ADN
H
P
O
OH
OH
HO
O
O
CH2
NH2
N
N N
N
Azuacutecar
Base
Fosfato
3rsquo
5rsquo
2rsquo
1rsquo4rsquo
H
2rsquo3rsquo-dideoxinucleoacutetido
monofosfato
H
P
O
OH
OH
HO
O
O
CH2
NH2
N
N N
N
Azuacutecar
Base
Fosfato
3rsquo
5rsquo
2rsquo
1rsquo4rsquo
deoxinucleotido
monofosfato
Secuenciacioacuten utiliza deoxinucleotidos
y dideoxinucleotidos
Cuando se incorpora un dideoxinucleoacutetido se
interrumpe la polimerizacioacuten
H
P
O
OH
OH
HO
O
O
CH2
NH2
N
N N
N
Azuacutecar
Base
Fosfato
3rsquo
5rsquo
2rsquo
1rsquo4rsquo
H
2rsquo3rsquo-dideoxinucleoacutetido
monofosfato
Se realizan 4 reacciones de siacutentesis (4 tubos
separados)
Se incluyen pequentildeas cantidades de
dideoxinucleotidos ddNTP que
compiten con los dNTP
En cada tubo se colocan
1 dNTP (4 tipos)
2 un solo tipo de ddNTP por tubo
3 primer o cebador marcado
4 ADN molde a secuenciar
5 Polimerasa
A ddNTP C ddNTP
G ddNTP T ddNTP
Los productos de las 4
reacciones cada una
conteniendo una pequentildea
cantidad de uno de los cuatro
dideoxinucleoacutetidos son
cargadas en el gel y sometidas
a electroforesis
Como la polimerizacioacuten es solo
en direccioacuten 5rsquo a 3rsquo los
fragmentos maacutes cortos estaraacuten
en 5rsquo y los maacutes largos que se
encontraraacuten en la direccioacuten 3rsquo
ddTTPddCTP ddGTPddATP
Lec
tura
5rsquo
a 3rsquo
des
de
la b
asa
al t
ope
Secuenciacioacuten Separacioacuten de fragmentos
Alternativa del meacutetodo Sanger
Se marca cebador con fluorescencia y se activa la reaccioacuten
Los productos se detectan durante electroforelectroforeacutesis al
pasar por un laacuteser que excita los fluorocromos y se detecta
fluorescencia emitida
Se realizan 4 reacciones de secuencia distintas
Se coloca el cebador marcado polimerasa dNTP y ddNTP
Al finalizar las cuatro reacciones se mezclan en uacutenico tubo
SECUENCIACION AUTOMATICA empleando
meacutetodo enzimaacutetico
hellip
Placa caliente
Pol
liacutequido
ATTGC A
Laser
Prisma
Detectores
-
+Ventana
Reaccioacuten
Secuencia
Capilar
iquestCoacutemo se ve el resultado
En el electroferograma se observa dos picos en
la posicioacuten 152 (C T)
A ndash A ndash T ndash G ndash G - T - C - C ndash A ndash N - T - T - G - G - C
A ndash A ndash T ndash G ndash G - T - C - T ndash A ndash N - T - T - G - G - C
Repeticiones en tandem
La variacioacuten en el nuacutemero de repeticiones de los
distintos mini y microsateacutelites es un polimorfismo
muy frecuente
Estos polimorfismos se generan por errores durante la
replicacioacuten
Dado que las repeticiones se encuentran en forma diploide
Cada uno de nosotros posee dos variantes para una repeticioacuten
determinada
VNTR (Nuacutemero variable de repeticiones en tandem) micro sateacutelites hipervariables
Obtencioacuten de DNA a partir de RNA
Rt-PCR Transcriptasareversa
Diferentes condiciones de hibridacioacuten permite mayor o menor estabilidad y especificidad
Pasos Previos a la Hibridacioacuten
separacioacuten de fragmentos
Extraccioacuten de ADN
Fragmentar el ADN en porciones maacutes pequentildeas
(Enzimas de restriccioacuten)
Separo los fragmentos realizando una corrida
electroforeacutetica usando como sustrato de
migracioacuten un gel (separacioacuten por tamantildeo)
Pasos Previos a la Hibridacioacuten
Inmovilizacioacuten de los fragmentos en soporte soacutelido
Desnaturalizacioacuten (SIMPLE CADENA)
Transferencia a soporte soacutelido (membrana de nylon nitrocelulosa) Por
capilaridad o por electroforesis pasan del gel a la membrana
Sacado de los bocetos de Edwin Southern
antes de la publicacioacuten de la teacutecnica
Pasos Hibridacioacuten
Se agrega la sonda sobre la membrana y se
incuba
Se lava para quitar el maacuteximo de hibridaciones
inespeciacuteficas
Se revela por autoradiografiacutea
Soacutelo veremos Teacutecnicas Directas
bullSouthern Blot
bullPCR
bullSecuenciacioacuten
PCR Reaccioacuten en cadena
de la polimerasa
Kerry Mullis en 1983 desarrolloacute esta teacutecnica
Amplificacioacuten de un gran nuacutemero de copias a
partir de un fragmento molde de ADN utilizando
una reaccioacuten enzimatica simple de polimerizacion
in vitro
PCR
ADN moldePCR
ADN resultante
Fundamento
REPLICACION DEL ADN
COMPLEMENTARIEDAD DE BASES
Herramientas
POLIMERASA BACTERIANA
Estrategia
Utilizar cambios de temperatura para
desnaturalizar y renaturalizar las hebras de
ADN complementario
PCR
1 Desnaturalizacioacuten 94degC - 96degC
2 Alineacioacuten temperatura variable
3 Extensioacuten 68 - 72degC
PCR la reaccioacuten se divide en 3 pasos
LOS 3 PASOS FORMAN 1 CICLO Y EL CICLO PUEDE
REPETIRSE VARIAS VECES
Necesitamos en este proceso controlar
la temperatura termociclador
Si repetimos el ciclo tendremos cuatro copias
Desnaturalizacioacuten
95degC
Hibridizacioacuten
50-60ordmC
Extensioacuten de la
cadena 75ordmC
Primer Ciclo
2do Ciclo95ordmC
50 - 60ordmC
75ordmC
Muacuteltiples ciclos daraacuten un incremento
exponencial en el nuacutemero de copias
iquestQueacute elementos son necesarios para la
polimerizacioacuten in Vitro
Extraccioacuten del ADN molde
Preparado de la MIX
1 Agua libre de nucleasas
2 1048698 Catioacuten divalente (MgCl2)
3 1048698 Desoxinucleoacutetidos (dNTPacutes)
4 1048698 Sol amortiguadora y sales (Buffer 10X)
5 1048698 Oligonucleoacutetidos (Primers)
6 1048698 Enzima termo-resistente (Ej Taq Polimerasa)
Para la polimerizacioacuten de ADN es necesario
Una polimerasa primers y nucleoacutetidos
Como se utiliza cambios de temperatura para
lograr la desnaturalizacioacuten y renaturalizacioacuten
de las hebras la enzima tiene que ser
resistente a cambios de temperatura
iquestQueacute elementos son necesarios para la
polimerizacioacuten in Vitro
Thermus aquaticus se
descubrioacute en el Parque
Yellowstone inicioacute el campo
de la biologiacutea de los
hipertermoacutefilos
Thermus aquaticus crece
a 70ordm grados (fuente de
la enzima taq polimerasa
usada en la PCR)
PCR
La taq polimerasa no es la uacutenica enzima usada en la
PCR Hay muchas maacutes
Ej PFU (enzima extraiacuteda de Pynococus Furioso)
PCR
TAQ PFU
No tiene actividad 3rsquo
exonucleasa Puede
copiar con errores
Tiene actividad 3rsquo
exonucleasa
Velocidad 2000
nucleoacutetidos min
Velocidad 500
nucleoacutetidos min
Complementariedad durante la hibridacioacuten
en la fase de alineamiento
Se unen zona donde la secuencia es
complementaria
Son disentildeados los primers esto permite
seleccionar que porcioacuten amplificar
PCR Primers
PCR
Ejemplos de utilizacioacuten PCR en diagnoacutestico
1 Colocando primers Fw diferentes (una para
secuencia normal y otra mutada) y mismo Rw
en el mismo tubo
2 Combinando la PCR con cortes con enzimas de
restriccioacuten (si se generase o perdiera algun sitio de
restriccioacuten por la misma mutacioacuten)
concepto Primers alelo especiacuteficos
El siguiente es el resultado en un gel de agarosa
En la calle (1) se sembroacute
el marcador de peso
molecular
En la calle (2) se sembroacute
una muestra conocida
para una mutacioacuten
homocigota
En la calle (3) se sembroacute
la muestra del paciente
El siguiente es el resultado en un gel de agarosa
En la calle (C1) muestra
conocida homocigota
gen mutado
En la calle (C2) muestra
conocida homocigota
gen normal
iquestQueacute resultados
dieron las
muestras 1 2 3 4
iquestQueacute elementos son necesarios para la
polimerizacioacuten in Vitro
Extraccioacuten del ADN molde
Preparado de la MIX
1 Agua libre de nucleasas
2 1048698 Catioacuten divalente (MgCl2)
3 1048698 Desoxinucleoacutetidos (dNTPacutes)
4 1048698 Sol amortiguadora y sales (Buffer 10X)
5 1048698 Oligonucleoacutetidos (Primers)
6 1048698 Enzima termo-resistente (Ej Taq Polimerasa)
Los iones de magnesio
estimulan a la enzima Taq Polimerasa
para que incorpore los dNTPacutes
Algunas aclaracioneshellip
Taq
Mg
Sol amortiguadora PCR
1048698 Mantiene el pH oacuteptimo para que la enzima actuacutee
1048698 Sales
Proporcionan la fuerza ioacutenica adecuada para una maacutexima actividad de la
enzima
Herramientas
POLIMERASA BACTERIANA que resista a los cambios Tordm
Estrategia
Utilizar cambios de temperatura para desnaturalizar y
renaturalizar las hebras de ADN complementario
PCR coacutemo ve el observador el proceso
MIX +
ADN
Soacutelo veremos Teacutecnicas Directas
bullSouthern Blot
bullPCR
bullSecuenciacioacuten
Secuenciacioacuten
Meacutetodo enzimaacutetico 1977
Frederick Sanger desarrolloacute esta teacutecnica
Meacutetodo de los terminadores de cadena o dideoxi
Fundamento
REPLICACION DEL ADN
COMPLEMENTARIEDAD DE BASES
Herramientas
Dideoxinucleotidos
Estrategia
Cuando se agrega un dideoxinucleotido
a la cadena en formacioacuten se
interrumpe la polimerizacioacuten
Secuenciacioacuten
H
P
O
OH
OH
HO
O
O
CH2
NH
N
N
N
Azuacutecar
Base
Fosfato
3rsquo
5rsquo
2rsquo
1rsquo4rsquo
Jeraacuterquico OH
del carbono 3
En la polimerizacioacuten
del ADN
H
P
O
OH
OH
HO
O
O
CH2
NH2
N
N N
N
Azuacutecar
Base
Fosfato
3rsquo
5rsquo
2rsquo
1rsquo4rsquo
H
2rsquo3rsquo-dideoxinucleoacutetido
monofosfato
H
P
O
OH
OH
HO
O
O
CH2
NH2
N
N N
N
Azuacutecar
Base
Fosfato
3rsquo
5rsquo
2rsquo
1rsquo4rsquo
deoxinucleotido
monofosfato
Secuenciacioacuten utiliza deoxinucleotidos
y dideoxinucleotidos
Cuando se incorpora un dideoxinucleoacutetido se
interrumpe la polimerizacioacuten
H
P
O
OH
OH
HO
O
O
CH2
NH2
N
N N
N
Azuacutecar
Base
Fosfato
3rsquo
5rsquo
2rsquo
1rsquo4rsquo
H
2rsquo3rsquo-dideoxinucleoacutetido
monofosfato
Se realizan 4 reacciones de siacutentesis (4 tubos
separados)
Se incluyen pequentildeas cantidades de
dideoxinucleotidos ddNTP que
compiten con los dNTP
En cada tubo se colocan
1 dNTP (4 tipos)
2 un solo tipo de ddNTP por tubo
3 primer o cebador marcado
4 ADN molde a secuenciar
5 Polimerasa
A ddNTP C ddNTP
G ddNTP T ddNTP
Los productos de las 4
reacciones cada una
conteniendo una pequentildea
cantidad de uno de los cuatro
dideoxinucleoacutetidos son
cargadas en el gel y sometidas
a electroforesis
Como la polimerizacioacuten es solo
en direccioacuten 5rsquo a 3rsquo los
fragmentos maacutes cortos estaraacuten
en 5rsquo y los maacutes largos que se
encontraraacuten en la direccioacuten 3rsquo
ddTTPddCTP ddGTPddATP
Lec
tura
5rsquo
a 3rsquo
des
de
la b
asa
al t
ope
Secuenciacioacuten Separacioacuten de fragmentos
Alternativa del meacutetodo Sanger
Se marca cebador con fluorescencia y se activa la reaccioacuten
Los productos se detectan durante electroforelectroforeacutesis al
pasar por un laacuteser que excita los fluorocromos y se detecta
fluorescencia emitida
Se realizan 4 reacciones de secuencia distintas
Se coloca el cebador marcado polimerasa dNTP y ddNTP
Al finalizar las cuatro reacciones se mezclan en uacutenico tubo
SECUENCIACION AUTOMATICA empleando
meacutetodo enzimaacutetico
hellip
Placa caliente
Pol
liacutequido
ATTGC A
Laser
Prisma
Detectores
-
+Ventana
Reaccioacuten
Secuencia
Capilar
iquestCoacutemo se ve el resultado
En el electroferograma se observa dos picos en
la posicioacuten 152 (C T)
A ndash A ndash T ndash G ndash G - T - C - C ndash A ndash N - T - T - G - G - C
A ndash A ndash T ndash G ndash G - T - C - T ndash A ndash N - T - T - G - G - C
Repeticiones en tandem
La variacioacuten en el nuacutemero de repeticiones de los
distintos mini y microsateacutelites es un polimorfismo
muy frecuente
Estos polimorfismos se generan por errores durante la
replicacioacuten
Dado que las repeticiones se encuentran en forma diploide
Cada uno de nosotros posee dos variantes para una repeticioacuten
determinada
VNTR (Nuacutemero variable de repeticiones en tandem) micro sateacutelites hipervariables
Obtencioacuten de DNA a partir de RNA
Rt-PCR Transcriptasareversa
Pasos Previos a la Hibridacioacuten
separacioacuten de fragmentos
Extraccioacuten de ADN
Fragmentar el ADN en porciones maacutes pequentildeas
(Enzimas de restriccioacuten)
Separo los fragmentos realizando una corrida
electroforeacutetica usando como sustrato de
migracioacuten un gel (separacioacuten por tamantildeo)
Pasos Previos a la Hibridacioacuten
Inmovilizacioacuten de los fragmentos en soporte soacutelido
Desnaturalizacioacuten (SIMPLE CADENA)
Transferencia a soporte soacutelido (membrana de nylon nitrocelulosa) Por
capilaridad o por electroforesis pasan del gel a la membrana
Sacado de los bocetos de Edwin Southern
antes de la publicacioacuten de la teacutecnica
Pasos Hibridacioacuten
Se agrega la sonda sobre la membrana y se
incuba
Se lava para quitar el maacuteximo de hibridaciones
inespeciacuteficas
Se revela por autoradiografiacutea
Soacutelo veremos Teacutecnicas Directas
bullSouthern Blot
bullPCR
bullSecuenciacioacuten
PCR Reaccioacuten en cadena
de la polimerasa
Kerry Mullis en 1983 desarrolloacute esta teacutecnica
Amplificacioacuten de un gran nuacutemero de copias a
partir de un fragmento molde de ADN utilizando
una reaccioacuten enzimatica simple de polimerizacion
in vitro
PCR
ADN moldePCR
ADN resultante
Fundamento
REPLICACION DEL ADN
COMPLEMENTARIEDAD DE BASES
Herramientas
POLIMERASA BACTERIANA
Estrategia
Utilizar cambios de temperatura para
desnaturalizar y renaturalizar las hebras de
ADN complementario
PCR
1 Desnaturalizacioacuten 94degC - 96degC
2 Alineacioacuten temperatura variable
3 Extensioacuten 68 - 72degC
PCR la reaccioacuten se divide en 3 pasos
LOS 3 PASOS FORMAN 1 CICLO Y EL CICLO PUEDE
REPETIRSE VARIAS VECES
Necesitamos en este proceso controlar
la temperatura termociclador
Si repetimos el ciclo tendremos cuatro copias
Desnaturalizacioacuten
95degC
Hibridizacioacuten
50-60ordmC
Extensioacuten de la
cadena 75ordmC
Primer Ciclo
2do Ciclo95ordmC
50 - 60ordmC
75ordmC
Muacuteltiples ciclos daraacuten un incremento
exponencial en el nuacutemero de copias
iquestQueacute elementos son necesarios para la
polimerizacioacuten in Vitro
Extraccioacuten del ADN molde
Preparado de la MIX
1 Agua libre de nucleasas
2 1048698 Catioacuten divalente (MgCl2)
3 1048698 Desoxinucleoacutetidos (dNTPacutes)
4 1048698 Sol amortiguadora y sales (Buffer 10X)
5 1048698 Oligonucleoacutetidos (Primers)
6 1048698 Enzima termo-resistente (Ej Taq Polimerasa)
Para la polimerizacioacuten de ADN es necesario
Una polimerasa primers y nucleoacutetidos
Como se utiliza cambios de temperatura para
lograr la desnaturalizacioacuten y renaturalizacioacuten
de las hebras la enzima tiene que ser
resistente a cambios de temperatura
iquestQueacute elementos son necesarios para la
polimerizacioacuten in Vitro
Thermus aquaticus se
descubrioacute en el Parque
Yellowstone inicioacute el campo
de la biologiacutea de los
hipertermoacutefilos
Thermus aquaticus crece
a 70ordm grados (fuente de
la enzima taq polimerasa
usada en la PCR)
PCR
La taq polimerasa no es la uacutenica enzima usada en la
PCR Hay muchas maacutes
Ej PFU (enzima extraiacuteda de Pynococus Furioso)
PCR
TAQ PFU
No tiene actividad 3rsquo
exonucleasa Puede
copiar con errores
Tiene actividad 3rsquo
exonucleasa
Velocidad 2000
nucleoacutetidos min
Velocidad 500
nucleoacutetidos min
Complementariedad durante la hibridacioacuten
en la fase de alineamiento
Se unen zona donde la secuencia es
complementaria
Son disentildeados los primers esto permite
seleccionar que porcioacuten amplificar
PCR Primers
PCR
Ejemplos de utilizacioacuten PCR en diagnoacutestico
1 Colocando primers Fw diferentes (una para
secuencia normal y otra mutada) y mismo Rw
en el mismo tubo
2 Combinando la PCR con cortes con enzimas de
restriccioacuten (si se generase o perdiera algun sitio de
restriccioacuten por la misma mutacioacuten)
concepto Primers alelo especiacuteficos
El siguiente es el resultado en un gel de agarosa
En la calle (1) se sembroacute
el marcador de peso
molecular
En la calle (2) se sembroacute
una muestra conocida
para una mutacioacuten
homocigota
En la calle (3) se sembroacute
la muestra del paciente
El siguiente es el resultado en un gel de agarosa
En la calle (C1) muestra
conocida homocigota
gen mutado
En la calle (C2) muestra
conocida homocigota
gen normal
iquestQueacute resultados
dieron las
muestras 1 2 3 4
iquestQueacute elementos son necesarios para la
polimerizacioacuten in Vitro
Extraccioacuten del ADN molde
Preparado de la MIX
1 Agua libre de nucleasas
2 1048698 Catioacuten divalente (MgCl2)
3 1048698 Desoxinucleoacutetidos (dNTPacutes)
4 1048698 Sol amortiguadora y sales (Buffer 10X)
5 1048698 Oligonucleoacutetidos (Primers)
6 1048698 Enzima termo-resistente (Ej Taq Polimerasa)
Los iones de magnesio
estimulan a la enzima Taq Polimerasa
para que incorpore los dNTPacutes
Algunas aclaracioneshellip
Taq
Mg
Sol amortiguadora PCR
1048698 Mantiene el pH oacuteptimo para que la enzima actuacutee
1048698 Sales
Proporcionan la fuerza ioacutenica adecuada para una maacutexima actividad de la
enzima
Herramientas
POLIMERASA BACTERIANA que resista a los cambios Tordm
Estrategia
Utilizar cambios de temperatura para desnaturalizar y
renaturalizar las hebras de ADN complementario
PCR coacutemo ve el observador el proceso
MIX +
ADN
Soacutelo veremos Teacutecnicas Directas
bullSouthern Blot
bullPCR
bullSecuenciacioacuten
Secuenciacioacuten
Meacutetodo enzimaacutetico 1977
Frederick Sanger desarrolloacute esta teacutecnica
Meacutetodo de los terminadores de cadena o dideoxi
Fundamento
REPLICACION DEL ADN
COMPLEMENTARIEDAD DE BASES
Herramientas
Dideoxinucleotidos
Estrategia
Cuando se agrega un dideoxinucleotido
a la cadena en formacioacuten se
interrumpe la polimerizacioacuten
Secuenciacioacuten
H
P
O
OH
OH
HO
O
O
CH2
NH
N
N
N
Azuacutecar
Base
Fosfato
3rsquo
5rsquo
2rsquo
1rsquo4rsquo
Jeraacuterquico OH
del carbono 3
En la polimerizacioacuten
del ADN
H
P
O
OH
OH
HO
O
O
CH2
NH2
N
N N
N
Azuacutecar
Base
Fosfato
3rsquo
5rsquo
2rsquo
1rsquo4rsquo
H
2rsquo3rsquo-dideoxinucleoacutetido
monofosfato
H
P
O
OH
OH
HO
O
O
CH2
NH2
N
N N
N
Azuacutecar
Base
Fosfato
3rsquo
5rsquo
2rsquo
1rsquo4rsquo
deoxinucleotido
monofosfato
Secuenciacioacuten utiliza deoxinucleotidos
y dideoxinucleotidos
Cuando se incorpora un dideoxinucleoacutetido se
interrumpe la polimerizacioacuten
H
P
O
OH
OH
HO
O
O
CH2
NH2
N
N N
N
Azuacutecar
Base
Fosfato
3rsquo
5rsquo
2rsquo
1rsquo4rsquo
H
2rsquo3rsquo-dideoxinucleoacutetido
monofosfato
Se realizan 4 reacciones de siacutentesis (4 tubos
separados)
Se incluyen pequentildeas cantidades de
dideoxinucleotidos ddNTP que
compiten con los dNTP
En cada tubo se colocan
1 dNTP (4 tipos)
2 un solo tipo de ddNTP por tubo
3 primer o cebador marcado
4 ADN molde a secuenciar
5 Polimerasa
A ddNTP C ddNTP
G ddNTP T ddNTP
Los productos de las 4
reacciones cada una
conteniendo una pequentildea
cantidad de uno de los cuatro
dideoxinucleoacutetidos son
cargadas en el gel y sometidas
a electroforesis
Como la polimerizacioacuten es solo
en direccioacuten 5rsquo a 3rsquo los
fragmentos maacutes cortos estaraacuten
en 5rsquo y los maacutes largos que se
encontraraacuten en la direccioacuten 3rsquo
ddTTPddCTP ddGTPddATP
Lec
tura
5rsquo
a 3rsquo
des
de
la b
asa
al t
ope
Secuenciacioacuten Separacioacuten de fragmentos
Alternativa del meacutetodo Sanger
Se marca cebador con fluorescencia y se activa la reaccioacuten
Los productos se detectan durante electroforelectroforeacutesis al
pasar por un laacuteser que excita los fluorocromos y se detecta
fluorescencia emitida
Se realizan 4 reacciones de secuencia distintas
Se coloca el cebador marcado polimerasa dNTP y ddNTP
Al finalizar las cuatro reacciones se mezclan en uacutenico tubo
SECUENCIACION AUTOMATICA empleando
meacutetodo enzimaacutetico
hellip
Placa caliente
Pol
liacutequido
ATTGC A
Laser
Prisma
Detectores
-
+Ventana
Reaccioacuten
Secuencia
Capilar
iquestCoacutemo se ve el resultado
En el electroferograma se observa dos picos en
la posicioacuten 152 (C T)
A ndash A ndash T ndash G ndash G - T - C - C ndash A ndash N - T - T - G - G - C
A ndash A ndash T ndash G ndash G - T - C - T ndash A ndash N - T - T - G - G - C
Repeticiones en tandem
La variacioacuten en el nuacutemero de repeticiones de los
distintos mini y microsateacutelites es un polimorfismo
muy frecuente
Estos polimorfismos se generan por errores durante la
replicacioacuten
Dado que las repeticiones se encuentran en forma diploide
Cada uno de nosotros posee dos variantes para una repeticioacuten
determinada
VNTR (Nuacutemero variable de repeticiones en tandem) micro sateacutelites hipervariables
Obtencioacuten de DNA a partir de RNA
Rt-PCR Transcriptasareversa
Pasos Previos a la Hibridacioacuten
Inmovilizacioacuten de los fragmentos en soporte soacutelido
Desnaturalizacioacuten (SIMPLE CADENA)
Transferencia a soporte soacutelido (membrana de nylon nitrocelulosa) Por
capilaridad o por electroforesis pasan del gel a la membrana
Sacado de los bocetos de Edwin Southern
antes de la publicacioacuten de la teacutecnica
Pasos Hibridacioacuten
Se agrega la sonda sobre la membrana y se
incuba
Se lava para quitar el maacuteximo de hibridaciones
inespeciacuteficas
Se revela por autoradiografiacutea
Soacutelo veremos Teacutecnicas Directas
bullSouthern Blot
bullPCR
bullSecuenciacioacuten
PCR Reaccioacuten en cadena
de la polimerasa
Kerry Mullis en 1983 desarrolloacute esta teacutecnica
Amplificacioacuten de un gran nuacutemero de copias a
partir de un fragmento molde de ADN utilizando
una reaccioacuten enzimatica simple de polimerizacion
in vitro
PCR
ADN moldePCR
ADN resultante
Fundamento
REPLICACION DEL ADN
COMPLEMENTARIEDAD DE BASES
Herramientas
POLIMERASA BACTERIANA
Estrategia
Utilizar cambios de temperatura para
desnaturalizar y renaturalizar las hebras de
ADN complementario
PCR
1 Desnaturalizacioacuten 94degC - 96degC
2 Alineacioacuten temperatura variable
3 Extensioacuten 68 - 72degC
PCR la reaccioacuten se divide en 3 pasos
LOS 3 PASOS FORMAN 1 CICLO Y EL CICLO PUEDE
REPETIRSE VARIAS VECES
Necesitamos en este proceso controlar
la temperatura termociclador
Si repetimos el ciclo tendremos cuatro copias
Desnaturalizacioacuten
95degC
Hibridizacioacuten
50-60ordmC
Extensioacuten de la
cadena 75ordmC
Primer Ciclo
2do Ciclo95ordmC
50 - 60ordmC
75ordmC
Muacuteltiples ciclos daraacuten un incremento
exponencial en el nuacutemero de copias
iquestQueacute elementos son necesarios para la
polimerizacioacuten in Vitro
Extraccioacuten del ADN molde
Preparado de la MIX
1 Agua libre de nucleasas
2 1048698 Catioacuten divalente (MgCl2)
3 1048698 Desoxinucleoacutetidos (dNTPacutes)
4 1048698 Sol amortiguadora y sales (Buffer 10X)
5 1048698 Oligonucleoacutetidos (Primers)
6 1048698 Enzima termo-resistente (Ej Taq Polimerasa)
Para la polimerizacioacuten de ADN es necesario
Una polimerasa primers y nucleoacutetidos
Como se utiliza cambios de temperatura para
lograr la desnaturalizacioacuten y renaturalizacioacuten
de las hebras la enzima tiene que ser
resistente a cambios de temperatura
iquestQueacute elementos son necesarios para la
polimerizacioacuten in Vitro
Thermus aquaticus se
descubrioacute en el Parque
Yellowstone inicioacute el campo
de la biologiacutea de los
hipertermoacutefilos
Thermus aquaticus crece
a 70ordm grados (fuente de
la enzima taq polimerasa
usada en la PCR)
PCR
La taq polimerasa no es la uacutenica enzima usada en la
PCR Hay muchas maacutes
Ej PFU (enzima extraiacuteda de Pynococus Furioso)
PCR
TAQ PFU
No tiene actividad 3rsquo
exonucleasa Puede
copiar con errores
Tiene actividad 3rsquo
exonucleasa
Velocidad 2000
nucleoacutetidos min
Velocidad 500
nucleoacutetidos min
Complementariedad durante la hibridacioacuten
en la fase de alineamiento
Se unen zona donde la secuencia es
complementaria
Son disentildeados los primers esto permite
seleccionar que porcioacuten amplificar
PCR Primers
PCR
Ejemplos de utilizacioacuten PCR en diagnoacutestico
1 Colocando primers Fw diferentes (una para
secuencia normal y otra mutada) y mismo Rw
en el mismo tubo
2 Combinando la PCR con cortes con enzimas de
restriccioacuten (si se generase o perdiera algun sitio de
restriccioacuten por la misma mutacioacuten)
concepto Primers alelo especiacuteficos
El siguiente es el resultado en un gel de agarosa
En la calle (1) se sembroacute
el marcador de peso
molecular
En la calle (2) se sembroacute
una muestra conocida
para una mutacioacuten
homocigota
En la calle (3) se sembroacute
la muestra del paciente
El siguiente es el resultado en un gel de agarosa
En la calle (C1) muestra
conocida homocigota
gen mutado
En la calle (C2) muestra
conocida homocigota
gen normal
iquestQueacute resultados
dieron las
muestras 1 2 3 4
iquestQueacute elementos son necesarios para la
polimerizacioacuten in Vitro
Extraccioacuten del ADN molde
Preparado de la MIX
1 Agua libre de nucleasas
2 1048698 Catioacuten divalente (MgCl2)
3 1048698 Desoxinucleoacutetidos (dNTPacutes)
4 1048698 Sol amortiguadora y sales (Buffer 10X)
5 1048698 Oligonucleoacutetidos (Primers)
6 1048698 Enzima termo-resistente (Ej Taq Polimerasa)
Los iones de magnesio
estimulan a la enzima Taq Polimerasa
para que incorpore los dNTPacutes
Algunas aclaracioneshellip
Taq
Mg
Sol amortiguadora PCR
1048698 Mantiene el pH oacuteptimo para que la enzima actuacutee
1048698 Sales
Proporcionan la fuerza ioacutenica adecuada para una maacutexima actividad de la
enzima
Herramientas
POLIMERASA BACTERIANA que resista a los cambios Tordm
Estrategia
Utilizar cambios de temperatura para desnaturalizar y
renaturalizar las hebras de ADN complementario
PCR coacutemo ve el observador el proceso
MIX +
ADN
Soacutelo veremos Teacutecnicas Directas
bullSouthern Blot
bullPCR
bullSecuenciacioacuten
Secuenciacioacuten
Meacutetodo enzimaacutetico 1977
Frederick Sanger desarrolloacute esta teacutecnica
Meacutetodo de los terminadores de cadena o dideoxi
Fundamento
REPLICACION DEL ADN
COMPLEMENTARIEDAD DE BASES
Herramientas
Dideoxinucleotidos
Estrategia
Cuando se agrega un dideoxinucleotido
a la cadena en formacioacuten se
interrumpe la polimerizacioacuten
Secuenciacioacuten
H
P
O
OH
OH
HO
O
O
CH2
NH
N
N
N
Azuacutecar
Base
Fosfato
3rsquo
5rsquo
2rsquo
1rsquo4rsquo
Jeraacuterquico OH
del carbono 3
En la polimerizacioacuten
del ADN
H
P
O
OH
OH
HO
O
O
CH2
NH2
N
N N
N
Azuacutecar
Base
Fosfato
3rsquo
5rsquo
2rsquo
1rsquo4rsquo
H
2rsquo3rsquo-dideoxinucleoacutetido
monofosfato
H
P
O
OH
OH
HO
O
O
CH2
NH2
N
N N
N
Azuacutecar
Base
Fosfato
3rsquo
5rsquo
2rsquo
1rsquo4rsquo
deoxinucleotido
monofosfato
Secuenciacioacuten utiliza deoxinucleotidos
y dideoxinucleotidos
Cuando se incorpora un dideoxinucleoacutetido se
interrumpe la polimerizacioacuten
H
P
O
OH
OH
HO
O
O
CH2
NH2
N
N N
N
Azuacutecar
Base
Fosfato
3rsquo
5rsquo
2rsquo
1rsquo4rsquo
H
2rsquo3rsquo-dideoxinucleoacutetido
monofosfato
Se realizan 4 reacciones de siacutentesis (4 tubos
separados)
Se incluyen pequentildeas cantidades de
dideoxinucleotidos ddNTP que
compiten con los dNTP
En cada tubo se colocan
1 dNTP (4 tipos)
2 un solo tipo de ddNTP por tubo
3 primer o cebador marcado
4 ADN molde a secuenciar
5 Polimerasa
A ddNTP C ddNTP
G ddNTP T ddNTP
Los productos de las 4
reacciones cada una
conteniendo una pequentildea
cantidad de uno de los cuatro
dideoxinucleoacutetidos son
cargadas en el gel y sometidas
a electroforesis
Como la polimerizacioacuten es solo
en direccioacuten 5rsquo a 3rsquo los
fragmentos maacutes cortos estaraacuten
en 5rsquo y los maacutes largos que se
encontraraacuten en la direccioacuten 3rsquo
ddTTPddCTP ddGTPddATP
Lec
tura
5rsquo
a 3rsquo
des
de
la b
asa
al t
ope
Secuenciacioacuten Separacioacuten de fragmentos
Alternativa del meacutetodo Sanger
Se marca cebador con fluorescencia y se activa la reaccioacuten
Los productos se detectan durante electroforelectroforeacutesis al
pasar por un laacuteser que excita los fluorocromos y se detecta
fluorescencia emitida
Se realizan 4 reacciones de secuencia distintas
Se coloca el cebador marcado polimerasa dNTP y ddNTP
Al finalizar las cuatro reacciones se mezclan en uacutenico tubo
SECUENCIACION AUTOMATICA empleando
meacutetodo enzimaacutetico
hellip
Placa caliente
Pol
liacutequido
ATTGC A
Laser
Prisma
Detectores
-
+Ventana
Reaccioacuten
Secuencia
Capilar
iquestCoacutemo se ve el resultado
En el electroferograma se observa dos picos en
la posicioacuten 152 (C T)
A ndash A ndash T ndash G ndash G - T - C - C ndash A ndash N - T - T - G - G - C
A ndash A ndash T ndash G ndash G - T - C - T ndash A ndash N - T - T - G - G - C
Repeticiones en tandem
La variacioacuten en el nuacutemero de repeticiones de los
distintos mini y microsateacutelites es un polimorfismo
muy frecuente
Estos polimorfismos se generan por errores durante la
replicacioacuten
Dado que las repeticiones se encuentran en forma diploide
Cada uno de nosotros posee dos variantes para una repeticioacuten
determinada
VNTR (Nuacutemero variable de repeticiones en tandem) micro sateacutelites hipervariables
Obtencioacuten de DNA a partir de RNA
Rt-PCR Transcriptasareversa
Sacado de los bocetos de Edwin Southern
antes de la publicacioacuten de la teacutecnica
Pasos Hibridacioacuten
Se agrega la sonda sobre la membrana y se
incuba
Se lava para quitar el maacuteximo de hibridaciones
inespeciacuteficas
Se revela por autoradiografiacutea
Soacutelo veremos Teacutecnicas Directas
bullSouthern Blot
bullPCR
bullSecuenciacioacuten
PCR Reaccioacuten en cadena
de la polimerasa
Kerry Mullis en 1983 desarrolloacute esta teacutecnica
Amplificacioacuten de un gran nuacutemero de copias a
partir de un fragmento molde de ADN utilizando
una reaccioacuten enzimatica simple de polimerizacion
in vitro
PCR
ADN moldePCR
ADN resultante
Fundamento
REPLICACION DEL ADN
COMPLEMENTARIEDAD DE BASES
Herramientas
POLIMERASA BACTERIANA
Estrategia
Utilizar cambios de temperatura para
desnaturalizar y renaturalizar las hebras de
ADN complementario
PCR
1 Desnaturalizacioacuten 94degC - 96degC
2 Alineacioacuten temperatura variable
3 Extensioacuten 68 - 72degC
PCR la reaccioacuten se divide en 3 pasos
LOS 3 PASOS FORMAN 1 CICLO Y EL CICLO PUEDE
REPETIRSE VARIAS VECES
Necesitamos en este proceso controlar
la temperatura termociclador
Si repetimos el ciclo tendremos cuatro copias
Desnaturalizacioacuten
95degC
Hibridizacioacuten
50-60ordmC
Extensioacuten de la
cadena 75ordmC
Primer Ciclo
2do Ciclo95ordmC
50 - 60ordmC
75ordmC
Muacuteltiples ciclos daraacuten un incremento
exponencial en el nuacutemero de copias
iquestQueacute elementos son necesarios para la
polimerizacioacuten in Vitro
Extraccioacuten del ADN molde
Preparado de la MIX
1 Agua libre de nucleasas
2 1048698 Catioacuten divalente (MgCl2)
3 1048698 Desoxinucleoacutetidos (dNTPacutes)
4 1048698 Sol amortiguadora y sales (Buffer 10X)
5 1048698 Oligonucleoacutetidos (Primers)
6 1048698 Enzima termo-resistente (Ej Taq Polimerasa)
Para la polimerizacioacuten de ADN es necesario
Una polimerasa primers y nucleoacutetidos
Como se utiliza cambios de temperatura para
lograr la desnaturalizacioacuten y renaturalizacioacuten
de las hebras la enzima tiene que ser
resistente a cambios de temperatura
iquestQueacute elementos son necesarios para la
polimerizacioacuten in Vitro
Thermus aquaticus se
descubrioacute en el Parque
Yellowstone inicioacute el campo
de la biologiacutea de los
hipertermoacutefilos
Thermus aquaticus crece
a 70ordm grados (fuente de
la enzima taq polimerasa
usada en la PCR)
PCR
La taq polimerasa no es la uacutenica enzima usada en la
PCR Hay muchas maacutes
Ej PFU (enzima extraiacuteda de Pynococus Furioso)
PCR
TAQ PFU
No tiene actividad 3rsquo
exonucleasa Puede
copiar con errores
Tiene actividad 3rsquo
exonucleasa
Velocidad 2000
nucleoacutetidos min
Velocidad 500
nucleoacutetidos min
Complementariedad durante la hibridacioacuten
en la fase de alineamiento
Se unen zona donde la secuencia es
complementaria
Son disentildeados los primers esto permite
seleccionar que porcioacuten amplificar
PCR Primers
PCR
Ejemplos de utilizacioacuten PCR en diagnoacutestico
1 Colocando primers Fw diferentes (una para
secuencia normal y otra mutada) y mismo Rw
en el mismo tubo
2 Combinando la PCR con cortes con enzimas de
restriccioacuten (si se generase o perdiera algun sitio de
restriccioacuten por la misma mutacioacuten)
concepto Primers alelo especiacuteficos
El siguiente es el resultado en un gel de agarosa
En la calle (1) se sembroacute
el marcador de peso
molecular
En la calle (2) se sembroacute
una muestra conocida
para una mutacioacuten
homocigota
En la calle (3) se sembroacute
la muestra del paciente
El siguiente es el resultado en un gel de agarosa
En la calle (C1) muestra
conocida homocigota
gen mutado
En la calle (C2) muestra
conocida homocigota
gen normal
iquestQueacute resultados
dieron las
muestras 1 2 3 4
iquestQueacute elementos son necesarios para la
polimerizacioacuten in Vitro
Extraccioacuten del ADN molde
Preparado de la MIX
1 Agua libre de nucleasas
2 1048698 Catioacuten divalente (MgCl2)
3 1048698 Desoxinucleoacutetidos (dNTPacutes)
4 1048698 Sol amortiguadora y sales (Buffer 10X)
5 1048698 Oligonucleoacutetidos (Primers)
6 1048698 Enzima termo-resistente (Ej Taq Polimerasa)
Los iones de magnesio
estimulan a la enzima Taq Polimerasa
para que incorpore los dNTPacutes
Algunas aclaracioneshellip
Taq
Mg
Sol amortiguadora PCR
1048698 Mantiene el pH oacuteptimo para que la enzima actuacutee
1048698 Sales
Proporcionan la fuerza ioacutenica adecuada para una maacutexima actividad de la
enzima
Herramientas
POLIMERASA BACTERIANA que resista a los cambios Tordm
Estrategia
Utilizar cambios de temperatura para desnaturalizar y
renaturalizar las hebras de ADN complementario
PCR coacutemo ve el observador el proceso
MIX +
ADN
Soacutelo veremos Teacutecnicas Directas
bullSouthern Blot
bullPCR
bullSecuenciacioacuten
Secuenciacioacuten
Meacutetodo enzimaacutetico 1977
Frederick Sanger desarrolloacute esta teacutecnica
Meacutetodo de los terminadores de cadena o dideoxi
Fundamento
REPLICACION DEL ADN
COMPLEMENTARIEDAD DE BASES
Herramientas
Dideoxinucleotidos
Estrategia
Cuando se agrega un dideoxinucleotido
a la cadena en formacioacuten se
interrumpe la polimerizacioacuten
Secuenciacioacuten
H
P
O
OH
OH
HO
O
O
CH2
NH
N
N
N
Azuacutecar
Base
Fosfato
3rsquo
5rsquo
2rsquo
1rsquo4rsquo
Jeraacuterquico OH
del carbono 3
En la polimerizacioacuten
del ADN
H
P
O
OH
OH
HO
O
O
CH2
NH2
N
N N
N
Azuacutecar
Base
Fosfato
3rsquo
5rsquo
2rsquo
1rsquo4rsquo
H
2rsquo3rsquo-dideoxinucleoacutetido
monofosfato
H
P
O
OH
OH
HO
O
O
CH2
NH2
N
N N
N
Azuacutecar
Base
Fosfato
3rsquo
5rsquo
2rsquo
1rsquo4rsquo
deoxinucleotido
monofosfato
Secuenciacioacuten utiliza deoxinucleotidos
y dideoxinucleotidos
Cuando se incorpora un dideoxinucleoacutetido se
interrumpe la polimerizacioacuten
H
P
O
OH
OH
HO
O
O
CH2
NH2
N
N N
N
Azuacutecar
Base
Fosfato
3rsquo
5rsquo
2rsquo
1rsquo4rsquo
H
2rsquo3rsquo-dideoxinucleoacutetido
monofosfato
Se realizan 4 reacciones de siacutentesis (4 tubos
separados)
Se incluyen pequentildeas cantidades de
dideoxinucleotidos ddNTP que
compiten con los dNTP
En cada tubo se colocan
1 dNTP (4 tipos)
2 un solo tipo de ddNTP por tubo
3 primer o cebador marcado
4 ADN molde a secuenciar
5 Polimerasa
A ddNTP C ddNTP
G ddNTP T ddNTP
Los productos de las 4
reacciones cada una
conteniendo una pequentildea
cantidad de uno de los cuatro
dideoxinucleoacutetidos son
cargadas en el gel y sometidas
a electroforesis
Como la polimerizacioacuten es solo
en direccioacuten 5rsquo a 3rsquo los
fragmentos maacutes cortos estaraacuten
en 5rsquo y los maacutes largos que se
encontraraacuten en la direccioacuten 3rsquo
ddTTPddCTP ddGTPddATP
Lec
tura
5rsquo
a 3rsquo
des
de
la b
asa
al t
ope
Secuenciacioacuten Separacioacuten de fragmentos
Alternativa del meacutetodo Sanger
Se marca cebador con fluorescencia y se activa la reaccioacuten
Los productos se detectan durante electroforelectroforeacutesis al
pasar por un laacuteser que excita los fluorocromos y se detecta
fluorescencia emitida
Se realizan 4 reacciones de secuencia distintas
Se coloca el cebador marcado polimerasa dNTP y ddNTP
Al finalizar las cuatro reacciones se mezclan en uacutenico tubo
SECUENCIACION AUTOMATICA empleando
meacutetodo enzimaacutetico
hellip
Placa caliente
Pol
liacutequido
ATTGC A
Laser
Prisma
Detectores
-
+Ventana
Reaccioacuten
Secuencia
Capilar
iquestCoacutemo se ve el resultado
En el electroferograma se observa dos picos en
la posicioacuten 152 (C T)
A ndash A ndash T ndash G ndash G - T - C - C ndash A ndash N - T - T - G - G - C
A ndash A ndash T ndash G ndash G - T - C - T ndash A ndash N - T - T - G - G - C
Repeticiones en tandem
La variacioacuten en el nuacutemero de repeticiones de los
distintos mini y microsateacutelites es un polimorfismo
muy frecuente
Estos polimorfismos se generan por errores durante la
replicacioacuten
Dado que las repeticiones se encuentran en forma diploide
Cada uno de nosotros posee dos variantes para una repeticioacuten
determinada
VNTR (Nuacutemero variable de repeticiones en tandem) micro sateacutelites hipervariables
Obtencioacuten de DNA a partir de RNA
Rt-PCR Transcriptasareversa
Pasos Hibridacioacuten
Se agrega la sonda sobre la membrana y se
incuba
Se lava para quitar el maacuteximo de hibridaciones
inespeciacuteficas
Se revela por autoradiografiacutea
Soacutelo veremos Teacutecnicas Directas
bullSouthern Blot
bullPCR
bullSecuenciacioacuten
PCR Reaccioacuten en cadena
de la polimerasa
Kerry Mullis en 1983 desarrolloacute esta teacutecnica
Amplificacioacuten de un gran nuacutemero de copias a
partir de un fragmento molde de ADN utilizando
una reaccioacuten enzimatica simple de polimerizacion
in vitro
PCR
ADN moldePCR
ADN resultante
Fundamento
REPLICACION DEL ADN
COMPLEMENTARIEDAD DE BASES
Herramientas
POLIMERASA BACTERIANA
Estrategia
Utilizar cambios de temperatura para
desnaturalizar y renaturalizar las hebras de
ADN complementario
PCR
1 Desnaturalizacioacuten 94degC - 96degC
2 Alineacioacuten temperatura variable
3 Extensioacuten 68 - 72degC
PCR la reaccioacuten se divide en 3 pasos
LOS 3 PASOS FORMAN 1 CICLO Y EL CICLO PUEDE
REPETIRSE VARIAS VECES
Necesitamos en este proceso controlar
la temperatura termociclador
Si repetimos el ciclo tendremos cuatro copias
Desnaturalizacioacuten
95degC
Hibridizacioacuten
50-60ordmC
Extensioacuten de la
cadena 75ordmC
Primer Ciclo
2do Ciclo95ordmC
50 - 60ordmC
75ordmC
Muacuteltiples ciclos daraacuten un incremento
exponencial en el nuacutemero de copias
iquestQueacute elementos son necesarios para la
polimerizacioacuten in Vitro
Extraccioacuten del ADN molde
Preparado de la MIX
1 Agua libre de nucleasas
2 1048698 Catioacuten divalente (MgCl2)
3 1048698 Desoxinucleoacutetidos (dNTPacutes)
4 1048698 Sol amortiguadora y sales (Buffer 10X)
5 1048698 Oligonucleoacutetidos (Primers)
6 1048698 Enzima termo-resistente (Ej Taq Polimerasa)
Para la polimerizacioacuten de ADN es necesario
Una polimerasa primers y nucleoacutetidos
Como se utiliza cambios de temperatura para
lograr la desnaturalizacioacuten y renaturalizacioacuten
de las hebras la enzima tiene que ser
resistente a cambios de temperatura
iquestQueacute elementos son necesarios para la
polimerizacioacuten in Vitro
Thermus aquaticus se
descubrioacute en el Parque
Yellowstone inicioacute el campo
de la biologiacutea de los
hipertermoacutefilos
Thermus aquaticus crece
a 70ordm grados (fuente de
la enzima taq polimerasa
usada en la PCR)
PCR
La taq polimerasa no es la uacutenica enzima usada en la
PCR Hay muchas maacutes
Ej PFU (enzima extraiacuteda de Pynococus Furioso)
PCR
TAQ PFU
No tiene actividad 3rsquo
exonucleasa Puede
copiar con errores
Tiene actividad 3rsquo
exonucleasa
Velocidad 2000
nucleoacutetidos min
Velocidad 500
nucleoacutetidos min
Complementariedad durante la hibridacioacuten
en la fase de alineamiento
Se unen zona donde la secuencia es
complementaria
Son disentildeados los primers esto permite
seleccionar que porcioacuten amplificar
PCR Primers
PCR
Ejemplos de utilizacioacuten PCR en diagnoacutestico
1 Colocando primers Fw diferentes (una para
secuencia normal y otra mutada) y mismo Rw
en el mismo tubo
2 Combinando la PCR con cortes con enzimas de
restriccioacuten (si se generase o perdiera algun sitio de
restriccioacuten por la misma mutacioacuten)
concepto Primers alelo especiacuteficos
El siguiente es el resultado en un gel de agarosa
En la calle (1) se sembroacute
el marcador de peso
molecular
En la calle (2) se sembroacute
una muestra conocida
para una mutacioacuten
homocigota
En la calle (3) se sembroacute
la muestra del paciente
El siguiente es el resultado en un gel de agarosa
En la calle (C1) muestra
conocida homocigota
gen mutado
En la calle (C2) muestra
conocida homocigota
gen normal
iquestQueacute resultados
dieron las
muestras 1 2 3 4
iquestQueacute elementos son necesarios para la
polimerizacioacuten in Vitro
Extraccioacuten del ADN molde
Preparado de la MIX
1 Agua libre de nucleasas
2 1048698 Catioacuten divalente (MgCl2)
3 1048698 Desoxinucleoacutetidos (dNTPacutes)
4 1048698 Sol amortiguadora y sales (Buffer 10X)
5 1048698 Oligonucleoacutetidos (Primers)
6 1048698 Enzima termo-resistente (Ej Taq Polimerasa)
Los iones de magnesio
estimulan a la enzima Taq Polimerasa
para que incorpore los dNTPacutes
Algunas aclaracioneshellip
Taq
Mg
Sol amortiguadora PCR
1048698 Mantiene el pH oacuteptimo para que la enzima actuacutee
1048698 Sales
Proporcionan la fuerza ioacutenica adecuada para una maacutexima actividad de la
enzima
Herramientas
POLIMERASA BACTERIANA que resista a los cambios Tordm
Estrategia
Utilizar cambios de temperatura para desnaturalizar y
renaturalizar las hebras de ADN complementario
PCR coacutemo ve el observador el proceso
MIX +
ADN
Soacutelo veremos Teacutecnicas Directas
bullSouthern Blot
bullPCR
bullSecuenciacioacuten
Secuenciacioacuten
Meacutetodo enzimaacutetico 1977
Frederick Sanger desarrolloacute esta teacutecnica
Meacutetodo de los terminadores de cadena o dideoxi
Fundamento
REPLICACION DEL ADN
COMPLEMENTARIEDAD DE BASES
Herramientas
Dideoxinucleotidos
Estrategia
Cuando se agrega un dideoxinucleotido
a la cadena en formacioacuten se
interrumpe la polimerizacioacuten
Secuenciacioacuten
H
P
O
OH
OH
HO
O
O
CH2
NH
N
N
N
Azuacutecar
Base
Fosfato
3rsquo
5rsquo
2rsquo
1rsquo4rsquo
Jeraacuterquico OH
del carbono 3
En la polimerizacioacuten
del ADN
H
P
O
OH
OH
HO
O
O
CH2
NH2
N
N N
N
Azuacutecar
Base
Fosfato
3rsquo
5rsquo
2rsquo
1rsquo4rsquo
H
2rsquo3rsquo-dideoxinucleoacutetido
monofosfato
H
P
O
OH
OH
HO
O
O
CH2
NH2
N
N N
N
Azuacutecar
Base
Fosfato
3rsquo
5rsquo
2rsquo
1rsquo4rsquo
deoxinucleotido
monofosfato
Secuenciacioacuten utiliza deoxinucleotidos
y dideoxinucleotidos
Cuando se incorpora un dideoxinucleoacutetido se
interrumpe la polimerizacioacuten
H
P
O
OH
OH
HO
O
O
CH2
NH2
N
N N
N
Azuacutecar
Base
Fosfato
3rsquo
5rsquo
2rsquo
1rsquo4rsquo
H
2rsquo3rsquo-dideoxinucleoacutetido
monofosfato
Se realizan 4 reacciones de siacutentesis (4 tubos
separados)
Se incluyen pequentildeas cantidades de
dideoxinucleotidos ddNTP que
compiten con los dNTP
En cada tubo se colocan
1 dNTP (4 tipos)
2 un solo tipo de ddNTP por tubo
3 primer o cebador marcado
4 ADN molde a secuenciar
5 Polimerasa
A ddNTP C ddNTP
G ddNTP T ddNTP
Los productos de las 4
reacciones cada una
conteniendo una pequentildea
cantidad de uno de los cuatro
dideoxinucleoacutetidos son
cargadas en el gel y sometidas
a electroforesis
Como la polimerizacioacuten es solo
en direccioacuten 5rsquo a 3rsquo los
fragmentos maacutes cortos estaraacuten
en 5rsquo y los maacutes largos que se
encontraraacuten en la direccioacuten 3rsquo
ddTTPddCTP ddGTPddATP
Lec
tura
5rsquo
a 3rsquo
des
de
la b
asa
al t
ope
Secuenciacioacuten Separacioacuten de fragmentos
Alternativa del meacutetodo Sanger
Se marca cebador con fluorescencia y se activa la reaccioacuten
Los productos se detectan durante electroforelectroforeacutesis al
pasar por un laacuteser que excita los fluorocromos y se detecta
fluorescencia emitida
Se realizan 4 reacciones de secuencia distintas
Se coloca el cebador marcado polimerasa dNTP y ddNTP
Al finalizar las cuatro reacciones se mezclan en uacutenico tubo
SECUENCIACION AUTOMATICA empleando
meacutetodo enzimaacutetico
hellip
Placa caliente
Pol
liacutequido
ATTGC A
Laser
Prisma
Detectores
-
+Ventana
Reaccioacuten
Secuencia
Capilar
iquestCoacutemo se ve el resultado
En el electroferograma se observa dos picos en
la posicioacuten 152 (C T)
A ndash A ndash T ndash G ndash G - T - C - C ndash A ndash N - T - T - G - G - C
A ndash A ndash T ndash G ndash G - T - C - T ndash A ndash N - T - T - G - G - C
Repeticiones en tandem
La variacioacuten en el nuacutemero de repeticiones de los
distintos mini y microsateacutelites es un polimorfismo
muy frecuente
Estos polimorfismos se generan por errores durante la
replicacioacuten
Dado que las repeticiones se encuentran en forma diploide
Cada uno de nosotros posee dos variantes para una repeticioacuten
determinada
VNTR (Nuacutemero variable de repeticiones en tandem) micro sateacutelites hipervariables
Obtencioacuten de DNA a partir de RNA
Rt-PCR Transcriptasareversa
Soacutelo veremos Teacutecnicas Directas
bullSouthern Blot
bullPCR
bullSecuenciacioacuten
PCR Reaccioacuten en cadena
de la polimerasa
Kerry Mullis en 1983 desarrolloacute esta teacutecnica
Amplificacioacuten de un gran nuacutemero de copias a
partir de un fragmento molde de ADN utilizando
una reaccioacuten enzimatica simple de polimerizacion
in vitro
PCR
ADN moldePCR
ADN resultante
Fundamento
REPLICACION DEL ADN
COMPLEMENTARIEDAD DE BASES
Herramientas
POLIMERASA BACTERIANA
Estrategia
Utilizar cambios de temperatura para
desnaturalizar y renaturalizar las hebras de
ADN complementario
PCR
1 Desnaturalizacioacuten 94degC - 96degC
2 Alineacioacuten temperatura variable
3 Extensioacuten 68 - 72degC
PCR la reaccioacuten se divide en 3 pasos
LOS 3 PASOS FORMAN 1 CICLO Y EL CICLO PUEDE
REPETIRSE VARIAS VECES
Necesitamos en este proceso controlar
la temperatura termociclador
Si repetimos el ciclo tendremos cuatro copias
Desnaturalizacioacuten
95degC
Hibridizacioacuten
50-60ordmC
Extensioacuten de la
cadena 75ordmC
Primer Ciclo
2do Ciclo95ordmC
50 - 60ordmC
75ordmC
Muacuteltiples ciclos daraacuten un incremento
exponencial en el nuacutemero de copias
iquestQueacute elementos son necesarios para la
polimerizacioacuten in Vitro
Extraccioacuten del ADN molde
Preparado de la MIX
1 Agua libre de nucleasas
2 1048698 Catioacuten divalente (MgCl2)
3 1048698 Desoxinucleoacutetidos (dNTPacutes)
4 1048698 Sol amortiguadora y sales (Buffer 10X)
5 1048698 Oligonucleoacutetidos (Primers)
6 1048698 Enzima termo-resistente (Ej Taq Polimerasa)
Para la polimerizacioacuten de ADN es necesario
Una polimerasa primers y nucleoacutetidos
Como se utiliza cambios de temperatura para
lograr la desnaturalizacioacuten y renaturalizacioacuten
de las hebras la enzima tiene que ser
resistente a cambios de temperatura
iquestQueacute elementos son necesarios para la
polimerizacioacuten in Vitro
Thermus aquaticus se
descubrioacute en el Parque
Yellowstone inicioacute el campo
de la biologiacutea de los
hipertermoacutefilos
Thermus aquaticus crece
a 70ordm grados (fuente de
la enzima taq polimerasa
usada en la PCR)
PCR
La taq polimerasa no es la uacutenica enzima usada en la
PCR Hay muchas maacutes
Ej PFU (enzima extraiacuteda de Pynococus Furioso)
PCR
TAQ PFU
No tiene actividad 3rsquo
exonucleasa Puede
copiar con errores
Tiene actividad 3rsquo
exonucleasa
Velocidad 2000
nucleoacutetidos min
Velocidad 500
nucleoacutetidos min
Complementariedad durante la hibridacioacuten
en la fase de alineamiento
Se unen zona donde la secuencia es
complementaria
Son disentildeados los primers esto permite
seleccionar que porcioacuten amplificar
PCR Primers
PCR
Ejemplos de utilizacioacuten PCR en diagnoacutestico
1 Colocando primers Fw diferentes (una para
secuencia normal y otra mutada) y mismo Rw
en el mismo tubo
2 Combinando la PCR con cortes con enzimas de
restriccioacuten (si se generase o perdiera algun sitio de
restriccioacuten por la misma mutacioacuten)
concepto Primers alelo especiacuteficos
El siguiente es el resultado en un gel de agarosa
En la calle (1) se sembroacute
el marcador de peso
molecular
En la calle (2) se sembroacute
una muestra conocida
para una mutacioacuten
homocigota
En la calle (3) se sembroacute
la muestra del paciente
El siguiente es el resultado en un gel de agarosa
En la calle (C1) muestra
conocida homocigota
gen mutado
En la calle (C2) muestra
conocida homocigota
gen normal
iquestQueacute resultados
dieron las
muestras 1 2 3 4
iquestQueacute elementos son necesarios para la
polimerizacioacuten in Vitro
Extraccioacuten del ADN molde
Preparado de la MIX
1 Agua libre de nucleasas
2 1048698 Catioacuten divalente (MgCl2)
3 1048698 Desoxinucleoacutetidos (dNTPacutes)
4 1048698 Sol amortiguadora y sales (Buffer 10X)
5 1048698 Oligonucleoacutetidos (Primers)
6 1048698 Enzima termo-resistente (Ej Taq Polimerasa)
Los iones de magnesio
estimulan a la enzima Taq Polimerasa
para que incorpore los dNTPacutes
Algunas aclaracioneshellip
Taq
Mg
Sol amortiguadora PCR
1048698 Mantiene el pH oacuteptimo para que la enzima actuacutee
1048698 Sales
Proporcionan la fuerza ioacutenica adecuada para una maacutexima actividad de la
enzima
Herramientas
POLIMERASA BACTERIANA que resista a los cambios Tordm
Estrategia
Utilizar cambios de temperatura para desnaturalizar y
renaturalizar las hebras de ADN complementario
PCR coacutemo ve el observador el proceso
MIX +
ADN
Soacutelo veremos Teacutecnicas Directas
bullSouthern Blot
bullPCR
bullSecuenciacioacuten
Secuenciacioacuten
Meacutetodo enzimaacutetico 1977
Frederick Sanger desarrolloacute esta teacutecnica
Meacutetodo de los terminadores de cadena o dideoxi
Fundamento
REPLICACION DEL ADN
COMPLEMENTARIEDAD DE BASES
Herramientas
Dideoxinucleotidos
Estrategia
Cuando se agrega un dideoxinucleotido
a la cadena en formacioacuten se
interrumpe la polimerizacioacuten
Secuenciacioacuten
H
P
O
OH
OH
HO
O
O
CH2
NH
N
N
N
Azuacutecar
Base
Fosfato
3rsquo
5rsquo
2rsquo
1rsquo4rsquo
Jeraacuterquico OH
del carbono 3
En la polimerizacioacuten
del ADN
H
P
O
OH
OH
HO
O
O
CH2
NH2
N
N N
N
Azuacutecar
Base
Fosfato
3rsquo
5rsquo
2rsquo
1rsquo4rsquo
H
2rsquo3rsquo-dideoxinucleoacutetido
monofosfato
H
P
O
OH
OH
HO
O
O
CH2
NH2
N
N N
N
Azuacutecar
Base
Fosfato
3rsquo
5rsquo
2rsquo
1rsquo4rsquo
deoxinucleotido
monofosfato
Secuenciacioacuten utiliza deoxinucleotidos
y dideoxinucleotidos
Cuando se incorpora un dideoxinucleoacutetido se
interrumpe la polimerizacioacuten
H
P
O
OH
OH
HO
O
O
CH2
NH2
N
N N
N
Azuacutecar
Base
Fosfato
3rsquo
5rsquo
2rsquo
1rsquo4rsquo
H
2rsquo3rsquo-dideoxinucleoacutetido
monofosfato
Se realizan 4 reacciones de siacutentesis (4 tubos
separados)
Se incluyen pequentildeas cantidades de
dideoxinucleotidos ddNTP que
compiten con los dNTP
En cada tubo se colocan
1 dNTP (4 tipos)
2 un solo tipo de ddNTP por tubo
3 primer o cebador marcado
4 ADN molde a secuenciar
5 Polimerasa
A ddNTP C ddNTP
G ddNTP T ddNTP
Los productos de las 4
reacciones cada una
conteniendo una pequentildea
cantidad de uno de los cuatro
dideoxinucleoacutetidos son
cargadas en el gel y sometidas
a electroforesis
Como la polimerizacioacuten es solo
en direccioacuten 5rsquo a 3rsquo los
fragmentos maacutes cortos estaraacuten
en 5rsquo y los maacutes largos que se
encontraraacuten en la direccioacuten 3rsquo
ddTTPddCTP ddGTPddATP
Lec
tura
5rsquo
a 3rsquo
des
de
la b
asa
al t
ope
Secuenciacioacuten Separacioacuten de fragmentos
Alternativa del meacutetodo Sanger
Se marca cebador con fluorescencia y se activa la reaccioacuten
Los productos se detectan durante electroforelectroforeacutesis al
pasar por un laacuteser que excita los fluorocromos y se detecta
fluorescencia emitida
Se realizan 4 reacciones de secuencia distintas
Se coloca el cebador marcado polimerasa dNTP y ddNTP
Al finalizar las cuatro reacciones se mezclan en uacutenico tubo
SECUENCIACION AUTOMATICA empleando
meacutetodo enzimaacutetico
hellip
Placa caliente
Pol
liacutequido
ATTGC A
Laser
Prisma
Detectores
-
+Ventana
Reaccioacuten
Secuencia
Capilar
iquestCoacutemo se ve el resultado
En el electroferograma se observa dos picos en
la posicioacuten 152 (C T)
A ndash A ndash T ndash G ndash G - T - C - C ndash A ndash N - T - T - G - G - C
A ndash A ndash T ndash G ndash G - T - C - T ndash A ndash N - T - T - G - G - C
Repeticiones en tandem
La variacioacuten en el nuacutemero de repeticiones de los
distintos mini y microsateacutelites es un polimorfismo
muy frecuente
Estos polimorfismos se generan por errores durante la
replicacioacuten
Dado que las repeticiones se encuentran en forma diploide
Cada uno de nosotros posee dos variantes para una repeticioacuten
determinada
VNTR (Nuacutemero variable de repeticiones en tandem) micro sateacutelites hipervariables
Obtencioacuten de DNA a partir de RNA
Rt-PCR Transcriptasareversa
PCR Reaccioacuten en cadena
de la polimerasa
Kerry Mullis en 1983 desarrolloacute esta teacutecnica
Amplificacioacuten de un gran nuacutemero de copias a
partir de un fragmento molde de ADN utilizando
una reaccioacuten enzimatica simple de polimerizacion
in vitro
PCR
ADN moldePCR
ADN resultante
Fundamento
REPLICACION DEL ADN
COMPLEMENTARIEDAD DE BASES
Herramientas
POLIMERASA BACTERIANA
Estrategia
Utilizar cambios de temperatura para
desnaturalizar y renaturalizar las hebras de
ADN complementario
PCR
1 Desnaturalizacioacuten 94degC - 96degC
2 Alineacioacuten temperatura variable
3 Extensioacuten 68 - 72degC
PCR la reaccioacuten se divide en 3 pasos
LOS 3 PASOS FORMAN 1 CICLO Y EL CICLO PUEDE
REPETIRSE VARIAS VECES
Necesitamos en este proceso controlar
la temperatura termociclador
Si repetimos el ciclo tendremos cuatro copias
Desnaturalizacioacuten
95degC
Hibridizacioacuten
50-60ordmC
Extensioacuten de la
cadena 75ordmC
Primer Ciclo
2do Ciclo95ordmC
50 - 60ordmC
75ordmC
Muacuteltiples ciclos daraacuten un incremento
exponencial en el nuacutemero de copias
iquestQueacute elementos son necesarios para la
polimerizacioacuten in Vitro
Extraccioacuten del ADN molde
Preparado de la MIX
1 Agua libre de nucleasas
2 1048698 Catioacuten divalente (MgCl2)
3 1048698 Desoxinucleoacutetidos (dNTPacutes)
4 1048698 Sol amortiguadora y sales (Buffer 10X)
5 1048698 Oligonucleoacutetidos (Primers)
6 1048698 Enzima termo-resistente (Ej Taq Polimerasa)
Para la polimerizacioacuten de ADN es necesario
Una polimerasa primers y nucleoacutetidos
Como se utiliza cambios de temperatura para
lograr la desnaturalizacioacuten y renaturalizacioacuten
de las hebras la enzima tiene que ser
resistente a cambios de temperatura
iquestQueacute elementos son necesarios para la
polimerizacioacuten in Vitro
Thermus aquaticus se
descubrioacute en el Parque
Yellowstone inicioacute el campo
de la biologiacutea de los
hipertermoacutefilos
Thermus aquaticus crece
a 70ordm grados (fuente de
la enzima taq polimerasa
usada en la PCR)
PCR
La taq polimerasa no es la uacutenica enzima usada en la
PCR Hay muchas maacutes
Ej PFU (enzima extraiacuteda de Pynococus Furioso)
PCR
TAQ PFU
No tiene actividad 3rsquo
exonucleasa Puede
copiar con errores
Tiene actividad 3rsquo
exonucleasa
Velocidad 2000
nucleoacutetidos min
Velocidad 500
nucleoacutetidos min
Complementariedad durante la hibridacioacuten
en la fase de alineamiento
Se unen zona donde la secuencia es
complementaria
Son disentildeados los primers esto permite
seleccionar que porcioacuten amplificar
PCR Primers
PCR
Ejemplos de utilizacioacuten PCR en diagnoacutestico
1 Colocando primers Fw diferentes (una para
secuencia normal y otra mutada) y mismo Rw
en el mismo tubo
2 Combinando la PCR con cortes con enzimas de
restriccioacuten (si se generase o perdiera algun sitio de
restriccioacuten por la misma mutacioacuten)
concepto Primers alelo especiacuteficos
El siguiente es el resultado en un gel de agarosa
En la calle (1) se sembroacute
el marcador de peso
molecular
En la calle (2) se sembroacute
una muestra conocida
para una mutacioacuten
homocigota
En la calle (3) se sembroacute
la muestra del paciente
El siguiente es el resultado en un gel de agarosa
En la calle (C1) muestra
conocida homocigota
gen mutado
En la calle (C2) muestra
conocida homocigota
gen normal
iquestQueacute resultados
dieron las
muestras 1 2 3 4
iquestQueacute elementos son necesarios para la
polimerizacioacuten in Vitro
Extraccioacuten del ADN molde
Preparado de la MIX
1 Agua libre de nucleasas
2 1048698 Catioacuten divalente (MgCl2)
3 1048698 Desoxinucleoacutetidos (dNTPacutes)
4 1048698 Sol amortiguadora y sales (Buffer 10X)
5 1048698 Oligonucleoacutetidos (Primers)
6 1048698 Enzima termo-resistente (Ej Taq Polimerasa)
Los iones de magnesio
estimulan a la enzima Taq Polimerasa
para que incorpore los dNTPacutes
Algunas aclaracioneshellip
Taq
Mg
Sol amortiguadora PCR
1048698 Mantiene el pH oacuteptimo para que la enzima actuacutee
1048698 Sales
Proporcionan la fuerza ioacutenica adecuada para una maacutexima actividad de la
enzima
Herramientas
POLIMERASA BACTERIANA que resista a los cambios Tordm
Estrategia
Utilizar cambios de temperatura para desnaturalizar y
renaturalizar las hebras de ADN complementario
PCR coacutemo ve el observador el proceso
MIX +
ADN
Soacutelo veremos Teacutecnicas Directas
bullSouthern Blot
bullPCR
bullSecuenciacioacuten
Secuenciacioacuten
Meacutetodo enzimaacutetico 1977
Frederick Sanger desarrolloacute esta teacutecnica
Meacutetodo de los terminadores de cadena o dideoxi
Fundamento
REPLICACION DEL ADN
COMPLEMENTARIEDAD DE BASES
Herramientas
Dideoxinucleotidos
Estrategia
Cuando se agrega un dideoxinucleotido
a la cadena en formacioacuten se
interrumpe la polimerizacioacuten
Secuenciacioacuten
H
P
O
OH
OH
HO
O
O
CH2
NH
N
N
N
Azuacutecar
Base
Fosfato
3rsquo
5rsquo
2rsquo
1rsquo4rsquo
Jeraacuterquico OH
del carbono 3
En la polimerizacioacuten
del ADN
H
P
O
OH
OH
HO
O
O
CH2
NH2
N
N N
N
Azuacutecar
Base
Fosfato
3rsquo
5rsquo
2rsquo
1rsquo4rsquo
H
2rsquo3rsquo-dideoxinucleoacutetido
monofosfato
H
P
O
OH
OH
HO
O
O
CH2
NH2
N
N N
N
Azuacutecar
Base
Fosfato
3rsquo
5rsquo
2rsquo
1rsquo4rsquo
deoxinucleotido
monofosfato
Secuenciacioacuten utiliza deoxinucleotidos
y dideoxinucleotidos
Cuando se incorpora un dideoxinucleoacutetido se
interrumpe la polimerizacioacuten
H
P
O
OH
OH
HO
O
O
CH2
NH2
N
N N
N
Azuacutecar
Base
Fosfato
3rsquo
5rsquo
2rsquo
1rsquo4rsquo
H
2rsquo3rsquo-dideoxinucleoacutetido
monofosfato
Se realizan 4 reacciones de siacutentesis (4 tubos
separados)
Se incluyen pequentildeas cantidades de
dideoxinucleotidos ddNTP que
compiten con los dNTP
En cada tubo se colocan
1 dNTP (4 tipos)
2 un solo tipo de ddNTP por tubo
3 primer o cebador marcado
4 ADN molde a secuenciar
5 Polimerasa
A ddNTP C ddNTP
G ddNTP T ddNTP
Los productos de las 4
reacciones cada una
conteniendo una pequentildea
cantidad de uno de los cuatro
dideoxinucleoacutetidos son
cargadas en el gel y sometidas
a electroforesis
Como la polimerizacioacuten es solo
en direccioacuten 5rsquo a 3rsquo los
fragmentos maacutes cortos estaraacuten
en 5rsquo y los maacutes largos que se
encontraraacuten en la direccioacuten 3rsquo
ddTTPddCTP ddGTPddATP
Lec
tura
5rsquo
a 3rsquo
des
de
la b
asa
al t
ope
Secuenciacioacuten Separacioacuten de fragmentos
Alternativa del meacutetodo Sanger
Se marca cebador con fluorescencia y se activa la reaccioacuten
Los productos se detectan durante electroforelectroforeacutesis al
pasar por un laacuteser que excita los fluorocromos y se detecta
fluorescencia emitida
Se realizan 4 reacciones de secuencia distintas
Se coloca el cebador marcado polimerasa dNTP y ddNTP
Al finalizar las cuatro reacciones se mezclan en uacutenico tubo
SECUENCIACION AUTOMATICA empleando
meacutetodo enzimaacutetico
hellip
Placa caliente
Pol
liacutequido
ATTGC A
Laser
Prisma
Detectores
-
+Ventana
Reaccioacuten
Secuencia
Capilar
iquestCoacutemo se ve el resultado
En el electroferograma se observa dos picos en
la posicioacuten 152 (C T)
A ndash A ndash T ndash G ndash G - T - C - C ndash A ndash N - T - T - G - G - C
A ndash A ndash T ndash G ndash G - T - C - T ndash A ndash N - T - T - G - G - C
Repeticiones en tandem
La variacioacuten en el nuacutemero de repeticiones de los
distintos mini y microsateacutelites es un polimorfismo
muy frecuente
Estos polimorfismos se generan por errores durante la
replicacioacuten
Dado que las repeticiones se encuentran en forma diploide
Cada uno de nosotros posee dos variantes para una repeticioacuten
determinada
VNTR (Nuacutemero variable de repeticiones en tandem) micro sateacutelites hipervariables
Obtencioacuten de DNA a partir de RNA
Rt-PCR Transcriptasareversa
Amplificacioacuten de un gran nuacutemero de copias a
partir de un fragmento molde de ADN utilizando
una reaccioacuten enzimatica simple de polimerizacion
in vitro
PCR
ADN moldePCR
ADN resultante
Fundamento
REPLICACION DEL ADN
COMPLEMENTARIEDAD DE BASES
Herramientas
POLIMERASA BACTERIANA
Estrategia
Utilizar cambios de temperatura para
desnaturalizar y renaturalizar las hebras de
ADN complementario
PCR
1 Desnaturalizacioacuten 94degC - 96degC
2 Alineacioacuten temperatura variable
3 Extensioacuten 68 - 72degC
PCR la reaccioacuten se divide en 3 pasos
LOS 3 PASOS FORMAN 1 CICLO Y EL CICLO PUEDE
REPETIRSE VARIAS VECES
Necesitamos en este proceso controlar
la temperatura termociclador
Si repetimos el ciclo tendremos cuatro copias
Desnaturalizacioacuten
95degC
Hibridizacioacuten
50-60ordmC
Extensioacuten de la
cadena 75ordmC
Primer Ciclo
2do Ciclo95ordmC
50 - 60ordmC
75ordmC
Muacuteltiples ciclos daraacuten un incremento
exponencial en el nuacutemero de copias
iquestQueacute elementos son necesarios para la
polimerizacioacuten in Vitro
Extraccioacuten del ADN molde
Preparado de la MIX
1 Agua libre de nucleasas
2 1048698 Catioacuten divalente (MgCl2)
3 1048698 Desoxinucleoacutetidos (dNTPacutes)
4 1048698 Sol amortiguadora y sales (Buffer 10X)
5 1048698 Oligonucleoacutetidos (Primers)
6 1048698 Enzima termo-resistente (Ej Taq Polimerasa)
Para la polimerizacioacuten de ADN es necesario
Una polimerasa primers y nucleoacutetidos
Como se utiliza cambios de temperatura para
lograr la desnaturalizacioacuten y renaturalizacioacuten
de las hebras la enzima tiene que ser
resistente a cambios de temperatura
iquestQueacute elementos son necesarios para la
polimerizacioacuten in Vitro
Thermus aquaticus se
descubrioacute en el Parque
Yellowstone inicioacute el campo
de la biologiacutea de los
hipertermoacutefilos
Thermus aquaticus crece
a 70ordm grados (fuente de
la enzima taq polimerasa
usada en la PCR)
PCR
La taq polimerasa no es la uacutenica enzima usada en la
PCR Hay muchas maacutes
Ej PFU (enzima extraiacuteda de Pynococus Furioso)
PCR
TAQ PFU
No tiene actividad 3rsquo
exonucleasa Puede
copiar con errores
Tiene actividad 3rsquo
exonucleasa
Velocidad 2000
nucleoacutetidos min
Velocidad 500
nucleoacutetidos min
Complementariedad durante la hibridacioacuten
en la fase de alineamiento
Se unen zona donde la secuencia es
complementaria
Son disentildeados los primers esto permite
seleccionar que porcioacuten amplificar
PCR Primers
PCR
Ejemplos de utilizacioacuten PCR en diagnoacutestico
1 Colocando primers Fw diferentes (una para
secuencia normal y otra mutada) y mismo Rw
en el mismo tubo
2 Combinando la PCR con cortes con enzimas de
restriccioacuten (si se generase o perdiera algun sitio de
restriccioacuten por la misma mutacioacuten)
concepto Primers alelo especiacuteficos
El siguiente es el resultado en un gel de agarosa
En la calle (1) se sembroacute
el marcador de peso
molecular
En la calle (2) se sembroacute
una muestra conocida
para una mutacioacuten
homocigota
En la calle (3) se sembroacute
la muestra del paciente
El siguiente es el resultado en un gel de agarosa
En la calle (C1) muestra
conocida homocigota
gen mutado
En la calle (C2) muestra
conocida homocigota
gen normal
iquestQueacute resultados
dieron las
muestras 1 2 3 4
iquestQueacute elementos son necesarios para la
polimerizacioacuten in Vitro
Extraccioacuten del ADN molde
Preparado de la MIX
1 Agua libre de nucleasas
2 1048698 Catioacuten divalente (MgCl2)
3 1048698 Desoxinucleoacutetidos (dNTPacutes)
4 1048698 Sol amortiguadora y sales (Buffer 10X)
5 1048698 Oligonucleoacutetidos (Primers)
6 1048698 Enzima termo-resistente (Ej Taq Polimerasa)
Los iones de magnesio
estimulan a la enzima Taq Polimerasa
para que incorpore los dNTPacutes
Algunas aclaracioneshellip
Taq
Mg
Sol amortiguadora PCR
1048698 Mantiene el pH oacuteptimo para que la enzima actuacutee
1048698 Sales
Proporcionan la fuerza ioacutenica adecuada para una maacutexima actividad de la
enzima
Herramientas
POLIMERASA BACTERIANA que resista a los cambios Tordm
Estrategia
Utilizar cambios de temperatura para desnaturalizar y
renaturalizar las hebras de ADN complementario
PCR coacutemo ve el observador el proceso
MIX +
ADN
Soacutelo veremos Teacutecnicas Directas
bullSouthern Blot
bullPCR
bullSecuenciacioacuten
Secuenciacioacuten
Meacutetodo enzimaacutetico 1977
Frederick Sanger desarrolloacute esta teacutecnica
Meacutetodo de los terminadores de cadena o dideoxi
Fundamento
REPLICACION DEL ADN
COMPLEMENTARIEDAD DE BASES
Herramientas
Dideoxinucleotidos
Estrategia
Cuando se agrega un dideoxinucleotido
a la cadena en formacioacuten se
interrumpe la polimerizacioacuten
Secuenciacioacuten
H
P
O
OH
OH
HO
O
O
CH2
NH
N
N
N
Azuacutecar
Base
Fosfato
3rsquo
5rsquo
2rsquo
1rsquo4rsquo
Jeraacuterquico OH
del carbono 3
En la polimerizacioacuten
del ADN
H
P
O
OH
OH
HO
O
O
CH2
NH2
N
N N
N
Azuacutecar
Base
Fosfato
3rsquo
5rsquo
2rsquo
1rsquo4rsquo
H
2rsquo3rsquo-dideoxinucleoacutetido
monofosfato
H
P
O
OH
OH
HO
O
O
CH2
NH2
N
N N
N
Azuacutecar
Base
Fosfato
3rsquo
5rsquo
2rsquo
1rsquo4rsquo
deoxinucleotido
monofosfato
Secuenciacioacuten utiliza deoxinucleotidos
y dideoxinucleotidos
Cuando se incorpora un dideoxinucleoacutetido se
interrumpe la polimerizacioacuten
H
P
O
OH
OH
HO
O
O
CH2
NH2
N
N N
N
Azuacutecar
Base
Fosfato
3rsquo
5rsquo
2rsquo
1rsquo4rsquo
H
2rsquo3rsquo-dideoxinucleoacutetido
monofosfato
Se realizan 4 reacciones de siacutentesis (4 tubos
separados)
Se incluyen pequentildeas cantidades de
dideoxinucleotidos ddNTP que
compiten con los dNTP
En cada tubo se colocan
1 dNTP (4 tipos)
2 un solo tipo de ddNTP por tubo
3 primer o cebador marcado
4 ADN molde a secuenciar
5 Polimerasa
A ddNTP C ddNTP
G ddNTP T ddNTP
Los productos de las 4
reacciones cada una
conteniendo una pequentildea
cantidad de uno de los cuatro
dideoxinucleoacutetidos son
cargadas en el gel y sometidas
a electroforesis
Como la polimerizacioacuten es solo
en direccioacuten 5rsquo a 3rsquo los
fragmentos maacutes cortos estaraacuten
en 5rsquo y los maacutes largos que se
encontraraacuten en la direccioacuten 3rsquo
ddTTPddCTP ddGTPddATP
Lec
tura
5rsquo
a 3rsquo
des
de
la b
asa
al t
ope
Secuenciacioacuten Separacioacuten de fragmentos
Alternativa del meacutetodo Sanger
Se marca cebador con fluorescencia y se activa la reaccioacuten
Los productos se detectan durante electroforelectroforeacutesis al
pasar por un laacuteser que excita los fluorocromos y se detecta
fluorescencia emitida
Se realizan 4 reacciones de secuencia distintas
Se coloca el cebador marcado polimerasa dNTP y ddNTP
Al finalizar las cuatro reacciones se mezclan en uacutenico tubo
SECUENCIACION AUTOMATICA empleando
meacutetodo enzimaacutetico
hellip
Placa caliente
Pol
liacutequido
ATTGC A
Laser
Prisma
Detectores
-
+Ventana
Reaccioacuten
Secuencia
Capilar
iquestCoacutemo se ve el resultado
En el electroferograma se observa dos picos en
la posicioacuten 152 (C T)
A ndash A ndash T ndash G ndash G - T - C - C ndash A ndash N - T - T - G - G - C
A ndash A ndash T ndash G ndash G - T - C - T ndash A ndash N - T - T - G - G - C
Repeticiones en tandem
La variacioacuten en el nuacutemero de repeticiones de los
distintos mini y microsateacutelites es un polimorfismo
muy frecuente
Estos polimorfismos se generan por errores durante la
replicacioacuten
Dado que las repeticiones se encuentran en forma diploide
Cada uno de nosotros posee dos variantes para una repeticioacuten
determinada
VNTR (Nuacutemero variable de repeticiones en tandem) micro sateacutelites hipervariables
Obtencioacuten de DNA a partir de RNA
Rt-PCR Transcriptasareversa
Fundamento
REPLICACION DEL ADN
COMPLEMENTARIEDAD DE BASES
Herramientas
POLIMERASA BACTERIANA
Estrategia
Utilizar cambios de temperatura para
desnaturalizar y renaturalizar las hebras de
ADN complementario
PCR
1 Desnaturalizacioacuten 94degC - 96degC
2 Alineacioacuten temperatura variable
3 Extensioacuten 68 - 72degC
PCR la reaccioacuten se divide en 3 pasos
LOS 3 PASOS FORMAN 1 CICLO Y EL CICLO PUEDE
REPETIRSE VARIAS VECES
Necesitamos en este proceso controlar
la temperatura termociclador
Si repetimos el ciclo tendremos cuatro copias
Desnaturalizacioacuten
95degC
Hibridizacioacuten
50-60ordmC
Extensioacuten de la
cadena 75ordmC
Primer Ciclo
2do Ciclo95ordmC
50 - 60ordmC
75ordmC
Muacuteltiples ciclos daraacuten un incremento
exponencial en el nuacutemero de copias
iquestQueacute elementos son necesarios para la
polimerizacioacuten in Vitro
Extraccioacuten del ADN molde
Preparado de la MIX
1 Agua libre de nucleasas
2 1048698 Catioacuten divalente (MgCl2)
3 1048698 Desoxinucleoacutetidos (dNTPacutes)
4 1048698 Sol amortiguadora y sales (Buffer 10X)
5 1048698 Oligonucleoacutetidos (Primers)
6 1048698 Enzima termo-resistente (Ej Taq Polimerasa)
Para la polimerizacioacuten de ADN es necesario
Una polimerasa primers y nucleoacutetidos
Como se utiliza cambios de temperatura para
lograr la desnaturalizacioacuten y renaturalizacioacuten
de las hebras la enzima tiene que ser
resistente a cambios de temperatura
iquestQueacute elementos son necesarios para la
polimerizacioacuten in Vitro
Thermus aquaticus se
descubrioacute en el Parque
Yellowstone inicioacute el campo
de la biologiacutea de los
hipertermoacutefilos
Thermus aquaticus crece
a 70ordm grados (fuente de
la enzima taq polimerasa
usada en la PCR)
PCR
La taq polimerasa no es la uacutenica enzima usada en la
PCR Hay muchas maacutes
Ej PFU (enzima extraiacuteda de Pynococus Furioso)
PCR
TAQ PFU
No tiene actividad 3rsquo
exonucleasa Puede
copiar con errores
Tiene actividad 3rsquo
exonucleasa
Velocidad 2000
nucleoacutetidos min
Velocidad 500
nucleoacutetidos min
Complementariedad durante la hibridacioacuten
en la fase de alineamiento
Se unen zona donde la secuencia es
complementaria
Son disentildeados los primers esto permite
seleccionar que porcioacuten amplificar
PCR Primers
PCR
Ejemplos de utilizacioacuten PCR en diagnoacutestico
1 Colocando primers Fw diferentes (una para
secuencia normal y otra mutada) y mismo Rw
en el mismo tubo
2 Combinando la PCR con cortes con enzimas de
restriccioacuten (si se generase o perdiera algun sitio de
restriccioacuten por la misma mutacioacuten)
concepto Primers alelo especiacuteficos
El siguiente es el resultado en un gel de agarosa
En la calle (1) se sembroacute
el marcador de peso
molecular
En la calle (2) se sembroacute
una muestra conocida
para una mutacioacuten
homocigota
En la calle (3) se sembroacute
la muestra del paciente
El siguiente es el resultado en un gel de agarosa
En la calle (C1) muestra
conocida homocigota
gen mutado
En la calle (C2) muestra
conocida homocigota
gen normal
iquestQueacute resultados
dieron las
muestras 1 2 3 4
iquestQueacute elementos son necesarios para la
polimerizacioacuten in Vitro
Extraccioacuten del ADN molde
Preparado de la MIX
1 Agua libre de nucleasas
2 1048698 Catioacuten divalente (MgCl2)
3 1048698 Desoxinucleoacutetidos (dNTPacutes)
4 1048698 Sol amortiguadora y sales (Buffer 10X)
5 1048698 Oligonucleoacutetidos (Primers)
6 1048698 Enzima termo-resistente (Ej Taq Polimerasa)
Los iones de magnesio
estimulan a la enzima Taq Polimerasa
para que incorpore los dNTPacutes
Algunas aclaracioneshellip
Taq
Mg
Sol amortiguadora PCR
1048698 Mantiene el pH oacuteptimo para que la enzima actuacutee
1048698 Sales
Proporcionan la fuerza ioacutenica adecuada para una maacutexima actividad de la
enzima
Herramientas
POLIMERASA BACTERIANA que resista a los cambios Tordm
Estrategia
Utilizar cambios de temperatura para desnaturalizar y
renaturalizar las hebras de ADN complementario
PCR coacutemo ve el observador el proceso
MIX +
ADN
Soacutelo veremos Teacutecnicas Directas
bullSouthern Blot
bullPCR
bullSecuenciacioacuten
Secuenciacioacuten
Meacutetodo enzimaacutetico 1977
Frederick Sanger desarrolloacute esta teacutecnica
Meacutetodo de los terminadores de cadena o dideoxi
Fundamento
REPLICACION DEL ADN
COMPLEMENTARIEDAD DE BASES
Herramientas
Dideoxinucleotidos
Estrategia
Cuando se agrega un dideoxinucleotido
a la cadena en formacioacuten se
interrumpe la polimerizacioacuten
Secuenciacioacuten
H
P
O
OH
OH
HO
O
O
CH2
NH
N
N
N
Azuacutecar
Base
Fosfato
3rsquo
5rsquo
2rsquo
1rsquo4rsquo
Jeraacuterquico OH
del carbono 3
En la polimerizacioacuten
del ADN
H
P
O
OH
OH
HO
O
O
CH2
NH2
N
N N
N
Azuacutecar
Base
Fosfato
3rsquo
5rsquo
2rsquo
1rsquo4rsquo
H
2rsquo3rsquo-dideoxinucleoacutetido
monofosfato
H
P
O
OH
OH
HO
O
O
CH2
NH2
N
N N
N
Azuacutecar
Base
Fosfato
3rsquo
5rsquo
2rsquo
1rsquo4rsquo
deoxinucleotido
monofosfato
Secuenciacioacuten utiliza deoxinucleotidos
y dideoxinucleotidos
Cuando se incorpora un dideoxinucleoacutetido se
interrumpe la polimerizacioacuten
H
P
O
OH
OH
HO
O
O
CH2
NH2
N
N N
N
Azuacutecar
Base
Fosfato
3rsquo
5rsquo
2rsquo
1rsquo4rsquo
H
2rsquo3rsquo-dideoxinucleoacutetido
monofosfato
Se realizan 4 reacciones de siacutentesis (4 tubos
separados)
Se incluyen pequentildeas cantidades de
dideoxinucleotidos ddNTP que
compiten con los dNTP
En cada tubo se colocan
1 dNTP (4 tipos)
2 un solo tipo de ddNTP por tubo
3 primer o cebador marcado
4 ADN molde a secuenciar
5 Polimerasa
A ddNTP C ddNTP
G ddNTP T ddNTP
Los productos de las 4
reacciones cada una
conteniendo una pequentildea
cantidad de uno de los cuatro
dideoxinucleoacutetidos son
cargadas en el gel y sometidas
a electroforesis
Como la polimerizacioacuten es solo
en direccioacuten 5rsquo a 3rsquo los
fragmentos maacutes cortos estaraacuten
en 5rsquo y los maacutes largos que se
encontraraacuten en la direccioacuten 3rsquo
ddTTPddCTP ddGTPddATP
Lec
tura
5rsquo
a 3rsquo
des
de
la b
asa
al t
ope
Secuenciacioacuten Separacioacuten de fragmentos
Alternativa del meacutetodo Sanger
Se marca cebador con fluorescencia y se activa la reaccioacuten
Los productos se detectan durante electroforelectroforeacutesis al
pasar por un laacuteser que excita los fluorocromos y se detecta
fluorescencia emitida
Se realizan 4 reacciones de secuencia distintas
Se coloca el cebador marcado polimerasa dNTP y ddNTP
Al finalizar las cuatro reacciones se mezclan en uacutenico tubo
SECUENCIACION AUTOMATICA empleando
meacutetodo enzimaacutetico
hellip
Placa caliente
Pol
liacutequido
ATTGC A
Laser
Prisma
Detectores
-
+Ventana
Reaccioacuten
Secuencia
Capilar
iquestCoacutemo se ve el resultado
En el electroferograma se observa dos picos en
la posicioacuten 152 (C T)
A ndash A ndash T ndash G ndash G - T - C - C ndash A ndash N - T - T - G - G - C
A ndash A ndash T ndash G ndash G - T - C - T ndash A ndash N - T - T - G - G - C
Repeticiones en tandem
La variacioacuten en el nuacutemero de repeticiones de los
distintos mini y microsateacutelites es un polimorfismo
muy frecuente
Estos polimorfismos se generan por errores durante la
replicacioacuten
Dado que las repeticiones se encuentran en forma diploide
Cada uno de nosotros posee dos variantes para una repeticioacuten
determinada
VNTR (Nuacutemero variable de repeticiones en tandem) micro sateacutelites hipervariables
Obtencioacuten de DNA a partir de RNA
Rt-PCR Transcriptasareversa
1 Desnaturalizacioacuten 94degC - 96degC
2 Alineacioacuten temperatura variable
3 Extensioacuten 68 - 72degC
PCR la reaccioacuten se divide en 3 pasos
LOS 3 PASOS FORMAN 1 CICLO Y EL CICLO PUEDE
REPETIRSE VARIAS VECES
Necesitamos en este proceso controlar
la temperatura termociclador
Si repetimos el ciclo tendremos cuatro copias
Desnaturalizacioacuten
95degC
Hibridizacioacuten
50-60ordmC
Extensioacuten de la
cadena 75ordmC
Primer Ciclo
2do Ciclo95ordmC
50 - 60ordmC
75ordmC
Muacuteltiples ciclos daraacuten un incremento
exponencial en el nuacutemero de copias
iquestQueacute elementos son necesarios para la
polimerizacioacuten in Vitro
Extraccioacuten del ADN molde
Preparado de la MIX
1 Agua libre de nucleasas
2 1048698 Catioacuten divalente (MgCl2)
3 1048698 Desoxinucleoacutetidos (dNTPacutes)
4 1048698 Sol amortiguadora y sales (Buffer 10X)
5 1048698 Oligonucleoacutetidos (Primers)
6 1048698 Enzima termo-resistente (Ej Taq Polimerasa)
Para la polimerizacioacuten de ADN es necesario
Una polimerasa primers y nucleoacutetidos
Como se utiliza cambios de temperatura para
lograr la desnaturalizacioacuten y renaturalizacioacuten
de las hebras la enzima tiene que ser
resistente a cambios de temperatura
iquestQueacute elementos son necesarios para la
polimerizacioacuten in Vitro
Thermus aquaticus se
descubrioacute en el Parque
Yellowstone inicioacute el campo
de la biologiacutea de los
hipertermoacutefilos
Thermus aquaticus crece
a 70ordm grados (fuente de
la enzima taq polimerasa
usada en la PCR)
PCR
La taq polimerasa no es la uacutenica enzima usada en la
PCR Hay muchas maacutes
Ej PFU (enzima extraiacuteda de Pynococus Furioso)
PCR
TAQ PFU
No tiene actividad 3rsquo
exonucleasa Puede
copiar con errores
Tiene actividad 3rsquo
exonucleasa
Velocidad 2000
nucleoacutetidos min
Velocidad 500
nucleoacutetidos min
Complementariedad durante la hibridacioacuten
en la fase de alineamiento
Se unen zona donde la secuencia es
complementaria
Son disentildeados los primers esto permite
seleccionar que porcioacuten amplificar
PCR Primers
PCR
Ejemplos de utilizacioacuten PCR en diagnoacutestico
1 Colocando primers Fw diferentes (una para
secuencia normal y otra mutada) y mismo Rw
en el mismo tubo
2 Combinando la PCR con cortes con enzimas de
restriccioacuten (si se generase o perdiera algun sitio de
restriccioacuten por la misma mutacioacuten)
concepto Primers alelo especiacuteficos
El siguiente es el resultado en un gel de agarosa
En la calle (1) se sembroacute
el marcador de peso
molecular
En la calle (2) se sembroacute
una muestra conocida
para una mutacioacuten
homocigota
En la calle (3) se sembroacute
la muestra del paciente
El siguiente es el resultado en un gel de agarosa
En la calle (C1) muestra
conocida homocigota
gen mutado
En la calle (C2) muestra
conocida homocigota
gen normal
iquestQueacute resultados
dieron las
muestras 1 2 3 4
iquestQueacute elementos son necesarios para la
polimerizacioacuten in Vitro
Extraccioacuten del ADN molde
Preparado de la MIX
1 Agua libre de nucleasas
2 1048698 Catioacuten divalente (MgCl2)
3 1048698 Desoxinucleoacutetidos (dNTPacutes)
4 1048698 Sol amortiguadora y sales (Buffer 10X)
5 1048698 Oligonucleoacutetidos (Primers)
6 1048698 Enzima termo-resistente (Ej Taq Polimerasa)
Los iones de magnesio
estimulan a la enzima Taq Polimerasa
para que incorpore los dNTPacutes
Algunas aclaracioneshellip
Taq
Mg
Sol amortiguadora PCR
1048698 Mantiene el pH oacuteptimo para que la enzima actuacutee
1048698 Sales
Proporcionan la fuerza ioacutenica adecuada para una maacutexima actividad de la
enzima
Herramientas
POLIMERASA BACTERIANA que resista a los cambios Tordm
Estrategia
Utilizar cambios de temperatura para desnaturalizar y
renaturalizar las hebras de ADN complementario
PCR coacutemo ve el observador el proceso
MIX +
ADN
Soacutelo veremos Teacutecnicas Directas
bullSouthern Blot
bullPCR
bullSecuenciacioacuten
Secuenciacioacuten
Meacutetodo enzimaacutetico 1977
Frederick Sanger desarrolloacute esta teacutecnica
Meacutetodo de los terminadores de cadena o dideoxi
Fundamento
REPLICACION DEL ADN
COMPLEMENTARIEDAD DE BASES
Herramientas
Dideoxinucleotidos
Estrategia
Cuando se agrega un dideoxinucleotido
a la cadena en formacioacuten se
interrumpe la polimerizacioacuten
Secuenciacioacuten
H
P
O
OH
OH
HO
O
O
CH2
NH
N
N
N
Azuacutecar
Base
Fosfato
3rsquo
5rsquo
2rsquo
1rsquo4rsquo
Jeraacuterquico OH
del carbono 3
En la polimerizacioacuten
del ADN
H
P
O
OH
OH
HO
O
O
CH2
NH2
N
N N
N
Azuacutecar
Base
Fosfato
3rsquo
5rsquo
2rsquo
1rsquo4rsquo
H
2rsquo3rsquo-dideoxinucleoacutetido
monofosfato
H
P
O
OH
OH
HO
O
O
CH2
NH2
N
N N
N
Azuacutecar
Base
Fosfato
3rsquo
5rsquo
2rsquo
1rsquo4rsquo
deoxinucleotido
monofosfato
Secuenciacioacuten utiliza deoxinucleotidos
y dideoxinucleotidos
Cuando se incorpora un dideoxinucleoacutetido se
interrumpe la polimerizacioacuten
H
P
O
OH
OH
HO
O
O
CH2
NH2
N
N N
N
Azuacutecar
Base
Fosfato
3rsquo
5rsquo
2rsquo
1rsquo4rsquo
H
2rsquo3rsquo-dideoxinucleoacutetido
monofosfato
Se realizan 4 reacciones de siacutentesis (4 tubos
separados)
Se incluyen pequentildeas cantidades de
dideoxinucleotidos ddNTP que
compiten con los dNTP
En cada tubo se colocan
1 dNTP (4 tipos)
2 un solo tipo de ddNTP por tubo
3 primer o cebador marcado
4 ADN molde a secuenciar
5 Polimerasa
A ddNTP C ddNTP
G ddNTP T ddNTP
Los productos de las 4
reacciones cada una
conteniendo una pequentildea
cantidad de uno de los cuatro
dideoxinucleoacutetidos son
cargadas en el gel y sometidas
a electroforesis
Como la polimerizacioacuten es solo
en direccioacuten 5rsquo a 3rsquo los
fragmentos maacutes cortos estaraacuten
en 5rsquo y los maacutes largos que se
encontraraacuten en la direccioacuten 3rsquo
ddTTPddCTP ddGTPddATP
Lec
tura
5rsquo
a 3rsquo
des
de
la b
asa
al t
ope
Secuenciacioacuten Separacioacuten de fragmentos
Alternativa del meacutetodo Sanger
Se marca cebador con fluorescencia y se activa la reaccioacuten
Los productos se detectan durante electroforelectroforeacutesis al
pasar por un laacuteser que excita los fluorocromos y se detecta
fluorescencia emitida
Se realizan 4 reacciones de secuencia distintas
Se coloca el cebador marcado polimerasa dNTP y ddNTP
Al finalizar las cuatro reacciones se mezclan en uacutenico tubo
SECUENCIACION AUTOMATICA empleando
meacutetodo enzimaacutetico
hellip
Placa caliente
Pol
liacutequido
ATTGC A
Laser
Prisma
Detectores
-
+Ventana
Reaccioacuten
Secuencia
Capilar
iquestCoacutemo se ve el resultado
En el electroferograma se observa dos picos en
la posicioacuten 152 (C T)
A ndash A ndash T ndash G ndash G - T - C - C ndash A ndash N - T - T - G - G - C
A ndash A ndash T ndash G ndash G - T - C - T ndash A ndash N - T - T - G - G - C
Repeticiones en tandem
La variacioacuten en el nuacutemero de repeticiones de los
distintos mini y microsateacutelites es un polimorfismo
muy frecuente
Estos polimorfismos se generan por errores durante la
replicacioacuten
Dado que las repeticiones se encuentran en forma diploide
Cada uno de nosotros posee dos variantes para una repeticioacuten
determinada
VNTR (Nuacutemero variable de repeticiones en tandem) micro sateacutelites hipervariables
Obtencioacuten de DNA a partir de RNA
Rt-PCR Transcriptasareversa
Necesitamos en este proceso controlar
la temperatura termociclador
Si repetimos el ciclo tendremos cuatro copias
Desnaturalizacioacuten
95degC
Hibridizacioacuten
50-60ordmC
Extensioacuten de la
cadena 75ordmC
Primer Ciclo
2do Ciclo95ordmC
50 - 60ordmC
75ordmC
Muacuteltiples ciclos daraacuten un incremento
exponencial en el nuacutemero de copias
iquestQueacute elementos son necesarios para la
polimerizacioacuten in Vitro
Extraccioacuten del ADN molde
Preparado de la MIX
1 Agua libre de nucleasas
2 1048698 Catioacuten divalente (MgCl2)
3 1048698 Desoxinucleoacutetidos (dNTPacutes)
4 1048698 Sol amortiguadora y sales (Buffer 10X)
5 1048698 Oligonucleoacutetidos (Primers)
6 1048698 Enzima termo-resistente (Ej Taq Polimerasa)
Para la polimerizacioacuten de ADN es necesario
Una polimerasa primers y nucleoacutetidos
Como se utiliza cambios de temperatura para
lograr la desnaturalizacioacuten y renaturalizacioacuten
de las hebras la enzima tiene que ser
resistente a cambios de temperatura
iquestQueacute elementos son necesarios para la
polimerizacioacuten in Vitro
Thermus aquaticus se
descubrioacute en el Parque
Yellowstone inicioacute el campo
de la biologiacutea de los
hipertermoacutefilos
Thermus aquaticus crece
a 70ordm grados (fuente de
la enzima taq polimerasa
usada en la PCR)
PCR
La taq polimerasa no es la uacutenica enzima usada en la
PCR Hay muchas maacutes
Ej PFU (enzima extraiacuteda de Pynococus Furioso)
PCR
TAQ PFU
No tiene actividad 3rsquo
exonucleasa Puede
copiar con errores
Tiene actividad 3rsquo
exonucleasa
Velocidad 2000
nucleoacutetidos min
Velocidad 500
nucleoacutetidos min
Complementariedad durante la hibridacioacuten
en la fase de alineamiento
Se unen zona donde la secuencia es
complementaria
Son disentildeados los primers esto permite
seleccionar que porcioacuten amplificar
PCR Primers
PCR
Ejemplos de utilizacioacuten PCR en diagnoacutestico
1 Colocando primers Fw diferentes (una para
secuencia normal y otra mutada) y mismo Rw
en el mismo tubo
2 Combinando la PCR con cortes con enzimas de
restriccioacuten (si se generase o perdiera algun sitio de
restriccioacuten por la misma mutacioacuten)
concepto Primers alelo especiacuteficos
El siguiente es el resultado en un gel de agarosa
En la calle (1) se sembroacute
el marcador de peso
molecular
En la calle (2) se sembroacute
una muestra conocida
para una mutacioacuten
homocigota
En la calle (3) se sembroacute
la muestra del paciente
El siguiente es el resultado en un gel de agarosa
En la calle (C1) muestra
conocida homocigota
gen mutado
En la calle (C2) muestra
conocida homocigota
gen normal
iquestQueacute resultados
dieron las
muestras 1 2 3 4
iquestQueacute elementos son necesarios para la
polimerizacioacuten in Vitro
Extraccioacuten del ADN molde
Preparado de la MIX
1 Agua libre de nucleasas
2 1048698 Catioacuten divalente (MgCl2)
3 1048698 Desoxinucleoacutetidos (dNTPacutes)
4 1048698 Sol amortiguadora y sales (Buffer 10X)
5 1048698 Oligonucleoacutetidos (Primers)
6 1048698 Enzima termo-resistente (Ej Taq Polimerasa)
Los iones de magnesio
estimulan a la enzima Taq Polimerasa
para que incorpore los dNTPacutes
Algunas aclaracioneshellip
Taq
Mg
Sol amortiguadora PCR
1048698 Mantiene el pH oacuteptimo para que la enzima actuacutee
1048698 Sales
Proporcionan la fuerza ioacutenica adecuada para una maacutexima actividad de la
enzima
Herramientas
POLIMERASA BACTERIANA que resista a los cambios Tordm
Estrategia
Utilizar cambios de temperatura para desnaturalizar y
renaturalizar las hebras de ADN complementario
PCR coacutemo ve el observador el proceso
MIX +
ADN
Soacutelo veremos Teacutecnicas Directas
bullSouthern Blot
bullPCR
bullSecuenciacioacuten
Secuenciacioacuten
Meacutetodo enzimaacutetico 1977
Frederick Sanger desarrolloacute esta teacutecnica
Meacutetodo de los terminadores de cadena o dideoxi
Fundamento
REPLICACION DEL ADN
COMPLEMENTARIEDAD DE BASES
Herramientas
Dideoxinucleotidos
Estrategia
Cuando se agrega un dideoxinucleotido
a la cadena en formacioacuten se
interrumpe la polimerizacioacuten
Secuenciacioacuten
H
P
O
OH
OH
HO
O
O
CH2
NH
N
N
N
Azuacutecar
Base
Fosfato
3rsquo
5rsquo
2rsquo
1rsquo4rsquo
Jeraacuterquico OH
del carbono 3
En la polimerizacioacuten
del ADN
H
P
O
OH
OH
HO
O
O
CH2
NH2
N
N N
N
Azuacutecar
Base
Fosfato
3rsquo
5rsquo
2rsquo
1rsquo4rsquo
H
2rsquo3rsquo-dideoxinucleoacutetido
monofosfato
H
P
O
OH
OH
HO
O
O
CH2
NH2
N
N N
N
Azuacutecar
Base
Fosfato
3rsquo
5rsquo
2rsquo
1rsquo4rsquo
deoxinucleotido
monofosfato
Secuenciacioacuten utiliza deoxinucleotidos
y dideoxinucleotidos
Cuando se incorpora un dideoxinucleoacutetido se
interrumpe la polimerizacioacuten
H
P
O
OH
OH
HO
O
O
CH2
NH2
N
N N
N
Azuacutecar
Base
Fosfato
3rsquo
5rsquo
2rsquo
1rsquo4rsquo
H
2rsquo3rsquo-dideoxinucleoacutetido
monofosfato
Se realizan 4 reacciones de siacutentesis (4 tubos
separados)
Se incluyen pequentildeas cantidades de
dideoxinucleotidos ddNTP que
compiten con los dNTP
En cada tubo se colocan
1 dNTP (4 tipos)
2 un solo tipo de ddNTP por tubo
3 primer o cebador marcado
4 ADN molde a secuenciar
5 Polimerasa
A ddNTP C ddNTP
G ddNTP T ddNTP
Los productos de las 4
reacciones cada una
conteniendo una pequentildea
cantidad de uno de los cuatro
dideoxinucleoacutetidos son
cargadas en el gel y sometidas
a electroforesis
Como la polimerizacioacuten es solo
en direccioacuten 5rsquo a 3rsquo los
fragmentos maacutes cortos estaraacuten
en 5rsquo y los maacutes largos que se
encontraraacuten en la direccioacuten 3rsquo
ddTTPddCTP ddGTPddATP
Lec
tura
5rsquo
a 3rsquo
des
de
la b
asa
al t
ope
Secuenciacioacuten Separacioacuten de fragmentos
Alternativa del meacutetodo Sanger
Se marca cebador con fluorescencia y se activa la reaccioacuten
Los productos se detectan durante electroforelectroforeacutesis al
pasar por un laacuteser que excita los fluorocromos y se detecta
fluorescencia emitida
Se realizan 4 reacciones de secuencia distintas
Se coloca el cebador marcado polimerasa dNTP y ddNTP
Al finalizar las cuatro reacciones se mezclan en uacutenico tubo
SECUENCIACION AUTOMATICA empleando
meacutetodo enzimaacutetico
hellip
Placa caliente
Pol
liacutequido
ATTGC A
Laser
Prisma
Detectores
-
+Ventana
Reaccioacuten
Secuencia
Capilar
iquestCoacutemo se ve el resultado
En el electroferograma se observa dos picos en
la posicioacuten 152 (C T)
A ndash A ndash T ndash G ndash G - T - C - C ndash A ndash N - T - T - G - G - C
A ndash A ndash T ndash G ndash G - T - C - T ndash A ndash N - T - T - G - G - C
Repeticiones en tandem
La variacioacuten en el nuacutemero de repeticiones de los
distintos mini y microsateacutelites es un polimorfismo
muy frecuente
Estos polimorfismos se generan por errores durante la
replicacioacuten
Dado que las repeticiones se encuentran en forma diploide
Cada uno de nosotros posee dos variantes para una repeticioacuten
determinada
VNTR (Nuacutemero variable de repeticiones en tandem) micro sateacutelites hipervariables
Obtencioacuten de DNA a partir de RNA
Rt-PCR Transcriptasareversa
iquestQueacute elementos son necesarios para la
polimerizacioacuten in Vitro
Extraccioacuten del ADN molde
Preparado de la MIX
1 Agua libre de nucleasas
2 1048698 Catioacuten divalente (MgCl2)
3 1048698 Desoxinucleoacutetidos (dNTPacutes)
4 1048698 Sol amortiguadora y sales (Buffer 10X)
5 1048698 Oligonucleoacutetidos (Primers)
6 1048698 Enzima termo-resistente (Ej Taq Polimerasa)
Para la polimerizacioacuten de ADN es necesario
Una polimerasa primers y nucleoacutetidos
Como se utiliza cambios de temperatura para
lograr la desnaturalizacioacuten y renaturalizacioacuten
de las hebras la enzima tiene que ser
resistente a cambios de temperatura
iquestQueacute elementos son necesarios para la
polimerizacioacuten in Vitro
Thermus aquaticus se
descubrioacute en el Parque
Yellowstone inicioacute el campo
de la biologiacutea de los
hipertermoacutefilos
Thermus aquaticus crece
a 70ordm grados (fuente de
la enzima taq polimerasa
usada en la PCR)
PCR
La taq polimerasa no es la uacutenica enzima usada en la
PCR Hay muchas maacutes
Ej PFU (enzima extraiacuteda de Pynococus Furioso)
PCR
TAQ PFU
No tiene actividad 3rsquo
exonucleasa Puede
copiar con errores
Tiene actividad 3rsquo
exonucleasa
Velocidad 2000
nucleoacutetidos min
Velocidad 500
nucleoacutetidos min
Complementariedad durante la hibridacioacuten
en la fase de alineamiento
Se unen zona donde la secuencia es
complementaria
Son disentildeados los primers esto permite
seleccionar que porcioacuten amplificar
PCR Primers
PCR
Ejemplos de utilizacioacuten PCR en diagnoacutestico
1 Colocando primers Fw diferentes (una para
secuencia normal y otra mutada) y mismo Rw
en el mismo tubo
2 Combinando la PCR con cortes con enzimas de
restriccioacuten (si se generase o perdiera algun sitio de
restriccioacuten por la misma mutacioacuten)
concepto Primers alelo especiacuteficos
El siguiente es el resultado en un gel de agarosa
En la calle (1) se sembroacute
el marcador de peso
molecular
En la calle (2) se sembroacute
una muestra conocida
para una mutacioacuten
homocigota
En la calle (3) se sembroacute
la muestra del paciente
El siguiente es el resultado en un gel de agarosa
En la calle (C1) muestra
conocida homocigota
gen mutado
En la calle (C2) muestra
conocida homocigota
gen normal
iquestQueacute resultados
dieron las
muestras 1 2 3 4
iquestQueacute elementos son necesarios para la
polimerizacioacuten in Vitro
Extraccioacuten del ADN molde
Preparado de la MIX
1 Agua libre de nucleasas
2 1048698 Catioacuten divalente (MgCl2)
3 1048698 Desoxinucleoacutetidos (dNTPacutes)
4 1048698 Sol amortiguadora y sales (Buffer 10X)
5 1048698 Oligonucleoacutetidos (Primers)
6 1048698 Enzima termo-resistente (Ej Taq Polimerasa)
Los iones de magnesio
estimulan a la enzima Taq Polimerasa
para que incorpore los dNTPacutes
Algunas aclaracioneshellip
Taq
Mg
Sol amortiguadora PCR
1048698 Mantiene el pH oacuteptimo para que la enzima actuacutee
1048698 Sales
Proporcionan la fuerza ioacutenica adecuada para una maacutexima actividad de la
enzima
Herramientas
POLIMERASA BACTERIANA que resista a los cambios Tordm
Estrategia
Utilizar cambios de temperatura para desnaturalizar y
renaturalizar las hebras de ADN complementario
PCR coacutemo ve el observador el proceso
MIX +
ADN
Soacutelo veremos Teacutecnicas Directas
bullSouthern Blot
bullPCR
bullSecuenciacioacuten
Secuenciacioacuten
Meacutetodo enzimaacutetico 1977
Frederick Sanger desarrolloacute esta teacutecnica
Meacutetodo de los terminadores de cadena o dideoxi
Fundamento
REPLICACION DEL ADN
COMPLEMENTARIEDAD DE BASES
Herramientas
Dideoxinucleotidos
Estrategia
Cuando se agrega un dideoxinucleotido
a la cadena en formacioacuten se
interrumpe la polimerizacioacuten
Secuenciacioacuten
H
P
O
OH
OH
HO
O
O
CH2
NH
N
N
N
Azuacutecar
Base
Fosfato
3rsquo
5rsquo
2rsquo
1rsquo4rsquo
Jeraacuterquico OH
del carbono 3
En la polimerizacioacuten
del ADN
H
P
O
OH
OH
HO
O
O
CH2
NH2
N
N N
N
Azuacutecar
Base
Fosfato
3rsquo
5rsquo
2rsquo
1rsquo4rsquo
H
2rsquo3rsquo-dideoxinucleoacutetido
monofosfato
H
P
O
OH
OH
HO
O
O
CH2
NH2
N
N N
N
Azuacutecar
Base
Fosfato
3rsquo
5rsquo
2rsquo
1rsquo4rsquo
deoxinucleotido
monofosfato
Secuenciacioacuten utiliza deoxinucleotidos
y dideoxinucleotidos
Cuando se incorpora un dideoxinucleoacutetido se
interrumpe la polimerizacioacuten
H
P
O
OH
OH
HO
O
O
CH2
NH2
N
N N
N
Azuacutecar
Base
Fosfato
3rsquo
5rsquo
2rsquo
1rsquo4rsquo
H
2rsquo3rsquo-dideoxinucleoacutetido
monofosfato
Se realizan 4 reacciones de siacutentesis (4 tubos
separados)
Se incluyen pequentildeas cantidades de
dideoxinucleotidos ddNTP que
compiten con los dNTP
En cada tubo se colocan
1 dNTP (4 tipos)
2 un solo tipo de ddNTP por tubo
3 primer o cebador marcado
4 ADN molde a secuenciar
5 Polimerasa
A ddNTP C ddNTP
G ddNTP T ddNTP
Los productos de las 4
reacciones cada una
conteniendo una pequentildea
cantidad de uno de los cuatro
dideoxinucleoacutetidos son
cargadas en el gel y sometidas
a electroforesis
Como la polimerizacioacuten es solo
en direccioacuten 5rsquo a 3rsquo los
fragmentos maacutes cortos estaraacuten
en 5rsquo y los maacutes largos que se
encontraraacuten en la direccioacuten 3rsquo
ddTTPddCTP ddGTPddATP
Lec
tura
5rsquo
a 3rsquo
des
de
la b
asa
al t
ope
Secuenciacioacuten Separacioacuten de fragmentos
Alternativa del meacutetodo Sanger
Se marca cebador con fluorescencia y se activa la reaccioacuten
Los productos se detectan durante electroforelectroforeacutesis al
pasar por un laacuteser que excita los fluorocromos y se detecta
fluorescencia emitida
Se realizan 4 reacciones de secuencia distintas
Se coloca el cebador marcado polimerasa dNTP y ddNTP
Al finalizar las cuatro reacciones se mezclan en uacutenico tubo
SECUENCIACION AUTOMATICA empleando
meacutetodo enzimaacutetico
hellip
Placa caliente
Pol
liacutequido
ATTGC A
Laser
Prisma
Detectores
-
+Ventana
Reaccioacuten
Secuencia
Capilar
iquestCoacutemo se ve el resultado
En el electroferograma se observa dos picos en
la posicioacuten 152 (C T)
A ndash A ndash T ndash G ndash G - T - C - C ndash A ndash N - T - T - G - G - C
A ndash A ndash T ndash G ndash G - T - C - T ndash A ndash N - T - T - G - G - C
Repeticiones en tandem
La variacioacuten en el nuacutemero de repeticiones de los
distintos mini y microsateacutelites es un polimorfismo
muy frecuente
Estos polimorfismos se generan por errores durante la
replicacioacuten
Dado que las repeticiones se encuentran en forma diploide
Cada uno de nosotros posee dos variantes para una repeticioacuten
determinada
VNTR (Nuacutemero variable de repeticiones en tandem) micro sateacutelites hipervariables
Obtencioacuten de DNA a partir de RNA
Rt-PCR Transcriptasareversa
Para la polimerizacioacuten de ADN es necesario
Una polimerasa primers y nucleoacutetidos
Como se utiliza cambios de temperatura para
lograr la desnaturalizacioacuten y renaturalizacioacuten
de las hebras la enzima tiene que ser
resistente a cambios de temperatura
iquestQueacute elementos son necesarios para la
polimerizacioacuten in Vitro
Thermus aquaticus se
descubrioacute en el Parque
Yellowstone inicioacute el campo
de la biologiacutea de los
hipertermoacutefilos
Thermus aquaticus crece
a 70ordm grados (fuente de
la enzima taq polimerasa
usada en la PCR)
PCR
La taq polimerasa no es la uacutenica enzima usada en la
PCR Hay muchas maacutes
Ej PFU (enzima extraiacuteda de Pynococus Furioso)
PCR
TAQ PFU
No tiene actividad 3rsquo
exonucleasa Puede
copiar con errores
Tiene actividad 3rsquo
exonucleasa
Velocidad 2000
nucleoacutetidos min
Velocidad 500
nucleoacutetidos min
Complementariedad durante la hibridacioacuten
en la fase de alineamiento
Se unen zona donde la secuencia es
complementaria
Son disentildeados los primers esto permite
seleccionar que porcioacuten amplificar
PCR Primers
PCR
Ejemplos de utilizacioacuten PCR en diagnoacutestico
1 Colocando primers Fw diferentes (una para
secuencia normal y otra mutada) y mismo Rw
en el mismo tubo
2 Combinando la PCR con cortes con enzimas de
restriccioacuten (si se generase o perdiera algun sitio de
restriccioacuten por la misma mutacioacuten)
concepto Primers alelo especiacuteficos
El siguiente es el resultado en un gel de agarosa
En la calle (1) se sembroacute
el marcador de peso
molecular
En la calle (2) se sembroacute
una muestra conocida
para una mutacioacuten
homocigota
En la calle (3) se sembroacute
la muestra del paciente
El siguiente es el resultado en un gel de agarosa
En la calle (C1) muestra
conocida homocigota
gen mutado
En la calle (C2) muestra
conocida homocigota
gen normal
iquestQueacute resultados
dieron las
muestras 1 2 3 4
iquestQueacute elementos son necesarios para la
polimerizacioacuten in Vitro
Extraccioacuten del ADN molde
Preparado de la MIX
1 Agua libre de nucleasas
2 1048698 Catioacuten divalente (MgCl2)
3 1048698 Desoxinucleoacutetidos (dNTPacutes)
4 1048698 Sol amortiguadora y sales (Buffer 10X)
5 1048698 Oligonucleoacutetidos (Primers)
6 1048698 Enzima termo-resistente (Ej Taq Polimerasa)
Los iones de magnesio
estimulan a la enzima Taq Polimerasa
para que incorpore los dNTPacutes
Algunas aclaracioneshellip
Taq
Mg
Sol amortiguadora PCR
1048698 Mantiene el pH oacuteptimo para que la enzima actuacutee
1048698 Sales
Proporcionan la fuerza ioacutenica adecuada para una maacutexima actividad de la
enzima
Herramientas
POLIMERASA BACTERIANA que resista a los cambios Tordm
Estrategia
Utilizar cambios de temperatura para desnaturalizar y
renaturalizar las hebras de ADN complementario
PCR coacutemo ve el observador el proceso
MIX +
ADN
Soacutelo veremos Teacutecnicas Directas
bullSouthern Blot
bullPCR
bullSecuenciacioacuten
Secuenciacioacuten
Meacutetodo enzimaacutetico 1977
Frederick Sanger desarrolloacute esta teacutecnica
Meacutetodo de los terminadores de cadena o dideoxi
Fundamento
REPLICACION DEL ADN
COMPLEMENTARIEDAD DE BASES
Herramientas
Dideoxinucleotidos
Estrategia
Cuando se agrega un dideoxinucleotido
a la cadena en formacioacuten se
interrumpe la polimerizacioacuten
Secuenciacioacuten
H
P
O
OH
OH
HO
O
O
CH2
NH
N
N
N
Azuacutecar
Base
Fosfato
3rsquo
5rsquo
2rsquo
1rsquo4rsquo
Jeraacuterquico OH
del carbono 3
En la polimerizacioacuten
del ADN
H
P
O
OH
OH
HO
O
O
CH2
NH2
N
N N
N
Azuacutecar
Base
Fosfato
3rsquo
5rsquo
2rsquo
1rsquo4rsquo
H
2rsquo3rsquo-dideoxinucleoacutetido
monofosfato
H
P
O
OH
OH
HO
O
O
CH2
NH2
N
N N
N
Azuacutecar
Base
Fosfato
3rsquo
5rsquo
2rsquo
1rsquo4rsquo
deoxinucleotido
monofosfato
Secuenciacioacuten utiliza deoxinucleotidos
y dideoxinucleotidos
Cuando se incorpora un dideoxinucleoacutetido se
interrumpe la polimerizacioacuten
H
P
O
OH
OH
HO
O
O
CH2
NH2
N
N N
N
Azuacutecar
Base
Fosfato
3rsquo
5rsquo
2rsquo
1rsquo4rsquo
H
2rsquo3rsquo-dideoxinucleoacutetido
monofosfato
Se realizan 4 reacciones de siacutentesis (4 tubos
separados)
Se incluyen pequentildeas cantidades de
dideoxinucleotidos ddNTP que
compiten con los dNTP
En cada tubo se colocan
1 dNTP (4 tipos)
2 un solo tipo de ddNTP por tubo
3 primer o cebador marcado
4 ADN molde a secuenciar
5 Polimerasa
A ddNTP C ddNTP
G ddNTP T ddNTP
Los productos de las 4
reacciones cada una
conteniendo una pequentildea
cantidad de uno de los cuatro
dideoxinucleoacutetidos son
cargadas en el gel y sometidas
a electroforesis
Como la polimerizacioacuten es solo
en direccioacuten 5rsquo a 3rsquo los
fragmentos maacutes cortos estaraacuten
en 5rsquo y los maacutes largos que se
encontraraacuten en la direccioacuten 3rsquo
ddTTPddCTP ddGTPddATP
Lec
tura
5rsquo
a 3rsquo
des
de
la b
asa
al t
ope
Secuenciacioacuten Separacioacuten de fragmentos
Alternativa del meacutetodo Sanger
Se marca cebador con fluorescencia y se activa la reaccioacuten
Los productos se detectan durante electroforelectroforeacutesis al
pasar por un laacuteser que excita los fluorocromos y se detecta
fluorescencia emitida
Se realizan 4 reacciones de secuencia distintas
Se coloca el cebador marcado polimerasa dNTP y ddNTP
Al finalizar las cuatro reacciones se mezclan en uacutenico tubo
SECUENCIACION AUTOMATICA empleando
meacutetodo enzimaacutetico
hellip
Placa caliente
Pol
liacutequido
ATTGC A
Laser
Prisma
Detectores
-
+Ventana
Reaccioacuten
Secuencia
Capilar
iquestCoacutemo se ve el resultado
En el electroferograma se observa dos picos en
la posicioacuten 152 (C T)
A ndash A ndash T ndash G ndash G - T - C - C ndash A ndash N - T - T - G - G - C
A ndash A ndash T ndash G ndash G - T - C - T ndash A ndash N - T - T - G - G - C
Repeticiones en tandem
La variacioacuten en el nuacutemero de repeticiones de los
distintos mini y microsateacutelites es un polimorfismo
muy frecuente
Estos polimorfismos se generan por errores durante la
replicacioacuten
Dado que las repeticiones se encuentran en forma diploide
Cada uno de nosotros posee dos variantes para una repeticioacuten
determinada
VNTR (Nuacutemero variable de repeticiones en tandem) micro sateacutelites hipervariables
Obtencioacuten de DNA a partir de RNA
Rt-PCR Transcriptasareversa
Thermus aquaticus se
descubrioacute en el Parque
Yellowstone inicioacute el campo
de la biologiacutea de los
hipertermoacutefilos
Thermus aquaticus crece
a 70ordm grados (fuente de
la enzima taq polimerasa
usada en la PCR)
PCR
La taq polimerasa no es la uacutenica enzima usada en la
PCR Hay muchas maacutes
Ej PFU (enzima extraiacuteda de Pynococus Furioso)
PCR
TAQ PFU
No tiene actividad 3rsquo
exonucleasa Puede
copiar con errores
Tiene actividad 3rsquo
exonucleasa
Velocidad 2000
nucleoacutetidos min
Velocidad 500
nucleoacutetidos min
Complementariedad durante la hibridacioacuten
en la fase de alineamiento
Se unen zona donde la secuencia es
complementaria
Son disentildeados los primers esto permite
seleccionar que porcioacuten amplificar
PCR Primers
PCR
Ejemplos de utilizacioacuten PCR en diagnoacutestico
1 Colocando primers Fw diferentes (una para
secuencia normal y otra mutada) y mismo Rw
en el mismo tubo
2 Combinando la PCR con cortes con enzimas de
restriccioacuten (si se generase o perdiera algun sitio de
restriccioacuten por la misma mutacioacuten)
concepto Primers alelo especiacuteficos
El siguiente es el resultado en un gel de agarosa
En la calle (1) se sembroacute
el marcador de peso
molecular
En la calle (2) se sembroacute
una muestra conocida
para una mutacioacuten
homocigota
En la calle (3) se sembroacute
la muestra del paciente
El siguiente es el resultado en un gel de agarosa
En la calle (C1) muestra
conocida homocigota
gen mutado
En la calle (C2) muestra
conocida homocigota
gen normal
iquestQueacute resultados
dieron las
muestras 1 2 3 4
iquestQueacute elementos son necesarios para la
polimerizacioacuten in Vitro
Extraccioacuten del ADN molde
Preparado de la MIX
1 Agua libre de nucleasas
2 1048698 Catioacuten divalente (MgCl2)
3 1048698 Desoxinucleoacutetidos (dNTPacutes)
4 1048698 Sol amortiguadora y sales (Buffer 10X)
5 1048698 Oligonucleoacutetidos (Primers)
6 1048698 Enzima termo-resistente (Ej Taq Polimerasa)
Los iones de magnesio
estimulan a la enzima Taq Polimerasa
para que incorpore los dNTPacutes
Algunas aclaracioneshellip
Taq
Mg
Sol amortiguadora PCR
1048698 Mantiene el pH oacuteptimo para que la enzima actuacutee
1048698 Sales
Proporcionan la fuerza ioacutenica adecuada para una maacutexima actividad de la
enzima
Herramientas
POLIMERASA BACTERIANA que resista a los cambios Tordm
Estrategia
Utilizar cambios de temperatura para desnaturalizar y
renaturalizar las hebras de ADN complementario
PCR coacutemo ve el observador el proceso
MIX +
ADN
Soacutelo veremos Teacutecnicas Directas
bullSouthern Blot
bullPCR
bullSecuenciacioacuten
Secuenciacioacuten
Meacutetodo enzimaacutetico 1977
Frederick Sanger desarrolloacute esta teacutecnica
Meacutetodo de los terminadores de cadena o dideoxi
Fundamento
REPLICACION DEL ADN
COMPLEMENTARIEDAD DE BASES
Herramientas
Dideoxinucleotidos
Estrategia
Cuando se agrega un dideoxinucleotido
a la cadena en formacioacuten se
interrumpe la polimerizacioacuten
Secuenciacioacuten
H
P
O
OH
OH
HO
O
O
CH2
NH
N
N
N
Azuacutecar
Base
Fosfato
3rsquo
5rsquo
2rsquo
1rsquo4rsquo
Jeraacuterquico OH
del carbono 3
En la polimerizacioacuten
del ADN
H
P
O
OH
OH
HO
O
O
CH2
NH2
N
N N
N
Azuacutecar
Base
Fosfato
3rsquo
5rsquo
2rsquo
1rsquo4rsquo
H
2rsquo3rsquo-dideoxinucleoacutetido
monofosfato
H
P
O
OH
OH
HO
O
O
CH2
NH2
N
N N
N
Azuacutecar
Base
Fosfato
3rsquo
5rsquo
2rsquo
1rsquo4rsquo
deoxinucleotido
monofosfato
Secuenciacioacuten utiliza deoxinucleotidos
y dideoxinucleotidos
Cuando se incorpora un dideoxinucleoacutetido se
interrumpe la polimerizacioacuten
H
P
O
OH
OH
HO
O
O
CH2
NH2
N
N N
N
Azuacutecar
Base
Fosfato
3rsquo
5rsquo
2rsquo
1rsquo4rsquo
H
2rsquo3rsquo-dideoxinucleoacutetido
monofosfato
Se realizan 4 reacciones de siacutentesis (4 tubos
separados)
Se incluyen pequentildeas cantidades de
dideoxinucleotidos ddNTP que
compiten con los dNTP
En cada tubo se colocan
1 dNTP (4 tipos)
2 un solo tipo de ddNTP por tubo
3 primer o cebador marcado
4 ADN molde a secuenciar
5 Polimerasa
A ddNTP C ddNTP
G ddNTP T ddNTP
Los productos de las 4
reacciones cada una
conteniendo una pequentildea
cantidad de uno de los cuatro
dideoxinucleoacutetidos son
cargadas en el gel y sometidas
a electroforesis
Como la polimerizacioacuten es solo
en direccioacuten 5rsquo a 3rsquo los
fragmentos maacutes cortos estaraacuten
en 5rsquo y los maacutes largos que se
encontraraacuten en la direccioacuten 3rsquo
ddTTPddCTP ddGTPddATP
Lec
tura
5rsquo
a 3rsquo
des
de
la b
asa
al t
ope
Secuenciacioacuten Separacioacuten de fragmentos
Alternativa del meacutetodo Sanger
Se marca cebador con fluorescencia y se activa la reaccioacuten
Los productos se detectan durante electroforelectroforeacutesis al
pasar por un laacuteser que excita los fluorocromos y se detecta
fluorescencia emitida
Se realizan 4 reacciones de secuencia distintas
Se coloca el cebador marcado polimerasa dNTP y ddNTP
Al finalizar las cuatro reacciones se mezclan en uacutenico tubo
SECUENCIACION AUTOMATICA empleando
meacutetodo enzimaacutetico
hellip
Placa caliente
Pol
liacutequido
ATTGC A
Laser
Prisma
Detectores
-
+Ventana
Reaccioacuten
Secuencia
Capilar
iquestCoacutemo se ve el resultado
En el electroferograma se observa dos picos en
la posicioacuten 152 (C T)
A ndash A ndash T ndash G ndash G - T - C - C ndash A ndash N - T - T - G - G - C
A ndash A ndash T ndash G ndash G - T - C - T ndash A ndash N - T - T - G - G - C
Repeticiones en tandem
La variacioacuten en el nuacutemero de repeticiones de los
distintos mini y microsateacutelites es un polimorfismo
muy frecuente
Estos polimorfismos se generan por errores durante la
replicacioacuten
Dado que las repeticiones se encuentran en forma diploide
Cada uno de nosotros posee dos variantes para una repeticioacuten
determinada
VNTR (Nuacutemero variable de repeticiones en tandem) micro sateacutelites hipervariables
Obtencioacuten de DNA a partir de RNA
Rt-PCR Transcriptasareversa
La taq polimerasa no es la uacutenica enzima usada en la
PCR Hay muchas maacutes
Ej PFU (enzima extraiacuteda de Pynococus Furioso)
PCR
TAQ PFU
No tiene actividad 3rsquo
exonucleasa Puede
copiar con errores
Tiene actividad 3rsquo
exonucleasa
Velocidad 2000
nucleoacutetidos min
Velocidad 500
nucleoacutetidos min
Complementariedad durante la hibridacioacuten
en la fase de alineamiento
Se unen zona donde la secuencia es
complementaria
Son disentildeados los primers esto permite
seleccionar que porcioacuten amplificar
PCR Primers
PCR
Ejemplos de utilizacioacuten PCR en diagnoacutestico
1 Colocando primers Fw diferentes (una para
secuencia normal y otra mutada) y mismo Rw
en el mismo tubo
2 Combinando la PCR con cortes con enzimas de
restriccioacuten (si se generase o perdiera algun sitio de
restriccioacuten por la misma mutacioacuten)
concepto Primers alelo especiacuteficos
El siguiente es el resultado en un gel de agarosa
En la calle (1) se sembroacute
el marcador de peso
molecular
En la calle (2) se sembroacute
una muestra conocida
para una mutacioacuten
homocigota
En la calle (3) se sembroacute
la muestra del paciente
El siguiente es el resultado en un gel de agarosa
En la calle (C1) muestra
conocida homocigota
gen mutado
En la calle (C2) muestra
conocida homocigota
gen normal
iquestQueacute resultados
dieron las
muestras 1 2 3 4
iquestQueacute elementos son necesarios para la
polimerizacioacuten in Vitro
Extraccioacuten del ADN molde
Preparado de la MIX
1 Agua libre de nucleasas
2 1048698 Catioacuten divalente (MgCl2)
3 1048698 Desoxinucleoacutetidos (dNTPacutes)
4 1048698 Sol amortiguadora y sales (Buffer 10X)
5 1048698 Oligonucleoacutetidos (Primers)
6 1048698 Enzima termo-resistente (Ej Taq Polimerasa)
Los iones de magnesio
estimulan a la enzima Taq Polimerasa
para que incorpore los dNTPacutes
Algunas aclaracioneshellip
Taq
Mg
Sol amortiguadora PCR
1048698 Mantiene el pH oacuteptimo para que la enzima actuacutee
1048698 Sales
Proporcionan la fuerza ioacutenica adecuada para una maacutexima actividad de la
enzima
Herramientas
POLIMERASA BACTERIANA que resista a los cambios Tordm
Estrategia
Utilizar cambios de temperatura para desnaturalizar y
renaturalizar las hebras de ADN complementario
PCR coacutemo ve el observador el proceso
MIX +
ADN
Soacutelo veremos Teacutecnicas Directas
bullSouthern Blot
bullPCR
bullSecuenciacioacuten
Secuenciacioacuten
Meacutetodo enzimaacutetico 1977
Frederick Sanger desarrolloacute esta teacutecnica
Meacutetodo de los terminadores de cadena o dideoxi
Fundamento
REPLICACION DEL ADN
COMPLEMENTARIEDAD DE BASES
Herramientas
Dideoxinucleotidos
Estrategia
Cuando se agrega un dideoxinucleotido
a la cadena en formacioacuten se
interrumpe la polimerizacioacuten
Secuenciacioacuten
H
P
O
OH
OH
HO
O
O
CH2
NH
N
N
N
Azuacutecar
Base
Fosfato
3rsquo
5rsquo
2rsquo
1rsquo4rsquo
Jeraacuterquico OH
del carbono 3
En la polimerizacioacuten
del ADN
H
P
O
OH
OH
HO
O
O
CH2
NH2
N
N N
N
Azuacutecar
Base
Fosfato
3rsquo
5rsquo
2rsquo
1rsquo4rsquo
H
2rsquo3rsquo-dideoxinucleoacutetido
monofosfato
H
P
O
OH
OH
HO
O
O
CH2
NH2
N
N N
N
Azuacutecar
Base
Fosfato
3rsquo
5rsquo
2rsquo
1rsquo4rsquo
deoxinucleotido
monofosfato
Secuenciacioacuten utiliza deoxinucleotidos
y dideoxinucleotidos
Cuando se incorpora un dideoxinucleoacutetido se
interrumpe la polimerizacioacuten
H
P
O
OH
OH
HO
O
O
CH2
NH2
N
N N
N
Azuacutecar
Base
Fosfato
3rsquo
5rsquo
2rsquo
1rsquo4rsquo
H
2rsquo3rsquo-dideoxinucleoacutetido
monofosfato
Se realizan 4 reacciones de siacutentesis (4 tubos
separados)
Se incluyen pequentildeas cantidades de
dideoxinucleotidos ddNTP que
compiten con los dNTP
En cada tubo se colocan
1 dNTP (4 tipos)
2 un solo tipo de ddNTP por tubo
3 primer o cebador marcado
4 ADN molde a secuenciar
5 Polimerasa
A ddNTP C ddNTP
G ddNTP T ddNTP
Los productos de las 4
reacciones cada una
conteniendo una pequentildea
cantidad de uno de los cuatro
dideoxinucleoacutetidos son
cargadas en el gel y sometidas
a electroforesis
Como la polimerizacioacuten es solo
en direccioacuten 5rsquo a 3rsquo los
fragmentos maacutes cortos estaraacuten
en 5rsquo y los maacutes largos que se
encontraraacuten en la direccioacuten 3rsquo
ddTTPddCTP ddGTPddATP
Lec
tura
5rsquo
a 3rsquo
des
de
la b
asa
al t
ope
Secuenciacioacuten Separacioacuten de fragmentos
Alternativa del meacutetodo Sanger
Se marca cebador con fluorescencia y se activa la reaccioacuten
Los productos se detectan durante electroforelectroforeacutesis al
pasar por un laacuteser que excita los fluorocromos y se detecta
fluorescencia emitida
Se realizan 4 reacciones de secuencia distintas
Se coloca el cebador marcado polimerasa dNTP y ddNTP
Al finalizar las cuatro reacciones se mezclan en uacutenico tubo
SECUENCIACION AUTOMATICA empleando
meacutetodo enzimaacutetico
hellip
Placa caliente
Pol
liacutequido
ATTGC A
Laser
Prisma
Detectores
-
+Ventana
Reaccioacuten
Secuencia
Capilar
iquestCoacutemo se ve el resultado
En el electroferograma se observa dos picos en
la posicioacuten 152 (C T)
A ndash A ndash T ndash G ndash G - T - C - C ndash A ndash N - T - T - G - G - C
A ndash A ndash T ndash G ndash G - T - C - T ndash A ndash N - T - T - G - G - C
Repeticiones en tandem
La variacioacuten en el nuacutemero de repeticiones de los
distintos mini y microsateacutelites es un polimorfismo
muy frecuente
Estos polimorfismos se generan por errores durante la
replicacioacuten
Dado que las repeticiones se encuentran en forma diploide
Cada uno de nosotros posee dos variantes para una repeticioacuten
determinada
VNTR (Nuacutemero variable de repeticiones en tandem) micro sateacutelites hipervariables
Obtencioacuten de DNA a partir de RNA
Rt-PCR Transcriptasareversa
Complementariedad durante la hibridacioacuten
en la fase de alineamiento
Se unen zona donde la secuencia es
complementaria
Son disentildeados los primers esto permite
seleccionar que porcioacuten amplificar
PCR Primers
PCR
Ejemplos de utilizacioacuten PCR en diagnoacutestico
1 Colocando primers Fw diferentes (una para
secuencia normal y otra mutada) y mismo Rw
en el mismo tubo
2 Combinando la PCR con cortes con enzimas de
restriccioacuten (si se generase o perdiera algun sitio de
restriccioacuten por la misma mutacioacuten)
concepto Primers alelo especiacuteficos
El siguiente es el resultado en un gel de agarosa
En la calle (1) se sembroacute
el marcador de peso
molecular
En la calle (2) se sembroacute
una muestra conocida
para una mutacioacuten
homocigota
En la calle (3) se sembroacute
la muestra del paciente
El siguiente es el resultado en un gel de agarosa
En la calle (C1) muestra
conocida homocigota
gen mutado
En la calle (C2) muestra
conocida homocigota
gen normal
iquestQueacute resultados
dieron las
muestras 1 2 3 4
iquestQueacute elementos son necesarios para la
polimerizacioacuten in Vitro
Extraccioacuten del ADN molde
Preparado de la MIX
1 Agua libre de nucleasas
2 1048698 Catioacuten divalente (MgCl2)
3 1048698 Desoxinucleoacutetidos (dNTPacutes)
4 1048698 Sol amortiguadora y sales (Buffer 10X)
5 1048698 Oligonucleoacutetidos (Primers)
6 1048698 Enzima termo-resistente (Ej Taq Polimerasa)
Los iones de magnesio
estimulan a la enzima Taq Polimerasa
para que incorpore los dNTPacutes
Algunas aclaracioneshellip
Taq
Mg
Sol amortiguadora PCR
1048698 Mantiene el pH oacuteptimo para que la enzima actuacutee
1048698 Sales
Proporcionan la fuerza ioacutenica adecuada para una maacutexima actividad de la
enzima
Herramientas
POLIMERASA BACTERIANA que resista a los cambios Tordm
Estrategia
Utilizar cambios de temperatura para desnaturalizar y
renaturalizar las hebras de ADN complementario
PCR coacutemo ve el observador el proceso
MIX +
ADN
Soacutelo veremos Teacutecnicas Directas
bullSouthern Blot
bullPCR
bullSecuenciacioacuten
Secuenciacioacuten
Meacutetodo enzimaacutetico 1977
Frederick Sanger desarrolloacute esta teacutecnica
Meacutetodo de los terminadores de cadena o dideoxi
Fundamento
REPLICACION DEL ADN
COMPLEMENTARIEDAD DE BASES
Herramientas
Dideoxinucleotidos
Estrategia
Cuando se agrega un dideoxinucleotido
a la cadena en formacioacuten se
interrumpe la polimerizacioacuten
Secuenciacioacuten
H
P
O
OH
OH
HO
O
O
CH2
NH
N
N
N
Azuacutecar
Base
Fosfato
3rsquo
5rsquo
2rsquo
1rsquo4rsquo
Jeraacuterquico OH
del carbono 3
En la polimerizacioacuten
del ADN
H
P
O
OH
OH
HO
O
O
CH2
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N
N N
N
Azuacutecar
Base
Fosfato
3rsquo
5rsquo
2rsquo
1rsquo4rsquo
H
2rsquo3rsquo-dideoxinucleoacutetido
monofosfato
H
P
O
OH
OH
HO
O
O
CH2
NH2
N
N N
N
Azuacutecar
Base
Fosfato
3rsquo
5rsquo
2rsquo
1rsquo4rsquo
deoxinucleotido
monofosfato
Secuenciacioacuten utiliza deoxinucleotidos
y dideoxinucleotidos
Cuando se incorpora un dideoxinucleoacutetido se
interrumpe la polimerizacioacuten
H
P
O
OH
OH
HO
O
O
CH2
NH2
N
N N
N
Azuacutecar
Base
Fosfato
3rsquo
5rsquo
2rsquo
1rsquo4rsquo
H
2rsquo3rsquo-dideoxinucleoacutetido
monofosfato
Se realizan 4 reacciones de siacutentesis (4 tubos
separados)
Se incluyen pequentildeas cantidades de
dideoxinucleotidos ddNTP que
compiten con los dNTP
En cada tubo se colocan
1 dNTP (4 tipos)
2 un solo tipo de ddNTP por tubo
3 primer o cebador marcado
4 ADN molde a secuenciar
5 Polimerasa
A ddNTP C ddNTP
G ddNTP T ddNTP
Los productos de las 4
reacciones cada una
conteniendo una pequentildea
cantidad de uno de los cuatro
dideoxinucleoacutetidos son
cargadas en el gel y sometidas
a electroforesis
Como la polimerizacioacuten es solo
en direccioacuten 5rsquo a 3rsquo los
fragmentos maacutes cortos estaraacuten
en 5rsquo y los maacutes largos que se
encontraraacuten en la direccioacuten 3rsquo
ddTTPddCTP ddGTPddATP
Lec
tura
5rsquo
a 3rsquo
des
de
la b
asa
al t
ope
Secuenciacioacuten Separacioacuten de fragmentos
Alternativa del meacutetodo Sanger
Se marca cebador con fluorescencia y se activa la reaccioacuten
Los productos se detectan durante electroforelectroforeacutesis al
pasar por un laacuteser que excita los fluorocromos y se detecta
fluorescencia emitida
Se realizan 4 reacciones de secuencia distintas
Se coloca el cebador marcado polimerasa dNTP y ddNTP
Al finalizar las cuatro reacciones se mezclan en uacutenico tubo
SECUENCIACION AUTOMATICA empleando
meacutetodo enzimaacutetico
hellip
Placa caliente
Pol
liacutequido
ATTGC A
Laser
Prisma
Detectores
-
+Ventana
Reaccioacuten
Secuencia
Capilar
iquestCoacutemo se ve el resultado
En el electroferograma se observa dos picos en
la posicioacuten 152 (C T)
A ndash A ndash T ndash G ndash G - T - C - C ndash A ndash N - T - T - G - G - C
A ndash A ndash T ndash G ndash G - T - C - T ndash A ndash N - T - T - G - G - C
Repeticiones en tandem
La variacioacuten en el nuacutemero de repeticiones de los
distintos mini y microsateacutelites es un polimorfismo
muy frecuente
Estos polimorfismos se generan por errores durante la
replicacioacuten
Dado que las repeticiones se encuentran en forma diploide
Cada uno de nosotros posee dos variantes para una repeticioacuten
determinada
VNTR (Nuacutemero variable de repeticiones en tandem) micro sateacutelites hipervariables
Obtencioacuten de DNA a partir de RNA
Rt-PCR Transcriptasareversa
PCR
Ejemplos de utilizacioacuten PCR en diagnoacutestico
1 Colocando primers Fw diferentes (una para
secuencia normal y otra mutada) y mismo Rw
en el mismo tubo
2 Combinando la PCR con cortes con enzimas de
restriccioacuten (si se generase o perdiera algun sitio de
restriccioacuten por la misma mutacioacuten)
concepto Primers alelo especiacuteficos
El siguiente es el resultado en un gel de agarosa
En la calle (1) se sembroacute
el marcador de peso
molecular
En la calle (2) se sembroacute
una muestra conocida
para una mutacioacuten
homocigota
En la calle (3) se sembroacute
la muestra del paciente
El siguiente es el resultado en un gel de agarosa
En la calle (C1) muestra
conocida homocigota
gen mutado
En la calle (C2) muestra
conocida homocigota
gen normal
iquestQueacute resultados
dieron las
muestras 1 2 3 4
iquestQueacute elementos son necesarios para la
polimerizacioacuten in Vitro
Extraccioacuten del ADN molde
Preparado de la MIX
1 Agua libre de nucleasas
2 1048698 Catioacuten divalente (MgCl2)
3 1048698 Desoxinucleoacutetidos (dNTPacutes)
4 1048698 Sol amortiguadora y sales (Buffer 10X)
5 1048698 Oligonucleoacutetidos (Primers)
6 1048698 Enzima termo-resistente (Ej Taq Polimerasa)
Los iones de magnesio
estimulan a la enzima Taq Polimerasa
para que incorpore los dNTPacutes
Algunas aclaracioneshellip
Taq
Mg
Sol amortiguadora PCR
1048698 Mantiene el pH oacuteptimo para que la enzima actuacutee
1048698 Sales
Proporcionan la fuerza ioacutenica adecuada para una maacutexima actividad de la
enzima
Herramientas
POLIMERASA BACTERIANA que resista a los cambios Tordm
Estrategia
Utilizar cambios de temperatura para desnaturalizar y
renaturalizar las hebras de ADN complementario
PCR coacutemo ve el observador el proceso
MIX +
ADN
Soacutelo veremos Teacutecnicas Directas
bullSouthern Blot
bullPCR
bullSecuenciacioacuten
Secuenciacioacuten
Meacutetodo enzimaacutetico 1977
Frederick Sanger desarrolloacute esta teacutecnica
Meacutetodo de los terminadores de cadena o dideoxi
Fundamento
REPLICACION DEL ADN
COMPLEMENTARIEDAD DE BASES
Herramientas
Dideoxinucleotidos
Estrategia
Cuando se agrega un dideoxinucleotido
a la cadena en formacioacuten se
interrumpe la polimerizacioacuten
Secuenciacioacuten
H
P
O
OH
OH
HO
O
O
CH2
NH
N
N
N
Azuacutecar
Base
Fosfato
3rsquo
5rsquo
2rsquo
1rsquo4rsquo
Jeraacuterquico OH
del carbono 3
En la polimerizacioacuten
del ADN
H
P
O
OH
OH
HO
O
O
CH2
NH2
N
N N
N
Azuacutecar
Base
Fosfato
3rsquo
5rsquo
2rsquo
1rsquo4rsquo
H
2rsquo3rsquo-dideoxinucleoacutetido
monofosfato
H
P
O
OH
OH
HO
O
O
CH2
NH2
N
N N
N
Azuacutecar
Base
Fosfato
3rsquo
5rsquo
2rsquo
1rsquo4rsquo
deoxinucleotido
monofosfato
Secuenciacioacuten utiliza deoxinucleotidos
y dideoxinucleotidos
Cuando se incorpora un dideoxinucleoacutetido se
interrumpe la polimerizacioacuten
H
P
O
OH
OH
HO
O
O
CH2
NH2
N
N N
N
Azuacutecar
Base
Fosfato
3rsquo
5rsquo
2rsquo
1rsquo4rsquo
H
2rsquo3rsquo-dideoxinucleoacutetido
monofosfato
Se realizan 4 reacciones de siacutentesis (4 tubos
separados)
Se incluyen pequentildeas cantidades de
dideoxinucleotidos ddNTP que
compiten con los dNTP
En cada tubo se colocan
1 dNTP (4 tipos)
2 un solo tipo de ddNTP por tubo
3 primer o cebador marcado
4 ADN molde a secuenciar
5 Polimerasa
A ddNTP C ddNTP
G ddNTP T ddNTP
Los productos de las 4
reacciones cada una
conteniendo una pequentildea
cantidad de uno de los cuatro
dideoxinucleoacutetidos son
cargadas en el gel y sometidas
a electroforesis
Como la polimerizacioacuten es solo
en direccioacuten 5rsquo a 3rsquo los
fragmentos maacutes cortos estaraacuten
en 5rsquo y los maacutes largos que se
encontraraacuten en la direccioacuten 3rsquo
ddTTPddCTP ddGTPddATP
Lec
tura
5rsquo
a 3rsquo
des
de
la b
asa
al t
ope
Secuenciacioacuten Separacioacuten de fragmentos
Alternativa del meacutetodo Sanger
Se marca cebador con fluorescencia y se activa la reaccioacuten
Los productos se detectan durante electroforelectroforeacutesis al
pasar por un laacuteser que excita los fluorocromos y se detecta
fluorescencia emitida
Se realizan 4 reacciones de secuencia distintas
Se coloca el cebador marcado polimerasa dNTP y ddNTP
Al finalizar las cuatro reacciones se mezclan en uacutenico tubo
SECUENCIACION AUTOMATICA empleando
meacutetodo enzimaacutetico
hellip
Placa caliente
Pol
liacutequido
ATTGC A
Laser
Prisma
Detectores
-
+Ventana
Reaccioacuten
Secuencia
Capilar
iquestCoacutemo se ve el resultado
En el electroferograma se observa dos picos en
la posicioacuten 152 (C T)
A ndash A ndash T ndash G ndash G - T - C - C ndash A ndash N - T - T - G - G - C
A ndash A ndash T ndash G ndash G - T - C - T ndash A ndash N - T - T - G - G - C
Repeticiones en tandem
La variacioacuten en el nuacutemero de repeticiones de los
distintos mini y microsateacutelites es un polimorfismo
muy frecuente
Estos polimorfismos se generan por errores durante la
replicacioacuten
Dado que las repeticiones se encuentran en forma diploide
Cada uno de nosotros posee dos variantes para una repeticioacuten
determinada
VNTR (Nuacutemero variable de repeticiones en tandem) micro sateacutelites hipervariables
Obtencioacuten de DNA a partir de RNA
Rt-PCR Transcriptasareversa
El siguiente es el resultado en un gel de agarosa
En la calle (1) se sembroacute
el marcador de peso
molecular
En la calle (2) se sembroacute
una muestra conocida
para una mutacioacuten
homocigota
En la calle (3) se sembroacute
la muestra del paciente
El siguiente es el resultado en un gel de agarosa
En la calle (C1) muestra
conocida homocigota
gen mutado
En la calle (C2) muestra
conocida homocigota
gen normal
iquestQueacute resultados
dieron las
muestras 1 2 3 4
iquestQueacute elementos son necesarios para la
polimerizacioacuten in Vitro
Extraccioacuten del ADN molde
Preparado de la MIX
1 Agua libre de nucleasas
2 1048698 Catioacuten divalente (MgCl2)
3 1048698 Desoxinucleoacutetidos (dNTPacutes)
4 1048698 Sol amortiguadora y sales (Buffer 10X)
5 1048698 Oligonucleoacutetidos (Primers)
6 1048698 Enzima termo-resistente (Ej Taq Polimerasa)
Los iones de magnesio
estimulan a la enzima Taq Polimerasa
para que incorpore los dNTPacutes
Algunas aclaracioneshellip
Taq
Mg
Sol amortiguadora PCR
1048698 Mantiene el pH oacuteptimo para que la enzima actuacutee
1048698 Sales
Proporcionan la fuerza ioacutenica adecuada para una maacutexima actividad de la
enzima
Herramientas
POLIMERASA BACTERIANA que resista a los cambios Tordm
Estrategia
Utilizar cambios de temperatura para desnaturalizar y
renaturalizar las hebras de ADN complementario
PCR coacutemo ve el observador el proceso
MIX +
ADN
Soacutelo veremos Teacutecnicas Directas
bullSouthern Blot
bullPCR
bullSecuenciacioacuten
Secuenciacioacuten
Meacutetodo enzimaacutetico 1977
Frederick Sanger desarrolloacute esta teacutecnica
Meacutetodo de los terminadores de cadena o dideoxi
Fundamento
REPLICACION DEL ADN
COMPLEMENTARIEDAD DE BASES
Herramientas
Dideoxinucleotidos
Estrategia
Cuando se agrega un dideoxinucleotido
a la cadena en formacioacuten se
interrumpe la polimerizacioacuten
Secuenciacioacuten
H
P
O
OH
OH
HO
O
O
CH2
NH
N
N
N
Azuacutecar
Base
Fosfato
3rsquo
5rsquo
2rsquo
1rsquo4rsquo
Jeraacuterquico OH
del carbono 3
En la polimerizacioacuten
del ADN
H
P
O
OH
OH
HO
O
O
CH2
NH2
N
N N
N
Azuacutecar
Base
Fosfato
3rsquo
5rsquo
2rsquo
1rsquo4rsquo
H
2rsquo3rsquo-dideoxinucleoacutetido
monofosfato
H
P
O
OH
OH
HO
O
O
CH2
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N N
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Azuacutecar
Base
Fosfato
3rsquo
5rsquo
2rsquo
1rsquo4rsquo
deoxinucleotido
monofosfato
Secuenciacioacuten utiliza deoxinucleotidos
y dideoxinucleotidos
Cuando se incorpora un dideoxinucleoacutetido se
interrumpe la polimerizacioacuten
H
P
O
OH
OH
HO
O
O
CH2
NH2
N
N N
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Azuacutecar
Base
Fosfato
3rsquo
5rsquo
2rsquo
1rsquo4rsquo
H
2rsquo3rsquo-dideoxinucleoacutetido
monofosfato
Se realizan 4 reacciones de siacutentesis (4 tubos
separados)
Se incluyen pequentildeas cantidades de
dideoxinucleotidos ddNTP que
compiten con los dNTP
En cada tubo se colocan
1 dNTP (4 tipos)
2 un solo tipo de ddNTP por tubo
3 primer o cebador marcado
4 ADN molde a secuenciar
5 Polimerasa
A ddNTP C ddNTP
G ddNTP T ddNTP
Los productos de las 4
reacciones cada una
conteniendo una pequentildea
cantidad de uno de los cuatro
dideoxinucleoacutetidos son
cargadas en el gel y sometidas
a electroforesis
Como la polimerizacioacuten es solo
en direccioacuten 5rsquo a 3rsquo los
fragmentos maacutes cortos estaraacuten
en 5rsquo y los maacutes largos que se
encontraraacuten en la direccioacuten 3rsquo
ddTTPddCTP ddGTPddATP
Lec
tura
5rsquo
a 3rsquo
des
de
la b
asa
al t
ope
Secuenciacioacuten Separacioacuten de fragmentos
Alternativa del meacutetodo Sanger
Se marca cebador con fluorescencia y se activa la reaccioacuten
Los productos se detectan durante electroforelectroforeacutesis al
pasar por un laacuteser que excita los fluorocromos y se detecta
fluorescencia emitida
Se realizan 4 reacciones de secuencia distintas
Se coloca el cebador marcado polimerasa dNTP y ddNTP
Al finalizar las cuatro reacciones se mezclan en uacutenico tubo
SECUENCIACION AUTOMATICA empleando
meacutetodo enzimaacutetico
hellip
Placa caliente
Pol
liacutequido
ATTGC A
Laser
Prisma
Detectores
-
+Ventana
Reaccioacuten
Secuencia
Capilar
iquestCoacutemo se ve el resultado
En el electroferograma se observa dos picos en
la posicioacuten 152 (C T)
A ndash A ndash T ndash G ndash G - T - C - C ndash A ndash N - T - T - G - G - C
A ndash A ndash T ndash G ndash G - T - C - T ndash A ndash N - T - T - G - G - C
Repeticiones en tandem
La variacioacuten en el nuacutemero de repeticiones de los
distintos mini y microsateacutelites es un polimorfismo
muy frecuente
Estos polimorfismos se generan por errores durante la
replicacioacuten
Dado que las repeticiones se encuentran en forma diploide
Cada uno de nosotros posee dos variantes para una repeticioacuten
determinada
VNTR (Nuacutemero variable de repeticiones en tandem) micro sateacutelites hipervariables
Obtencioacuten de DNA a partir de RNA
Rt-PCR Transcriptasareversa
El siguiente es el resultado en un gel de agarosa
En la calle (C1) muestra
conocida homocigota
gen mutado
En la calle (C2) muestra
conocida homocigota
gen normal
iquestQueacute resultados
dieron las
muestras 1 2 3 4
iquestQueacute elementos son necesarios para la
polimerizacioacuten in Vitro
Extraccioacuten del ADN molde
Preparado de la MIX
1 Agua libre de nucleasas
2 1048698 Catioacuten divalente (MgCl2)
3 1048698 Desoxinucleoacutetidos (dNTPacutes)
4 1048698 Sol amortiguadora y sales (Buffer 10X)
5 1048698 Oligonucleoacutetidos (Primers)
6 1048698 Enzima termo-resistente (Ej Taq Polimerasa)
Los iones de magnesio
estimulan a la enzima Taq Polimerasa
para que incorpore los dNTPacutes
Algunas aclaracioneshellip
Taq
Mg
Sol amortiguadora PCR
1048698 Mantiene el pH oacuteptimo para que la enzima actuacutee
1048698 Sales
Proporcionan la fuerza ioacutenica adecuada para una maacutexima actividad de la
enzima
Herramientas
POLIMERASA BACTERIANA que resista a los cambios Tordm
Estrategia
Utilizar cambios de temperatura para desnaturalizar y
renaturalizar las hebras de ADN complementario
PCR coacutemo ve el observador el proceso
MIX +
ADN
Soacutelo veremos Teacutecnicas Directas
bullSouthern Blot
bullPCR
bullSecuenciacioacuten
Secuenciacioacuten
Meacutetodo enzimaacutetico 1977
Frederick Sanger desarrolloacute esta teacutecnica
Meacutetodo de los terminadores de cadena o dideoxi
Fundamento
REPLICACION DEL ADN
COMPLEMENTARIEDAD DE BASES
Herramientas
Dideoxinucleotidos
Estrategia
Cuando se agrega un dideoxinucleotido
a la cadena en formacioacuten se
interrumpe la polimerizacioacuten
Secuenciacioacuten
H
P
O
OH
OH
HO
O
O
CH2
NH
N
N
N
Azuacutecar
Base
Fosfato
3rsquo
5rsquo
2rsquo
1rsquo4rsquo
Jeraacuterquico OH
del carbono 3
En la polimerizacioacuten
del ADN
H
P
O
OH
OH
HO
O
O
CH2
NH2
N
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N
Azuacutecar
Base
Fosfato
3rsquo
5rsquo
2rsquo
1rsquo4rsquo
H
2rsquo3rsquo-dideoxinucleoacutetido
monofosfato
H
P
O
OH
OH
HO
O
O
CH2
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N
N N
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Azuacutecar
Base
Fosfato
3rsquo
5rsquo
2rsquo
1rsquo4rsquo
deoxinucleotido
monofosfato
Secuenciacioacuten utiliza deoxinucleotidos
y dideoxinucleotidos
Cuando se incorpora un dideoxinucleoacutetido se
interrumpe la polimerizacioacuten
H
P
O
OH
OH
HO
O
O
CH2
NH2
N
N N
N
Azuacutecar
Base
Fosfato
3rsquo
5rsquo
2rsquo
1rsquo4rsquo
H
2rsquo3rsquo-dideoxinucleoacutetido
monofosfato
Se realizan 4 reacciones de siacutentesis (4 tubos
separados)
Se incluyen pequentildeas cantidades de
dideoxinucleotidos ddNTP que
compiten con los dNTP
En cada tubo se colocan
1 dNTP (4 tipos)
2 un solo tipo de ddNTP por tubo
3 primer o cebador marcado
4 ADN molde a secuenciar
5 Polimerasa
A ddNTP C ddNTP
G ddNTP T ddNTP
Los productos de las 4
reacciones cada una
conteniendo una pequentildea
cantidad de uno de los cuatro
dideoxinucleoacutetidos son
cargadas en el gel y sometidas
a electroforesis
Como la polimerizacioacuten es solo
en direccioacuten 5rsquo a 3rsquo los
fragmentos maacutes cortos estaraacuten
en 5rsquo y los maacutes largos que se
encontraraacuten en la direccioacuten 3rsquo
ddTTPddCTP ddGTPddATP
Lec
tura
5rsquo
a 3rsquo
des
de
la b
asa
al t
ope
Secuenciacioacuten Separacioacuten de fragmentos
Alternativa del meacutetodo Sanger
Se marca cebador con fluorescencia y se activa la reaccioacuten
Los productos se detectan durante electroforelectroforeacutesis al
pasar por un laacuteser que excita los fluorocromos y se detecta
fluorescencia emitida
Se realizan 4 reacciones de secuencia distintas
Se coloca el cebador marcado polimerasa dNTP y ddNTP
Al finalizar las cuatro reacciones se mezclan en uacutenico tubo
SECUENCIACION AUTOMATICA empleando
meacutetodo enzimaacutetico
hellip
Placa caliente
Pol
liacutequido
ATTGC A
Laser
Prisma
Detectores
-
+Ventana
Reaccioacuten
Secuencia
Capilar
iquestCoacutemo se ve el resultado
En el electroferograma se observa dos picos en
la posicioacuten 152 (C T)
A ndash A ndash T ndash G ndash G - T - C - C ndash A ndash N - T - T - G - G - C
A ndash A ndash T ndash G ndash G - T - C - T ndash A ndash N - T - T - G - G - C
Repeticiones en tandem
La variacioacuten en el nuacutemero de repeticiones de los
distintos mini y microsateacutelites es un polimorfismo
muy frecuente
Estos polimorfismos se generan por errores durante la
replicacioacuten
Dado que las repeticiones se encuentran en forma diploide
Cada uno de nosotros posee dos variantes para una repeticioacuten
determinada
VNTR (Nuacutemero variable de repeticiones en tandem) micro sateacutelites hipervariables
Obtencioacuten de DNA a partir de RNA
Rt-PCR Transcriptasareversa
iquestQueacute elementos son necesarios para la
polimerizacioacuten in Vitro
Extraccioacuten del ADN molde
Preparado de la MIX
1 Agua libre de nucleasas
2 1048698 Catioacuten divalente (MgCl2)
3 1048698 Desoxinucleoacutetidos (dNTPacutes)
4 1048698 Sol amortiguadora y sales (Buffer 10X)
5 1048698 Oligonucleoacutetidos (Primers)
6 1048698 Enzima termo-resistente (Ej Taq Polimerasa)
Los iones de magnesio
estimulan a la enzima Taq Polimerasa
para que incorpore los dNTPacutes
Algunas aclaracioneshellip
Taq
Mg
Sol amortiguadora PCR
1048698 Mantiene el pH oacuteptimo para que la enzima actuacutee
1048698 Sales
Proporcionan la fuerza ioacutenica adecuada para una maacutexima actividad de la
enzima
Herramientas
POLIMERASA BACTERIANA que resista a los cambios Tordm
Estrategia
Utilizar cambios de temperatura para desnaturalizar y
renaturalizar las hebras de ADN complementario
PCR coacutemo ve el observador el proceso
MIX +
ADN
Soacutelo veremos Teacutecnicas Directas
bullSouthern Blot
bullPCR
bullSecuenciacioacuten
Secuenciacioacuten
Meacutetodo enzimaacutetico 1977
Frederick Sanger desarrolloacute esta teacutecnica
Meacutetodo de los terminadores de cadena o dideoxi
Fundamento
REPLICACION DEL ADN
COMPLEMENTARIEDAD DE BASES
Herramientas
Dideoxinucleotidos
Estrategia
Cuando se agrega un dideoxinucleotido
a la cadena en formacioacuten se
interrumpe la polimerizacioacuten
Secuenciacioacuten
H
P
O
OH
OH
HO
O
O
CH2
NH
N
N
N
Azuacutecar
Base
Fosfato
3rsquo
5rsquo
2rsquo
1rsquo4rsquo
Jeraacuterquico OH
del carbono 3
En la polimerizacioacuten
del ADN
H
P
O
OH
OH
HO
O
O
CH2
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N
Azuacutecar
Base
Fosfato
3rsquo
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2rsquo
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H
2rsquo3rsquo-dideoxinucleoacutetido
monofosfato
H
P
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OH
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HO
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Azuacutecar
Base
Fosfato
3rsquo
5rsquo
2rsquo
1rsquo4rsquo
deoxinucleotido
monofosfato
Secuenciacioacuten utiliza deoxinucleotidos
y dideoxinucleotidos
Cuando se incorpora un dideoxinucleoacutetido se
interrumpe la polimerizacioacuten
H
P
O
OH
OH
HO
O
O
CH2
NH2
N
N N
N
Azuacutecar
Base
Fosfato
3rsquo
5rsquo
2rsquo
1rsquo4rsquo
H
2rsquo3rsquo-dideoxinucleoacutetido
monofosfato
Se realizan 4 reacciones de siacutentesis (4 tubos
separados)
Se incluyen pequentildeas cantidades de
dideoxinucleotidos ddNTP que
compiten con los dNTP
En cada tubo se colocan
1 dNTP (4 tipos)
2 un solo tipo de ddNTP por tubo
3 primer o cebador marcado
4 ADN molde a secuenciar
5 Polimerasa
A ddNTP C ddNTP
G ddNTP T ddNTP
Los productos de las 4
reacciones cada una
conteniendo una pequentildea
cantidad de uno de los cuatro
dideoxinucleoacutetidos son
cargadas en el gel y sometidas
a electroforesis
Como la polimerizacioacuten es solo
en direccioacuten 5rsquo a 3rsquo los
fragmentos maacutes cortos estaraacuten
en 5rsquo y los maacutes largos que se
encontraraacuten en la direccioacuten 3rsquo
ddTTPddCTP ddGTPddATP
Lec
tura
5rsquo
a 3rsquo
des
de
la b
asa
al t
ope
Secuenciacioacuten Separacioacuten de fragmentos
Alternativa del meacutetodo Sanger
Se marca cebador con fluorescencia y se activa la reaccioacuten
Los productos se detectan durante electroforelectroforeacutesis al
pasar por un laacuteser que excita los fluorocromos y se detecta
fluorescencia emitida
Se realizan 4 reacciones de secuencia distintas
Se coloca el cebador marcado polimerasa dNTP y ddNTP
Al finalizar las cuatro reacciones se mezclan en uacutenico tubo
SECUENCIACION AUTOMATICA empleando
meacutetodo enzimaacutetico
hellip
Placa caliente
Pol
liacutequido
ATTGC A
Laser
Prisma
Detectores
-
+Ventana
Reaccioacuten
Secuencia
Capilar
iquestCoacutemo se ve el resultado
En el electroferograma se observa dos picos en
la posicioacuten 152 (C T)
A ndash A ndash T ndash G ndash G - T - C - C ndash A ndash N - T - T - G - G - C
A ndash A ndash T ndash G ndash G - T - C - T ndash A ndash N - T - T - G - G - C
Repeticiones en tandem
La variacioacuten en el nuacutemero de repeticiones de los
distintos mini y microsateacutelites es un polimorfismo
muy frecuente
Estos polimorfismos se generan por errores durante la
replicacioacuten
Dado que las repeticiones se encuentran en forma diploide
Cada uno de nosotros posee dos variantes para una repeticioacuten
determinada
VNTR (Nuacutemero variable de repeticiones en tandem) micro sateacutelites hipervariables
Obtencioacuten de DNA a partir de RNA
Rt-PCR Transcriptasareversa
Los iones de magnesio
estimulan a la enzima Taq Polimerasa
para que incorpore los dNTPacutes
Algunas aclaracioneshellip
Taq
Mg
Sol amortiguadora PCR
1048698 Mantiene el pH oacuteptimo para que la enzima actuacutee
1048698 Sales
Proporcionan la fuerza ioacutenica adecuada para una maacutexima actividad de la
enzima
Herramientas
POLIMERASA BACTERIANA que resista a los cambios Tordm
Estrategia
Utilizar cambios de temperatura para desnaturalizar y
renaturalizar las hebras de ADN complementario
PCR coacutemo ve el observador el proceso
MIX +
ADN
Soacutelo veremos Teacutecnicas Directas
bullSouthern Blot
bullPCR
bullSecuenciacioacuten
Secuenciacioacuten
Meacutetodo enzimaacutetico 1977
Frederick Sanger desarrolloacute esta teacutecnica
Meacutetodo de los terminadores de cadena o dideoxi
Fundamento
REPLICACION DEL ADN
COMPLEMENTARIEDAD DE BASES
Herramientas
Dideoxinucleotidos
Estrategia
Cuando se agrega un dideoxinucleotido
a la cadena en formacioacuten se
interrumpe la polimerizacioacuten
Secuenciacioacuten
H
P
O
OH
OH
HO
O
O
CH2
NH
N
N
N
Azuacutecar
Base
Fosfato
3rsquo
5rsquo
2rsquo
1rsquo4rsquo
Jeraacuterquico OH
del carbono 3
En la polimerizacioacuten
del ADN
H
P
O
OH
OH
HO
O
O
CH2
NH2
N
N N
N
Azuacutecar
Base
Fosfato
3rsquo
5rsquo
2rsquo
1rsquo4rsquo
H
2rsquo3rsquo-dideoxinucleoacutetido
monofosfato
H
P
O
OH
OH
HO
O
O
CH2
NH2
N
N N
N
Azuacutecar
Base
Fosfato
3rsquo
5rsquo
2rsquo
1rsquo4rsquo
deoxinucleotido
monofosfato
Secuenciacioacuten utiliza deoxinucleotidos
y dideoxinucleotidos
Cuando se incorpora un dideoxinucleoacutetido se
interrumpe la polimerizacioacuten
H
P
O
OH
OH
HO
O
O
CH2
NH2
N
N N
N
Azuacutecar
Base
Fosfato
3rsquo
5rsquo
2rsquo
1rsquo4rsquo
H
2rsquo3rsquo-dideoxinucleoacutetido
monofosfato
Se realizan 4 reacciones de siacutentesis (4 tubos
separados)
Se incluyen pequentildeas cantidades de
dideoxinucleotidos ddNTP que
compiten con los dNTP
En cada tubo se colocan
1 dNTP (4 tipos)
2 un solo tipo de ddNTP por tubo
3 primer o cebador marcado
4 ADN molde a secuenciar
5 Polimerasa
A ddNTP C ddNTP
G ddNTP T ddNTP
Los productos de las 4
reacciones cada una
conteniendo una pequentildea
cantidad de uno de los cuatro
dideoxinucleoacutetidos son
cargadas en el gel y sometidas
a electroforesis
Como la polimerizacioacuten es solo
en direccioacuten 5rsquo a 3rsquo los
fragmentos maacutes cortos estaraacuten
en 5rsquo y los maacutes largos que se
encontraraacuten en la direccioacuten 3rsquo
ddTTPddCTP ddGTPddATP
Lec
tura
5rsquo
a 3rsquo
des
de
la b
asa
al t
ope
Secuenciacioacuten Separacioacuten de fragmentos
Alternativa del meacutetodo Sanger
Se marca cebador con fluorescencia y se activa la reaccioacuten
Los productos se detectan durante electroforelectroforeacutesis al
pasar por un laacuteser que excita los fluorocromos y se detecta
fluorescencia emitida
Se realizan 4 reacciones de secuencia distintas
Se coloca el cebador marcado polimerasa dNTP y ddNTP
Al finalizar las cuatro reacciones se mezclan en uacutenico tubo
SECUENCIACION AUTOMATICA empleando
meacutetodo enzimaacutetico
hellip
Placa caliente
Pol
liacutequido
ATTGC A
Laser
Prisma
Detectores
-
+Ventana
Reaccioacuten
Secuencia
Capilar
iquestCoacutemo se ve el resultado
En el electroferograma se observa dos picos en
la posicioacuten 152 (C T)
A ndash A ndash T ndash G ndash G - T - C - C ndash A ndash N - T - T - G - G - C
A ndash A ndash T ndash G ndash G - T - C - T ndash A ndash N - T - T - G - G - C
Repeticiones en tandem
La variacioacuten en el nuacutemero de repeticiones de los
distintos mini y microsateacutelites es un polimorfismo
muy frecuente
Estos polimorfismos se generan por errores durante la
replicacioacuten
Dado que las repeticiones se encuentran en forma diploide
Cada uno de nosotros posee dos variantes para una repeticioacuten
determinada
VNTR (Nuacutemero variable de repeticiones en tandem) micro sateacutelites hipervariables
Obtencioacuten de DNA a partir de RNA
Rt-PCR Transcriptasareversa
Herramientas
POLIMERASA BACTERIANA que resista a los cambios Tordm
Estrategia
Utilizar cambios de temperatura para desnaturalizar y
renaturalizar las hebras de ADN complementario
PCR coacutemo ve el observador el proceso
MIX +
ADN
Soacutelo veremos Teacutecnicas Directas
bullSouthern Blot
bullPCR
bullSecuenciacioacuten
Secuenciacioacuten
Meacutetodo enzimaacutetico 1977
Frederick Sanger desarrolloacute esta teacutecnica
Meacutetodo de los terminadores de cadena o dideoxi
Fundamento
REPLICACION DEL ADN
COMPLEMENTARIEDAD DE BASES
Herramientas
Dideoxinucleotidos
Estrategia
Cuando se agrega un dideoxinucleotido
a la cadena en formacioacuten se
interrumpe la polimerizacioacuten
Secuenciacioacuten
H
P
O
OH
OH
HO
O
O
CH2
NH
N
N
N
Azuacutecar
Base
Fosfato
3rsquo
5rsquo
2rsquo
1rsquo4rsquo
Jeraacuterquico OH
del carbono 3
En la polimerizacioacuten
del ADN
H
P
O
OH
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HO
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monofosfato
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NH2
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Base
Fosfato
3rsquo
5rsquo
2rsquo
1rsquo4rsquo
deoxinucleotido
monofosfato
Secuenciacioacuten utiliza deoxinucleotidos
y dideoxinucleotidos
Cuando se incorpora un dideoxinucleoacutetido se
interrumpe la polimerizacioacuten
H
P
O
OH
OH
HO
O
O
CH2
NH2
N
N N
N
Azuacutecar
Base
Fosfato
3rsquo
5rsquo
2rsquo
1rsquo4rsquo
H
2rsquo3rsquo-dideoxinucleoacutetido
monofosfato
Se realizan 4 reacciones de siacutentesis (4 tubos
separados)
Se incluyen pequentildeas cantidades de
dideoxinucleotidos ddNTP que
compiten con los dNTP
En cada tubo se colocan
1 dNTP (4 tipos)
2 un solo tipo de ddNTP por tubo
3 primer o cebador marcado
4 ADN molde a secuenciar
5 Polimerasa
A ddNTP C ddNTP
G ddNTP T ddNTP
Los productos de las 4
reacciones cada una
conteniendo una pequentildea
cantidad de uno de los cuatro
dideoxinucleoacutetidos son
cargadas en el gel y sometidas
a electroforesis
Como la polimerizacioacuten es solo
en direccioacuten 5rsquo a 3rsquo los
fragmentos maacutes cortos estaraacuten
en 5rsquo y los maacutes largos que se
encontraraacuten en la direccioacuten 3rsquo
ddTTPddCTP ddGTPddATP
Lec
tura
5rsquo
a 3rsquo
des
de
la b
asa
al t
ope
Secuenciacioacuten Separacioacuten de fragmentos
Alternativa del meacutetodo Sanger
Se marca cebador con fluorescencia y se activa la reaccioacuten
Los productos se detectan durante electroforelectroforeacutesis al
pasar por un laacuteser que excita los fluorocromos y se detecta
fluorescencia emitida
Se realizan 4 reacciones de secuencia distintas
Se coloca el cebador marcado polimerasa dNTP y ddNTP
Al finalizar las cuatro reacciones se mezclan en uacutenico tubo
SECUENCIACION AUTOMATICA empleando
meacutetodo enzimaacutetico
hellip
Placa caliente
Pol
liacutequido
ATTGC A
Laser
Prisma
Detectores
-
+Ventana
Reaccioacuten
Secuencia
Capilar
iquestCoacutemo se ve el resultado
En el electroferograma se observa dos picos en
la posicioacuten 152 (C T)
A ndash A ndash T ndash G ndash G - T - C - C ndash A ndash N - T - T - G - G - C
A ndash A ndash T ndash G ndash G - T - C - T ndash A ndash N - T - T - G - G - C
Repeticiones en tandem
La variacioacuten en el nuacutemero de repeticiones de los
distintos mini y microsateacutelites es un polimorfismo
muy frecuente
Estos polimorfismos se generan por errores durante la
replicacioacuten
Dado que las repeticiones se encuentran en forma diploide
Cada uno de nosotros posee dos variantes para una repeticioacuten
determinada
VNTR (Nuacutemero variable de repeticiones en tandem) micro sateacutelites hipervariables
Obtencioacuten de DNA a partir de RNA
Rt-PCR Transcriptasareversa
Soacutelo veremos Teacutecnicas Directas
bullSouthern Blot
bullPCR
bullSecuenciacioacuten
Secuenciacioacuten
Meacutetodo enzimaacutetico 1977
Frederick Sanger desarrolloacute esta teacutecnica
Meacutetodo de los terminadores de cadena o dideoxi
Fundamento
REPLICACION DEL ADN
COMPLEMENTARIEDAD DE BASES
Herramientas
Dideoxinucleotidos
Estrategia
Cuando se agrega un dideoxinucleotido
a la cadena en formacioacuten se
interrumpe la polimerizacioacuten
Secuenciacioacuten
H
P
O
OH
OH
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Base
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Jeraacuterquico OH
del carbono 3
En la polimerizacioacuten
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H
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Base
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1rsquo4rsquo
deoxinucleotido
monofosfato
Secuenciacioacuten utiliza deoxinucleotidos
y dideoxinucleotidos
Cuando se incorpora un dideoxinucleoacutetido se
interrumpe la polimerizacioacuten
H
P
O
OH
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HO
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Base
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3rsquo
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1rsquo4rsquo
H
2rsquo3rsquo-dideoxinucleoacutetido
monofosfato
Se realizan 4 reacciones de siacutentesis (4 tubos
separados)
Se incluyen pequentildeas cantidades de
dideoxinucleotidos ddNTP que
compiten con los dNTP
En cada tubo se colocan
1 dNTP (4 tipos)
2 un solo tipo de ddNTP por tubo
3 primer o cebador marcado
4 ADN molde a secuenciar
5 Polimerasa
A ddNTP C ddNTP
G ddNTP T ddNTP
Los productos de las 4
reacciones cada una
conteniendo una pequentildea
cantidad de uno de los cuatro
dideoxinucleoacutetidos son
cargadas en el gel y sometidas
a electroforesis
Como la polimerizacioacuten es solo
en direccioacuten 5rsquo a 3rsquo los
fragmentos maacutes cortos estaraacuten
en 5rsquo y los maacutes largos que se
encontraraacuten en la direccioacuten 3rsquo
ddTTPddCTP ddGTPddATP
Lec
tura
5rsquo
a 3rsquo
des
de
la b
asa
al t
ope
Secuenciacioacuten Separacioacuten de fragmentos
Alternativa del meacutetodo Sanger
Se marca cebador con fluorescencia y se activa la reaccioacuten
Los productos se detectan durante electroforelectroforeacutesis al
pasar por un laacuteser que excita los fluorocromos y se detecta
fluorescencia emitida
Se realizan 4 reacciones de secuencia distintas
Se coloca el cebador marcado polimerasa dNTP y ddNTP
Al finalizar las cuatro reacciones se mezclan en uacutenico tubo
SECUENCIACION AUTOMATICA empleando
meacutetodo enzimaacutetico
hellip
Placa caliente
Pol
liacutequido
ATTGC A
Laser
Prisma
Detectores
-
+Ventana
Reaccioacuten
Secuencia
Capilar
iquestCoacutemo se ve el resultado
En el electroferograma se observa dos picos en
la posicioacuten 152 (C T)
A ndash A ndash T ndash G ndash G - T - C - C ndash A ndash N - T - T - G - G - C
A ndash A ndash T ndash G ndash G - T - C - T ndash A ndash N - T - T - G - G - C
Repeticiones en tandem
La variacioacuten en el nuacutemero de repeticiones de los
distintos mini y microsateacutelites es un polimorfismo
muy frecuente
Estos polimorfismos se generan por errores durante la
replicacioacuten
Dado que las repeticiones se encuentran en forma diploide
Cada uno de nosotros posee dos variantes para una repeticioacuten
determinada
VNTR (Nuacutemero variable de repeticiones en tandem) micro sateacutelites hipervariables
Obtencioacuten de DNA a partir de RNA
Rt-PCR Transcriptasareversa
Secuenciacioacuten
Meacutetodo enzimaacutetico 1977
Frederick Sanger desarrolloacute esta teacutecnica
Meacutetodo de los terminadores de cadena o dideoxi
Fundamento
REPLICACION DEL ADN
COMPLEMENTARIEDAD DE BASES
Herramientas
Dideoxinucleotidos
Estrategia
Cuando se agrega un dideoxinucleotido
a la cadena en formacioacuten se
interrumpe la polimerizacioacuten
Secuenciacioacuten
H
P
O
OH
OH
HO
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Jeraacuterquico OH
del carbono 3
En la polimerizacioacuten
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H
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deoxinucleotido
monofosfato
Secuenciacioacuten utiliza deoxinucleotidos
y dideoxinucleotidos
Cuando se incorpora un dideoxinucleoacutetido se
interrumpe la polimerizacioacuten
H
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O
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OH
HO
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Azuacutecar
Base
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3rsquo
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H
2rsquo3rsquo-dideoxinucleoacutetido
monofosfato
Se realizan 4 reacciones de siacutentesis (4 tubos
separados)
Se incluyen pequentildeas cantidades de
dideoxinucleotidos ddNTP que
compiten con los dNTP
En cada tubo se colocan
1 dNTP (4 tipos)
2 un solo tipo de ddNTP por tubo
3 primer o cebador marcado
4 ADN molde a secuenciar
5 Polimerasa
A ddNTP C ddNTP
G ddNTP T ddNTP
Los productos de las 4
reacciones cada una
conteniendo una pequentildea
cantidad de uno de los cuatro
dideoxinucleoacutetidos son
cargadas en el gel y sometidas
a electroforesis
Como la polimerizacioacuten es solo
en direccioacuten 5rsquo a 3rsquo los
fragmentos maacutes cortos estaraacuten
en 5rsquo y los maacutes largos que se
encontraraacuten en la direccioacuten 3rsquo
ddTTPddCTP ddGTPddATP
Lec
tura
5rsquo
a 3rsquo
des
de
la b
asa
al t
ope
Secuenciacioacuten Separacioacuten de fragmentos
Alternativa del meacutetodo Sanger
Se marca cebador con fluorescencia y se activa la reaccioacuten
Los productos se detectan durante electroforelectroforeacutesis al
pasar por un laacuteser que excita los fluorocromos y se detecta
fluorescencia emitida
Se realizan 4 reacciones de secuencia distintas
Se coloca el cebador marcado polimerasa dNTP y ddNTP
Al finalizar las cuatro reacciones se mezclan en uacutenico tubo
SECUENCIACION AUTOMATICA empleando
meacutetodo enzimaacutetico
hellip
Placa caliente
Pol
liacutequido
ATTGC A
Laser
Prisma
Detectores
-
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Reaccioacuten
Secuencia
Capilar
iquestCoacutemo se ve el resultado
En el electroferograma se observa dos picos en
la posicioacuten 152 (C T)
A ndash A ndash T ndash G ndash G - T - C - C ndash A ndash N - T - T - G - G - C
A ndash A ndash T ndash G ndash G - T - C - T ndash A ndash N - T - T - G - G - C
Repeticiones en tandem
La variacioacuten en el nuacutemero de repeticiones de los
distintos mini y microsateacutelites es un polimorfismo
muy frecuente
Estos polimorfismos se generan por errores durante la
replicacioacuten
Dado que las repeticiones se encuentran en forma diploide
Cada uno de nosotros posee dos variantes para una repeticioacuten
determinada
VNTR (Nuacutemero variable de repeticiones en tandem) micro sateacutelites hipervariables
Obtencioacuten de DNA a partir de RNA
Rt-PCR Transcriptasareversa
Fundamento
REPLICACION DEL ADN
COMPLEMENTARIEDAD DE BASES
Herramientas
Dideoxinucleotidos
Estrategia
Cuando se agrega un dideoxinucleotido
a la cadena en formacioacuten se
interrumpe la polimerizacioacuten
Secuenciacioacuten
H
P
O
OH
OH
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Base
Fosfato
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Jeraacuterquico OH
del carbono 3
En la polimerizacioacuten
del ADN
H
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Base
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H
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Fosfato
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deoxinucleotido
monofosfato
Secuenciacioacuten utiliza deoxinucleotidos
y dideoxinucleotidos
Cuando se incorpora un dideoxinucleoacutetido se
interrumpe la polimerizacioacuten
H
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O
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Base
Fosfato
3rsquo
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1rsquo4rsquo
H
2rsquo3rsquo-dideoxinucleoacutetido
monofosfato
Se realizan 4 reacciones de siacutentesis (4 tubos
separados)
Se incluyen pequentildeas cantidades de
dideoxinucleotidos ddNTP que
compiten con los dNTP
En cada tubo se colocan
1 dNTP (4 tipos)
2 un solo tipo de ddNTP por tubo
3 primer o cebador marcado
4 ADN molde a secuenciar
5 Polimerasa
A ddNTP C ddNTP
G ddNTP T ddNTP
Los productos de las 4
reacciones cada una
conteniendo una pequentildea
cantidad de uno de los cuatro
dideoxinucleoacutetidos son
cargadas en el gel y sometidas
a electroforesis
Como la polimerizacioacuten es solo
en direccioacuten 5rsquo a 3rsquo los
fragmentos maacutes cortos estaraacuten
en 5rsquo y los maacutes largos que se
encontraraacuten en la direccioacuten 3rsquo
ddTTPddCTP ddGTPddATP
Lec
tura
5rsquo
a 3rsquo
des
de
la b
asa
al t
ope
Secuenciacioacuten Separacioacuten de fragmentos
Alternativa del meacutetodo Sanger
Se marca cebador con fluorescencia y se activa la reaccioacuten
Los productos se detectan durante electroforelectroforeacutesis al
pasar por un laacuteser que excita los fluorocromos y se detecta
fluorescencia emitida
Se realizan 4 reacciones de secuencia distintas
Se coloca el cebador marcado polimerasa dNTP y ddNTP
Al finalizar las cuatro reacciones se mezclan en uacutenico tubo
SECUENCIACION AUTOMATICA empleando
meacutetodo enzimaacutetico
hellip
Placa caliente
Pol
liacutequido
ATTGC A
Laser
Prisma
Detectores
-
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Reaccioacuten
Secuencia
Capilar
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En el electroferograma se observa dos picos en
la posicioacuten 152 (C T)
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A ndash A ndash T ndash G ndash G - T - C - T ndash A ndash N - T - T - G - G - C
Repeticiones en tandem
La variacioacuten en el nuacutemero de repeticiones de los
distintos mini y microsateacutelites es un polimorfismo
muy frecuente
Estos polimorfismos se generan por errores durante la
replicacioacuten
Dado que las repeticiones se encuentran en forma diploide
Cada uno de nosotros posee dos variantes para una repeticioacuten
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VNTR (Nuacutemero variable de repeticiones en tandem) micro sateacutelites hipervariables
Obtencioacuten de DNA a partir de RNA
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H
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Jeraacuterquico OH
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monofosfato
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Base
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3rsquo
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deoxinucleotido
monofosfato
Secuenciacioacuten utiliza deoxinucleotidos
y dideoxinucleotidos
Cuando se incorpora un dideoxinucleoacutetido se
interrumpe la polimerizacioacuten
H
P
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Base
Fosfato
3rsquo
5rsquo
2rsquo
1rsquo4rsquo
H
2rsquo3rsquo-dideoxinucleoacutetido
monofosfato
Se realizan 4 reacciones de siacutentesis (4 tubos
separados)
Se incluyen pequentildeas cantidades de
dideoxinucleotidos ddNTP que
compiten con los dNTP
En cada tubo se colocan
1 dNTP (4 tipos)
2 un solo tipo de ddNTP por tubo
3 primer o cebador marcado
4 ADN molde a secuenciar
5 Polimerasa
A ddNTP C ddNTP
G ddNTP T ddNTP
Los productos de las 4
reacciones cada una
conteniendo una pequentildea
cantidad de uno de los cuatro
dideoxinucleoacutetidos son
cargadas en el gel y sometidas
a electroforesis
Como la polimerizacioacuten es solo
en direccioacuten 5rsquo a 3rsquo los
fragmentos maacutes cortos estaraacuten
en 5rsquo y los maacutes largos que se
encontraraacuten en la direccioacuten 3rsquo
ddTTPddCTP ddGTPddATP
Lec
tura
5rsquo
a 3rsquo
des
de
la b
asa
al t
ope
Secuenciacioacuten Separacioacuten de fragmentos
Alternativa del meacutetodo Sanger
Se marca cebador con fluorescencia y se activa la reaccioacuten
Los productos se detectan durante electroforelectroforeacutesis al
pasar por un laacuteser que excita los fluorocromos y se detecta
fluorescencia emitida
Se realizan 4 reacciones de secuencia distintas
Se coloca el cebador marcado polimerasa dNTP y ddNTP
Al finalizar las cuatro reacciones se mezclan en uacutenico tubo
SECUENCIACION AUTOMATICA empleando
meacutetodo enzimaacutetico
hellip
Placa caliente
Pol
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ATTGC A
Laser
Prisma
Detectores
-
+Ventana
Reaccioacuten
Secuencia
Capilar
iquestCoacutemo se ve el resultado
En el electroferograma se observa dos picos en
la posicioacuten 152 (C T)
A ndash A ndash T ndash G ndash G - T - C - C ndash A ndash N - T - T - G - G - C
A ndash A ndash T ndash G ndash G - T - C - T ndash A ndash N - T - T - G - G - C
Repeticiones en tandem
La variacioacuten en el nuacutemero de repeticiones de los
distintos mini y microsateacutelites es un polimorfismo
muy frecuente
Estos polimorfismos se generan por errores durante la
replicacioacuten
Dado que las repeticiones se encuentran en forma diploide
Cada uno de nosotros posee dos variantes para una repeticioacuten
determinada
VNTR (Nuacutemero variable de repeticiones en tandem) micro sateacutelites hipervariables
Obtencioacuten de DNA a partir de RNA
Rt-PCR Transcriptasareversa
H
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HO
O
O
CH2
NH2
N
N N
N
Azuacutecar
Base
Fosfato
3rsquo
5rsquo
2rsquo
1rsquo4rsquo
deoxinucleotido
monofosfato
Secuenciacioacuten utiliza deoxinucleotidos
y dideoxinucleotidos
Cuando se incorpora un dideoxinucleoacutetido se
interrumpe la polimerizacioacuten
H
P
O
OH
OH
HO
O
O
CH2
NH2
N
N N
N
Azuacutecar
Base
Fosfato
3rsquo
5rsquo
2rsquo
1rsquo4rsquo
H
2rsquo3rsquo-dideoxinucleoacutetido
monofosfato
Se realizan 4 reacciones de siacutentesis (4 tubos
separados)
Se incluyen pequentildeas cantidades de
dideoxinucleotidos ddNTP que
compiten con los dNTP
En cada tubo se colocan
1 dNTP (4 tipos)
2 un solo tipo de ddNTP por tubo
3 primer o cebador marcado
4 ADN molde a secuenciar
5 Polimerasa
A ddNTP C ddNTP
G ddNTP T ddNTP
Los productos de las 4
reacciones cada una
conteniendo una pequentildea
cantidad de uno de los cuatro
dideoxinucleoacutetidos son
cargadas en el gel y sometidas
a electroforesis
Como la polimerizacioacuten es solo
en direccioacuten 5rsquo a 3rsquo los
fragmentos maacutes cortos estaraacuten
en 5rsquo y los maacutes largos que se
encontraraacuten en la direccioacuten 3rsquo
ddTTPddCTP ddGTPddATP
Lec
tura
5rsquo
a 3rsquo
des
de
la b
asa
al t
ope
Secuenciacioacuten Separacioacuten de fragmentos
Alternativa del meacutetodo Sanger
Se marca cebador con fluorescencia y se activa la reaccioacuten
Los productos se detectan durante electroforelectroforeacutesis al
pasar por un laacuteser que excita los fluorocromos y se detecta
fluorescencia emitida
Se realizan 4 reacciones de secuencia distintas
Se coloca el cebador marcado polimerasa dNTP y ddNTP
Al finalizar las cuatro reacciones se mezclan en uacutenico tubo
SECUENCIACION AUTOMATICA empleando
meacutetodo enzimaacutetico
hellip
Placa caliente
Pol
liacutequido
ATTGC A
Laser
Prisma
Detectores
-
+Ventana
Reaccioacuten
Secuencia
Capilar
iquestCoacutemo se ve el resultado
En el electroferograma se observa dos picos en
la posicioacuten 152 (C T)
A ndash A ndash T ndash G ndash G - T - C - C ndash A ndash N - T - T - G - G - C
A ndash A ndash T ndash G ndash G - T - C - T ndash A ndash N - T - T - G - G - C
Repeticiones en tandem
La variacioacuten en el nuacutemero de repeticiones de los
distintos mini y microsateacutelites es un polimorfismo
muy frecuente
Estos polimorfismos se generan por errores durante la
replicacioacuten
Dado que las repeticiones se encuentran en forma diploide
Cada uno de nosotros posee dos variantes para una repeticioacuten
determinada
VNTR (Nuacutemero variable de repeticiones en tandem) micro sateacutelites hipervariables
Obtencioacuten de DNA a partir de RNA
Rt-PCR Transcriptasareversa
Cuando se incorpora un dideoxinucleoacutetido se
interrumpe la polimerizacioacuten
H
P
O
OH
OH
HO
O
O
CH2
NH2
N
N N
N
Azuacutecar
Base
Fosfato
3rsquo
5rsquo
2rsquo
1rsquo4rsquo
H
2rsquo3rsquo-dideoxinucleoacutetido
monofosfato
Se realizan 4 reacciones de siacutentesis (4 tubos
separados)
Se incluyen pequentildeas cantidades de
dideoxinucleotidos ddNTP que
compiten con los dNTP
En cada tubo se colocan
1 dNTP (4 tipos)
2 un solo tipo de ddNTP por tubo
3 primer o cebador marcado
4 ADN molde a secuenciar
5 Polimerasa
A ddNTP C ddNTP
G ddNTP T ddNTP
Los productos de las 4
reacciones cada una
conteniendo una pequentildea
cantidad de uno de los cuatro
dideoxinucleoacutetidos son
cargadas en el gel y sometidas
a electroforesis
Como la polimerizacioacuten es solo
en direccioacuten 5rsquo a 3rsquo los
fragmentos maacutes cortos estaraacuten
en 5rsquo y los maacutes largos que se
encontraraacuten en la direccioacuten 3rsquo
ddTTPddCTP ddGTPddATP
Lec
tura
5rsquo
a 3rsquo
des
de
la b
asa
al t
ope
Secuenciacioacuten Separacioacuten de fragmentos
Alternativa del meacutetodo Sanger
Se marca cebador con fluorescencia y se activa la reaccioacuten
Los productos se detectan durante electroforelectroforeacutesis al
pasar por un laacuteser que excita los fluorocromos y se detecta
fluorescencia emitida
Se realizan 4 reacciones de secuencia distintas
Se coloca el cebador marcado polimerasa dNTP y ddNTP
Al finalizar las cuatro reacciones se mezclan en uacutenico tubo
SECUENCIACION AUTOMATICA empleando
meacutetodo enzimaacutetico
hellip
Placa caliente
Pol
liacutequido
ATTGC A
Laser
Prisma
Detectores
-
+Ventana
Reaccioacuten
Secuencia
Capilar
iquestCoacutemo se ve el resultado
En el electroferograma se observa dos picos en
la posicioacuten 152 (C T)
A ndash A ndash T ndash G ndash G - T - C - C ndash A ndash N - T - T - G - G - C
A ndash A ndash T ndash G ndash G - T - C - T ndash A ndash N - T - T - G - G - C
Repeticiones en tandem
La variacioacuten en el nuacutemero de repeticiones de los
distintos mini y microsateacutelites es un polimorfismo
muy frecuente
Estos polimorfismos se generan por errores durante la
replicacioacuten
Dado que las repeticiones se encuentran en forma diploide
Cada uno de nosotros posee dos variantes para una repeticioacuten
determinada
VNTR (Nuacutemero variable de repeticiones en tandem) micro sateacutelites hipervariables
Obtencioacuten de DNA a partir de RNA
Rt-PCR Transcriptasareversa
Se realizan 4 reacciones de siacutentesis (4 tubos
separados)
Se incluyen pequentildeas cantidades de
dideoxinucleotidos ddNTP que
compiten con los dNTP
En cada tubo se colocan
1 dNTP (4 tipos)
2 un solo tipo de ddNTP por tubo
3 primer o cebador marcado
4 ADN molde a secuenciar
5 Polimerasa
A ddNTP C ddNTP
G ddNTP T ddNTP
Los productos de las 4
reacciones cada una
conteniendo una pequentildea
cantidad de uno de los cuatro
dideoxinucleoacutetidos son
cargadas en el gel y sometidas
a electroforesis
Como la polimerizacioacuten es solo
en direccioacuten 5rsquo a 3rsquo los
fragmentos maacutes cortos estaraacuten
en 5rsquo y los maacutes largos que se
encontraraacuten en la direccioacuten 3rsquo
ddTTPddCTP ddGTPddATP
Lec
tura
5rsquo
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des
de
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al t
ope
Secuenciacioacuten Separacioacuten de fragmentos
Alternativa del meacutetodo Sanger
Se marca cebador con fluorescencia y se activa la reaccioacuten
Los productos se detectan durante electroforelectroforeacutesis al
pasar por un laacuteser que excita los fluorocromos y se detecta
fluorescencia emitida
Se realizan 4 reacciones de secuencia distintas
Se coloca el cebador marcado polimerasa dNTP y ddNTP
Al finalizar las cuatro reacciones se mezclan en uacutenico tubo
SECUENCIACION AUTOMATICA empleando
meacutetodo enzimaacutetico
hellip
Placa caliente
Pol
liacutequido
ATTGC A
Laser
Prisma
Detectores
-
+Ventana
Reaccioacuten
Secuencia
Capilar
iquestCoacutemo se ve el resultado
En el electroferograma se observa dos picos en
la posicioacuten 152 (C T)
A ndash A ndash T ndash G ndash G - T - C - C ndash A ndash N - T - T - G - G - C
A ndash A ndash T ndash G ndash G - T - C - T ndash A ndash N - T - T - G - G - C
Repeticiones en tandem
La variacioacuten en el nuacutemero de repeticiones de los
distintos mini y microsateacutelites es un polimorfismo
muy frecuente
Estos polimorfismos se generan por errores durante la
replicacioacuten
Dado que las repeticiones se encuentran en forma diploide
Cada uno de nosotros posee dos variantes para una repeticioacuten
determinada
VNTR (Nuacutemero variable de repeticiones en tandem) micro sateacutelites hipervariables
Obtencioacuten de DNA a partir de RNA
Rt-PCR Transcriptasareversa
Los productos de las 4
reacciones cada una
conteniendo una pequentildea
cantidad de uno de los cuatro
dideoxinucleoacutetidos son
cargadas en el gel y sometidas
a electroforesis
Como la polimerizacioacuten es solo
en direccioacuten 5rsquo a 3rsquo los
fragmentos maacutes cortos estaraacuten
en 5rsquo y los maacutes largos que se
encontraraacuten en la direccioacuten 3rsquo
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Lec
tura
5rsquo
a 3rsquo
des
de
la b
asa
al t
ope
Secuenciacioacuten Separacioacuten de fragmentos
Alternativa del meacutetodo Sanger
Se marca cebador con fluorescencia y se activa la reaccioacuten
Los productos se detectan durante electroforelectroforeacutesis al
pasar por un laacuteser que excita los fluorocromos y se detecta
fluorescencia emitida
Se realizan 4 reacciones de secuencia distintas
Se coloca el cebador marcado polimerasa dNTP y ddNTP
Al finalizar las cuatro reacciones se mezclan en uacutenico tubo
SECUENCIACION AUTOMATICA empleando
meacutetodo enzimaacutetico
hellip
Placa caliente
Pol
liacutequido
ATTGC A
Laser
Prisma
Detectores
-
+Ventana
Reaccioacuten
Secuencia
Capilar
iquestCoacutemo se ve el resultado
En el electroferograma se observa dos picos en
la posicioacuten 152 (C T)
A ndash A ndash T ndash G ndash G - T - C - C ndash A ndash N - T - T - G - G - C
A ndash A ndash T ndash G ndash G - T - C - T ndash A ndash N - T - T - G - G - C
Repeticiones en tandem
La variacioacuten en el nuacutemero de repeticiones de los
distintos mini y microsateacutelites es un polimorfismo
muy frecuente
Estos polimorfismos se generan por errores durante la
replicacioacuten
Dado que las repeticiones se encuentran en forma diploide
Cada uno de nosotros posee dos variantes para una repeticioacuten
determinada
VNTR (Nuacutemero variable de repeticiones en tandem) micro sateacutelites hipervariables
Obtencioacuten de DNA a partir de RNA
Rt-PCR Transcriptasareversa
Alternativa del meacutetodo Sanger
Se marca cebador con fluorescencia y se activa la reaccioacuten
Los productos se detectan durante electroforelectroforeacutesis al
pasar por un laacuteser que excita los fluorocromos y se detecta
fluorescencia emitida
Se realizan 4 reacciones de secuencia distintas
Se coloca el cebador marcado polimerasa dNTP y ddNTP
Al finalizar las cuatro reacciones se mezclan en uacutenico tubo
SECUENCIACION AUTOMATICA empleando
meacutetodo enzimaacutetico
hellip
Placa caliente
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liacutequido
ATTGC A
Laser
Prisma
Detectores
-
+Ventana
Reaccioacuten
Secuencia
Capilar
iquestCoacutemo se ve el resultado
En el electroferograma se observa dos picos en
la posicioacuten 152 (C T)
A ndash A ndash T ndash G ndash G - T - C - C ndash A ndash N - T - T - G - G - C
A ndash A ndash T ndash G ndash G - T - C - T ndash A ndash N - T - T - G - G - C
Repeticiones en tandem
La variacioacuten en el nuacutemero de repeticiones de los
distintos mini y microsateacutelites es un polimorfismo
muy frecuente
Estos polimorfismos se generan por errores durante la
replicacioacuten
Dado que las repeticiones se encuentran en forma diploide
Cada uno de nosotros posee dos variantes para una repeticioacuten
determinada
VNTR (Nuacutemero variable de repeticiones en tandem) micro sateacutelites hipervariables
Obtencioacuten de DNA a partir de RNA
Rt-PCR Transcriptasareversa
hellip
Placa caliente
Pol
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ATTGC A
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Detectores
-
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Capilar
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En el electroferograma se observa dos picos en
la posicioacuten 152 (C T)
A ndash A ndash T ndash G ndash G - T - C - C ndash A ndash N - T - T - G - G - C
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Repeticiones en tandem
La variacioacuten en el nuacutemero de repeticiones de los
distintos mini y microsateacutelites es un polimorfismo
muy frecuente
Estos polimorfismos se generan por errores durante la
replicacioacuten
Dado que las repeticiones se encuentran en forma diploide
Cada uno de nosotros posee dos variantes para una repeticioacuten
determinada
VNTR (Nuacutemero variable de repeticiones en tandem) micro sateacutelites hipervariables
Obtencioacuten de DNA a partir de RNA
Rt-PCR Transcriptasareversa
iquestCoacutemo se ve el resultado
En el electroferograma se observa dos picos en
la posicioacuten 152 (C T)
A ndash A ndash T ndash G ndash G - T - C - C ndash A ndash N - T - T - G - G - C
A ndash A ndash T ndash G ndash G - T - C - T ndash A ndash N - T - T - G - G - C
Repeticiones en tandem
La variacioacuten en el nuacutemero de repeticiones de los
distintos mini y microsateacutelites es un polimorfismo
muy frecuente
Estos polimorfismos se generan por errores durante la
replicacioacuten
Dado que las repeticiones se encuentran en forma diploide
Cada uno de nosotros posee dos variantes para una repeticioacuten
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VNTR (Nuacutemero variable de repeticiones en tandem) micro sateacutelites hipervariables
Obtencioacuten de DNA a partir de RNA
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En el electroferograma se observa dos picos en
la posicioacuten 152 (C T)
A ndash A ndash T ndash G ndash G - T - C - C ndash A ndash N - T - T - G - G - C
A ndash A ndash T ndash G ndash G - T - C - T ndash A ndash N - T - T - G - G - C
Repeticiones en tandem
La variacioacuten en el nuacutemero de repeticiones de los
distintos mini y microsateacutelites es un polimorfismo
muy frecuente
Estos polimorfismos se generan por errores durante la
replicacioacuten
Dado que las repeticiones se encuentran en forma diploide
Cada uno de nosotros posee dos variantes para una repeticioacuten
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VNTR (Nuacutemero variable de repeticiones en tandem) micro sateacutelites hipervariables
Obtencioacuten de DNA a partir de RNA
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Repeticiones en tandem
La variacioacuten en el nuacutemero de repeticiones de los
distintos mini y microsateacutelites es un polimorfismo
muy frecuente
Estos polimorfismos se generan por errores durante la
replicacioacuten
Dado que las repeticiones se encuentran en forma diploide
Cada uno de nosotros posee dos variantes para una repeticioacuten
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VNTR (Nuacutemero variable de repeticiones en tandem) micro sateacutelites hipervariables
Obtencioacuten de DNA a partir de RNA
Rt-PCR Transcriptasareversa
VNTR (Nuacutemero variable de repeticiones en tandem) micro sateacutelites hipervariables
Obtencioacuten de DNA a partir de RNA
Rt-PCR Transcriptasareversa
Obtencioacuten de DNA a partir de RNA
Rt-PCR Transcriptasareversa
