Introducción VIRUS Y VIROIDES Características generales ... · nucleicos de virus (secuencia de...

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Fitopatología 2008

VIRUS Y VIROIDES FITOPATOGENOS

II

Ing. Agr. Elisa Silvera Pérez

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Virus y viroides fitopatógenos

� Introducción � Características generales� Características biológicas� Taxonomía � Desarrollo de la enfermedad � Influencia del ambiente

� Criterio de manejo� Diagnóstico

3

Criterio de manejo

� No se disponen métodos directos de control

� Medidas de manejo

indirectas: disminuir fuente de inóculo

limitar la dispersión

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Desarrollo de la enfermedad

Fuente de inóculo

DiseminaciónInoculación

Penetración

Transmisión

Colonización

Síntomas

Material de propagación

Plantas

2

5

Medidas tendientes a reducir inóculo inicial

� Material de propagación sano

Semillas:embrión:

Lettuce mosaic potyvirus (LMV); Squash mosaic comovirus (SqMV)

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� Material de propagación sano

Semillas:envolturas:

Tomato mosaic tobamovirus (ToMV) 72 h, 70ºC /24 h, 80 ºC; Cucumber green mottle mosaic tobamovirus(CGMMV) 72 h, 70 ºC

7


� Material de propagación sano:

Multiplicación vegetativaTermoterapia (agua/aire caliente)‏

Cultivo de meristemas

8

Medidas tendientes a reducir inóculo inicial: Termoterapia

� Consiste en la aplicación de altas temperaturas a plantas completas o partes aisladas.

3

9

Medidas tendientes a reducir inóculoinicial: Termoterapia

� Nicotiana rustica - Cucumber mosaic cucumovirus (CMV) ‏

Walkey, 1991

%

10

Medidas tendientes a reducir inóculo inicial: Termoterapia

� Nicotiana rustica Cucumber mosaic cucumovirus (CMV) ‏

Walkey, 1991

%

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Porcentajes de plantas que resultaron negativas al virus Grapevine rootstock stem lesion-associated virus (GRSLaV) mediantepruebas DAS-ELISA según el período de termoterapia (37ºC) y posteriorcultivo in vitro.

0 a1080

0 a10100

10 a1060

80 b1040

10 a1020

0 a100

Negativas (DAS-ELISA) ‏(%)

RepeticionesTratamientos (días) ‏‏ ‏‏

Camacho, 2005 Universidad de Chile, Faculta de Ciencias Agronómicas

Se consideró 10 plantas aclimatadas y lignificadas por cada período.

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Medidas tendientes a reducir inóculo inicial: Producción de plantas a partir

de cultivo de meristema

� El proceso de cultivo in vitro incluye varias etapas:

I. Establecimiento del cultivo aséptico.

II. Propagación de propágulos sanos (subcultivos).

III. Enraizamiento de los propágulos obtenidos.

IV. Transplante a suelo y acondicionamiento a invernadero.

4

13

Medidas tendientes a reducir inóculo inicial: Producción de plantas a partir

de cultivo de meristema

� Regeneración de un meristema de vid

� Plantas de vides de cultivo in vitro

� Sala de cultivo http://www.mercier-groupe.com/Espagnol/ELaboratoire/Elabohistorique.htm

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Obtención de ajos libres de virus mediante termoterapia y cultivo in vitro

� Tratamientos:- Ajos: cultivo in vitro- Ajos: termoterapia + cultivo in vitro

Termoterapia = aire 30 ºC / 7 días + 36°C / 14 días + 38°C / 21 días

- Ajos: 20ºC 45 días (Testigo)‏

� Cultivo de meristema, transplante explante a los 90 días Test de ELISA

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Obtención de ajos libres de virus mediante termoterapia y cultivo in vitro

Resultado:Cultivo in vitro: 55 – 70 % plantas sanasTermoterapia + cultivo in vitro:

100% plantas sanas Testigos: 100% de infección con

Onion yellow dwarf potyvirus

Alicia, B.; Muñoz, C.; Escaff, M.INIA, Est. Exp. La Platina, Chile. II Congreso Nacional de Fitopatología, 1993.

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Eliminar fuentes de inóculo

� Malezas

� Cultivos infectados

� Plantas espontáneas

� Plantas del cultivo

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Medidas tendientes a limitar la dispersión

� Control de los vectores

Insecticidas

Uso de barrera física

� Cambio en la fecha de siembra o plantación

� Aislamiento de las plantaciones

� Destrucción de partes aéreas de las plantas

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Control de vectores: insecticida

Porcentaje de plántulas de avena tratadas con imidacloprid o sin tratar inoculadas con BYDV-PAV por Rhopalosiphum padi o Sitobion avenae, a los 10 o 24 días después de la emergencia

Gray et al. Insecticidal control of cereal aphids and its impact on the epidemilology of the barley yellow dwarf luteoviruses. Crop Protection 15(8):687-697. 1996

Control de vectores: barrera de plantas

� Vertederos de virus

� Barrera física

� Cultivo trampa

� Control biológico

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Hooks & Fereres. Protecting crops from non-persistently aphid-transmitted viruses: A review on the use of barrier plants as a management.Virus Research 120: 1-16. 2006.

Reduce contraste entre las plantas y el suelo

Protegen a las plantas actúa como barrera mecánica

Reduce la tasa de aterrizaje de los áfidos alados

Plantas actúan como un vertedero para ambos virus

Factores

Saucke y D¨oring (2004)‏

Reduce incidencia del PVY

Mulch, rastrojo trigo

PVY Papa

Mannan (2003)‏Aumento rendimiento de la papa y del trigo

Trigo, mostazaPLRVPapa

Simons (1957)‏Reduce dispersión del virus

GirasolPVYPimiento

Avilla et al. ‏(1996)

Reduce dispersión CMV y retrasa la dispersión PVY

SorgoCMV PVY

Pimiento

Referencia RespuestaPlanta barrera

VirusCultivo

Efecto de las barreras sobre las transmisión de virus y los rendimientos

6

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Bottenberg y Irwin ‏(1992)

Baja la tasa de aterrizaje de los áfidos

Reduce % del SMV Presencia de mosaico por la semilla

Sorgo (enano y isolinea alta)‏

SMVSoja

Hooks et al. ‏(1998)

Retraso la aparición del virus, reduce nº de alados

Aumento en el rendimiento

Trigo negro, mostaza amarilla

PRSV-WZucchini

ReferenciaFactoresRespuestaPlanta barrera

VirusCultivo

Hooks & Fereres. Protecting crops from non-persistently aphid-transmitted viruses: A review on the use of barrier plants as a management.Virus Research 120: 1-16. 2006.

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Control de vectores: Progreso de la infección por CMV en parcelas

protegidas por cultivos barrera

Cultivos barrera (maíz y girasol) en el momento de transplante del pimiento

Avilla et al. Cultivos barreras como método de control de virus no persistente en pimiento. Bol. San. Veg. Plagas, 22: 301-307, 1996

23

Control de vectores: Progreso de la infección por CMV en parcelas

protegidas por cultivos barrera

Avilla et al., 1996 Bol. San. Veg. Plagas, 22: 301-307, 1996

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Número de pulgones capturados a lo largo del tiempo en trampas verdes localizadas

en parcelas de pimiento protegido por cultivos barrera

Avilla et al., 1996 Bol. San. Veg. Plagas, 22: 301-307, 1996

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Control de vectores: fecha de siembra e insecticida

Gray et al. Insecticidal control of cereal aphids and its impact on the epidemilology of the barley yellow dwarf luteoviruses. Crop Protection 15(8):687-697. 1996

Incidencia Barley yellow dwarf luteovirus en trigo de invierno en siembra tempranas y tardías

28/10/94

2/5/95

9/9/94 4/10/94

26Fuente: Cañedo, 1997

Aislamiento de las plantaciones

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Medidas tendientes a limitar la dispersión: Higiene

� Virus transmisión mecánica o contacto* Tobacco mosaic tobamovirus (TMV); ToMV; Pepper mild mottle tobamovirus (PMMV).Suelo con restos de plantas infectadas: desinfección de suelo con vapor de agua 90 ºC 15 m ToMV‏

Estructuras de invernaderos, lavado con desinfectanteDesinfección de manos y herramientas de trabajo fosfato sódico y alcohol SqMV cucurbitáceas (Lecoq et al., 1988)‏

Lavar manos con fosfato sódico (3%), jabón y agua. Herramientas desinfección con fosfato sódico (3%), ToMV tomate (Broadbent, 1976)‏

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Protección cruzada

� Se basa en la atenuación o supresión de los síntomas causados por una cepa severa de un virus si la planta ha sido infectada previamente por una cepa atenuada relacionada con la anterior

� Citrus tristeza closterovirus (CTV); ToMV

� Limitante

- virulencia de cepas varía entre especies y variedades

- posibles efectos sinérgicos del virus protector con otros virus

o patógenos

- variabilidad cepa atenuada cepa severa

8

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Protección cruzada

Firibourg & Fernández-Northcote, 1972Fitopatología 7 (1-2):23-29. 1972

Hoja de Capsicum pendulum var. escabeche inoculada con aislamiento A2 de TMV(1) Mitad inoculada con aislamiento A1 antes de inocular la hoja con A2(2) Mitad sin inocular

‏‏(1) ‏‏ ‏‏(2) ‏‏

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Resistencia genética y tolerancia

Términos de resistencia relacionado a la producción de síntomas y multiplicación del virus

Walkey, 1991

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Resistencia genética y tolerancia

� Inmunidad: cebada, Barley yellow mosaic virus(BaYMV)

� Resistencia: pepino CMV; lechuga LMV; morrón PMMV; papa Potato leaf roll luteovirus (PLRV), Potato X potexvirus (PVX), Potato Y potyvirus (PVY); soja Soybean mosaic potyvirus (SMV); remolacha Beet western yellow luteovirus (BWYV); tomate ToMV, Tomato spotted wilt tospovirus (TSWV); duraznero y ciruelo PPV

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Resistencia al vector

� Resistencia a insectosCaracterísticas fenotípicas o fisiológicas de las plantas (exudados pegajosos, pubescencias de las hojas hojas, caract. estructurales del tejido que dificulte acceso del insecto al floema)‏

Plantas de melón: resistencia a CMV por la no preferencia de Aphis gossypii

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Resistencia por ingeniería genética

� Plantas trangénicas

Plantas transformadas con secuencias de ac. nucleicos de virus (secuencia de la proteína de la cápsida viral, secuencias relacionadas con la replicasa virales)‏

Resistencia a la infección o atenúan los síntomas de la enfermedad

Actúa en fases iniciales de la infección, replicación del virus, dispersión en la planta o desarrollo de síntomas

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Resistencia por ingeniería genética: Plantas con secuencias de la proteína de la cápside viral (PC)

� Plantas transformadas

AlMV / tabaco, tomate, alfalfa

CMV/ tabaco, calabacín

PVX / papa, tabaco

PVY / papa

TMV / tabaco, tomate

TSWV / tabaco

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Resistencia por ingeniería genética: Plantas con secuencias de la proteína

de la cápside viral (PC)‏

� Efectos infección viral Disminución del nº de sitios de infección en hojas inoculadasSíntomas sistémicos demoran o no se manifiestanMenor acumulación de virus en las hojas inoculadas

� Mecanismo de resistenciaBloqueo del ensamblaje del virus infectivo por expresión trangénica PC

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Porcentajes de plantas de tomate con síntomas del “virus de la peste negra del tomate” (TSWV) en 6 ambientes de evaluación.Tipos de cultivares evaluados: Resistentes, Tolerantes o Susceptibles.

< 0,1 %

< 1 %

< 5 %

Adecuado

Adecuado

Temprana

< 15 %< 5 %< 5 %< 5 %Resistente

> 60 %< 10 %< 10 %< 5 %Tolerante

> 90 %> 70 %> 40 %< 5 %Susceptible

Inadecuado o nulo

Adecuado

2 aplicaciones en todo el ciclo

Adecuado2 aplicaciones/ sem. hasta 60 d. post-transplante

AdecuadoControl del vector

Inadecuado o nulo

AdecuadoAdecuadoAdecuadoControl de maleza

Tardía Tardía Tardía TempranaMomento de implantación

Mitidieri.http://www.inta.gov.ar/sanpedro/info/doc/pdf/mmitidieri_mi.pdf.

10

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Ciclo del Mosaico enanizante del Maíz causado por Maize dwarf mosaic potyvirus (MDMV) ‏

Fuente: Instituto de Fitopatología y Fisiología Vegetal INTA-JICA, 1999

Medidas de manejo:• Usar materiales tolerantes y/o resistente al virus

• Control del sorgo de alepo y malezas dentro de los cultivos

38

Diagnóstico

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Diagnóstico

� Dificultades: Pequeño tamañoPoca diversidad morfologica Síntomas similares Síntomas variables: � cultivar � condiciones ambientales

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Postulados de Koch modificado por Bos (1981)

1. El virus debe encontrarse siempre asociado a la enfermedad

2. Debe ser aislado de la planta enferma (separarlo de otros patógenos, multiplicarlo en un hospedero, purificarlo, determinar sus propiedades intrínsecas)

3. Reproducir los síntomas en planta sana inoculada4. Demostrar que el virus se encuentra en la planta

inoculada y debe ser re-aislado

11

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Diagnóstico

� Planta con síntomas � Distribución de los síntomas en la planta� Distribución de los síntomas en el campo� Análisis de otros datos � Ensayos de infectividad� Forma de transmisión� Estudio de inclusiones celulares� Observaciones de partículas virales al microscopio

electrónico� Serología� Técnicas moleculares

Consulta

bibliográfica

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Síntomas

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Foto: Unidad de Fitopatología, FAGRO

Enanismo en planta de papa infectada con PVY

Reducción en el crecimiento

44

Mosaico

Mosaico en hojas de tabaco, TMV

Foto: http://www.apsnet.org/education/LessonsPlantPath/Top.html

12

45

Arabescos

Foto: Moreno en Llácer et al. Patología vegetal. 1996

Arabescos y anillos cloróticos en hoja de rosal, Prunus necrotic ringspot ilarvirus (PNRSV)

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Clorosis localizadas


Anillos cloróticos en hoja de morrón

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Necrosis

Foto: Moreno, en Maruchi, Instituto de Investigaciones Tropical

Desecación en tronco de naranjo dulce, Psorosis A

48

Necrosis

Anillos necróticos en frutos de tomate, TSWV


13

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Necrosis


Planta de lechuga con amarillamiento y necrosis foliar, TSWV

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Deformaciones

(a) Raiz normal (b) raíz con (CVY) Carrot virus Y Foto: Lindrea et al. Research, 100 (1): 89-99. 2004

a

b

Acanaladuras y sobrecimiento en troncos de viníferas, Rupestris stem pitting associated virus (RSPaV)�Foto: Barcelos. http://www.cnpuv.embrapa.br/publica/sprod/UvasViniferasRegioesClimaTemperado/virus.htm

51

Distribución de los síntomas en el campo

� Generalizada


Cultivo en invernáculo con plantas de lechuga afectadas por TSWV

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Distribución de los síntomas en el campo

� Parcial: bordes,

fila manchones al azar

Plantas sanas Plantas Enfermas

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Ensayos de infectividad

� Misma espécie

� Plantas indicadoras: Nicotiana, Solanum, Chenopodium, Cucumis, Phaseolus, Vicia, Brassica

Sin síntomas

Lesiones locales Lesiones sistémicasFuente: Unidad de Fitopatología, FAGRO

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Bioensayos con plantas indicadoras

Ortega et al. INCI 32(3) 2007

55

Plantas indicadoras de virus y viroides cítricos

Planta Indicadoras

Patógeno Indicador

Tristeza Limón criollo

PsorosisNaranja dulce Hamlin, mandarina común o naranja agria

Petrificación Grapefruit, proveniente de semilla

ExocortisCidra Ethrog Arizona 861-5-1 injertado sobre Citrus volkameriana Gynura aurantiaca, Petunia spp.

Ortega. Método de detección virus y viroides en cítricas. FONAIAP-Divulga, 22. 1986

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Forma de transmisión

� Mecánica

� Vectores

� Injerto

� Semilla

15

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Forma de transmisión: Mecánica

Agrios, 199558

Forma de transmisión:Injerto

Agrios, 1995

59

Forma de transmisión: Injerto

Agrios, 1995

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Estudio de las inclusiones celulares

Inclusiones en forma de “rueda de molino” (“pinwheel”) en células de plantas infectadas por un potyvirus, microscópio electrónico Foto: Gergerich & Dolja, 2006 APSnet

16

61

Estudio de las inclusiones celulares

Inclusiones granulares de un geminivirus afectando la pared celular de células floemáticas en plantas de tomate, microscopio óptico. (Foto: Villalba) http://web.catie.ac.cr/informacion/RMIP/rmip52/images/galileo4.jpg 62

Observación de partículas virales al microscopio electrónico

� Extractos brutos o parcialmente purificados � Estudio de partículas e inclusiones en secciones

ultrafinas de los tejidos enfermos � Forma y tamaño partícula viral

Limitantes:Concentración baja del virusTejidos infectados con dos o más virus de morfología similar o diferente pero se distribuyen irregularmente (Inmuno-Microscopía electrónica)‏

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Partículas virales de un geminivirus (Foto: R. Lastra) http://web.catie.ac.cr/informacion/RMIP/rmip52/nbusta-3.htm

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Observación bajo el microscopio electrónico de transmisión de muestras de plantas de cebadas afectadas con síntomas de estrías negras en las hojas. Típica partícula encontrada en plantas infectadas (30.000x). Foto: http://www.scielo.cl/scielo.php?pid=S0365-28072001000300003&script=sci_arttext

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65


Partículas de TSWVFoto: http://biology.anu.edu.au/Groups/MES/vide/refs.htm

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Serología

Reacción antígeno - anticuerpo

� Inmunodifusón en gel (reacción precipitina)‏

� ELISA (cambio de color de sustrato degradado por la enzima)‏

� Kits comerciales

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Inmunodisfusión en gel

Teste inmuno-difusión con antisuero producido de conejo inmunizado con extracto de plantas con Cowpea severe mosaic comovirus (CSMV) y Papaya lethal yellowing virus (PLYV) A: Antisuero CSMV; B: Antisuero PLYV; Cp: extracto de planta con CSMV; Pl: esxtracto de plantas con PLYV; H: extracto planta sin CSMV y PLYV

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ELISA (Enzyme-L inked InmunoSorbent Assays)

Representación esquemática de la técnica de DAS-ELISA doble sandwich de anticuerpos para detección indirecta de un virus con anticuerpos monoclonales

Microplaca de la técnica de DAS-ELISA después de la adición del sustrato de la enzima, cavidades con coloración amarilla de la enzima indicando reacción antígeno-anticuerpo y la intensidad la concentración

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Kit comercial

Fabricante: Loewe Biochemica GmbH

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Sensibilidad aproximada de diferentes técnicas de detección de virus

Walkey, 1991

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Técnicas moleculares

� Electroforesis

� Hibridación de ácido nucleico� Reacción de polimerasa en cadena (PCR)‏

Trascripción inversa- PCR (RT-PCR)‏

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Electroforesis

� Separación de moléculas cuando migran en un campo eléctrico

� Posición de las bandas depende del tamaño de las moléculas y la carga a que se trabaja

Partícula entera Proteína del virusÁcido nucleico

19

73

http://www.scielo.br/img/revistas/pab/v40n2/23828f1.jpg

74

Hibridación de ácidos nucleicos

� Dotblot� Squashblot

Esquema de la técnica de hibridaciónFuente: Llácer, 1996

75

Hibridación de ácidos nucleicos:Dotblot

Detección de un geminivirus mediante hibridación molecular. Los círculos negros indican la presencia del virus en la muestra analizada. (Foto: Rivas).

http://web.catie.ac.cr/informacion/RMIP/rmip52/nbusta-3.htm

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RT-PCR

Diagrama de RT-PCR usado para la detección de virus y viroides. RNA primero trascripción inversa para ADNc usando oligonucleotídeos iniciadores antisenso, luego inicia amplificación exponencial por multiplos ciclos de PCR usando oligonucleotídeos sense y antisenso

Fuente: Pallás et al. Options Méditerranéennes, Série B/19

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Electroforesis en gel de agarosa del producto obtenido del RT-PCR de muestras de campo para detectar presencia del Hop stunt viroid (HSVd). Linea 1, marcador de PM; Linea 2, muestra de durazno infectado con HSVd; Lineas 3-6, muestras de diferentes árboles apricot. Muestras 3-5 infectadas con HSVd mientras que la 6 está libre del viroide.

Fuente: Pallás et al. Options Méditerranéennes, Série B/19 78

¿Sensibilidad entre las técnicas DAS-ELISA y RT- PCR?

Camacho, 2005 Universidad de Chile, Faculta de Ciencias Agronómicas

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Selección de técnicas

� Estimar concentración de un virus en una suspensión

� Detectar un virus conocido en una o muchas plantas

� Conocer características de un virus para identificarlo si es conocido o describirlo si no lo es

� Tipo de agente (virus o viroide)‏

80

Selección de técnicas

� Diagnóstico de una enfermedad causada por un nuevo virus

� Diagnóstico de una enfermedad causada por un viroide conocido

� Detección de un virus de material propagativo vegetativo

21

81

Bibliografía

� Agrios, G.N. Fitopatología. México, Noriega. 1995. � Gepp, V. Virus y viroides fitopatógenos. Dpto. de

Publicaciones de la Facultad de Agronomía, Montevideo, Uruguay. 27 p. 1996.

� Gergerich, R.C.& Dolja, V.V. Introduction to Plant Viruses, the Invisible Foe. The Plant Health Instructor. <http://www.apsnet.org/education/IntroPlantPath/PathogenGroups/plantViruses/default.htm>. 2006.

� ICTVdB, Descriptions. International committee on taxonomy of viruses, <http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ICTVdb/ICTVdB/>

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